KR20180019089A - 알파(1 에서 4)-결합된 글루코오스 중합체의 아밀라아제-매개성 가수분해를 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

알파(1 에서 4)-결합된 글루코오스 중합체의 아밀라아제-매개성 가수분해를 억제하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

PAZ320은 두 가지 갈락토만난 (GMa와 GMPβ)의 혼합물로서, 당뇨병과 염증성 질환을 치료하기 위해 개발중이다. GMα와 GMβ 둘다 고밀도의 α(1→ 6) 연결된 갈락토오스 유닛의 함께 β (1→ 4) 만난 백본을 가지고 있다. 당뇨병 환자에 의해 섭취될 때 PAZ320은 식후 글루코오스 변동의 크기를 줄인다. PAZ320은 위장관에서 녹말을 가수 분해하는 효소에 결합함으로써 글루코오스와 같은 저 분자량 당의 정상 상태 농도를 감소시키는 기능을 한다. PAZ320은 사람과 돼지 공급원으로부터의 α-아밀라아제 효소와 결합함으로써 α(1→4)-결합된 글루코오스 중합체 (녹말과 말토헥사오스)의 아밀라아제-매개 가수분해의 속도를 감쇠시킨다. 본 발명자들은 2.5 mg/ml의 PAZ320가 녹말과의 아밀라아제 활성도를 약 45% 까지 저해하는 것을 발견하였는데, 이는 0.13 mg/ml에서의 아카보스의 수준에 필적하는 저해 수준이다. 더욱이, 본 발명자들은 PAZ320의 GMα 성분이 GMβ보다 약 5배 더 활성임을 발견하였다. 두가지 GM은 또한 아밀라아제에 대한 억제 효능에는 영향을 미치지 않으면서 녹말의 코일 모양의 구조를 "펼치는" 작용을 한다. 한편, 시험관내에서 GMα로부터의 억제 효과의 일부는 용액 점도 증가에 대한 그것의 영향으로부터 발생한다.

Description

알파(1 에서 4)-결합된 글루코오스 중합체의 아밀라아제-매개성 가수분해를 억제하는 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 No.62/157,630, 표제 "PAZ320가 α(1→4)-결합된 글루코오스 중합체의 아밀라아제-매개성 가수분해를 억제한다"에 대한 우선권을 주장하며, 이것은 사실상 문헌 전체가 본 명세서에 참고로 원용된다.
글루코오스의 α(1→4)-결합 중합체인 녹말은 식품에서 널리 발견되며, 이것은 예를 들어, 빵, 감자 및 쌀 중의 주성분이다. 음식물을 섭취하고 녹말이 소화될 때, 이 복합 탄수화물은 덱스트린과 같은 다양한 더 작은 다당류로 가수분해되어, 말토트리오스 및 말토오스와 같은 작은 당으로 전환되고, 최종적으로는 단당류 글루코오스가 된다. 이러한 소화 과정은 일반적으로 고혈당을 초래하며, 당뇨병 환자에 있어서는 인슐린의 사용을 요구하는 고혈당증으로 이어질 수 있다. 당뇨병이 있는 사람은 상대적으로 더 낮은 양의 탄수화물/녹말이 함유된 음식을 섭취함으로써 혈중 글루코오스 농도를 제어하려고 할 수 있다. 하지만, 이것은 주식으로 쌀을 먹는 아시아처럼 녹말이 많은 식이가 표준인 인구 집단에서는 번거로울 수 있다. 따라서, 당뇨병 환자에게는 더 낮은 농도의 글루코오스를 관리하거나 유지하는데 도움을 줄 수 있는 약제를 투여하는 것이 매우 유용할 것이다.
사실상, 아카보스 (Costa & Pifiol, 1997; Scheen, 1998)와 보글리보스 (Dabhi 외, 2013)는 제2형 당뇨병을 치료하기 위해 이미 임상에서 사용되고 있는 두가지 항-당뇨병 약물이다. 아카보스는 녹말과 같은 더 큰 탄수화물을 가수분해하고 궁극적으로 글루코오스를 방출하는 장내 효소인 a-글루코시다아제의 올리고당 결합 부위에 가역적으로 그리고 경쟁적으로 결합하는, 천연 미생물 가성 4당류(pseudotetrasaccharide)이다. 이들 효소의 억제는 녹말과 같은 복합 탄수화물의 소화 (가수분해)의 속도를 감소시킨다. 이와 관련하여, 탄수화물이 글루코오스 분자들로 분해되지 않기 때문에 글루코오스가 덜 흡수된다. 당뇨병 환자에 있어서, 즉각적인 효과는 혈중 글루코오스 농도(혈당)을 감소시키는 것이다. 하지만, 아카보스는 일반적으로 예를 들어, 설사, 고창(속이 부글거림), 그리고 경우에 따라서 간염 등의 부작용(Lee 외, 2014)을 정당화하기에는 충분하지 않다. 분명히, 추가적인 약제가 개발되어야 한다.
발명의 개요
PAZ320는 당뇨병 환자의 식후 혈당을 감소시키는 식이보충제로 개발되고 있는 또다른 약제이다. PAZ320는 글루코오스-무함유 복합 탄수화물의 혼합물이며, 본질적으로 대략 1 :4 몰비로 혼합된 2가지 갈락토만난의 복합체, 즉, 하나는 페누그리크(fenugreek) (GMα)로부터 또 하나는 구아검 (GΜβ)으로부터 각각 유래한 것들의 복합체이다. 몇가지 연구에서 페누그리크 씨앗이 혈청 글루코오스를 감소시키고 내당능(포도당 내성)을 개선시킴으로써 사람과 동물 모두에서 제 1 형 및 2 형 당뇨병과 관련된 대사 증상을 호전시킬 수 있음을 입증하였으며(Sharma 외, 1990; Gupta 외, 2001), 이는 페누그리크 유래 GMα가 PAZ320의 활성 성분일 수 있음을 시사한다. 최근의 임상 연구에서는, PAZ320가 피실험자의 약 절반에서 글루코오스 수준을 감소시킨 것으로 보고되었다 (Trask 외, 2013). 완전히 확립되지는 않았지만, 제안된 PAZ320의 분자 수준의 작용 메커니즘은 탄수화물, 특히 녹말을 글루코오스로 분해하는 가수분해 효소의 작용을 차단함으로써, 혈류로의 글루코오스의 방출을 감소시킨다.
상기 언급한 바와 같이, 녹말을 가수분해하는 핵심 효소 중의 하나는 α-아밀라아제로서, 타액(침)과 췌장에서 주로 발견되는 효소이다(Maureen 외, 2000, Voet & Voet, 2005). α-아밀라아제가, 아노머 배열을 유지하면서 이중 변위 메커니즘을 통해, 녹말(아밀로오스)의 α (1→4) 글리코시드 결합을 무작위로 절단하여 덱스트린, 말토오스, 또는 말토트리오스를 산출하는 것으로 생각된다. 그다음 글루코시다아제는 예를 들어, 이 당류를 글루코오스로 더 가수분해한다. 여기에서 본 발명자들은 GMα 및/또는 GMβ가 α-아밀라아제와 직접 상호 작용할 수 있는지 그리고 녹말과 말토헥사오스 가수 분해의 속도를 감소시키는 기능을 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 NMR 분광법을 사용하였다.
