-
Diese Erfindung betrifft biologisch
aktive β-Glucan-Mannan-Präparationen
und Verfahren für
ihre Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung β-Glucan-Mannan-Präparationen,
einschließlich β-(1-3)-Glucan, die
von Mikroorganismen produziert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf
Hefen, und Verfahren für
die Produktion der β-Glucan-Mannan-Präparationen,
die die Verwendung von konzentriertem Alkali oder von konzentrierter
Säure vermeiden.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Polysaccharide sind in der Natur
weit verbreitet und sind insbesondere wichtig bei ihrer Rolle zur
Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität von Bakterien-, Pilz- und
Pflanzenzellen. Glucane sind Polymere aus D-Glucose, und die D-Glucoseeinheiten
können
auf eine Reihe von Arten miteinander verknüpft sein. Zum Beispiel sind
Glucane mit 1-3-, 1-4-,
1-6- und 1-2-Bindungen bekannt. Die Vielzahl von möglichen
Bindungen bedeutet, dass Glucane normalerweise stark verzweigte
Verbindungen sind. Wegen ihrer chemischen Eigenschaften haben Glucane
vielfältige
Verwendung in der chemischen, Lebensmittel- und pharmazeutischen
Industrie gefunden. Zum Beispiel sind von Nutzen als Viskosität verleihende
Mittel, Emulgatoren, Fasern, Filme, Beschichtungsmittel, Träger bei
der Affinitätschromatographie
und Gelelektrophorese, in Zellkulturmedien, als Filterpropfen und
in Zement. Sie werden auch verbreitet als Verdickungsmittel bei
Lebensmitteln und als Quelle von Nahrungsfasern und als Träger und
Beschichtungsmittel bei pharmazeutischen Produkten verwendet.
-
Glucane, insbesondere β-(1-3)-Glucane,
wurden sehr ausführlich
erforscht, und es wurde gezeigt, dass sie zusätzlich zu vorstehend Gesagtem
eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten haben, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf anti-Cholesterinämie-Aktivität, Hypoglycämie-Aktivität, Beschleunigung der
Exkretion von Schwermetallen und Stimulierung des Immunsystems.
Die immunstimulierende Aktivität
von β-Glucanen
hat zu Vorschlägen
geführt,
dass sie als anti-Krebsmittel oder bei der Behandlung einer HIV-Infektion,
als Mittel für
die Stimulierung der Wundheilung oder als anti-Infektionsmittel für die alleinige Verwendung oder
in Verbindung mit Antibiotika von Nutzen sind.
-
Die β-Glucane können auch die Resistenzantwort
auf Krankheit in Pflanzen induzieren, wie die Phytoalexin-Produktion
und Welken. Dies hat zu Vorschlägen
geführt,
dass sie als anti-Infektionsmittel und Wachstumsförderer in
Pflanzen verwendet werden können.
-
Wegen der Probleme, die bei der intensiven
Produktion von Geflügel,
Tieren, Fischen oder Crustaceae auftreten, wurde die Verwendung
der β-Glucane
auch als Zusatz zu den Futtermitteln vorgeschlagen, um das Auftreten
von Infektionen zu reduzieren und folglich das Wachstum zu fördern und
den Bedarf an Antibiotika zu reduzieren.
-
β-(1-3)-Glucan
ist ein wichtiger Zellwandbestandteil von Hefezellen. Die Zellwand
von Saccharomyces cerevisiae besteht vorwiegend aus β-verknüpftem Glucan,
das hauptsächlich
ein Rückgrat
von β-(1-3)-verknüpften Glucoseeinheiten
ist, mit einem geringeren Bestandteil von inter- und intramolekularen
Verzweigungen über β-(1-6)-Bindungen. Wegen
der sehr breiten Anwendung von Hefen in der Nahrungsmittel- und
Brauindustrie ebenso wie bei der Herstellung von Industriealkohol,
sind verbrauchte Hefezellen ein wichtiges industrielles Nebenprodukt.
Von Hefe abgeleitete Produkte selbst haben einen beträchtlichen
kommerziellen Wert, zum Beispiel in solchen Produkten wie Hefeextrakten,
Geschmacksmitteln, Geschmacksverstärkern wie Guanosinmonophosphat
und Inosinmonophosphat, und bei der Herstellung von Enzymen, Feinchemikalien
und Produkten zur Verwendung bei der biochemischen und pharmazeutischen
Industrie, wie Trehalose, Thymidin, Nucleoside und Nucleotide, usw.
Abfallhefe bei der Brauindustrie ist eine wichtige Quelle für β-Glucane.
-
Zusätzlich sind auch andere Arten
von Hefe von Nutzen als Quelle für β-Glucane,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf andere Hefestämme
von Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis und Candida-Stämme wie
Candida utilis. Alle diese Hefestämme können unter Verwendung von Nährstoffen
in Lebensmittelqualität
entweder mittels diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Fermentation
produziert werden. Viele andere Arten von Mikroorganismen, einschließlich Bakterien,
Pilze und einzellige Algen, sind im Stand der Technik als Quelle
für β-Glucane
beschrieben worden.
-
Die Reinigung der β-Glucane
aus Hefe und anderen Organismen wurde intensiv untersucht, und eine Reihe
von Verfahren ist bekannt. Die meisten beruhen auf der Unlöslichkeit
von β-(1-3)-Glucan
in Alkali oder in organischen Lösungsmitteln.
Die wichtigen bekannten Verfahren sind:
- (a)
Extraktion bei hoher Temperatur mit konzentriertem Natriumhydroxid,
gefolgt von Extraktion bei hoher Temperatur mit Säure und
Ausfällung
mit Ethanol (vgl. zum Beispiel Manners, D. J. et al., Biochem. J.
135 19–30
(1973), Jamas, S. et al., US-Patent Nr. 4810646, Nr. 5028703 und
Nr. 5250436 und das Australische Patent Nr. 628752 von Phillips
Petroleum Company). Viele dieser Protokolle verlangen die vorläufige Homogenisierung
der Hefezellen, und viele verlangen die vielfache Wiederholung von
jedem Extraktionsschritt.
- (b) Extraktion mit konzentriertem Natriumhydroxid, gefolgt von
Extraktion bei hoher Temperatur mit Säure und Enzymbehandlung, um
das Glucan zu modifizieren oder reinigen (vgl. zum Beispiel die
Tschechische Patentanmeldung Nr. 890038 von Masler, L. et al., die über die
Reinigung von β-D-Glucan
durch Alkali-Säure-Extraktion
berichten, gefolgt von Behandlung mit Enzymen, die Amylase-Aktivität haben).
- (c) Extraktion von Hefezellwandpräparationen, die von Autolyse
oder Enzymabbau von Hefe mit konzentriertem Phenol : Wasser (1 :
1) resultieren (vgl. zum Beispiel US-Patent Nr. 4138479 von Truscheit,
E. et al.).
- (d) Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Isopropanol,
Ethanol, Aceton oder Methanol, entweder allein oder in der Gegenwart
von Alkali (vgl. zum Beispiel die Japanischen Patentoffenlegungen
Nr. 7051081, 6340701, 5295003 und 3002202; Europäische Patentanmeldung Nr. 515216).
-
Von der Behandlung mit Säure ist
bekannt, dass sie die Zahl an β-(1-6)-Bindungen
in dem Glucanmaterial reduziert, und dies resultiert in einer Erhöhung der
Viskosität.
-
Die Zellwand von Hefe besteht vor
allem aus:
- (i) fibrillärem, in Alkali unlöslichem β-(1-3)-verknüpftem Glucan
mit seitlichen Verzweigungen von β-(1-6)-verknüpftem Glucan.
- (ii) in Alkali löslichem β-(1-3)-verknüpftem Glucan
mit seitlichen Verzweigungen von β-(1-6)-verknüpftem Glucan.
