CN107847760A - 抑制α（1→4）键葡萄糖聚合物的淀粉酶介导的水解的组合物及方法 - Google Patents

抑制α（1→4）键葡萄糖聚合物的淀粉酶介导的水解的组合物及方法 Download PDF

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Abstract

作为两种半乳甘露聚糖(GMα及iMPβ)的混合物的PAZ320，已被开发用于治疗糖尿病及炎症性疾病。GMα及GMβ都具有β(1→4)甘露聚糖主链及高密度的α(1→6)键葡萄糖单位。若糖尿病患者服用PAZ320，则降低餐后血糖波动的大小。PAZ320与在胃肠道中水解淀粉的酶结合，从而起到降低如葡萄糖等低分子量的糖的正常状态的浓度的作用。PAZ320通过与人和猪来源的α‑淀粉酶结合，来减弱α(1→4)键葡萄糖聚合物(淀粉及麦芽六糖)的淀粉酶介导水解的速度。

Description

抑制α(1→4)键葡萄糖聚合物的淀粉酶介导的水解的组合物 及方法
技术领域
(相关申请的相互参照)
本申请主张与2015年5月6日提交的发明的名称为“抑制α(1→4)键葡萄糖聚合物的淀粉酶介导水解的PAZ320”的美国临时申请62/157630号有关的优先权，出于所有目的，其全部内容通过参照并入本说明书。
背景技术
淀粉作为葡萄糖的α(1→4)键聚合物，广泛存在于食品中，其为例如，面包、土豆及大米的主要成分。当摄取食物来消化淀粉时，上述复合碳水化合物被水解为如糊精等多种小的多糖，然后，被水解为如麦芽三糖和麦芽糖等小的糖，最后成为单糖葡萄糖。这种消化过程通常导致高血糖，对于糖尿病患者来说，可引起需要使用胰岛素的高血糖症。糖尿病患者可通过摄取相对少量的具有碳水化合物/淀粉的食物来调节血糖值。然而，高淀粉的饮食习惯可使普通人，即，将米作为主食的亚洲人感到头痛。因此，对糖尿病患者来说，使用药物来帮助维持或控制较低的血糖值为非常有效。
实际上，阿卡波糖(Costa&Pifiol，1997；Scheen，1998)和伏格列波糖(Dabhi etal.，2013)为在临床上已经用于治疗第二型糖尿病的两种抗糖尿病药物。阿卡波糖水解如淀粉等大的碳水化合物，最终以可逆地并竞争性地结合在释放葡萄糖的作为肠内酶的α-葡糖苷酶的低聚糖结合部位的天然微生物假四糖(pseudotetrasaccharide)。这些酶的抑制降低如淀粉等复合碳水化合物的消化率(水解)。与此相关地，碳水化合物无法分解为葡萄糖分子，因此葡萄糖吸收少。对于糖尿病患者来说，直接的效果降低血糖值。然而，例如，阿卡波糖通常不足以证明腹泻、胰腺炎、某些情况下的肝炎的副作用。(Lee et al.，2014)。显然，需要开发额外的药物。
发明内容
PAZ320作为降低糖尿病患者的餐后血糖的膳食补充剂，为被开发的另一种药物。PAZ320为含有非葡萄糖的复合碳水化合物的混合物，其基本上为分别以约1∶4的摩尔比混合胡芦巴来源的半乳甘露聚糖(GMα)和瓜尔豆胶来源的半乳甘露聚糖(GMβ)的两种半乳甘露聚糖的复合物。几项研究已经证明，胡芦巴籽降低血清葡萄糖并提高葡萄糖耐性，从而可改善人类和动物的与第一型糖尿病及第二型糖尿病有关的代谢症状(Sharma et al.，1990；Gupta et al.，2001)，并且给出胡芦巴来源的GMα可以为PAZ320的活性成分的启示。在最近的临床研究中，据报道PAZ320在大约一半受试者中降低了血糖值。尚未完全确立，但所提出的PAZ320的分子级的作用机制为阻断碳水化合物的作用，尤其，阻断将淀粉分解为葡萄糖的水解酶的作用，从而减少葡萄糖向血流的释放。
如上所述，水解淀粉的关键(key)酶中之一为主要存在于唾液和胰腺中的α-淀粉酶(Maureen et al，2000，Voet&Voet，2005)。认为淀粉酶通过随机切割淀粉(直链淀粉)的α(1→4)糖苷键来维持反构体排列的同时通过双取代机制来生成糊精、麦芽糖或麦芽三糖。然后，例如，葡糖苷酶将这些糖进一步水解为葡萄糖。在这里，为了调查GMα和/或GMβ与α-淀粉酶是否直接相互作用、能否起到降低淀粉及麦芽六糖的水解速度的作用而使用了NMR分光法。
附图说明