본 발명의 개시는 본 개시의 실시예의 비 제한적인 예로서 언급된 복수의 도면을 참조하여 이하의 상세한 설명에서 추가로 설명되며, 도면의 여러 도시 전체에서의 동일한 참조 번호는 유사한 부분을 나타낸다;
도면 1은 비색계 아이오딘(요오드) 녹말 분석법을 보여준다. 돼지 췌장 α-아밀라아제 (1 μΜ)에 의해 매개된 녹말 가수분해를 억제하는(1 mg/ml) GMα (패널 A) 및 GMβ (패널)의 유효성이 GMα 및 GMβ의 농도의 함수로서 도시된다. 반응 억제율은 U/ml = (As62 대조군 - As62 샘플)/(As62 녹말 x 20 분 x 0.1 ml 반응 부피)로 (참고 문헌)에 기술된 바와 같이, 아이오딘-녹말 분석으로부터 결정된 U/ml 값을 사용하여 계산되었고, 이는 1 분당 가수분해된 mg 당 녹말로 해석할 수 있는 값이다. "펼쳐진(Unfolded)" 녹말의 비율은 GMα(패널 C)와 GMβ(패널 D)의 존재 하에서 얻은 A562를 GM이 없는 상태에서 얻은 A562로 나눈 것으로서, 효소의 부재하에 계산하였다. 일반적인 용액 조건은 20 mM 인산 칼륨, pH 7, 30℃이다;
도면 2는 용액 점도와, 녹말의 아밀라아제-매개성 가수분해에 대한 글리세롤의 효과를 보여준다. (A) GMα 및 αMβ에 대해 cP 값으로 나타낸 점도는 방법 섹션에서 설명한 바와 같이 그들의 농도(㎎/㎖)의 함수로서 측정되었다. (B) 아이오딘 녹말 분석법은 PPA 및 1 mg/ml 녹말과 함께 사용되어 글리세롤-매개성 용액 점도의 효과를 평가하였다. 글리세롤에 의한 반응 억제율에 대한 값은 글리세롤의 점도에 대해서 플로팅되었다. 동일한 플롯은 GMα에 의한 반응 억제율 대(vs) GMα의 용액 점도에 대해서 도시된다. 일반적인 용액 조건은 20 mM 인산칼륨, pH 7, 30℃ 이다;
도면 3은 아밀라아제가 있을 때와 없을 때, 녹말과 녹말/GMα의 1H NMR 스펙트럼을 보여준다. 아래쪽 궤적은 췌장 a-아밀라아제(1μM)를 첨가하기 전에 녹말 (1mg/ml)의 1 H NMR 스펙트럼 (3.13ppm 에서 4.01 ppm)을 보여준다. 위쪽의 궤적은 GMα(4mg/ml) 첨가 후의 동일한 녹말 용액에 대한 것이다. 녹말은 a(1 74) 결합된 글루코오스의 중합체이며, 이것은 α-아밀라아제에 의해 주로 말토트리오스(MT3), 말토오스(MT2), 및 글루코오스(Glc)로 가수분해 소화되며, 이것의 H2 공명이 도면에 라벨링되어있다. 삽입부는 GMα의 부재(하단 삽입부) 및 GMα의 존재하에(4 ㎎/㎖, 상단 삽입부) 11 시간에 걸쳐 가수 분해가 진행됨에 따라 MT2, MT3 및 Glc H2 공명 강도의 시간-의존적 증가 동안 얻어진 스펙트럼 궤적의 중첩을 보여준다. 강도의 증가는 가수분해 동안 이들 당류의 농도 증가를 반영한다. 일반적인 용액 조건은 20 mM 인산칼륨, pH 7, 30 ℃이다;
도면 4는 아밀라아제-매개 가수분해의 NMR-유도된 겉보기 속도를 나타낸다. (A) 녹말 (1 mg/ml)과의 아밀라아제-매개 반응의 시간 경과 동안 생성된 MT2/MT3의 양이 반응의 초기 기간에 대해 도시되어 있다. 도면에 표시되어 있는 바와 같이, 녹말 단독 그리고 0.5, 1, 2 및 4 mg / ml의 농도로 GMα의 존재하에서의 녹말에 대한 결과가 제시된다. (B) 말토헥사오스 (1 mg/ml)와의 아밀라아제-매개 반응의 시간 경과 동안 생성된 MT2/MT3의 양이 반응의 초기 기간에 대해 도시되어 있다. 도면에 표시되어있는 바와 같이, 말토헥사오스 단독 그리고 1 및 2 m g/ml의 농도로 GMα의 존재하에서의 말토헥사오스에 대한 결과가 제시된다. 일반 용액 조건은 20 mM 인산칼륨. pH 7, 30 ℃ 이다. 생성된 MT2 / MT3의 농도는 공지된 농도의 말토오스 (MT2)의 NMR 스펙트럼을 얻음으로써 생성된 보정 곡선을 사용하여 결정하였다. 이들 곡선의 각각의 기울기는 겉보기 반응 속도의 척도를 효과적으로 제공한다. 이 값은 표 1에 나와있다.
도면 5. GMα의 존재 및 부재하에서 아밀라아제의 1 H NMR 스펙트럼. (A) 사람 타액 아밀라아제 (HSA, 50 μΜ) 단독의 1H NMR 스펙트럼은 하부 궤적으로 도시되어 있고, 1 mg/ml 및 2 mg/ml (최상위 궤적)의 GMα의 존재하에서 HSA (50μΜ.)의 스펙트럼은 이 궤적보다 위에 도시되어 있다. (B) GMα 단독(4 mg/ml)의 1H NMR 스펙트럼은 가장 아래쪽 궤적으로 도시되고, 이어서 돼지 췌장 아밀라아제 (PPA, 50 μΜ) 단독의 스펙트럼과, 그다음은 0.5, 1, 2, 3, 4 mg/ml으로 GMα가 존재할 경우의 PPA (50μΜ)의 스펙트럼(맨 위의 궤적)이 도시된다. 적정 중에 이동하는 일부 공명은 화살표로 표시된다. 일반적인 용액 조건은 20 mM 인산칼륨, pH 7, 30 ℃ 이다;
도면 6은 아카보스 (A)와 GM (B)의 부재 및 존재하에서 돼지 췌장 아밀라아제 (PPA)의 1H NMR 스펙트럼을 보여준다. PPA (50 μΜ) 단독의 1 H NMR 스펙트럼 은 각각의 스펙트럼 세트의 하부 궤적으로 도시된다. 아카보스는 1, 10 및 50 μΜ의 농도로 첨가되었다(A에서 맨 위의 궤적). GM 는 0.5, 1 , 2, 및 4 mg/ml의 농도로 첨가되었다 (B에서 맨 위의 궤적). 적정 중에 이동하는 일부 공명은 화살표로 표시된다. 일반 용액 조건은 20 mM 인산칼륨, pH 7, 30 ℃ 이다;
도면 7은 아카보스와 결합된 돼지 췌장 α-아밀라아제 (PPA)의 X-선 결정 구조(PDB 엑세스 코드 IDHK)를 보여준다. 아카보스와 결합된 사람 췌장 α-아밀라아제 (HPA)의 X-선 결정 구조(PDB 엑세스 코드 10SE)가 PPA의 구조 위에 중첩된다;
도면 8 은 유리 말토오스 및 HPA 와의 반응으로부터 생긴 말토오스에 대하여 가수분해 생성물 말토오스로부터의 몇개의 공명을 보여준다 (PPA에 대한 것과 동일함);
도면 9 는 GM 1 없는 경우 (그리고 그다음 도면들은 녹말: GM 1이 1 : 1 과 1 :4의 몰비로 존재하며 효소가 있을 때) HPA의 존재하에서 말토오스가 I mg/mL 녹말로부터 생성될 때의 1 H NMR 스펙트럼의 중첩을 보여준다.
도면 10 은 GM 1 없는 경우, 그리고 그다음은 녹말: GM 1이 1 : 1 과 1 :4의 몰비로 존재하며 효소가 있을 때, HPA의 존재하에서 말토오스가 I mg/mL 녹말로부터 생성될 때의 1 H NMR 스펙트럼의 중첩을 보여준다.
도면 11은 GM 1 없는 경우, 그리고 그다음은 녹말: GM 1이 1 : 1 과 1 :4의 몰비로 존재하며 효소가 있을 때, HPA의 존재하에서 말토오스가 I mg/mL 녹말로부터 생성될 때의 1 H NMR 스펙트럼의 중첩을 보여준다.
도면 12는 GM 1 없을 때 그리고 그다음은 녹말: GM 1 이 1 : 1 및 1 :4의 몰비로 존재하며 효소가 있을 때 HPA 존재하에서, 말토오스가 I mg/mL 녹말로부터 생성될 때의 1 H NMR 스펙트럼의 중첩 데이터의 정규화된 오버레이를 보여준다.
도면 13 은 GM 1 없을 때 그리고 그다음은 녹말: GM 1 이 1 : 1 및 1 :4의 몰비로 존재하며 효소가 있을 때 HPA 존재하에서, 말토오스가 I mg/mL 녹말로부터 생성될 때의 1 H NMR 스펙트럼의 중첩 데이터의 정규화된 오버레이를 보여준다.
도면 14 는 GM 1 의 부재 및 존재하에서 말토오스의 상대적 생산량을 보여준다 ;
도면 15는 운동역학 매개변수 즉, 속도 상수 k를 산출하기 위하여 (1 에서 생성된 말토오스 분율을 뺀 것)의 자연 로그 대(vs) 시간을 도시한다;
도면 16은 PPA를 사용하여 수행된 NMR 실험을 도시한다;
도면 17은 PPA를 사용하여 수행된 NMR 실험을 도시한다;
도면 18은 PPA를 사용하여 수행된 NMR 실험을 도시한다;
도면 19은 PPA를 사용하여 수행된 NMR 실험을 도시하고; 운동역학 데이터를 도시한다.