- (iii) amorphem, in Säure
löslichem β-(1-6)-Glucan
mit dazwischen liegenden β-(1-3)-Bindungen.
- (iv) amorphem in Alkali löslichem
Mannan, das mit Proteinen verknüpft
ist.
-
Die fibrilläre Glucankomponente liegt in
der Nachbarschaft der Hefeplasmamembran und ist extern durch eine
amorphe Schicht bedeckt, die vor allem aus Mannoproteinen besteht
(Kopecka M. et al., J. Cell. Biol., 62 68–76 (1974)). Von partikulärem Material
(Zymosan), das aus den Zellwänden
von Saccharomyces cerevisiae isoliert wurde, ist bekannt, dass es
die Fähigkeit
hat, als ein unspezifisches immunstimulierendes Mittel zu wirken.
Die biologische Aktivität
von Teilchen der Hefezellwand wird zum großen Teil der Gegenwart von β-(1-3)-verknüpftem Glucan
zugeordnet, aber auch die beiden anderen Formen von Glucan und Mannan haben
eine gewisse Fähigkeit,
das Immunsystem zu stimulieren. Von Mannan wird berichtet, dass
es die Adsorption und Phagocytose von partikulärem Material wie unlöslichem β-(1-3)-Glucan
an Zellen des Immunsystems vermittelt (Giaimis, J., et al., Journal
Of Leukocyte Biology 54 564–571
(1993); Sun-Sang, J., et al., Journal Of Cell Biology 96 160-166 (1983)).
-
Existierende Verfahren für die Isolierung
von β-Glucanen
verwenden üblicherweise
ein Alkali-Säure-Extraktionsverfahren
in vielen Schritten (Manners, D. J., et al., J. Gen. Micro. 80 411–417 (1974)).
Die Schritte der Alkaliextraktion entfernen das meiste an amorphem
Mannoprotein- und Glucanmaterial, und die folgenden Schritte der
Säureextraktion
entfernen das Glycogen und die meisten seitlichen β-(1-6)-Verzweigungen
von dem fibrillären,
vorwiegend β-(1-3)-verknüpften Glucan.
Eine letzte Lösungsmittelextraktion
wird manchmal verwendet, um Lipide zu entfernen.
-
Unter Berücksichtigung des Verkaufspreises
von Glucan für
einige Anwendungen ist es klar, dass die Kosten der Produktion von
Glucan unter Verwendung existierender veröffentlichter oder patentierter
Verfahren nicht kommerziell sinnvoll sind. Diese Verfahren haben
die folgenden Probleme:
- (i) Sie zielen nur
darauf, die fibrilläre,
in Alkali unlösliche
Form von Glucan zu produzieren. Andere Formen von Glucan und das
in der Zellwand vorhandene Mannan werden als Nebenprodukte des Verfahrens
entfernt. Diese stellen eine zusätzliche
Menge an Glucan dar, welche die Glucanausbeute signifikant hätten erhöhen können, und
die funktionell wichtig sein kann.
- (ii) Die existierenden Verfahren erfordern signifikante Kapitalinvestitionen.
- (iii) Die existierenden Verfahren sind wegen der Erfordernis
der Behandlungen mit Basen und Säuren
mit hohen Konzentrationen und bei hohen Temperaturen gefährlich.
- (iv) Die Verfahrenen resultieren in einer Lösung, die in Alkali unlösliches
Glucan enthält,
welches auf der Grundlage herkömmlicher
Verfahren schwer abzutrennen ist, und das resultiert in schlechten
Ausbeuten.
- (v) Die Herstellungskosten sind im Vergleich zum Wert der Produkte
bei vielen Anwendungen hoch.
-
Elektronenmikroskopische Untersuchungen
von Hefezellwänden
(Kopecka M., et al., J. Cell. Biol. 62 68–76 1974) zeigten, dass die
fibrilläre
Komponente der Zellwand freigelegt wurde, wenn die äußere amorphe Schicht
von Mannoproteinen durch Behandlung mit Enzymen entfernt wurde.
-
Im Stand der Technik besteht ein
klarer Bedarf an einem schnellen und billigen Verfahren für die Extraktion
von β-Glucan,
welches die Verwendung von hohen Konzentrationen an Alkali oder
Säure und
die Verwendung von hohen Temperaturen vermeidet, einen Verlust von
in Alkali löslichen
Glucanen und Mannanen vermeidet, eine verbesserte Ausbeute an Glucanen
und Mannanen hat und in einer biologisch aktiven Präparation
resultiert.
-
Gemäß dem US-Patent 4,313.934 wird
ein physiologisch aktives Polysaccharid durch Behandlung von bei
der Autolyse unlöslichem
Material von Hefen von Saccharomyces mit einem für die Hefezellwand lytischen Enzym
und Gewinnung einer wasserlöslichen,
physiologisch aktiven Substanz in der resultierenden Lösungsfraktion
hergestellt. Das neue Polysaccharid besitzt spezifische physikalische
und chemische Eigenschaften und stellt ein chemotherapeutisches
Mittel wie ein karzinostatisches Mittel, das bei der Behandlung
von eingepflanzten Tumoren in Mäusen
und Ratten verwendet werden kann, und ein Interferon induzierendes
Mittel bereit.
-
In JP 53/044614-A wird ein anti-Krebsmittel
wie folgt definiert:
(1) es ist eine in Wasser unlösliche Fraktion
von Bierhefe-Autolysat; (2) es besteht aus Polysaccharid und Protein;
(3) der Hauptbestandteil, das Polysaccharid, umfaßt mindestens
Glucan, Mannan und Glycogen; und (4) sein Säure-Hydrolysat zeigt positive
reduzierende Zuckerreaktionen.
- – Die Substanz
verlängert
bei oraler oder parenteraler Verabreichung das Überleben von Mäusen, die
einen Ehrlich-Ascites-Tumor oder einen Brusttumor tragen. Ihre akute
Toxizität
LD50 bei Mäusen
ist 1335 mg/kg (i.p.).
- – Die
Antitumor-Substanz kann erhalten werden durch (a) Waschen einer
Bierhefe wie Saccharomyces carlsbergensis mit einem geeigneten Detergens
oder nur Wasser, um Hopfen oder andere Verunreinigungen zu entfernen,
und (b) Suspension der erhaltenen Hefezellen in einem angesäuerten Wasser
und 18–24 Std.
Inkubation bei 45–55
Grad C für
die Autolyse. Die Autolyse kann lange Zeit in Anspruch nehmen, z.
B. 2–3
Tage. Das Autolysat wird dann zentrifugiert, um die wasserlösliche Form
zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit
wird zur Trockenheit verdampft, um die Antitumor-Substanz bereitzustellen.
-
Mit der vorliegenden Erfindung haben
wir gefunden, dass β-Glucan-Mannan-Präparationen
unter Verwendung eines Autolyse-Verfahrens bei fast neutralem pH-Wert
und bei nur leicht erhöhter
Temperatur isoliert werden können
und dass die ausgezeichnete Ausbeute eines Produkts mit hoher immunstimulierender
Aktivität
erhalten wird, welche die Stimulierung der phagocytischen Aktivität, der Superoxidproduktion
und eine erhöhte
Resistenz gegen Pathogene und Infektionen umfassen kann. Die Autolyse
kann durch eine Behandlung mit Enzymen oder anderen Mitteln unter
schonenden Bedingungen ergänzt
werden, und, falls erwünscht,
können
die Eigenschaften des Glucan-Mannan-Produkts durch Säurebehandlung,
Grad der Homogenisierung oder durch Variation der verwendeten Art
von Enzym modifiziert werden.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein Verfahren für
die Produktion einer immunstimulatorischen Präparation bereitgestellt, die β-Glucane
und Mannane enthält,
wobei die β-Glucane
1,3-β-Glucane
und 1,6-β-Glucane
umfassen, welches die Schritte umfaßt:
- a)
Zellen eines Mikroorganismus einem ersten Autolyseschritt bei einem
pH-Wert von etwa 5 bis etwa 6 und einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa
60°C für etwa 6
bis etwa 48 Stunden unterziehen, um ein Material mit einer Partikelgröße von etwa
100 bis 300 Mikrometer zu erzeugen;
- b) Abtrennen des festen Materials von den autolysierten Produkten;
- c) das feste Material von Schritt b) einem zweiten Autolyseschritt
in Gegenwart eines oder mehrere Mittel unterziehen, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus einem proteolytischen Enzym, Mannanase,
Amylase und β-Glucanase,
bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 6 und einer Temperatur von
etwa 35°C
bis etwa 60°C
für etwa
6 bis etwa 48 Stunden;
- d) Abtrennen des festen Materials von dem autolysierten Produkt;
und anschließend
- e) Verringern des festen Materials auf Partikel von weniger
als 2 Mikrometer.