参照所提及的多个附图并通过本公开内容的实施形式的非限定性示例，在后述的详细说明中，进一步说明本发明的公开内容，附图中的部分附图的相同的附图标记表示相同的部件。
图1示出淀粉-碘比色试验。抑制猪胰脏的由α-淀粉酶(1μM)介导的淀粉水解(1mg/ml)的GMα(面板A)及GMβ(面板B)的效果表示为GMα及GMβ的浓度的函数。如记载，利用从碘-淀粉试验测定的U/ml值计算被抑制的反应的分率(ref)，但是，U/ml＝(As62对照组-As62样品)/(As62淀粉×20分钟×0.1ml反应体积)，这个值可以解释为每分钟被水解的淀粉的毫克数。在不存在酶的情况下，通过将GM不存在时取的A562除以GMα(面板C)及GMβ(面板D)存在时取的A562来计算“展开(unfoled)”淀粉的分率。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7，30℃。
图2示出与淀粉的淀粉酶介导水解有关的甘油的溶液粘度及效果。(A)部分如方法部分所述，以浓度(mg/ml)的函数测定了作为与GMα和GMβ有关的cP值来表示的粘度。(B)部分将淀粉-碘试验与PPA及1mg/ml淀粉一同使用来评价了甘油介导溶液粘度的效果。对通过甘油抑制的反应的分率的值与甘油的粘度进行绘制。示出对相同的绘图通过GMα抑制的反应的分率和GMα的溶液粘度。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7，30℃。
图3示出根据淀粉酶的存在与否的淀粉及淀粉/GMα的1H NMR谱。下部的踪迹示出添加胰腺α-淀粉酶(1μM)之前的淀粉(1mg/ml)的1H NMR谱(3.13ppm～4.01ppm)。上部的踪迹与添加GMα(4mg/ml)后的相同的淀粉溶液有关。淀粉为由淀粉酶以水解的方式主要消化为麦芽三糖(MT3)、麦芽糖(MT2)及葡萄糖(Glc)的α(1→4)键葡萄糖的聚合物，并且其H2共振在图中被标记。插图示出根据GMα的不存在(下部的插图)及GMα的存在(4mg/ml，上部的插图)下进行水解11小时，并且在MT2、MT3及Glc H2共振的强度依赖性地增加时所得到的谱踪迹的重叠。强度的增加反映水解过程中糖类的浓度的增加。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7，30℃。
图4示出淀粉酶介导水解的NMR来源的表观速度。(A)部分示出与淀粉(1mg/ml)的淀粉酶介导反应初期随时间推移所生成的MT2/MT3的量。如图中所标记，示出在单独的淀粉及0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml及4mg/ml的浓度的GMα的存在下的淀粉的结果。(B)部分示出与麦芽六糖(1mg/ml)的淀粉酶介导反应初期随时间推移所生成的MT2/MT3的量。如图中所标记，示出在单独的麦芽六糖及1mg/ml及2mg/ml的浓度的GMα的存在下的麦芽六糖的结果。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7.30℃。生成的MT2/MT3的浓度使用通过获得已知浓度的麦芽糖(MT2)的NMR谱生成的校准曲线来确定。这些曲线的各自的斜率有效地提供表观反应速度的尺度。在表1中示出这些值。
图5为在GMα的不存在及存在下的淀粉酶的1H NMR谱。(A)部分的下端踪迹示出人类唾液淀粉酶(HSA，50μM)单独的1H NMR谱，在踪迹上方示出1mg/ml及2mg/ml(最顶部踪迹)的GMα存在下的HSA(50μM)的谱。(B)部分的最底部踪迹示出GMα单独(4mg/ml)的1H NMR谱，然后示出单独的猪胰脏淀粉酶(PPA，50μM)的1H NMR谱，并且在0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml(最顶部踪迹)的GMα的存在下的PPA(50μM)的1H NMR谱。箭头表示滴定过程中偏移的部分共振。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7，30℃。