도면 20은 GM 1 이 실제로 사람 타액의 아밀라아제와 돼지 췌장 아밀라아제 양쪽 모두에 결합하는 것을 나타내는 NMR 데이터를 도시한다 ;
도면 21은 GM 1 이 실제로 사람 타액의 아밀라아제와 돼지 췌장 아밀라아제 양쪽 모두에 결합하는 것을 나타내는 NMR 데이터를 도시한다 ;
도면 22은 GM 1 이 실제로 사람 타액의 아밀라아제와 돼지 췌장 아밀라아제 양쪽 모두에 결합하는 것을 나타내는 NMR 데이터를 도시한다 ;
도면 23은 β-시트 αH 영역의 일부분과 함께, 16 Trp 잔기가 있는 HAS 의 트립토판 (Trp) 영역을 보여준다 ;
도면 24는 PPA를 이용한 일부 NMR 데이터를 보여준다:
도면 25는 PPA를 이용한 일부 NMR 데이터를 보여준다;
도면 26은 PPA를 이용한 일부 NMR 데이터를 보여준다.
녹말의 아밀라아제-매개성 가수분해
본원에서 설명한 기술의 실시예는 당뇨병과 염증성 질환을 치료하기 위해 개발중인, 2가지 갈락토만난 (GMα와 GΜΡβ)의 혼합물인 PAZ320 가, 당뇨병 환자에 의해 섭취될때, 식후 글루코오스 변동(excursions)의 규모를 감소시킨다는 발견에 기초한다. 고 분자량의 정제된 가용성 만난(mannan) 다당류 한가지 이상과 저 분자량의 정제된 만난 다당류 한가지 이상의 조성물인 PAZ320 는 미국 특허 출원 US 2013/0302471에 보다 자세히 설명되어 있으며, 그 내용은 전체가 참고 문헌으로 인용된다. PAZ320가 위장관에서 녹말을 가수 분해하는 효소에 결합함으로써 작용하고 그로인해 글루코오스와 같이 낮은 분자량 당의 정상 상태 농도를 감소시키는 것으로 생각된다. 또한, PAZ320가 사람과 돼지 공급원으로부터의 α-아밀라아제 효소에 실제로 결합하고 그로인해 α(1→4)-연결된 글루코오스 중합체 (녹말 및 말토헥사오스)의 아밀라아제-매개성 가수분해의 속도를 감소시킨다고 생각된다. 본 발명자들은 2.5 mg/ml의 PAZ320가 녹말과의 아밀라아제 활성도를 약 45% 까지 저해하는 것을 발견하였는데, 이는 0.13 mg/ml에서의 아카보스의 수준에 필적하는 저해 수준이다. 더욱이, 본 발명자들은 PAZ320의 GMα 성분이 GMβ보다 약 5배 더 활성임을 발견하였다. 두가지 GM은 또한 아밀라아제에 대한 억제 효능에는 영향을 미치지 않으면서 녹말의 코일 모양의 구조를 "펼치기" 위해 작동한다. 한편, 시험관내에서 GMα로부터의 억제 효과의 일부는 용액 점도 증가에 대한 그것의 영향으로부터 발생한다. 전반적으로 이 연구 결과는 PAZ 320이 생체 내에서 어떻게 작용하여 당뇨병과 염증성 질환 환자를 돕는지에 대한 통찰력을 제공한다.
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구 범위에서 본원에서 채택된 특정 용어들이 여기에 수집된다. 다르게 명시되거나 문맥에 암시되어 있지 않는 한, 다음 용어 및 문구는 아래에 제공된 의미를 포함한다. 명백하게 다르게 명시되지 않거나 문맥에서 명백하지 않은 한, 아래의 용어 및 문구는 해당 용어 또는 구문이 관련 기술 분야에서 취득한 의미를 배제하지 않는다. 그 정의는 특정 실시예의 설명을 돕기 위해 제공되며, 청구된 발명을 한정하고자하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 범위가 청구 범위에 의해서만 한정되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "감소되다", "줄이다", "감소된", "축소", "감소" 및 "억제(저해)"는 모두 본원에서 일반적으로 참조에 비해 통계적으로 유의적인 양 만큼의 감소를 의미하기 위해 사용된다. 그러나 의심의 여지를 피하기 위해 "줄이다", "감소" 또는 "감소되다" 또는 "억제하다"는 일반적으로 기준 레벨에 비해 적어도 10 % 만큼의 감소를 의미하며, 예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30% , 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%. 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%만큼의 감소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 기준 수준과 비교하여 주어진 개체 또는 매개 변수가 완전히 부재하거나, 주어진 치료가 없는 경우와 비교하여 10-99 % 사이에서 감소한 경우까지 포함한다.
"또는 "활성화 "는 기준 레벨과 비교하여 적어도 10 %의 증가를 의미하며, 예를 들어 "증가된", "증가 "또는 "증강 "또는 "활성화 "라는 용어는 모두 본원에서 일반적으로 정적으로 유의한 양 만큼의 증가를 의미한다 ; 의심의 여지를 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가" 또는 "증강"은 기준 레벨과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가에서 100% 증가까지 또는 10- 100% 사이의 어떠한 증가 또는 기준 레벨과 비교하여 적어도 약 2-배, 또는 적어도 약 3-배, 또는 적어도 약 4-배, 또는 적어도 약 5-배 또는 적어도 약 10-배 증가, 또는 2 배 내지 10 배 이상 사이에서 증가하는 경우까지 포함한다.
비색계 녹말-요오드(아이오딘) 분석법은 GMα 와 GMβ 가 녹말의 아밀라아제-매개성 가수분해를 억제하는 효과를 입증한다. 표 1은 GMα 과 GMβ의 다양한 농도에서의 녹말 가수분해의 속도(1분당 가수분해된 녹말의 mg)를 나타낸다. 이들 데이터는 1 mg/ml 과 5 mg/ml의 녹말 농도를 가지고 4 또는 5번 실험으로부터의 평균 값을 나타낸다. 결과는 GMα와 GMβ 모두가 이 반응을 억제할 수 있음을 나타내며, GMα가 유의적으로 더 큰 효과를 나타냈다. GMα의 경우, 1 mg/ml 녹말일때의 가수분해 속도는 0.5 mg/ml에서의 xx로부터 4 mg/ml에서의 xx까지 떨어졌다. 심지어 GMβ가 16 mg/ml일때도, 속도는 오직 xx 이다. 5 mg/ml의 녹말 농도일 때 속도는 예상대로 다소 감쇠되지만, 그럼에도 불구하고 유사한 효과가 관찰된다.
이러한 저해 경향은 아마도 저해된 반응의 비율 (GM이 있을때의 속도를 GM 없을때의 속도로 나눔) 대 GMα (도면 1A) 및 GMβ (도면 18)의 농도를 도시하는 도면 1에서 더 잘 이해할 수 있다. 여기에서 표 1에 주어진 바와같이 평균치가 아닌 모든 개별 데이터 포인트가 표시된다. 4 mg / ml에서 GMα는 반응을 완전히 억제하는 것으로 보인다; 그러나 이것은 분석이 실제로 수행된 특정 조건 하에서 그 한계에 있기 때문에 오해의 소지가 있다. 그럼에도 불구하고, 가수 분해율은 4 mg / ml GMα의 존재에 의해 분명히 현저하게 감소된다. 한편, GMβ에 의한 반응 억제율은 4 mg / ml의 동일한 농도에서 단지 약 0.1이며, 16 mg / ml에 의해서 단지 0.48로 증가된다. 이 데이터는 GMα가 GMβ보다 약 10 배 더 효과적임을 나타낸다. 또한 GMα에 의해 저해되는 분율은 1 mg/ml 및 5 mg/ml의 녹말 농도에서 본질적으로 동일하다는 점에 유의해야 한다. 아밀라아제의 농도(1μM)가 어느 쪽의 녹말 농도에서도 동일하기 때문에, 이것은 결국 아밀라아제와 GMα 사이의 직접적인 상호 작용이 존재하며 이것이 효소-매개성 가수분해 반응을 약화시킨다는 것을 의미한다.
PAZ320은 각각 대략 1 : 4 몰비로 구성된 GMα와 GMβ의 조합이기 때문에 본 발명자들은 이 조합을 사용하여 녹말-요오드 분석법도 수행하였다 (표 1). 이 경우, 효과는 부가적으로 나타난다. 이것은 결국 GMα와 GMβ가 서로 독립적으로 아밀라아제의 활성도를 억제함을 시사한다.
본 발명자들은 또한 GMα와 GMβ의 효과를 아카보스의 효과와 비교하였다. 표 1은 2mg/ml의 GMα가 400μM에서의 아카보스만큼 효과적임을 보여준다. GMα의 무게 평균 분자량 MW (-200 kDa)이 주어지면 그 농도는 10 μM이다. 언뜻보기에 이것은 GMα가 아카보스보다 훨씬 더 효과적이라는 것을 암시한다. 그러나, 아밀라아제와 작은 가성 4당류 아카보스 사이의 결합 화학양론은 1 : 1 인 반면, GMα의 경우 아밀라아제에 대한 결합 화학양론은 알 수 없지만, 1몰의 GMα가 아마도 1 몰 이상의 아밀라아제에 결합하도록, 1 : 1보다 훨씬 클 가능성이 있기 때문에 오해의 소지가 있다.