-
Die Inkubationsbedingungen, die gemäß dem vorstehend
beschriebenen Verfahren bereitgestellt werden, ermöglichen
eine wirksame immunstimulierende Präparation, die Glucane und Mannane
enthält
und die billig, effizient und auf eine nicht gefährliche Weise herzustellen
ist. Die Präparation
stimuliert das Immunsystem vorzugsweise durch Erhöhung der
Phagocytose-Aktivität
oder der nicht spezifischen Immunantwort.
-
Die immunstimulierende Wirksamkeit
und Viskosität
der so produzierten β-Glucan-Mannan-Präparation
wird durch eine Verringerung der Partikelgröße des extrahierten Materials
auf unter 2 Mikrometer, mehr bevorzugt unter 1 Mikrometer, unter
Verwendung eines mechanischen Aufbrechverfahrens wie Mahlen, einer
Ultraschallbehandlung oder einer Homogenisierung unter Druck weiter
erhöht.
-
In einer anderen Ausführungsform
wird gemahlene Hefe verwendet, um die β-Glucan-Mannan-Präparation zu erhalten. Hefezellen
werden der Autolyse und dem enzymatischen Verdau entweder während oder nach
der Mahlphase unter Verwendung von Bedingungen, wie vorstehend beschrieben,
unterworfen.
-
In einer alternativen, besonders
bevorzugten Ausführungsform
wird die immunstimulierende Wirksamkeit und Viskosität der β-Glucan-Mannan-Präparation
durch Veränderung
der Natur des beim Extraktionverfahren verwendeten Enzyms verändert.
-
Während
verbrauchte Hefe von der Fermentationsindustrie beim Verfahren der
Erfindung besonders von Nutzen ist, sollte klar verstanden werden,
dass die Erfindung auf jede Quelle anwendbar ist, wie mikrobielles
oder Pflanzenmaterial, in dem β-Glucane
in einem signifikanten Anteil vorhanden sind. Mikroorganismen, von
denen berichtet wurde, dass sie nützliche Quellen von β-Glucane
sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Bakterien wie Alkaligenes,
insbesondere Alkaligenes faecalis Var. mixogenes (ATCC-21680); Agrobacterium;
Cellulomonas wie ATCC 21399 und Cellulomas flavigens (ATCC 53703);
und Pestalotia; Pilze, zum Beispiel Aureobasidum wie Aureobasidum
pullulans Stamm IFO446 und Aureobasidum Art K-1 (FERM P1289); Pleurotus
ostreatus; Macrophomopsis wie der Stamm KOB55; Ganoderma; Schizophylla;
Fachyma hoelen; Pestalotia; und Coriolus. Zusätzlich zu Brauhefen sind andere
Hefen, die in der Lebensmittel- und Fermentationsindustrie verwendet
werden, für
die Zwecke der Erfindung geeignet. Diese umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf Hefen, die bei der Produktion von Viskosität verleihenden Mitteln, Emulgatoren,
Fasern, Filmen, Beschichtungssubstanzen, Trägern für die Affinitätschromatographie
und Gelelektrophorese, bei Zellkulturmedien, als Filterpfropfen
und in Zement verwendet werden. Sie werden auch verbreitet als Verdickungsmittel
für Lebensmittel
und als Quelle für
Nahrungsfasern und als Träger
und Beschichtungsmittel in pharmazeutischen Produkten verwendet.
-
Der Durchschnittsfachmann auf dem
Fachgebiet wird leicht die geeigneten Bedingungen ermitteln können, unter
denen das endungsgemäße Verfahren
bei Organismen, die keine Hefen sind, angewendet werden kann.
-
Dem Durchschnittsfachmann auf dem
Fachgebiet wird offensichtlich sein, dass für einige Anwendungen von β-Glucan und
Mannan die unter Verwendung des Verfahrens der Endung hergestellte
Präparation
vorteilhafterweise in einer trockenen Form bereitgestellt wird.
Die Präparation
wird in geeigneter Weise mittels jedes geeigneten Verfahrens getrocknet,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Gefriertrocknung, Trocknung in einer Rolltrommel, Trocknung
in einem Ofen, Sprühtrocknung,
Ringtrocknung oder Trocknung unter Verwendung von filmbildender
Ausrüstung,
und kann entweder ohne weitere Verarbeitung verwendet werden oder kann
unter Verwendung jeder geeigneten Technik zu einer Partikelgröße von vorzugsweise
weniger als 20 Mikrometer gemahlen werden. Für andere Anwendungen ist ein
feuchtes Produkt wie eine viskose Paste geeignet, und die Präparation
kann entweder ohne weitere Verarbeitung verwendet werden oder nach
mechanischem Aufbrechen, um ihre Viskosität zu erhöhen und die Partikelgröße zu vermindern.
-
Gemäß einem verwandten Aspekt stellt
die Erfindung eine β-Glucan-Mannan-Präparation
bereit, die mit dem Verfahren der Erfindung produziert wurde. Die
Glucan-Mannan-Präparation
gemäß der Erfindung
umfaßt
vorzugsweise hauptsächlich
Glucan (zum Beispiel bis zu 80%) und etwas Mannan (zum Beispiel
bis zu 50%). Die Präparation
kann aus β-1-2-, β-1-3-, β-1-4- und β-1-6-Glucanen
bestehen.
-
Die Präparation kann allein verwendet
werden. Üblicherweise
wird sie jedoch in Verbindung mit anderen Komponenten bereitgestellt.
Damit umfassen bei diesem Aspekt der Erfindung bevorzugte Ausführungsformen,
sind aber nicht beschränkt
darauf, eine Futtermittelzusammensetzung für Geflügel, Fisch, Crustaceae oder
Schalentiere, die die β-Glucan-Mannan-Präparation
der Endung zusammen mit einer oder mehreren veterinärmedizinisch
zulässigen
Futtermittelkomponenten umfaßt;
eine immunstimulierende Zusammensetzung, eine Zusammensetzung gegen
Cholesterinämie,
gegen Hypoglycämie,
eine Zusammensetzung zur Stimulierung der Exkretion von Schwermetallen,
umfassend die β-Glucan-Mannan-Präparation
der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger;
eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch aktives Mittel
umfaßt
und die β-Glucan-Mannan-Präparation
der Erfindung entweder als Träger oder
als Adjuvans oder als Beschichtungsmittel für eine Dosierung in fester
Form wie eine Tablette oder Kapsel; und eine Zusammensetzung zum
Pflanzenschutz, umfassend die β-Glucan-Mannan-Präparation
der Erfindung zusammen mit einem landwirtschaftlich zulässigen Träger und
gegebenenfalls einem landwirtschaftlich zulässigen Nährstoff oder Pestizid. Die β-Glucan-Mannan-Präparation
kann auch im Trinkwasser für
Geflügel
oder Tiere oder im Umgebungswasser für Fisch, Crustaceae oder Schalentiere
bereitgestellt werden.