图6示出阿卡波糖(A)部分及GM(B)部分的不存在及存在下的猪胰脏淀粉酶(PPA)的1H NMR谱。在各自的谱组的底部踪迹示出单独的PPA(50μM)的1H NMR谱。以1μM、10μM及50μM(A中的顶部踪迹)的浓度添加阿卡波糖。以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml及4mg/ml(B中的顶部踪迹)的浓度添加GM。箭头表示滴定过程中偏移的部分共振。通常的溶液条件为20mM的磷酸钾，pH为7，30℃。
图7示出与阿卡波糖(PDB访问代码为IDHK)结合的猪胰脏α-淀粉酶(PPA)的X射线晶体结构。与阿卡波糖(PDB访问代码为10SE)结合的人类胰腺α-淀粉酶(HPA)的X射线晶体结构覆盖在PPA的结构上。
图8示出从与HPA(与PPA相同)的反应得到的游离麦芽糖和麦芽糖的水解产物麦芽糖的多个共振。
图9示出当在不含GM1的HPA的存在下，由1mg/ml的淀粉生成麦芽糖后，在1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉/GM1的存在下，利用酶生成时的1H NMR谱的重叠。
图10示出当在不含GM1的HPA的存在下，由1mg/mL淀粉生成麦芽糖后，在1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉/GM1的存在下，利用酶生成时的1H NMR谱的重叠。
图11示出当在不含GM1的HPA的存在下，由1mg/mL淀粉生成麦芽糖后，在1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉/GM1的存在下，利用酶生成时的1H NMR谱的重叠。
图12示出当在不含GM1的HPA的存在下，由1mg/mL淀粉生成麦芽糖后，在1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉/GM1的存在下，利用酶生成时的1H NMR谱的重叠数据的标准化的覆盖。
图13示出当在不含GM1的HPA的存在下，由1mg/mL淀粉生成麦芽糖后，在1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉/GM1的存在下，利用酶生成时的1H NMR谱的重叠数据的标准化的覆盖。
图14示出在GM1的不存在及存在下的麦芽糖的相对产量。
图15示出用于计算运动参数，即，速度常数(k)所生成的麦芽糖分率和时间的自然对数。
图16示出利用PPA进行的NMR实验。
图17示出利用PPA进行的NMR实验。
图18示出利用PPA进行的NMR实验。
图19示出利用PPA进行的NMR实验和反应速度数据的说明。
图20示出表明GM1实际上与人类唾液淀粉酶及猪胰脏淀粉酶均结合的NMR数据。
图21示出表明GM1实际上与人类唾液淀粉酶及猪胰脏淀粉酶均结合的NMR数据。
图22示出表明GM1实际上与人类唾液淀粉酶及猪胰脏淀粉酶均结合的NMR数据。
图23示出不仅具有16Trp残基而且具有部分β-片αH区域的HSA的色氨酸(Trp)区域。
图24示出使用PPA的部分NMR数据。
图25示出使用PPA的部分NMR数据。
图26示出使用PPA的部分NMR数据。
具体实施方式
淀粉的淀粉酶介导水解
在本说明书所公开的实施方式中，PAZ320作为两种半乳甘露聚糖(GMα及GMPβ)的混合物，用于治疗糖尿病及炎症性患者而被开发，这基于糖尿病患者服用后减少餐后血糖波动的大小的发现。PAZ320为高分子量的至少一种纯化的可溶性甘露聚糖多糖及低分子量的至少一种纯化的甘露聚糖多糖的组合物，更完整地记载于美国专利申请US2013/0302471，其全部内容作为参考通过引用并入本说明书。认为PAZ320通过与水解胃肠道中的淀粉的酶结合而起到降低如葡萄糖等低分子量糖的正常状态的浓度的作用。并且，PAZ320实际上与人类和猪的α-淀粉酶结合，从而降低α(1→4)键的葡萄糖聚合物(淀粉和麦芽六糖)的淀粉酶介导水解比例。本申请人进一步发现2.5mg/ml的PAZ320抑制淀粉酶对淀粉的活性约45％，抑制水平与0.13mg/ml的阿卡波糖相当。并且，本申请人还发现PAZ320的GMα成分比GMβ的活性约高5倍。并且，这两种GM在不影响对淀粉酶的抑制功效的情况下展开淀粉的卷曲结构。相反，体外的GMα的部分抑制效果的一部分源于增加溶液粘度的效果。总的来说，这一发现有助于了解PAZ320如何在体内起作用并帮助患有糖尿病及炎症性疾病。