아이오딘 녹말 분석법에서, GMα가 녹말과 직접 상호 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이 결론은 효소가 없을 때, 요오드에 의해 유도된 흡광도(A562)가 GMα의 존재하에서 1 mg/ml 녹말(플러스 요오드)의 경우에 현저히 더 낮다는 관찰에 근거한다. 요오드는 녹말의 초분자 코일 구조에 인터칼레이션(삽입)되어 강한 청색을 띄게된다. 색상의 강도는 녹말 "접힌(folded) " 구조의 양과 관련이 있다. 이 점에서 색 강도의 감소는 이 구조의 양의 감소와 직접적으로 관련된다. 도면 1은 GMα (도면 1C)와 GMβ (도면 1D)의 농도의 함수로서 "펼쳐진(unfolded)" 녹말의 분율을 나타낸다. 본 발명자들은 "펼쳐진" 녹말의 분율은 GM이 있을때의 A562 를 GM 없을때의 A562 로 나눈 값으로 계산했다. 도면 1C에서 GMα의 농도가 증가할 때, 녹말의 "펼쳐진" 구조의 비율이 크게 증가하며, 4 mg/ml GMα에 의해서 접힌 구조는 0에 가까워진다는 것을 주목하라. 그러나, 위에서 언급했듯이 A562 값이 분석의 한계점에서 떨어지므로, 일부 구조는 아마도 4 mg / ml에서 남아있지만, 그것은 분명히 매우 약해진다. 이점에 있어서, GMα는 녹말과 상호 작용하여 녹말에서의 코일(꼬인) 구조 세그먼트를 효과적으로 펼쳐야한다. 이것은 GMβ에서도 발생하지만 그 정도가 훨씬 작다.
녹말의 전개(펼침)이 분석의 결과 및/또는 아밀라아제-매개성 가수 분해에 대한 GMα의 효과에 영향을 주는지를 평가하기 위해, 더 높은 녹말 농도 (5mg / ml)에서 녹말-요오드 분석을 수행하였다. 이 녹말 농도에서, 녹말의 분명한 전개는 없지만(도면 I C), 효소 저해의 계산된 분율은 동일하게 유지된다 (도면 I A). (효소 없이) 요오드가 첨가될 때 색상 강도가 훨씬 적기 때문에, GMα에 의한 녹말의 전개가 인위적(인공적) 효과를 야기할 수 있으므로 이 실험은 중요하였고, 그것이 효소의 억제, 녹말의 펼침, 또는 이 두 가지의 어떤 조합 때문인지 여부를 분별할 필요가 없을 것이다. 반응의 억제율이 어느 쪽의 녹말 농도에서도 동일하기 때문에, 이러한 우려는 해소되었다. 이 결론을 뒷받침하는 또다른 증거는 더 작고 선형인 α(1 → 4)-결합 글루코오스 고분자인 말토헥사오스의 가수 분해와 함께 다음 섹션에서 제공된다.
GMα와 GMβ에 대한 또다른 우려는 용액 점도에 대한 가능한 영향이었다. 이러한 GM과 같은 대형 다당류는 용액 점도를 증가시키고 이는 결국 효소 활성도를 약화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 우리는 GMα와 GΜβ 용액의 점도를 측정하였고, 이것은 GMα와 GMβ의 농도 (mg/ml) 대 점도 (cP)로서 도면 2A에 도시되어 있다. 완충 용액 단독은 약 1 cP의 점성을 보였고, 본 실험에서 사용된 농도의 녹말 용액 (0.4 mg / ml ~ 5 mg / ml)은 점성에서 유의한 변화를 보이지 않았다. 동일한 경향이 GMP에서 관찰되었는데, 용액 점도는 16 mg / ml에 의해 기껏해야 1.3 cP로 증가했다. 반면에 GMα의 농도가 증가함에 따라 용액 점도는 급격히 증가했다 (도면 2A).
GMα에 의해 유도된 점성의 변화가 아밀라아제 활성에 미치는 영향에 대한 문제를 해결하기 위해, 우리는 효소 활성도에 대한 점성의 영향을 조사하기 위해 종종 사용되는 시약인 글리세롤의 농도의 함수로서 녹말-요오드 분석법을 수행했다(참조). 30 ℃에서 글리세롤 용액의 점성은 약 10 % 글리세롤까지는 1cP 이하로 이하로 유지되었으며, 글리세롤의 비율이 증가함에 따라 상당히 증가했다. 도면 28은 글리세롤에 의해 저해되는 아밀라아제-매개 가수분해 반응의 분율 대 글리세롤 용액의 점도를 나타낸 것이다. 이러한 결과로부터, 용액 점도의 증가가 아밀라아제 활성도를 약화시킨다는 것이 명백하다. 그러나, 도면 28은 또한 GMα에 의해 억제된 아밀라아제-매개성 가수 분해 반응의 분율 대 GMα 용액의 점성을 나타낸다. 여기에서, 글리세롤과 동일한 점도에서 GMa는 아밀라아제 활성도에 대해 글리세롤보다 유의하게 큰 억제 효과를 나타냄이 분명하다. 따라서 아밀라아제 활성도에 대한 GMα 효과의 단지 일부만이 GMα에 의한 용액 점도의 변화로부터 비롯된다. 점도를 고려하면, GMα로부터의 억제 효과는 여전히 1mg / ml 내지 2mg / ml GMα일때 약 40 내지 50 %에 머물러있다.
NMR에 의해 모니터링된 아밀라아제-매개성 녹말 가수분해
본 발명자들은 다음으로 NMR을 사용하여 녹말 가수 분해의 운동역학과 GMα와 GMβ의 효과를 따라갔다. 도면 3은 췌장 a-아밀라아제를 첨가하기 전의녹말의 1H NMR 스펙트럼 (3.13 ppm 에서 4.01 ppm)을 보여준다(아래쪽 궤적). 녹말은 α(1→4)연결된 글루코오스의 고분자로서 α-아밀라아제에 의해 가수분해 소화되어 주로 말토트리오스 (MT3)와 말토오스 (MT2) 그다음은 글루코오스 (Glc)가 된다. 위쪽 스펙트럼 궤적은 효소 (1 유닛)의 존재하에 11 시간 후에 녹말에 어떤 일이 일어나는지 보여준다. 이 당류는 모두 올레 (Ole) 유닛으로 구성되어 있기 때문에 두 스펙트럼이 비슷하게 보인다. 녹말 가수 분해시, 결과로 생성된 보다 작은 3 종의 당류 (MT3, MT2 및 Glc) 모두는 이전에 보고된 1 H 및 13 C 화학 변위 배치를 사용하여 천연 부존량(존재비) 13C-1H HSQC 스펙트럼 (데이터는 나타내지 않음)에서 쉽게 확인할 수 있다 (Coffin 외, 2009).
도면 3에 나타낸 1H 스펙트럼에서, 3.23 ppm 및 3.26 ppm에서의 두 개의 명백한 삼중선 공명 (이중선의 이중선)은 아마도 가장 잘 분해되며 표기된 바와 같이, Ole (3.23 ppm), MT2A 및 MT3A (3.27 및 3.26 ppm에서 각각 중첩됨)의 H2 공명에 배정될 수 있다. 접미사 "A"(예: MT3A)는 MT2와 MT3 모두에서 환원 말단 Glc 유닛을 나타내는 한편, B 및 C는 각각의 다당류의 비-환원 말단을 향한 다른 Glc 유닛을 나타낸다. 도면의 오른쪽에 있는 삽입부는 GMα의 부재 (아래쪽 삽입) 및 존재(위쪽 삽입)하에서 가수 분해가 진행됨에 따라, 이러한 공명 강도의 시간에 따른 증가 동안에 스펙트럼 궤적의 중첩을 보여준다. 강도의 증가는 가수분해 동안 이들 당류의 농도 증가를 반영한다. 이러한 세트의 궤적들에서의 각 스펙트럼 사이의 시간 간격이 동일하기 때문에, GMα의 존재시 녹말로부터 MT2 / MT3 / Glc의 생성이 더 느리게 일어난다는 것이 분명할 것이다. 이러한 관찰은 아밀라아제에 대한 GMα의 억제 효과를 보여주는 아이오딘 녹말 분석법의 결과와 일치한다.