-
Es sollte eindeutig verstanden werden,
dass die Präparation
der Erfindung im allgemeinen für
die Verwendung in Produkten geeignet ist, bei denen bekannt ist,
dass β-Glucane von Nutzen
sind. In einigen Fällen kann
eine weitere Reinigung wünschenswert
oder notwendig sein, und wenn dem so ist, können Reinigungsschritte verwendet
werden, die per se bekannt sind.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die Endung wird nun im Detail im
Wege der Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele
beschrieben.
-
Beispiel 1 Autolytische
Extraktion
-
Eine Hefeprobe wurde einem autolytischen
Extraktionsverfahren unterworfen. 1 Liter verbrauchte Brauhefe (15%
Trockengewicht) wurde 6 bis 48 Stunden bei 35 bis 60°C unter Rühren inkubiert.
Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 2 M NaOH oder 2 M HCl , wie
erforderlich, zwischen 5 und 6 eingestellt. Diese Bedingungen fördern die
Autolyse der Hefe und die Freisetzung von die Zellwand abbauenden
Enzymen. Das Material wurde zentrifugiert (3.000 g, 15 Minuten bei
4 bis 20°C),
und das Sediment wurde vor der Sprüh- oder Gefriertrocknung mit
einem gleichen Wasser Volumen gewaschen.
-
Beispiel 2 Enzymatische
Extraktion
-
Die Produktion von Glucan-Mannan
durch das Verfahren der autolytischen Extraktion von Beispiel 1 wurde
durch die Zugabe von Substanzen modifiziert, von denen man weiß, dass
sie die Autolyse der Hefe induzieren.
-
1 Liter verbrauchte Brauhefe (15%
Trockengewicht) wurde mit dem enzymatischen Verfahren von Beispiel
1 behandelt. Die weitere Autolyse wurde durch die Zugabe von proteolytischen
Enzymen (Papain, Optimase APL440 (Solvay), Protomex (Novo) und/oder Mannanase
(Gist Brocades) und/oder alpha-Amylase (Optidex L300 (Solvay), Ban
240L (Novo)) und/oder Glucanase (SP299 (Novo), Tunicase (Solvay)
induziert. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 2 M NaOH oder
2 M HCl , wie erforderlich, auf den optimalen pH-Wert für die enzymatische
Aktivität
eingestellt. Die Hefe wurde 6 bis 48 Stunden bei 35 bis 60°C unter Rühren inkuziert.
Das Material wurde zentrifugiert (3.000 g, 15 Minuten bei 4 bis
20°C), und
das Sediment wurde mit einem gleichen Wasser Volumen gewaschen.
Das Sediment wurde, wie vorstehend beschrieben, getrocknet.
-
Beispiel 3 Ein Vergleich
des Glucans, das nach dem Verfahren des Stands der Technik produziert
wurde (Alkali-Säure),
mit dem Glucan-Mannan, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung-produziert
wurde (autolytisch und enzymatisch).
-
Zum Zwecke des Vergleichs wurde unter
Verwendung eines Verfahrens der Extraktion mit Alkali-Säure, basierend
auf dem von Manners, D. J., et al., Biochemical Journal 135 19–30 (1973),
eine Probe von gereinigtem β-(1-3)-Glucan
hergestellt.
-
1 Liter verbrauchte Brauhefe (20%
Trockengewicht) wurde mit einem gleichen Volumen Natriumhydroxid
(4% Gew./Vol.) bei 100°C
3 Stunden unter Rühren
extrahiert, um die Mannoproteine zu entfernen. Das Material wurde
zentrifugiert (3.000 g, 15 Minuten bei 4°C), der Überstand verworfen und das
Pellet 4 weitere Male mit Natriumhydroxid (4% Gew./Vol.) extrahiert.
Das Sediment des letzten basischen Extraktionsschritts wurde zweimal
mit Wasser (21) gewaschen und mit Essigsäure (0,15 M) 3 Stunden unter
Rühren
bei 100°C extrahiert,
um Glycogen zu entfernen. Das Material wurde zentrifugiert (3.000
g, 15 Minuten bei 4°C),
und der Säure-Extraktionsschritt
wurde 3 weitere Male wiederholt. Das Sediment vom letzten Säureschritt
wurde zweimal mit Wasser (21) und dann mit 150 ml Ethanol (96% Vol./Vol.)
gewaschen. Das Material wurde vor der Sprüh- oder Gefriertrocknung zentrifugiert
(3.000 g, 15 Minuten bei 4°C).
-
Das unter Verwendung des Verfahrens
des Stands der Technik hergestellte Material (vorstehend beschrieben)
oder kommerziell verfügbare
Proben von Glucan, die mittels der Alkali-Säure-Extraktion hergestellt worden
waren, wurden mit dem Glucan verglichen, das gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellt worden war.
-
Unmittelbare Analyse wurde gemäß der offiziellen
Analyseverfahren der Association of Official Analytical Chemists,
Verfahren 27.8.04, 27.6.08, 32.1.14 (mod), 27.8.05, Sechzehnte Aushabe,
1995, durchgeführt.
Die Resultate dieser Analysen sind in Tabelle 1 dargestellt.
-
Tabelle 1
-
Ein Vergleich von Glucanen, die gemäß dem Alkali-Säure-, dem
autolytischen und dem enzymatischen Verfahren produziert wurden:
-
-
Von dem Glucan, das gemäß dem Verfahren
des Stands der Technik produziert worden war (Alkali-Säure), wurde
gezeigt, dass es weniger Protein und mehr Kohlenhydrate im Vergleich
zu Proben hatte, die gemäß dem vorliegenden
Verfahren produziert worden waren, wie in Tabelle I gezeigt.
-
Fourier-transformierte Infrarot (FTIR)-Spektren
der Glucanpräparate
wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Spectrophotometers gemessen.
Die Proben wurden gefriergetrocknet, um jegliche verbliebene Feuchtigkeit
zu entfernen, in Tetrachlorethylen aufgeschlämmt und unter Verwendung einer
Zelle mit horizontaler gedämpfter
Gesamtreflektion (ATR) analysiert. Das vollständige Spektrum ist in 1 gezeigt.
-
Die FTIR-Spektren von Proben, die
gemäß dem Stand
der Technik hergestellt worden waren (Alkali-Säure), unterschieden sich von
den Spektren von Proben, die gemäß dem vorliegenden
Verfahren hergestellt worden waren (autolytisch oder enzymatisch,
wie in 1 gezeigt). Den
Proben, die gemäß dem Stand der
Technik hergestellt worden waren, fehlte eine starke Absorption
bei 2955 bis 2855 cm1 (Zeichen für gesättigte Fettsäuren), 1744
cm1 (Zeichen für Glycoside), 1650 cm1 (Zeichen für Protein). Die Spektren der
Glucanprobe, die gemäß dem Stand
der Technik hergestellt worden waren (Alkali-Säure), waren ähnlich den
Spektren eines gereinigten β-Glucan-Präparats mit
einer starken Absorption in der Bande bei 950 cm1.
-
Die Menge an Glucan und Mannan in
den Proben, die gemäß dem Verfahren
des Standes der Technik (Alkali-Säure) und gemäß dem vorliegenden
Verfahren (autolytisch und enzymatisch) hergestellt worden waren,
wurden durch selektive Extraktion und kolorimetrische Analyse (basierend
auf Stewart, P. R., Methods In Cell Biology XII 111–145 (1975))
bestimmt. Die Glucanproben, die gemäß dem herkömmlichen Verfahren hergestellt
worden waren, enthielten wenig Mannan im Vergleich mit den Proben,
die gemäß dem vorliegenden Verfahren
hergestellt worden waren, wie in Tabelle II gezeigt.