为了方便起见，在此，总结本文、说明书、实施方式、实施例及所附发明要求保护范围中采用的特定术语。除非上下文具体说明或暗示，否则以下术语及短语包括以下提供的含义。在下文中，除非术语及短语明确地提及或者从上下文不明确，否则术语及短语不排除在该领域中可获得的含义。即使提供定义以有助于说明特定实施方式，但是本发明的范围仅限于发明要求保护范围，因此不限定要求保护的发明。除非特别定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
术语“减少”、“降低”、“降低的”、“降低”、“下降”及“抑制”在本文中通常都用于表示相对于标准的统计显著量的减少。然而，为了避免混淆，与基准水平相比，“降低”、“降低”或“减少”或“抑制”通常意味着至少10％左右的减少，并且例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％，例如与基准水平比较时，完全缺乏给定的个体或参数，或者与缺乏给定治疗时相比，可包括10～99％之间的减少。
“激活”是指与基准水平相比增加至少10％的增加，并且术语“增加的”、“增加”或“增大”或“激活”在本文中通常都用于表示相对于标准的统计显著量的增加，为了避免混淆，术语“增加的”、“增加”或“增大”与基准水平相比时，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或100％的增加或10～100％之间的任意的增加，或者与基准水平相比时，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或2倍～10倍以上之间的增加。
比色淀粉-碘试验证明抑制淀粉的淀粉酶介导水解的GMα及GMβ的有效性。表1示出在GMα及GMβ的多种浓度下的淀粉水解速度(每分钟被水解的淀粉的mg)。这些数据表示在1mg/ml及5mg/ml的淀粉浓度下的4次或5次的实验的平均值。结果表明，GMα及GMβ都可抑制这种反应，并且GMα发挥更大的作用。基于GMα的1mg/ml的淀粉的水解速度在0.5mg/ml时的xx至在4mg/ml时的xx的范围内。在16mg/ml的GM/3中的速度仅为xx。在淀粉浓度为5mg/ml时，观察到的速度如预期进一步降低，但是观察到相同的效果。
这种抑制倾向或可在绘制抑制的反应分率(将使用GM时的速度除以未使用GM时的速度)和GMα的浓度(图1的(A)部分)及GMβ(图1的(B)部分)的浓度的图1中更好地理解。其中，如表I所示，示出所有的各个数据点，而不是平均值。在4mg/ml时，GMα表示完全地抑制反应；这是有些错误的，因为在进行试验的特定条件下实际上是有限度的。然而，由于4mg/ml的GMα的存在，水解速度急剧降低。另一方面，被GMβ抑制的反应的分率在4mg/ml的相同的浓度下仅为约0.1，并且仅增加0.48，直到16mg/ml。这些数据表明，GMα基本上比GMβ有效约10倍。并且，还注意到，被GMα抑制的分率在1mg/ml及5mg/ml的淀粉浓度下基本相同。由于淀粉酶的浓度(1μM)在所有的上述淀粉浓度下是相同的，这意味着在削弱淀粉酶和酶介导水解反应的GMα之间存在直接的相互作用。
由于PAZ320为约以1∶4的摩尔比组成的GMα及GMβ的组合，所以本申请人由该组合进行了淀粉-碘试验(表1)。在这种情况下，其效果似乎是相加的。这表明GMα及GMβ可彼此独立地抑制淀粉酶活性。
并且，本申请人将基于GMα及GMβ的效果与阿卡波糖进行了比较。表1示出2mg/ml的GMα与约400μM的阿卡波糖一样有效。考虑到GMα的重量平均MW(-200kDa)时，其浓度为10μM。起初，GMα比阿卡波糖更有效。然而，淀粉酶和小假四糖糖类阿卡波糖之间的结合化学计量比为1∶1，相反，对于GMα的与淀粉酶的结合化学计量未被报道，可远大于1∶1，1摩尔的GMα或许可与大于1摩尔的淀粉酶结合，因此这是一个误解。