대조군으로서, 본 발명자들은 GMα 단독에 더하여 아밀라아제를 사용하여 동일한 NMR 실험을 수행하였으며, 시간에 따른 NMR 스펙트럼의 뚜렷한 변화를 발견하지 못했는데, 이는 아밀라아제가 GMα를 가수분해하지 않음을 나타낸다. 이것은 GMα 다당류가, 고밀도의 α(1→6)-결합 갈락토오스 유닛을 갖고 α(1→4)-결합 Glc 유닛은 없는 β(1→4) 결합 만난 주쇄(백본)로 구성되기 때문으로 예상된다. 예상대로, GMβ를 사용한 동일한 NMR 실험은 동일한 결과를 산출했다.
도면 4A는 도면에 표기한 대로, 녹말 단독일때 그리고 0.5, 1, 2 및 4mg / ml의 농도로 GMα의 존재하에서 녹말에 대한 가수분해 반응의 시간 경과에 걸쳐 생성된 MT2 / MT3의 양을 플로팅함으로써 녹말과 GMα을 이용한 NMR 결과를 정량화한다. 생성된 MT2 / MT3의 농도는 공지된 농도의 말토오스 (MT2)의 NMR 스펙트럼을 얻음으로써 생성된 검량선을 사용하여 결정하였다. 도면 4A에서 GMα의 농도가 증가함에 따라 MT2 / MT3의 생성 속도가 현저하게 감소됨을 주목해야 하며, 아밀라아제에 대한 GMα의 억제 효능을 다시 한번 시사하는 것이다. 이 곡선의 각각의 기울기는 겉보기 초기 반응 속도의 척도를 효과적으로 제공한다. 이 값은 표 1에 나와있다. 아밀라아제-매개 가수분해의 운동역학은 다수의 더 작은 당 생성물로의 분해에 의해 복잡해질 수 있기 때문에, 본 발명자들은 반응이 시작되는 동안 MT2 / MT3에 대한 변화, 즉 초기 속도만을 분석하고 보고하였다.
GMα가 가수 분해 속도에 미치는 영향에서의 경향은 녹말-요오드 분석법에서 관찰된 것과 유사하며, GMα가 있을때와 GMα가 없을때의 속도의 비율은 GMα로 반응 억제율과 본질적으로 동일하다 (도면 1C ). 녹말 단독일때는 속도가 29 s- 1 인 반면, GMα가 존재할 때의 속도는 GMα 농도가 증가함에 따라 감소한다 : 0.5 mg/ml일때 27 s-1, 1 mg/ml일때 22 s-1, 2 mg/ml일때 15 s - 1, 4 ㎎/㎖일때 7 s- 1 ㎎/㎖ 이다. 즉, 4 mg/ml GMα의 첨가는 아밀라아제-매개 녹말 가수 분해율을 약 4 배 감소시킨다.
GMα에 의해 유도된 녹말의 전개가 아밀라아제-매개 가수분해에서 중요한 역할을하지 않는다는 것을 확실하게 하기 위해서, α(1 → 4) 결합된 Glc 유닛의 선형 중합체인 말토헥사오스를 사용하여 동일한 NMR 동역학 실험을 수행하였다. 말토헥사오스는 꼬인 코일 구조를 형성할 수 없는 작은 조각의 선형 녹말과 유사하다. 도면 4B는 도면 4A와 동일한 방식으로 그 결과를 도시한다. 말토헥사오스만으로는 가수 분해율이 19 s-1로 녹말보다 다소 느리다. 그럼에도 불구하고 이 비율은 GMα 농도가 증가함에 따라 또한 감소한다: 1 mg/ml일때 12 s-1, 2 mg/ml일때 9 s-1. 녹말과 말토헥사오스의 아밀라아제 매개 가수분해의 속도가 매우 동일하기 때문에, 우리는 GMα에 의해 유발된 녹말의 전개가 녹말의 아밀라아제 매개 가수분해에 영향을 미치지 않는다고 결론을 내릴 수 있다. 이러한 결과는 또한 아밀라아제의 공지된 작용 기전과 일치하며, 이는 코일형 구조로서 고도로 조직화되지 않은 녹말의 부위를 가수 분해한다는 점에서 동일하다.
GMα 는 a-아밀라아제와 상호작용한다.
우리의 데이터는 이미 GMα와 α-아밀라아제 사이의 직접적인 상호 작용을 제안했기 때문에, 우리는 1 H NMR 분광학을 사용하여 사람 췌장 (HPA), 사람 타액 (HSA) 및 돼지 췌장(PPA) 공급원으로부터의 아밀라아제와 GMα 사이에서 결합 현상이 실제로 존재하는지 여부를 평가했다. GMα로부터의 공명은 아밀라아제의 공명과 업-필드(0-6ppm)가 중첩되기 때문에, 우리는 다운필드 영역(6-10ppm)에서의 스펙트럼 분석에 집중하였다. 도면 5A는 GMα가 존재하지 않을 때(아래쪽 궤적)와 1 mg/ml(중간 궤적)과 2 mg/ml (상단 궤적)로 GMα의 존재하에서, 사람 타액 α-아밀라아제 (50μM)의 NH/방향족 영역(7.8ppm - 8.4ppm)으로부터의 1H NMR 스펙트럼 궤적을 도시한다). GMα가 첨가되면, α-아밀라아제 스펙트럼은 많은 공명들이 화학적으로 이동되면서 변경된다. 스펙트럼 위쪽의 화살표는 몇몇의 변화된 영역을 나타낸다.
8.42 ppm에서의 한 공명은 His 잔기의 H2 그룹에 속할 수 있으며 이는 GMα 첨가시에 좀더 이동성이 커진다. 7.88 ppm에서의 또다른 상대적으로 날카로운 공명은 HisH4 그룹과 관련될 수 있다; 이 공명은 GMα의 첨가시 현저히 이동된다 (그리고 초기에 넓혀짐). 공명의 이동을 제외하면, 용액 점도의 증가 및 / 또는 다양한 교환 동역학의 변화의 결과로서 일부 공명이 확대될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 데이터는 GMα가 실제로 효소와 상호 작용한다는 것을 설명한다.
GMα는 돼지 췌장 a-아밀라아제와도 상호 작용한다. 도면 5B는 GMα가 존재하지 않을때(바닥으로부터 두번째 궤적) 그리고 0.5, 1, 2, 3 에서 4 mg / ml 까지 증가하는 농도의 GMα가 존재할 때(최상위 궤적) 이 효소의 1 H NMR 스펙트럼을 보여준다. GMα로부터 발생하는 대략 8.07ppm의 약간의 공명(이 도면에서 하부 궤적)을 제외하고는, 모든 다른 공명들은 효소의 그것과 연관된다. 다시 한번, GMα의 농도가 증가함에 따라, 다수의 아밀라아제 공명이 현저하게 화학적으로 이동하게 되고, 그 중 일부는 이 도면에서 화살표로 표시된다. 부위-특이적 공명 할당(배치)가 이들 아밀라아제들 중 어느 하나에 대해서 만들어지지 않았기 때문에, 우리는 GMα가 아밀라아제 모두에 결합한다는 결론을 내릴 수 있었지만, GMα가 효소의 어디에서 상호작용하는지에 대한 통찰력은 부족하다.
이들 아밀라아제 및 GMα를 이용한 두 세트의 NMR 스펙트럼에서, 1H의 공명은 적정하는 동안 꾸준히 이동하였다. 이것은 이들 아밀라아제와 GMα 사이의 상호작용이 화학적 이동 시간 스케일상에서 빠른 교환 체계 내에서 일어난다는 것을 시사한다. 이러한 NMR 실험 조건 하에서 더 높은 농도의 GMα는 달성할 수 없기 때문에, 우리는 적정으로부터 평형 결합 상수를 결정할 수 없었다. 그러나 빠른 교환 체계에서 상호작용이 발생하기 때문에, Kd 값은 약 20μM보다 더 클 가능성이 있다.
도면 6A는 GMβ가 존재하지 않을 때 (하부 궤적) 그리고 0.5, 1, 2에서 4mg / ml까지 증가하는 농도의 GMβ가 존재할 때의 돼지 췌장 α-아밀라아제의 1 H NMR 스펙트럼을 보여준다. 이들 NMR 스펙트럼의 비교는 이들 농도의 GMβ가 효소에 대해 뚜렷한 효과가 없음을 나타낸다. 즉 GMβ는 아밀라아제와 상호 작용하지 않거나, 또는 하더라도 GMα와는 달리, 아밀라아제와 매우 약하게 상호 작용하는 것이다. 이 관찰은 4 mg/ml까지의 GM과 일치하며, 만약 있다하더라도 아밀라아제 기능에 대해 매우 약한 억제 효과를 유발한다.