-
Die Proben wurden auch hydrolysiert
und mittels Gaschromatographie analysiert, um die Zuckerkomponenten
zu identifizieren. Die Proben wurden unter Verwendung von 4 M Trifluoressigsäure 4 Stunden
bei 100°C
unter Argon hydrolysiert. Die Säure
wurde durch Verdampfen unter einem Stickstoffstrom entfernt, wonach
die Proben, wie in Harris P. J. et al., Carbohydrate Research 127
59–73
(1984) beschrieben, reduziert und acetyliert wurden. Die Hydrolysate
wurden mittels Gaschromatographie auf einer BPX70-Säule unter
Verwendung des Flammen-Ionisations-Nachweises analysiert. Die Injektor-
und Detektor-Temperatur waren 280°C
bzw. 300°C.
Der Ofen wurde 1 Minute auf 185°C
gehalten, und dann wurde die Temperatur mit 3°C pro Minute auf 260°C angehoben
und 5 Minuten auf der Endtemperatur gehalten.
-
Die Glucanproben, die gemäß dem Stand
der Technik hergestellt worden waren, zeigten Peaks, die nur Glucose
entsprachen, was anzeigt, dass die Kohlenhydratkomponente hauptsächlich Glucane
waren, wie in Tabelle II gezeigt. Proben, die gemäß dem vorliegenden
Verfahren hergestellt worden waren, enthielten Glucose ebenso wie
erhebliche Mengen an Mannose-Zuckern, was anzeigt, dass die Kohlenhydratkomponente ein
Gemisch aus Mannanen und Glucanen war. Unlösliche β-(1-3)-Glucane sind auch relativ
resistent gegen Säurehydolyse
im Vergleich mit Mannan: daher unterbewertet das Verfahren der Gaschromatographie
die Konzentration an Glucose (und damit Glucan) im Vergleich mit
dem kolorimetrischen Verfahren.
-
Tabelle II
-
Ein Vergleich von Glucanen, die gemäß dem Alkali-Säure- und
dem autolytischen und dem enzymatischen Verfahren produziert wurden: Kohlenhydrat-Analyse
-
Die Arten von Bindungen zwischen
den Glucoseresten in den Glucanproben, die unter Verwendung des
Verfahrens der Alkali-Säure-Extraktion
und des vorliegenden Verfahrens (autolytisch und enzymatisch) hergestellt
worden waren, wurden unter Verwendung eines Verfahrens, basierend
auf dem von Harris P. J. et al., Carbohydrate Research 127 59–73 (1984),
mittels der Methylierungsanalyse bestimmt.
-
Die Resultate in Tabelle III zeigen,
dass die Probe, die mittels des Alkali-Säure-Verfahrens hergestellt worden war, vor
allem aus (1-3)-verknüpfter
Glucose bestand im Vergleich zu den Proben, die mittels des Verfahrens
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt worden waren.
-
Tabelle III
-
Ein Vergleich von Glucanen, die gemäß dem Alkali-Säure-, dem
autolytischen und dem enzymatischen Verfahren produziert wurden: Verknüpfungs-Analyse
-
Die Glucanproben wurden unter Verwendung
eines Mausmodells auf ihre biologische Aktivität getestet. Das Material, das
durch jedes der drei Verfahren produziert wurde, hatte ein Partikelgröße von vorwiegend 100–300 Mikrometer.
Das getrocknete Material wurde in einer Perlmühle zu einem Partikeldurchmesser
von < 20 Mikrometer
gemahlen und wurde verwendet, um es Mäuse intraperitoneal zu injizieren
(2mg/Maus). Nach 72 Stunden wurden die Zellen, die in das peritoneale
Exsudat induziert worden waren, von der Bauchhöhle geerntet, mit Hitze-getöteten Hefezellen
inkubiert und der Anteil an phagocytischen Zellen berechnet.
-
Das Material, das gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt worden war (autolytisch oder enzymatisch),
ist bei der Induktion einer unspezifischen Immunanwort wirksamer
als das Material, das gemäß dem Verfahren
der Alkali-Säure-Extraktion
hergestellt worden war, wie gezeigt durch einen Anstieg bei der
Zahl der Zellen in der Bauchhöhle
aufgrund einer chemotaktischen Wirkung des injizierten Materials,
das Entzündungszellen
anzieht, und einen Anstieg bei der Zahl der phagocytischen neutrophilen
Zellen und Macrophagen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt.
-
Tabelle IV
-
Ein Vergleich von Glucanen, die gemäß dem Alkali-Säure- und
dem autolytischen und dem enzymatischen Verfahren produziert wurden:
-
Fähigkeit
der Induktion von phagocytischen Zellen
-
Ohne an irgendeinen vorgeschlagenen
Mechanismus für
den beobachteten nützlichen
Effekt gebunden sein zu wollen, glauben wir, dass Mannan und nicht-β-(1-3)-verknüpftes Glucan
synergistisch mit dem fibrillären β-(1-3)-verknüpften Glucan
zusammenwirken können,
um eine bessere Immunantwort zu produzieren.
-
Beispiel 4 Die Verbesserung
der Potenz der Glucan-Mannan-Herstellung durch Ansäuern.
-
1 Liter verbrauchte Brauhefe (15%
Trockengewicht) wurde mit dem enzymatischen Verfahren von Beispiel
1 behandelt. Eine Teilmenge des Sediments wurde gefriergetrocknet.
Der pH-Wert des verbleibenden Sediments wurde entweder mit Salzsäure oder
mit Essigsäure
auf 2 bis 4 eingestellt, und dann wurde das Sediment entweder gefriergetrocknet
oder bei 80°C
im Ofen getrocknet. Die Zuckerbindungen wurden mittels GC-MS analysiert,
wie in Beispiel 3 beschrieben.
-
Das Glucan-Mannan-Material wurde
auf < 20 Mikrometer
gemahlen; und auf seine Fähigkeit
getestet, phagocytische Zellen zu induzieren, wie in Beispiel 3
beschrieben. Die Resultate in Tabelle V zeigen, dass Ansäuern, gefolgt
von Trocknen im Ofen, die Wirksamkeit des Glucan-Mannans bei der
Stimulierung der Immunantwort erhöhte und dass Ansäuern, gefolgt
von Hitzebehandlung, einige der β-(1-6)-Bindungen
im Glucan aufbricht und damit vielleicht mehr aktive Stellen im
mikrofibrillären
Glucan freilegt.
-
Tabelle
V
Wirkung der Hitzetrocknung von angesäuertem Material
-
Beispiel 5 Die Verbesserung
der Wirksamkeit der Glucan-Mannan-Herstellun durch Veränderung
der Partikelgrgöße.
-
Es ist bekannt, dass die Potenz einiger
Materialien durch Veränderung
der Partikelgröße signifikant verändert werden
kann. 1 Liter verbrauchte Brauhefe (10% Trockengewicht) wurde mit
dem enzymatischen Verfahren von Beispiel 1 behandelt. Das endgültige Sediment
wurde in Wasser suspendiert (20% Trockengewicht). In diesem Stadium
erschien das Glucan-Mannan-Material mikroskopisch als diskrete Kügelchen
von etwa 4 bis 6 Mikrometer Durchmesser. Eine Teilmenge des suspendierten
Sediments wurde 6 Minuten in einem Braun-Zellhomogenisator unter
Verwendung von Glaskügelchen
behandelt, die im Durchmesser der Kügelchengröße von 0,25 bis 1 nun variierten.
Dies zerbrach die Glucanteilchen in Partikel von einer Größe von unter
2 Mikrometer und resultierte in einem hoch viskosen Produkt mit
der Konsistenz von Schlagsahne. Wenn das Produkt mit dem in Beispiel
3 beschriebenen Verfahren getestet wurde, zeigte es eine gute Fähigkeit
zur Stimulierung der unspezifischen Immunantwort.