在淀粉-碘试验中，发现GMα与淀粉直接相互作用。这种结论是基于不存在酶的情况下的碘诱导吸光度(A562)相对于存在GMα的情况下的1mg/ml淀粉(及碘)显著降低的观察。碘置于淀粉的大分子卷曲结构中，得到深蓝色。颜色的强度与淀粉“折叠”结构的量有关。与此相关地，颜色强度的降低与这种结构的量的减少直接相关。图1为GMα(图1的(C)部分)及GMβ(图1的(D)部分)的浓度的函数，绘制了“展开”淀粉的分率。本申请人通过将具有GM的A562除以不含GM的A562，从而计算“展开”淀粉的分率。在图1的(C)部分中，随着GMα的浓度增加，淀粉的“展开”结构的分率显著增加，这表明由4mg/ml的GMα，折叠结构几乎为零。但是，如上所述，A562值达到试验的阀值，并且部分结构可维持在4mg/ml，但显然非常减弱。与此相关地，GMα必须与淀粉相互作用，才能有效地展开淀粉中的卷曲结构的片段。并且，这由GMβ发生，但少得多。
为了评价淀粉的展开是否影响试验的结果和/或GMα对淀粉酶介导水解的效果，本申请人在高淀粉浓度(5mg/m1)下进行了淀粉-碘试验。在这个淀粉浓度下，淀粉的展开未出现(图1的(C)部分)，并且计算的酶抑制的分率不变(图1的(A)部分)。这个实验是重要的，因为GMα诱导的淀粉的展开可引起人为效果，例如添加碘时(不含酶)，进一步削弱颜色强度，并且可不需要区分是否基于酶的抑制、淀粉的展开、或者两者的任何组合。抑制的反应的分率在任何淀粉浓度下都相同，因此这种担忧得到缓解。在下一节中提供支持这一结论的另一证据利用作为一种小的线性(1→4)键葡萄糖聚合物的麦芽六糖的水解。
GMα及GMβ的另一个问题可影响溶液粘度。已知，如这些GM的大的多糖增加溶液粘度，从而最终可减弱酶活性。因此，本申请人测定了GMα及GMβ溶液的粘度，并且在图2a中绘制了对GMα和GMP的浓度(mg/ml)的粘度(cP)。单独的缓冲溶液粘度约为1cP，并且在本实验中所使用的浓度(0.4～5mg/ml)的淀粉溶液在此粘度下未呈现出显著变化。在GMβ中也观察到相同的倾向，溶液的粘度在16mg/ml浓度下最大增加至1.3cP。另一方面，随着GMα的浓度的增加，溶液粘度显著增加(图2的(A)部分)。
为了研究由GMα引起的粘度变化如何影响淀粉酶活性的问题，作为用于调查粘度(ref.)对酶活性的影响而经常使用的药剂的甘油的浓度的函数，进行了淀粉-碘试验，在30℃下的甘油溶液的粘度维持在1cP以下，直到约10％的甘油，然后，随着甘油的比率进一步增加而显著增加。图2的(B)部分绘制了与甘油溶液的粘度有关的由甘油抑制的淀粉酶介导水解反应的分率。从这些结果可显然地看出，溶液的粘度增加减弱淀粉酶活性。然而，图2的(B)部分还绘制了与GMα溶液的粘度有关的由GMα抑制的淀粉酶介导水解反应的分率。其中，显然，与甘油相同的粘度的GMα呈现出与甘油相比对淀粉酶活性显著更大的抑制效果。因此，GMα对淀粉酶活性的影响只有部分是由GMα引起的溶液粘度的变化产生。鉴于粘度的GMα的抑制效果在1mg/ml～2mg/ml的GMα中仍然为约40％～50％。
通过NMR监测淀粉酶介导淀粉水解
接着，来自GMα及GMβ的本申请人使用NMR来确定淀粉水解的反应速度及效果。图3示出添加胰腺α-淀粉酶(底部踪迹)之前的淀粉的1H-NMR谱(3.13ppm～4.01ppm)。淀粉作为α(1→4)键葡萄糖的聚合物，由α-淀粉酶主要以水解的方式消化成麦芽三糖(MT3)、麦芽糖(MT2)及葡萄糖(Glc)。上部谱的踪迹表示在酶的存在(1单位)下的11小时后淀粉发生的变化。这种糖类均由Ole单位组成，因此两个谱是相似的。将所有在淀粉的水解时获得的3个小糖类(MT3、MT2及Glc)在以往报道的利用1H及13C化学位移分配的自然存在13C-1H HSQC谱(数据未显示)(Goffin et al.，2009)中可易于识别。
在图3所示的1H谱中，3.23ppm及3.26ppm处的两个明显的双二重峰(doublet ofdoublet)可被最好地解决，如所标记，可分配为Ole(3.23ppm)、MT2A及MT3A(分别包裹在3.27ppm及3.26ppm处)的H2共振。后缀“A”(例如，MT3A)是指MT2及MT3中的还原末端的Glc单位，并且B和C是指朝向各自的多糖的非还原末端的其他Glc单位。图中右侧的插图示出随着在GMα的不存在(底部插图)及存在(上部插图)下进行水解，这些共振的强度时间依赖性增加期间的谱踪迹的重叠。上述强度的增加反映水解过程中这些糖类的浓度的增加。很显然，由于这些踪迹的组中的各自的谱之间的时间间隔相同，因此由淀粉的MT2/MT3/Glc的生成与GMα的存在下相比，发生得更慢。这些观察与证明GMα对淀粉酶的抑制效果的淀粉-碘试验的结果一致。