아카보스는 경쟁적인 억제제로서 아밀라아제와 상호작용하는 잘 알려진 항 당뇨병 약물이다. 이러한 이유로 우리는 아카보스의 존재하에서(1 μΜ, 10 μΜ, 및 50 μΜ) α-아밀라아제의 1 H NMR 스펙트럼을 얻었다. 도면 6B는 일련의 NMR 스펙트럼을 보여주는데, 아밀라아제 단독의 스펙트럼이 바닥에 있고 이어서 이들 아카보스 농도의 존재하에 아밀라아제의 스펙트럼이 뒤따른다. 1 μM 아카보스 첨가시 스펙트럼의 변화가 본질적으로 완결되는데, 이 아밀라아제에 아카보스를 결합시키기 위한 평형 해리 상수 Kd가 1μM 이하임을 알 수 있으며, 보고된 Kd 값과 일치하는 관찰 결과이다. 아카보스의 첨가에 의해 이동된 그러한 많은 공명들은 GMα의 존재에 의해 이동된 공명들과 동일하다는 것을 주목하라(도면 5B). 확정적인 결론을 내릴 수는 없지만, 이러한 비교는 GMα가 아카보스와 비슷한 방식으로 효소와 상호 작용할 수 있음을 시사한다.
우리의 결과는 PAZ 320이 α(1 → 4)-결합된 글루코오스 중합체 (녹말과 말토헥사오스)의 아밀라아제-매개 가수분해를 효과적으로 억제함을 보여준다. PAZ320을 포함하는 두가지 갈락토만난 다당류 (GMα와 GΜβ) 중에서 GMα는 이 활성을 촉진시키는 주요 작용제이다. 심지어 용액 점도의 GMα-매개 증가로부터의 효과를 고려해도, GMα는 동일한 농도에서 GMβ보다 약 5 배 더 효과적이다.
분자 수준에서, 우리는 GMα가 사람 및 돼지 공급원 모두로부터의 아밀라아제와 직접적으로 상호작용한다는 것을 발견했으며, PAZ320의 저해 효능을 매개할 가능성이 있는 사건이다. 문헌에 나타난 바와 같이, α-아밀라아제는 다수의 뚜렷한 구조적 도메인을 포함한다 (예, Ramasubbu 외, 1996; Kadziola 외, 1998). 촉매 도메인은 대략 70- 아미노산 잔기 칼슘 결합 도메인에 의해 중단된 활성 부위를 함유하는 8 가닥의 α/β 배럴과, 카복시 말단의 그리스 키 P 배럴 도메인으로 이루어진 구조를 갖는다. 도면 7은 아카보스와 결합된 사람 췌장 a-아밀라아제 (HPA)의 결정 구조과 겹쳐진(PDB 엑서드 코드 1OSE), 돼지 췌장 α-아밀라아제 (PPA) 의 엑스레이 결정 구조를 보여준다(PDB 엑세스 1 DHK). 우리의 NMR 데이터가 아밀라아제의 구조 어디에서 GMα가 상호 작용하는지 정확한 위치를 보고하지는 않지만, 효소의 P-시트 영역으로부터의 잔기가 결합 현상에 의해 가장 교란되는 것처럼 보인다. 게다가, 같은 세트의 공명들이 아카보스의 결합에 의해 영향을 받는 것처럼 보이기 때문에, 그들은 동일한 결합 영역을 공유할 수 있다. 아카보스의 결합 영역은 효소의 활성 부위에 있는 P- 시트 영역 내에 있다. 특정 이론에 구속되지 않고, 우리는 GMα가 동일한 영역 주위에서 결합한다고 제안한다. 또한, 우리의 NMR 데이터는 아밀라아제에 결합하는 GMα가 특이적이고, 효소 구조의 일부를 구조적으로 안정화시킬 수 있음을 시사한다.
아카보스는 아밀라아제를 매우 강력하게 결합시키고, Ka 값은 나노 몰 범위이다. 다른 한편으로, 본 발명자들은 Ka가 높은 마이크로 몰 범위에 있는 것으로 보이며, GMα가 아밀라아제를 결합시킨다는 것을 발견하였다. 그럼에도 불구하고 PAZ320은 아카보스와 마찬가지로 생체 내에서 효과적이다. 최근 제 2 형 당뇨병 환자에서 2 시간 식후 글루코오스 변동의 크기의 감소를 입증하는 PAZ320에 대한 성공적인 임상 연구가 보고되었다. 흥미롭게도 그 임상 연구에서 PAZ320은 환자 한명 당 8g과 16g의 섭취량으로 투여되었다. 사람의 혈액량 (약 SL)을 사용하여 PAZ320 농도를 mg/ml로 계산하면, 섭취시 약 1.6 ~ 3.2 mg/ml가 된다. 이것은 본질적으로 우리가 PAZ320 (즉, GMα)이 녹말의 효소-매개성 가수분해를 효과적으로 억제한다는 것을 시험관내에서 증명했던 생물 물리학 연구에서 사용된 것과 동일한 범위이다. 물론, PAZ320을 섭취 할 때, 그것은 GI 트랙을 통해 소화되지 않고 이동하며, 여기서는 부피가 덜 명확하며, 일부 녹말은 타액에 존재하는 아밀라아제에 의해 소화된다.
이 임상 연구에서, 대상 환자의 약 50 %는 PAZ320 치료에 반응하지 않았다. 이에 대한 한가지 가능한 이유는 PAZ320가 식후 글루코오스 변동을 평가하기 단지 2시간 전에 소비되었다는 사실과 관련이 있을 수 있다. 우리의 생물 물리학 연구에서, 우리는 녹말과 GMα (및 GMβ)의 용액이 우리보다 앞서 밤새 섞일 수 있게되었을 때 아밀라아제에 대한 최적의 GMα-매개 억제 억제 효과를 관찰했다. 이러한 점에서, GM이 녹말 중합체와 상호 작용하는 동안 명백한 동역학 단계가 존재한다. 임상 연구에서, GM 함유 식사가 검사(스크리닝)에 앞서 약 24 시간 전에 섭취되었을 때 수행된 연구에서 더 많은 반응자들이 있었을지도 모른다. 전반적으로 우리의 결과는 PAZ320이 분자 수준에서 작용하는 기전과 당뇨병 치료제로서의 치료제로서의 사용에 대한 통찰력을 제공한다.
당뇨병에 대한 주어진 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나 혈액 글루코오스 수치의 징후 또는 증상들 중 어느 하나 또는 모두가 유익한 방식으로 변경되거나 또는 다른 임상적으로 승인된 증상들이 호전되거나 심지어 개선된다면(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 약제로 치료한 후 적어도 10 % 만큼), 이 용어가 본원에서 사용된 바와 같이, 치료는 "효과적인 치료"로 간주된다. 이러한 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 또는 본원에 기술되어 있다.
질병의 치료를 위한 유효량은 이를 필요로하는 포유 동물에 투여될 때, 본 질병에 대해 본원에서 정의된 바와 같이 효과적인 치료를 초래하기에 충분한 양을 의미한다.
본 개시물의 실시예에 대한 설명은 개시된 정확한 형태로 본 발명을 한정하거나 포괄하려는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구체예 및 실시예가 설명의 목적으로 여기에 설명되었지만, 관련 기술 분야의 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 다양한 동등한 수정이 본 개시의 범위 내에서 가능하다. 본 명세서에 제공된 개시의 교시는 적절한 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들은 결합되어 추가적인 실시예들을 제공할 수 있다. 본 개시의 양태들은 필요하다면, 상기 문헌의 구성, 기능 및 개념을 사용하도록 수정될 수 있고, 응용되어 본 개시의 또다른 실시예를 제공할 수 있다. 이러한 변경 및 다른 변경은 상세한 설명에 비추어 본 개시에 대해 행해질 수 있다.
전술한 실시예들 중 임의의 특정 요소는 다른 실시예에서 요소들과 결합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 실시예와 관련된 이점이 이들 실시예와 관련하여 설명되었지만, 다른 실시예도 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시예가 반드시 본 발명의 범위 내에 속하는 그러한 장점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되는데, 이는 제한적으로 해석되어서는 안된다. GM I이 사람 타액 아밀라아제와 돼지 췌장 아밀라아제와 상호작용하는지 여부를 평가하기 위해 실험을 수행하였고, 다양한 농도의 GM1의 존재 및 부재 하에서 효소에 대한 1H NMR 스펙트럼을 획득하였고, GM I의 첨가시 아밀라아제 단백질로부터 발생하는 공명에 대한 섭동(pertubation)이 이어졌다.
예를 들어, 녹말의 가수분해로부터의 작은 설탕 분자의 생산은 신체에 해로운 영향을 줄 수 있으며 예를 들어, 당뇨병 환자에서 특히 문제가 될 수 있는 고혈당 수치와 죽상 경화증, 심장 마비 및/또는 뇌졸중을 촉진시킬 수 있는 높은 콜레스테롤 수치 등이다. 식이 요법에 섬유질을 추가하면 대장암의 잠재적 감소를 초래하는 대변 배증을 증가시키고 체중 조절을 위한 식이 포만감의 수준을 증가시키는 것뿐만 아니라, 글루코오스와 콜레스테롤 수치를 감소시키는 것으로 나타났다.