-
In einer Abänderung des Verfahrens wurden
frisch geerntete Hefezellen in einer Perlmühle gemahlen, um die Zellen
aufzubrechen. Während
oder nach der Mahlphase wurden die Hefezellen unter Verwendung ähnlicher
Bedingungen wie den in Beispiel 1 oder 2 beschriebenen der Autolyse
und dem enzymatischen Verdau unterworfen. Das unlösliche Material
wurde mittels Zentrifugation geerntet und unter Verwendung des Mausmodells
auf biologische Aktivität
getestet. Die Resultate sind in Tabelle VI zusammengestellt.
-
Tabelle
VI
Wirkung der Veränderung
der Glucanpartikelgröße
-
Für
das Aufbrechen der Hefe- oder Glucanpartikel kann eine Reihe von
anderen Naßmahlverfahren und
anderer Ausrüstung
verwendet werden. Diese umfassen Druckhomogenisierung (Manton Gaulin),
Perlmahlen und Kugelmahlen (Dyno-Mühle, Drais-Mühle,
Netzsch-Mühle),
sind aber nicht beschränkt
darauf.
-
Beispiel 6 Die Verbesserung
der Wirksamkeit der Glucan-Mannan-Herstellun durch Veränderung
der Natur der verwendeten Enzyme.
-
Eine frische Hefeaufschlämmung (16,5%
Trockengewicht) wurde mit Wasser gewaschen und dann 17 Stunden bei
50°C unter
Rühren
inkubiert. Die autolysierte Hefe wurde 30 Minuten auf 100°C erhitzt
und dann in zwei Teilmengen aufgeteilt.
-
Eine Teilmenge wurde mit Enzymen
von Solvay behandelt. Die Hefe wurde 2 Stunden bei 47°C und pH-Wert
9 mit 1% Gew./Gew. Optimase APL-440 (ein proteolytisches Enzym)
unter Rühren
behandelt. Der pH-Wert wurde dann auf 7,5 abgesenkt und 1% Gew./Gew.
-
Tunicase FN (Glucanase)-Enzym zugegeben.
Nach 6 Stunden Inkubation wurde 1% Optidex (Glucoamylase) zugegeben,
und das Gemisch wurde weiterhin 6 Stunden bei 60°C und pH-Wert 4,5 inkubiert. Es wurde ein viskoses
Sediment erhalten. Das Sediment wurde gefriergetrocknet und mit
einer Kugelmühle
gemahlen.
-
Die zweite Teilmenge wurde mit Enzymen
von Novo inkubiert. Die Hefe wurde 6 Stunden mit 1% Gew./Gew. BAN
(Glucoamylase)- und 1% Gew./Gew. Mutanase SP299 (Glucanase)-Enzym
bei einem pH-Wert von 5,5 unter Rühren inkubiert. 1% Protomex
(ein proteolytisches Enzym) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde
weitere 16 Stunden bei 55°C
und pH-Wert 5,5 inkubiert.
-
In einem anderen Experiment wurde
das gemäß Beispiel
1 hergestellte Glucan-Mannan mit 1% Gew./Gew. Tunicase behandelt
(6 Stunden bei pH-Wert 7,5 und 35°C).
Das mit Tunicase behandelte Glucan-Mannan erhöhte die Viskosität. Der Herstellung
wurde zentrifugiert und das Sediment gefriergetrocknet und gemahlen.
Der Überstand
des mit Tunicase behandelten Glucans wurde ausführlich gegen destilliertes Wasser
dialysiert und gefriergetrocknet.
-
Die Arten von Verknüpfungen
zwischen den Glucoseresten in den Glucanproben wurde, wie in Beispiel
3 beschrieben, analysiert. Die biologische Aktivität wurde
unter Verwendung des Mausmodells auch . getestet. Die Resultate
sind in Tabelle VII gezeigt, welche zeigt, dass Enzyme verwendet
werden können,
um die Natur des Glucanpräparats
zu verändern.
So resultiert die Behandlung mit Tunicase (Solvay) zum Beispiel
in einem viskosen Produkt mit reduzierten β-(1-6)-Bindungen in dem Glucanpräparat. Enzyme
können
auch verwendet werden, um eine biologisch aktive lösliche Form
von Glucan zu produzieren.
-
Tabelle
VII
Wirkung der Enzymaktivität
-
Beispiel 7 Die Veränderung
der Viskosität
der Glucan-Mannan-Herstellung
-
Die Viskosität des Glucan-Mannans, hergestellt
wie in Beispiel 2 beschrieben, kann auch durch Ansäuern (Beispiel
4), durch Mahlen (Beispiel 5) und durch Veränderung der Art des verwendeten
Enzyms (Beispiel 6) verändert
werden. Die Viskosität
wurde unter Verwendung eines CSL100-Rheometers mit Platten von 60
mm gemessen. Die Messungen wurden bei 20°C bei einer Scherrate von 100/s
und unter Verwendung einer 10%-igen Gew./Vol. Glucansuspension vorgenommen,
und die Resultate sind in Tabelle VIII zusammengestellt.
-
Tabelle
VIII
Die Veränderung
der Viskosität
der Glucan-Mannan-Herstellung.
-
Daher kann die Viskosität der Glucan-Mannan-Herstellung
mittels Hitze, Säure,
Enzymen und durch Veränderung
der Partikelgröße verändert werden,
um ein viskoses Material zu produzieren. Dieses kann als Creme,
Gel oder dergleichen verwendet werden.
-
Beispiel 8 Wirksamkeit der Glucan-Mannan-Herstellung
als Immunverstärker
in Fischen
-
Regenbogenforellen (Oncorhynchus
mykiss) wurden von einer kommerziellen Farm in Victoria erhalten.
Die Fische hatten ein durchschnittliches Körpergewicht von 13 g und wurden
auf 6 experimentelle Tanks von 260 1 mit 12 Fischen pro Aquarium
verteilt. Die Fische wurden 7 Tage akklimatisiert, bevor das Experiment begann.
-
Es wurden Standardpellets für Forellen
verwendet, und die Fische wurden zweimal täglich mit etwa 5% ihres Körpergewichts
pro Tag gefüttert.
Die Glucan-Mannan-Herstellung wurde in das Futter eingebracht und
ergab eine Endkonzentration von 0,1% Gew./Gew. im endgültigen Futter.
Das gesamte Futter einschließlich
des Kontrollfutters wurde erneut in Pellets geformt und bei 50°C getrocknet.
Nach drei Wochen Fütterung wurden
die Fische mit Benzococain (1 : 10.000) betäubt und getötet.
-
Die Vornieren wurden in Gewebekulturmedium
gegeben, das 1 Einheit Heparin pro ml enthielt. Das Gewebe wurde
durch ein Edelstahlsieb mit der Maschengröße 80 passiert, um einzelne
Zellen zum isolieren. Die Zellsuspensionen wurden mit Dulbecco modifiziertem
Eagles-Medium (DMEM) (Gibco Laboratories) gewaschen. Die Zellen
wurden einem Nitroblau-Tetrazolium-Test, um die Produktion des Superoxid-Anions
nachzuweisen (basierend auf Rook, J., et al., J. Immunol. Methods
82 161–167
(1985)), und einem Phagocytose-Test unterworfen, um die Fähigkeit
der Macrophagen zu bestimmen, die Hefezellen zu phagocytieren.
-
Bei dem Glucan-Mannan, das wie in
Beispiel 2 beschrieben produziert wurde, wurde gefunden, dass es
die Phagocytose-Aktivität
und die Produktion des Superoxid-Anions in Zellen erhöhte, die
von der Vorniere von Regenbogenforellen isoliert worden waren, wie
in Tabelle IX gezeigt. Die Daten zeigen, dass Glucan-Mannan, das
wie in Beispiel 2 beschrieben produziert wurde, das Immunsystem
in Regenbogenforellen stimulieren kann.