作为对照组，本申请人发现，利用单独的GMα+淀粉酶进行相同的NMR实验，并且NMR谱随时间未显著变化，因此淀粉酶未水解GMα。这是因为GMα多糖由具有高密度的α(1→6)键半乳糖单位且不具有α(1→4)键半乳糖单位的β(1→4)键甘露聚糖的主链形成。如预期，从利用GMβ的相同的NMR实验获得了相同的结果。
在图4的(A)部分中，如图中所标记，在单独存在淀粉及0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml及4mg/ml的浓度的GMα时的对淀粉的水解反应中，绘制随反应的时间所生成的MT2/MT3的量，从而定量化淀粉和GMα的NMR结果。利用通过获得已知浓度的麦芽糖(MT2)的NMR谱生成的校准曲线确定MT2/MT3的浓度。在图4的(A)部分，随着GMα的浓度的增加，MT2/MT3的生成速度显著减小，从此再次可知GMα对淀粉酶的抑制功效。这些每条曲线的斜率有效地提供反应的明确的初期速度的测定值。这些值在表1中示出。淀粉酶介导水解的反应速度可由于分解成多个小糖类产物生成物而变得复杂，所以本申请人仅通过反应开始时的MT2/MT3的变化即初期速度来进行分析并报告。
对上述水解速度的GMα影响的倾向与在上述淀粉-碘试验中观察到的相似，即在存在及不存在GMα时的速度比例基本上与GMα的反应抑制分率相同(图1的(C)部分)。在单独的淀粉中的速度为29s-1，相反，在GMα存在下，随着GMα的浓度的增加，速度降低：在0.5mg/ml时为27s-1、在1mg/ml时为22s-1、在2mg/ml时为15s-1及在4mg/ml时为7s-1。若进行还原，则在添加4mg/ml的GMα时，淀粉酶介导的淀粉水解速度约降低4倍。
为了进一步确保由GMα诱导的淀粉的展开在淀粉酶介导的水解中不起重要作用，本申请人已经利用作为麦芽六糖的α(1→4)键半乳糖单位的线性聚合物进行了相同的NMR反应速度实验。麦芽六糖与无法形成卷曲结构的线性淀粉的小片段类似。图4的(B)部分以与图4的(A)部分相同的方法绘制了这些结果。在单独的麦芽六糖中的水解速度为19s-1，比淀粉稍慢。然而，这个速度也随着GMα浓度的增加而降低：在1mg/ml时为12s-1及在2mg/ml时为9s-1。淀粉及麦芽六糖的淀粉酶介导水解的速度非常相同，因此本申请人可以得出结论：淀粉诱导的GMα淀粉的展开在淀粉酶介导水解中不起重要作用。并且，这些结果也与已知的淀粉酶的作用机制一致，即，作为卷曲结构，水解未被高度组织化的淀粉的区域。
GMα与淀粉酶的相互作用
本说明书的数据已经证明GMα和α-淀粉酶之间的直接的相互作用，本申请人为了评价实际上是否存在来自人类的胰腺(HPA)和人类的唾液(HSA)来源及来自猪的胰腺(PPA)来源的GMα及淀粉酶之间的结合事件，使用了1H NMR分光法。由于来自GMα的共振与淀粉酶的高场区(0～6ppm)重叠，因此本申请人将焦点聚集在低场区(6～10ppm)的谱分析。图5的(A)部分示出在不存在GMα(底部踪迹)和存在1mg/ml(中间踪迹)及2mg/ml(上部踪迹)的GMα的情况下，来自人类的唾液α-淀粉酶(50μM)的NH/芳香族区域(7.8ppm～8.4ppm)的1H NMR谱踪迹。当添加GMα时，α-淀粉酶谱变化为化学偏移的多个共振。谱上方的箭头表示一些变化区域。
在8.42ppm处的一个共振可属于His残基的H2基团，其在添加GMα时进一步移动。在7.88ppm处的其他相对尖锐的共振可与HisH4组相关。当添加GMα时，这种共振显著偏移(初期宽)。除了共振偏移之外，显然由于溶液粘度的增加和/或各种交换动力学的变化，一些共振可被扩大。但是，这些数据表示GMα实际上与酶相互作用。