갈락토만난 (GM)은 점액성의 가용성 섬유로 식후에 혈중 글루코오스, 콜레스테롤, 중성 지방 및 인슐린 수치를 감소시킨다. 행동 메커니즘이 완전히 이해되지는 않았지만, 가장 일반적으로 언급되는 가설은 장을 통한 위 내용물 배출/흐름의 느려짐, 연동 운동의 감소, 장 벽과 소화물 접촉의 감소, 감소된 흡수, 및 기질 및 효소의 느린 이동과 같은 소화 내용물의 점도 증가에 근거한다.
GM 기반 제품 (PAZ320)은 미국 특허 출원 번호 2013/0302471에 자세히 설명되어 있으며, 그 내용은 참조용으로 포함된다. 이 실험의 이론적 근거는 탄수화물 가수 분해 효소에 대한 GM I (분명한 유효 성분)와 첨가제 (GM2)의 효과를 평가하기 위해 생물학적 방법 주로 NMR 분광법을 사용하는 것이었다. GM I은 사람 타액 아밀라아제에 결합할 뿐 아니라 사람 및 돼지 췌장 아밀라아제에도 결합하고 2)이 들 효소에 GM I가 결합하면, 더 작은 당 단위 예를 들어, 말토오스로 변하는 녹말 가수 분해율이 크게 감소한다는 것을 발견했다.
녹말의 아밀라아제-매개성 가수분해에 대한 GM I 영향.
녹말, 사람 췌장 아밀라아제 (HP A) 및 돼지 췌장 아밀라아제 (PPA) (0.1 μΜ, 어느 쪽이나 IO 유닛)의 아밀라아제 매개 가수분해에 대한 GM I의 영향을 평가하기 위해 용해성 녹말 (각각 1 또는 0.4 mg / mL)을 사용하였고, 생성물 말토오스 형성의 운동역학은 1 : 0, 1 : 1 및 1 : 4의 녹말 : GM I의 몰비로 GM I의 부재 및 존재하에서 관찰되었다. 1H NMR 스펙트럼은 O에서 -80 분까지의 시점에서 얻어졌으며, 말토오스 생성물로부터의 H4 및 H4 '공명의 강도를 모니터링하였는데, 도면 8에서 예시된 바와 같이, 자유 말토오스와 HPA(PPA와 동일)와 반응하여 생기는 말토오스에 대해서 가수분해 생성물 말토오스로부터의 몇개의 공명을 보여준다. 우리는 말토오스로부터의 이러한 공명을 모니터링하였는데, 이는 GMI 나 효소로부터의 공명들과 중첩되지 않기 때문이다.
도면 9, 10 및 11은 말토오스가 GM 1 없이 HPA의 존재하에 1 mg / mL의 녹말로부터 생성되고, 그 다음에 1 : 1 및 1 : 4인 녹말: GM 몰비의 존재하에서 효소를 이용하여 생산될 때, 1 H NMR 스펙트럼의 중첩을 보여준다. 상대적인 효과는 데이터의 정규화된 오버레이를 나타내는 도면 12 및 13에서 더 잘 이해된다. 여기서 GM 1의 부재 및 존재하에서 말토오스의 상대적 생산을 보여주는 슬라이드 14 에서나타낸 바와 같이, GM 1이 녹말로부터의 말토오스 생산을 현저하게 늦춘다는 것이 명백하며, 그림 15는 동역학적 매개 변수, 즉 속도 상수, k를 산출하기 위해 (1에서 생성된 말토오스의 분율을 뺀 값)의 자연 로그 대 시간을 도시한다. 녹말:GM I 몰비가 1:4 일 때 가수 분해 속도가 약 4 배 감소한다는 것을 주목하라.
도면 16, 17, 18에서 보여준 바와 같이, 그다음 동일한 NMR 실험을 PPA를 사용하여 수행했다. 이들 운동역학 데이터 분석은 슬라이드 19에 나와있다. 여기에서 속도 상수는 PPA일때 다소 더 크다는 점을 주목하라. 그럼에도 불구하고 경향은 HPA일때와 분명히 동일하다. 또한 추정된 K 값은 약간 다르다는 점을 유의하라. K는 PPA에 대해 약 78μM인데, 이 값은 HPA의 경우 약 80μM 정도로 다소 크다. 이것은 GM I 가 HPA보다 PPA에 대해 더 강하게 결합하는 것과 일치할 것이다. 대조군으로서, 본 발명자들은 또한 GM1 단독에 HPA와 PPA를 첨가했는데, 아무것도 생성되지 않았다. 즉, 예상대로 GM1은 이들 효소에 의해 가수 분해되지 않는다.
녹말의 아밀라아제-매개성 가수분해에 대한 GM I 의 영향을 평가하기 위해, 사람 췌장 아밀라아제 및 돼지 췌장 아밀라아제 (어느쪽이나 모두 0.1 μΜ, 10 유닛)를 용해성 녹말(0.4 또는 1 mg/mL)과 함께 사용하였고 생성물 말토오스의 형성의 운동역학을 1 :0, 1 : 1 , 및 1 :4의 녹말:GMI 몰비로 GM1 의 부재 및 존재하에서 수행되었다. 1H NMR 스펙트럼을 O에서 -80 분까지의 시점에서 수집하고, 말토오스 생성물로부터 H4 및 H4 '공명의 강도를 모니터링 하였다. 동역학적 매개 변수는 (1 에서 생성된 말토오스의 분율을 뺀 값)의 자연 로그 대 시간을 플롯하여 결정되었다. 이 플롯의 기울기는 본질적으로 역 시간의 단위로 (min-1 또는 s-1) 속도 상수 k를 산출한다. Kr 값은 V 값 대신 k 값이 사용된 방정식 (V최대 /V)-1 = [I]/K1을 사용하여 조잡하게 추정되었다.
결과 및 논의
HSA와 PPA에 GM1 결합.
초기 1H NMR 데이터는 2D NMR 스펙트럼을 사용하려고 시도했지만, 제한된 양의 효소 때문에 실험에 일관성이 없는 것으로 보였고, 그 결과 신호 대 잡음이 상대적으로 불량하였다. 대신에, 1D 1 H NMR 스펙트럼은 다양한 농도의 GM I의 부재 및 존재하에서 HSA 및 PPA를 이용하여 얻었고, GM 1의 첨가시 아밀라아제 단백질로부터 발생하는 1H 공명에 대한 섭동이 뒤를 이었다.
도면 20, 21 및 22에 도시된 이러한 NMR 데이터는 GM 1이 실제로 사람 타액 아밀라아제와 돼지 췌장 아밀라아제 모두에 결합함을 나타낸다. 이 프리젠테이션의 처음 4개의 슬라이드는 HSA를 이용한 NMR 스펙트럼으로부터의 몇 가지 영역을 보여주며, 여기에서 공명 변화가 관찰된다.
이들 아밀라아제는 비교적 크기가 크기 때문에 (즉, 약 60 kDa), 관찰된 바와 같이 우리는 NMR 스펙트럼에 대한 선택적인 변화를 볼 것으로 예상했다. 사실, 대부분의 아밀라아제 공명이 GM 1의 존재하에서 교란되지 않기 때문에(비섭동), 우리는 GM 1이 어느 한 아밀라아제의 전체적인 접힘 구조를 크게 변화시키지 않는다고 결론지을 수 있다.
이 슬라이드에 대해 좀 자세히 설명하기 위해, 도면 20은 16 Trp 잔기가 있는 HAS의 트립토판 (Trp) 영역을 보여준다. GM 1의 존재하에서 대부분은 계속 교란(섭동)되지 않고있지만, 특별히 하나가 교란된다. 도 23에 나타낸 β 시트 αH 영역의 일부분 그리고 도면 24에 도시된 글루탐산 (Glu)과 글루타민 (Gln) 잔기의 측쇄 영역의 일부의 그것은 물론이고, 도면 21에 도시된 백본 NH 영역의 일부와 동일하다고 말할 수 있다. PPA와 HPA의 X 선 구조는 결합된 아카보스의 구조와 함께 슬라이드 5에 중첩되어 표시된다.
이것은 효소의 활성 부위이며, 그것의 β- 시트가 중요한 Trp 및 Gin 잔기를 함유하고 있음을 주목하라. GM이 동일한 부위에서 상호작용하는지 여부는 알 수 없지만, 이것이 사실인 것으로 추측하는 것은 매우 흥미롭다.