-
Tabelle
IX
Wirksamkeit als Verstärker
der Immunantwort in Fischen
-
Beispiel 9 Fähigkeit
der Glucan-Mannan-Herstellung zur Reduktion der Sterblichkeit bei
Fischen
-
Regenbogenforellen von weniger als
einem Jahr (Oncorhynchus mykiss) wurden von einer kommerziellen
Farm in Tasmanien erhalten. Sie hatten ein durchschnittliches Körpergewicht
von 65 g. Die Fische wurden auf 6 isolierte Aquarien mit 16 Fischen
in jedem Aquarium verteilt. Die Fische wurden bei einer Lufttemperatur
von 15°C
und einer Wassertemperatur von 13–18°C gehalten und wurden 7 Tage
akklimatisiert, bevor das Experiment begann.
-
Die Fische wurden täglich bis
zur Sättigung
mit Gibson-Forellenpellets mit etwa 2,5% des Körpergewichts pro Tag gefüttert. Die
Glucan-Herstellungen (entweder gemäß Beispiel 2 hergestelltes
Glucan oder unter Verwendung des Alkali/Säure-Extraktionsverfahrens produziertes
Glucan) wurden in eine 5%-ige Gew./Gew. Gelatinelösung eingebracht
und die Pellets damit beschichtet, um in dem endgültigen Futter
eine Konzentration von 0,1% Gew./Gew. Glucan bereitzustellen. Die
an die Kontrollfische verfütterten
Pellets wurden nur mir Gelatine beschichtet. Das folgende Fütterungsschema
wurde verwendet: 14 Tage mit ergänztem Futter,
gefolgt von 42 Tagen mit nicht ergänztem Futter, und dann noch
einmal 14 Tage mit ergänztem
Futter. Eine Woche nach der zweiten Periode der Ergänzung wurden
die Fische mit Vibrio anguillarum herausgefordert.
-
Es wurde ein Tasmanischer Stamm von
V. anguillarum Serotyp C (äquivalent
zu Serotyp 01) verwendet (Munday, B., et al., Immunology and Cell
Biology 70 391–397
(1992)). Der Organismus wurde in einem Nährbrühenmedium gezüchtet, das
mit 2% NaCl ergänzt
wurde.
-
Die Fische wurden mit V anguillarum
durch intraperitoneale Injektion des Organismus mit 3 × 107 UBE (LD50-Dosis)
herausgefordert und wurden 10 Tage mindestens zweimal täglich beobachtet.
Von allen Fischen, die starben, wurde V. anguillarum gezüchtet.
-
Die Todesfälle traten während der
drei Tage nach der Inokulation ein. Am 3. oder 4. Tag nach der Inokulation
waren viele in den Kontrollgruppen lethargisch und hatten Hyperaemie
an der Basis der Flossen und am Bauch, obgleich in dieser Gruppe
keine weiteren Todesfälle
beobachtet wurden.
-
Nach der Herausforderung mit V. anguillarum
war die Schutzwirkung des Glucans gemäß der Erfindung offensichtlich.
Ein Glucan, das unter Verwendung des Verfahrens der Alkali-Säure-Extraktion
hergestellt worden war, war weniger wirksam, wie in Tabelle X gezeigt.
-
Tabelle
X
Fähigkeit
von Glucan-Mannan zur Reduktion der Sterblichkeit von Fischen
-
Die Resultate zeigen, dass das Glucan-Mannan,
das wie in Beispiel 2 beschrieben produziert wurde, verwendet werden
kann, um die Resistenz von Regenbogenforellen gegen eine Infektion
mit Vibrio anguillarum zu verbessern, und einer Herstellung von
Glucan gemäß dem Stand
der Technik überlegen
ist.
-
Beispiel 10 Fähigkeit
der Glucan-Mannan-Herstellung zur Reduktion der Sterblichkeit in
der Garnele Penaeus monodon
-
5–10 g P. monodon-Garnelen wurden
von einer Farm in Queensland erhalten. 12 Garnelen wurden in 12
Aquarien von 60 l gewogen. Die Garnelen wurden 5 Tage in den Aquarien
akklimatisiert und dann mit Kontrollfutter oder Futter zur Behandlung
gefüttert.
Nach 23 Tagen wurde den Garnelen eine LD50-Dosis
Vibrio harveyi injiziert. Die Todesfälle wurden 7 Tage aufgezeichnet.
Während
dieses Zeitraums wurden die Garnelen mit dem Kontrollfutter oder
Futter zur Behandlung gefüttert.
-
Alle Garnelen wurden mit einem mit
Dampf pelletierten Standardfutter (CP 100) gefüttert. Glucan-Mannan gemäß der vorliegenden
Endung wurde zu dem Futter zur Behandlung durch Adhäsion mit
Gelatine an der Oberfläche
der Pellets zugegeben. Es wurde eine Lösung mit etwa 5% Gew./Vol.
Gelatine hergestellt und dem Kontrollfutter mit der Rate von 100ml/kg
Pellet beigemischt. Die für
das Futter zur Behandlung verwendete Gelatinelösung enthielt genug Glucan-Mannan,
das gemäß Beispiel
2 hergestellt worden war, oder ein Glucan, das unter Verwendung
des Verfahrens der Alkali-Säure-Extraktion
produziert worden war, um eine Endkonzentration von 0,1% Gew./Gew.
in dem endgültigen
Futter sicherzustellen. Die Fütterungsrate
war 6,5 bis 5% des Körpergewichts
der Garnelen/Tag.
-
Ein pathogener Stamm von V. harveyi,
Stamm 656, isoliert aus einer sterbenden P. esculentus-Garnele,
wurde für
die Herausforderungsuntersuchungen verwendet. Die Bakterien wurden
bei 26–28°C übernacht in
Seawater Liquid Broth mit Vitaminen subkultiviert. Die Zellen wurden
dreimal mit 0,73%-iger Gew./Vol. Salzlösung mit 30 Minuten Zentrifugation
bei 2.000 UpM und 40°C
gewaschen. Bei jedem Schritt wurde mit einem Vortexgerät gemischt.
Es wurden serielle Verdünnungen
der Bakteriensuspension hergestellt, und jede Verdünnung wurde
in nicht behandelte Garnelen injiziert, um die LD50-Dosis
zu berechnen. Von jeder seriellen Verdünnung wurden 0,1 ml mit 25
ml Marine Agar mit Vitaminen (MAV) bei 42°C gemischt und in Petrischalen gegossen.
Nach 24 Stunden bei 26–28°C wurden
die Kolonien gezählt,
und die Zahl an Bakterien in jeder der Inokulationssuspensionen
wurde berechnet. Die gegossenen Platten wurden verwendet, um die
Zahl an Bakterien in dem Injektionsvolumen von 0,05 ml zu berechnen.
-
Der V. harveyi-Stamm 656, injiziert
mit einer Dosis von 1 – 2 × 10
5 in 0,05 ml, wurde letztlich für die LD
50-Herausforderung ausgewählt. Den Garnelen wurde in
die zweite abdominale Sektion injiziert. Die Sterblichkeit wurde
für die
nächsten
sieben Tage täglich
festgehalten, der Sterblichkeitsprozentsatz wurde wie folgt berechnet:
A = Sterblichkeit nach Tag
1.
-
Die Leistungsfähigkeit und die Gesundheit
der Garnelen wurden im Fütterungszeitraum
vor der Herausforderung mit V. harveyi aufgezeichnet. Während es
keine signifikante Wirkung beim Wachstum gab, hatten die Garnelen,
die mit dem Glucan-Mannan gefüttert
wurden, das wie in Beispiel 2, beschrieben hergestellt wurde, einen
besseren Appetit, waren lebendiger und zeigten eine niedrigere Sterblichkeitsrate.
-
Nach der Herausforderung mit V. harveyi
wurde die Schutzwirkung des Glucans der Erfindung evident. Glucan,
das gemäß dem Alkali-Säure-Verfahren
hergestellt worden war, war weniger wirksam, wie in Tabelle XI gezeigt.
-
Tabelle
XI
Reduktion der Sterblichkeit in Garnelen
-
Das Glucan-Mannan, das wie in Beispiel
2 beschrieben hergestellt wurde, kann daher verwendet werden, um
erfolgreich die Krankheitsresistenz der Garnele P. monodon zu verbessern.