GMα也与猪胰脏α-淀粉酶相互作用。图5的(B)部分示出在不存在GMα(最后第二个踪迹)及存在0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3～4mg/ml的增加浓度(最顶部踪迹)的GMα的情况下的1H NMR谱。除了由GMα产生的8.07ppm附近的多个共振(图中的底部踪迹)之外的其他所有共振都与酶有关。同样，随着GMα的浓度的增加，多个淀粉酶共振被显著地化学偏移，其中一些在图中用箭头表示。由于不存在对所有这些淀粉酶进行位置特异性共振分配，因此本申请人可以得出GMα与两种淀粉酶都结合的结论，但是具体地，对于GMα与酶的哪个部位相互作用缺乏了解。
在淀粉酶及GMα的两组NMR谱中，1H共振在滴定(titration)过程中持续偏移。这揭示这些淀粉酶和GMα之间的相互作用发生在化学位移时间尺度的快速交换系统内。由于这些NMR实验条件下无法获得高浓度的GMα，本申请人无法从滴定中确定平行结合常数。然而，由于相互作用发生在快速交换系统中，Kd值容易大于约20μM。
图6的(A)部分示出在不存在GMβ(底部踪迹)及存在向0.5mg/ml、1mg/ml、2～4mg/ml的增加的浓度的GMβ的情况下的猪胰脏的α-淀粉酶的1H NMR谱。从这些NMR谱的比较中可以看出，在这些浓度下的GMβ不存在与酶有关的明显的影响。若进行还原，与GMα不同，GMβ不与淀粉酶相互作用，或者与淀粉酶的相互作用非常弱。这种观察结果与4mg/ml的最大的GM诱导对淀粉酶功能的抑制效果(根据需要，非常弱的效果)一致。
阿卡波糖为众所周知的抗糖尿病药，其作为竞争性抑制剂与淀粉酶相互作用。因此，本申请人在阿卡波糖的存在下(1μM、10μM及50μM)获得了α-淀粉酶的1H NMR谱。图6的(B)部分示出一系列这些NMR谱，在下部示出单独的淀粉酶的谱，然后，示出在这些浓度的阿卡波糖的存在下的淀粉酶的谱。添加1μM的阿卡波糖后的谱的变化基本上结束，从而揭示阿卡波糖与该淀粉酶结合的平衡解离常数Kd低于1μM，与报道的kd值一致。注意到这些通过添加阿卡波糖而偏移的多个共振与由GMα的存在而偏移的多个共振相同(图5的(B)部分)。虽然无法得出明确的结论，但是这种比较揭示GMα能够以与阿卡波糖类似的方式与酶相互作用。
研究结果证明，PAZ320有效地抑制α(1→4)键葡萄糖聚合物(淀粉及麦芽六糖)的淀粉酶介导水解。在包括PAZ320的两种半乳甘露聚糖多糖(GMα及GMβ)中，GMα为促进活性的主要药剂。考虑到增加GMα介导溶液粘度的效果，GMα与相同的浓度的GMβ相比有效5倍。
本申请人发现，在分子级上GMα直接与人和猪来源的淀粉酶相互作用，并且该事件可介导PAZ320的抑制功效。如上述文献中所示，α-淀粉酶包括多个不同的结构上的结合域(例如，Ramasubbu et al.，1996；Kadziola et al.，1998)。催化结合域具有由包含被大约70-氨基酸残基的钙结合结合域中断的活性部位及羧酸末端润滑脂关键P-筒结合域的8-滞留的(stranded)α/β筒组成的结构。图7示出与阿卡波糖结合的人类胰腺的α-淀粉酶(HPA)(PDB存取编码为1OSE)被覆盖的猪胰脏的α-淀粉酶(PPA)((PDB访问代码为1DHK)的x射线晶体结构。我们的NMR数据并未准确地报告GMα在淀粉酶的结构中的相互作用，但是可知来自上述酶的P-片区域(多个)的残基很大程度上受到结合事件的干扰。并且，由于相同组的共振似乎受到阿卡波糖的结合的影响，这些可共享相同的结合区域。阿卡波糖的结合区域位于酶的活性部位的P-片结合域内。不限定于任何特定的理论，但是本申请人认为GMα在相同的区域附近结合。并且，我们的NMR数据证明，与淀粉酶结合的GMα为特异性的，并且可稳定酶的空间结构的一部分。
阿卡波糖以纳摩尔范围内的Ka值与淀粉酶非常强烈的结合。相反，本申请人发现，GMα以高微摩尔范围内的Ka值与淀粉酶结合。尽管如此，PAZ320和阿卡波糖在体内一样有效。最近，在一项成功的临床研究中，据报道，PAZ320可降低第二型糖尿病患者的餐后2小时的血糖波动的大小。有趣的是，在这个临床研究中，PAZ320通过摄取以每个患者8g及16g的剂量进行给药。为了以mg/ml计算PAZ320浓度，若利用人类的血液量(对于SL)，则摄取后将变为约1.6～3.2mg/ml。这与本申请人的生物物理学研究中使用的范围基本相同，其中本申请人已经在体外证明PAZ320(即，GMα)有效抑制淀粉的酶介导水解。当然，现在当摄取PAZ320时，其不通过胃肠道消化而移动，从而其体积有些不清楚，部分淀粉被唾液中的淀粉酶所消化。