도면 24 에서 26은 PPA를 이용한 일부 NMR 데이터를 보여준다. HSA와 PPA의 스펙트럼이 다르게 보일지라도, 이것은 예기치 않은 것이 아니다. 그럼에도 불구하고 HSA와 관련하여 위에서 결론지었던 결론은 동일하다 : 1) GM I은 PPA에 결합하고, 2) 결합은 선택적이며, 3) PPA의 구조에 대한 주요 섭동은 발생하지 않는다. 이러한 결합 데이터의 분석은 Kci 값이 μM 범위, 아마도 약 50μM에 해당하며, HSA보다 PPA에 다소 더 강한 결합력을 보임을 시사한다.
재료 및 방법
재료
돼지 췌장 아밀라아제는 Megazyme, Inc.로부터 구입하였다. 다른 모든 아밀라아제, 화학 물질 및 시약은 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
다당류 준비
PAZ320 구성성분인, GMα 및 GMP (1 :4의 몰비로 혼합됨)는 각각 페누그리크와 구아검으로부터 유래한 다당류의 가수분해된 부분이고, 둘다 약 200 kDa (ref)의 중량 평균 분자량을 갖는다. GMα 과 GMP 는 주로 각각 1.2 및 1.1의 Man/Gal 비를 갖는 1,4-P-o-갈락토만난이다.
용액
모든 용액, PPA 및 억제제는 20 mM 인산 칼륨, 2 μM CaCli, 10 μM DSS 및 0.02 % NaN3, pH 6.9의 "아밀라아제" 완충액에서 제조되었다. PPA는 1OkDa Amicon Ultra-0.5 mL 원심 분리 필터를 사용하여 6 회 완충제 교환하였다. 여액은 NanoDrop 8000 UV-Vis 분광 광도계에서 A280 프로그램을 사용하여 측정하였고, 20 μM으로 희석하고, 분액(분취)하여, 사용될 때까지 동결시켰다. 사람 췌장 아밀라아제 (HPA)를 이 완충액으로 희석하고, 측정하고, 추가 제조없이 사용하였다.
GMα와 GMP의 저장 원액은 아밀라아제 완충액에 GM을 첨가하고 15 분 동안 와류발생시킨 후, 실온 0/N에서 진탕 배양하여 준비했다. 녹말 / GM 용액을 와류발생시켜서, 즉시 사용하거나 하룻밤 동안 실온에서 배양하였다.
아이오딘 녹말 분석법
요오드 녹말 분석법은 Xiao 등 (2006)에 의해 보고된 것에서 수정되었다. 표준 곡선은 100 μL의 6 농도 (0-1.0 mg / ml)와 100 μL의 가용성 녹말을 사용하여 구성되었다. 1 mg / ml의 수용성 녹말 +/- 다양한 농도의 GM의 총 100 μL 를 30 ℃ ± 5 μL의 효소에서 20 분 동안 1 μM PPA / 웰의 총 농도로 배양하고, 520 nm에서 흡광도를 읽었다.
NMR 분광법
NMR 실험은 H/C/N 3중-공명 탐침과 x/y/z 3축 펄스 필드 기울기 장치가 구비된 Bruker Avance 700 MHz 또는 850 MHz 분광기로 300 K에서 수행되었다. 통상적인 1H NMR 실험은 15 ppm의 스윕 폭으로 수행되었다. 그래디언트(구배) 민감도 향상 버전의 2 차원 1H-13C HSQC도 또한 각각 탄소와 양성자 차원에서 408 (t1) x 2048 (t2) 복소수 데이터 포인트와 함께 사용되었다.
NMR 시료에는 600μL의 1mg / ml 용해성 녹말 및/또는 말토헥사오스 및 10 % D20 +/- GMs 또는 아카보스 중 한가지가 함유되어 있다. NMR 스펙트럼을 효소 첨가 전에 얻은 후, HPA 또는 PPA를 1μM의 농도로 NMR 튜브에 직접 첨가하고, 연속적인 NMR 스펙트럼을 시간의 함수로서 수득하였다. 원시 데이터는 NMRPipe 를 사용하여 처리하고(Delaglio 등, 1995) NMR뷰를 사용하여 분석하였다(Johnson and Blevins, 1994). 피크 강도를 측정하고, 알려진 농도의 말토오스에 대해 결정된 표준 곡선을 사용하여 농도를 결정했다.
점도 측정
GM +/- 녹말 (15 ml)의 각각의 혼합물은 "아밀라아제" 완충액 (상기 참조)을 사용하여 농축 저장 원액으로부터 제조하였다. 각 샘플을 5000 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 공기 방울을 제거하였다. 점도 측정은 실온에서 봅(bob)과 컵 지오메트리를 사용하는 동심원 실린더가 장착된 TA Instruments AR-G2 레오미터를 사용하여 수행되었다. 선형 점탄성 영역을 정의하기 위해, 샘플에서 변형 및 주파수 스윕을 처음에 수행하였다. 그다음 1에서 100, 100에서 0.01 그리고 마지막으로 1에서 1000까지 올라가는(ramped) 전단 속도(1/s)로 후속 진동성 계단식 플로우(oscillatory stepped flow) 절차를 수행했다. 결과는 Rheology Advantage Data Analysis 소프트웨어를 사용하여 가시화되었다.
[표 1] 아이오딘 녹말 분석법에 의해 측정된 녹말의 아밀라아제 매개 가수분해 속도 및 NMR을 이용한 MT2/MT3 공명 강도. 녹말 가수 분해에 대한 GMα와 GMβ의 유효성을 평가할 수 있는 아밀라아제-저해 잠재성. 분석은 0.5, 1, 2 및 4 mg / mL; 400 μM의 아카보스, 1 mg / ml의 녹말에서 수행되었다. U / ml = (As62 대조군 - As62 샘플)/(As62 녹말 x 20분 x 0.1mℓ 반응 부피)이며, X를 나타내는 것으로 해석된다. 표시된 U/ml 값은 각각 3 번씩 수행된 4 또는 5 번의 개별 실험의 평균값이다.
Figure pct00001
예시적인 실시예가 이들 교시를 더 설명하기 위해 제공되었지만, 이러한 교시가 단지 예시적인 실시예로만 한정되지 않는다는 것을 알아야한다.
본 발명이 다양한 실시예들에 관하여 설명되었지만, 이러한 교시는 첨부된 청구 범위의 사상 및 범위 내에서 다양한 추가 및 다른 실시예들도 구현될 수 있음을 알아야 한다.
명세서는 본 명세서에 인용된 참고 문헌의 교시를 감안하여 가장 잘 이해된다. 본 명세서 내의 실시예는 본 발명의 실시예에 대한 예시를 제공하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 다른 많은 실시예가 본 발명에 포함된다는 것을 쉽게 인식할 수 있다. 당업자는 단지 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 첨부된 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (10)

  1. 적어도 하나의 올리고당 및/또는 단당류와 함께, 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류와, 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류를 갖는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는,
    탄수화물을 분해하는 가수분해 효소의 작용을 억제(저해)함으로써, 혈류로의 글루코오스의 방출을 감소시키기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 갖는 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류가 약 50 kD 내지 약 300 kD 인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 갖는 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류가 약 5 kD 내지 약 50 kD 인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 갖는 저 분자량 만난 다당류 대 고 분자량 만난 다당류의 비가 중량비로 약 2: 1 내지 약 100: 1 의 비인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류 및 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류 중 적어도 한가지를 가지며, 한가지 이상의 콩과식물의 씨앗으로부터 분별되는데, 상기 한가지 이상의 콩과식물의 씨앗은 Cassia fistula, Ceratoniasiliqua , Caesalpinia spinosa Trigonelle foenumgraecum, 및/또는 Cyamopsis tetragonolobus 중 적어도 한가지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류 및 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류를 갖는 상기 조성물이 적어도 약 90% 중합체 탄수화물로 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류와 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류를 가지며, 단백질, 알칼로이드, 글리코알칼로이드를 포함한 천연 비-다당류 불순물을 약 1 % 미만으로 함유하도록 정제되었으며 저자극성 식이 섬유를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류와 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류를 가지며, 중금속, 살충제, 제초제, 미생물 독소 및 마이코톡신을 비롯한 환경 및 농업 오염 물질의 적어도 일부를 제거하도록 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류가 적어도 하나의 제 2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류에 내장되어(embedded) 하나 이상의 결합된 만난 다당류를 형성하고; 이러한 하나 이상의 결합된 만난 다당류는 하나 이상의 올리고당 및/또는 단당류에 내장되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이:
    약 1 % 내지 약 25% (wt/wt)의 적어도 하나의 제 1의 정제된 고 분자량의 가용성 만난 다당류,
    약 20% 내지 약 80% (wt/wt)의 적어도 하나의 제2의 정제된 저 분자량의 만난 다당류, 그리고
    약 40% 내지 약 60% (wt/wt)의 적어도 하나의 올리고당 및/또는 단당류
    를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
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