-
Beispiel 11 Fähigkeit
der Glucan-Mannan-Herstellung zur Verbesserung Krankheitsresistenz
in Geflügel
-
240 Hühner zum Braten gemischten
Geschlechts wurden auf 4 verschiedene Futterbehandlungen verteilt.
Die einen Tag alten Küken
für Brathühnchen wurden
in zwei Batteriebrütern
untergebracht und gleichmäßig auf
die 24 Abteile mit 10 Küken
pro Abteil verteilt. Die Küken
wurden entweder mit einem kommerziellen Standardfutter ohne medizinische
Zusätze
(Kontrolle) oder einem Standardfutter mit dem Futter zu lg/kg Futter zugesetztem
Glucan-Mannan gefüttert.
Das Glucan-Mannan wurde gemäß dem Verfahren
von Beispiel 2 oder Beispiel 5 (Enzymwirkung während oder nach dem Mahlen)
hergestellt. Den Küken
wurde das Futter zwischen dem Alter von einem Tag und 21 Tagen ad
libitum angeboten. Die Wachstumsraten wurden in wöchentlichen Abständen aufgezeichnet.
-
Beim Abschluß der Fütterungsversuche wurde 18 Vögeln von
jeder Behandlung Blut entnommen. Das Blut wurde in mit Heparin versetzten
Röhrchen
gesammelt und zweimal mit PBS gewaschen. Die bakterizide Aktivität von zirkulierenden
Blutleukocyten wurde durch Isolierung von Leukocyten aus einer kleinen
Blutprobe und Inkubation mit einer lebenden Suspension von Staphylococcus
aureus bewertet. Nach der Inkubationszeit von 1 Stunde wurden die
Blutzellen lysiert, und die Zahl an lebenden Bakterien wurde gemessen.
-
20 andere Vögel von jeder Behandlung wurden
in Blasenisolatoren gegeben, mit einer Behandlungsgruppe pro Isolator.
Kotabstriche, die bei jedem Vogel gemacht wurden, bestätigten,
dass die Vögel
frei von Salmonellen waren. Das Futter wurde bestrahlt, um sicherzustellen,
dass es frei von Salmonellen war. Die Vögel wurden oral mit einem gentechnischen
Stamm von Salmonella typhimurium (nalidixinsäureresistent) inokuliert. Fünf Vögel von
jeder Behandlung wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet und
aus dem Verdauungstrakt wurde die Zahl an Salmonellen festgestellt.
Die Resultate sind in Tabelle XII und Tabelle XIII zusammengefaßt.
-
Tabelle
XII
Wirkung der Glucan-Mannan-Herstellung auf die Gesundheit
von Geflügel:
Wachstumsraten
und Monocytenaktivität
-
Tabelle
XIII
Herausforderungsversuche : Salmonellen-Kolonisation
-
Tabelle XII zeigt, dass Glucan-Mannan
eine 2–3%-ige
Verbesserung bei den Wachstumsraten erreichte. Die Glucan-Mannan-Herstellung
erhöht
die Immunantwort in Küken
für Brathühnchen und
erhöht
die Fähigkeit,
Infektionen zu widerstehen, während
Tabelle XIII zeigt, dass die Zugabe von Glucan-Mannan zum Futter
das Auftreten und das Ausmaß der
Kolonisation durch Salmonellen in Küken für Brathühnchen signifikant reduziert.
-
Beispiel 12 Funktionelle
Getränke
-
Die Glucan-Mannan-Herstellung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann zu Getränken
oder Essen (z. B. Yoghurt) zugegeben werden, um die Gesundheit von
Menschen zu verbessern, die zu Infektionen neigen, wie immunologisch
beeinträchtigte
Individuen, Athleten in intensivem Training und Personen mit einem hektischen
Lebensstil oder die an Problemen mit dem Verdauungstrakt leiden.
Eine geeignete Formulierung zur Verwendung als ein nicht alkoholisches
Getränk
ist:
25% Saftgehalt von Karotten, Tomaten und/oder Orangen
1%
(Gew./Vol.) Glucan-Herstellung
-
Zusammenfassend
-
- (i) Unser Verfahren zur Produktion einer partikulären Glucan-Herstellung,
die Mannan enthält
und mit einer immunstimulierenden Aktivität, unterscheidet sich erheblich
von bisher bekannten Verfahren, die auf Extraktion mit Alkali-Säure, Phenol
: Wasser oder Lösungsmittel
beruhen.
- (ii) Das Glucan-Mannan-Material, das mit unserem Verfahren produziert
wird, ist weniger rein als dasjenige, das mit dem Verfahren der
Extraktion mit Alkali-Säure
produziert wird, es ist jedoch wirksamer bei der Stimulierung einer
unspezifischen Immunantwort in Mäusen.
- (iii) Die Aktivität
des Glucan-Mannan-Materials kann durch Ansäuern des Materials vor der
Hitzetrocknung verbessert werden.
- (iv) Die Viskosität
und die biologische Aktivität
des Glucan-Mannan-Materials kann durch Veränderung der Partikelgröße, Säurebehandlung
und Enzymbehandlung signifikant verändert werden.
-
Das Glucan-Mannan-Material der vorliegenden
Erfindung ist in einer Reihe von Gebieten von Nutzen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf:
- i) Aquakultur. Um die Resistenz von Knochenfischen
und Crustaceae bei verschiedenen über das Wasser übertragenen
Infektionen zu erhöhen.
Das Glucan-Material kann in zubereitetem Fischfutter verabreicht werden.
- ii) Tierische Landwirtschaft: Das Glucan-Material kann den Tieren
und dem Geflügel
in Viehfutter, Haustierfutter und in einer flüssigen Form verabreicht werden.
- iii) Tiermedizinische und medizinische Anwendungen: Das Glucan-Mannan-Material kann als
eine topische Creme oder ein topischer Film für die Wundheilung oder es kann
oral, intranasal oder mittels parenteraler Injektion verabreicht
werden.
- iv) Als ein Lebensmittelzusatzstoff:: Hefezellwandmaterial,
das als Nebenprodukt produziert wird, ist bereits ein zugelassener
Lebensmittelzusatzstoff als ein Verdickungsmittel oder zur Bereitstellung
von Nahrungsfasern in Salatsoßen,
Suppen, Aufstrichen, Soßen
usw., und ist von Nutzen in "funktionellen" Lebensmitteln und
Getränken,
um Resistenz gegen Krankheit zu vermitteln.
- v) Kosmetika: in Cremes und Lotionen, um zum Beispiel Sonnenbrand
zu reduzieren und in Formulierungen für die empfindliche Haut.
- vi) Pharmazeutika: Als Wundheilungsmittel, als anti-Krebsmittel,
als anti-Infektionsmittel
bei immunsupprimierten Patienten oder Patienten, die sonst zu Infektionen neigen.
Das Produkt der Erfindung kann in Cremes, Lotionen, Tabletten, Mundwasser
verwendet werden oder das Material kann zu einem Film getrocknet
werden zur Verwendung als Verband bei Verbrennungen. Es kann als
Adjuvans mit Impfstoffen, Antibiotika oder anderen pharmazeutischen
Präparaten
verwendet werden.
-
Es ist klar zu verstehen, dass das
Glucan-Mannan-Produkt der Endung bei den Anwendungen von β-Glucanen
einsetzbar ist, die im Stand der Technik beschrieben wurden. Es
wird dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich
sein, dass, während
die Erfindung zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses
etwas detailliert beschrieben wurde, bei den Ausführungsformen
und Verfahren, die hier beschrieben werden, verschiedene Modifikationen
und Veränderungen
vorgenommen werden können,
ohne den Umfang des erfinderischen Konzepts zu verlassen, das in
dieser Beschreibung offenbart wird.