在这个临床研究中，大约50％的对象患者对PAZ320治疗不反应。一个可能的原因可与PAZ320在评价餐后血糖变化的2小时前已被消耗有关。在本申请人的生物物理学研究中，当淀粉及GMα(及GMβ)的溶液混合过夜后使用时，观察到对淀粉酶的最佳的GMα介导抑制效果。与此相关地，GM在与淀粉聚合物相互作用期间具有表观动力学相(apparent kineticphase)。在临床研究中，在试验前24小时左右食用含有GM的餐食的研究中可存在更多的反应者。总体而言，这些结果提供与分子级的PAZ320的作用机制及其作为糖尿病治疗的治疗药治疗剂的用途有关的理解。
给定的糖尿病治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，血糖值的任何或所有的体征或症状能够以有益的方式改变，或者可改变其他临床上可接受的症状，或者例如使用本说明书中公开的药剂来接受治疗后，如在说明书中使用的术语，将改善至少10％的情况视为“有效的治疗”。测定这种指标的方法为本领域技术人员已知的和/或如本文所述的。
治疗疾病的有效量是指当向有需要的哺乳动物进行给药时获得的有效治疗疾病的充分的量，如本说明书中定义的术语。
本说明书中的实施方式的说明并非旨在穷举或者将本发明限制于所公开的准确的形式。本公开的特定实施方式及实施例以示例性的目的记载于本文，在本公开的范围内，本领域技术人员已知的各种等同修改可在本公开的范围内进行。本文提供的公开的思想可应用于其他合适的方法或方法。本文记载的各种实施形式可被组合以提供其他实施方式。如果需要，可修改本公开的各方面以采用上述文献及申请的组成、功能及概念来提供本公开的另一个实施方式。根据详细说明可进行这些及其他修改。
上述实施方式中的任何一个可与其他实施例的要素结合或替代。并且，与本公开的规定实施方式相关的优点记载于这些实施方式，但是其他实施方式也可表现出这些优点，并且所有实施方式不一定代表属于本发明的范围内的这些优点。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。进行实验以评价GM1是否与人类唾液淀粉酶及猪胰脏淀粉酶相互作用，并且在不存在GM1及存在不同浓度的GM1的情况下获得了酶的1H NMR谱，由淀粉酶蛋白质产生的1H共振的干扰在添加GM1后发生。
例如，由淀粉的水解生成的小分子糖，可用于促进高血糖值，例如对于糖尿病患者可成为问题的高血糖值，可产生如促进动脉粥样硬化、心脏麻痹和/或脑卒中的高胆固醇水平的有害的影响。向饮食中添加纤维素不仅降低血糖和胆固醇水平，而且增加粪便体积，从而导致结肠直肠癌的潜在的减少，并且增加饮食饱足感的水平以更好地调节体重。
半乳甘露聚糖(GM)为一种粘稠的可溶性纤维，可降低血液中的餐后血糖、胆固醇、甘油三酯及胰岛素水平。尽管作用机制尚不完全清楚，但最通常提及的假设基于通过钝化的胃排空/肠道的流动、蠕动运动的减少、消化物与肠壁接触的减少、吸收减少及如钝化的底物和酶的移动等消化物的粘度的增加。
GM类产品(PAZ320)进一步记载于美国专利申请第2013/0302471号中，其内容通过引用并入本文。这个实验的基本原理为主要使用作为生物化学方法的NMR光谱仪来评价对碳水化合物水解酶的GM1(表观活性成分)及添加剂(GM2)的效果。GM1不仅与人类及猪的胰腺淀粉酶结合，而且与人类的唾液淀粉酶结合以及2)GMI与这些酶的结合显著降低将淀粉分解为如麦芽糖等小糖单位的速度。
淀粉对淀粉酶介导水解的GM1效果
为了评价淀粉对淀粉酶介导水解的GM1的效果，将人类胰腺淀粉酶(HPA)及猪胰脏淀粉酶(PPA)(均为0.1μM、IO单位)与可溶性淀粉(分别为1mg/ml或0.4mg/m1)一同使用，在不存在GM1及存在1∶0、1∶1及1∶4的淀粉∶GM1的摩尔比的GM1的情况下追踪了作为生成物的麦芽糖的形成速度。在0～80分钟时间点获得1H NMR谱，并且如通过对作为水解生成物的游离麦芽糖的麦芽糖及HPA的反应所获得的麦芽糖(与PPA相同)的多个共振的图8所示，监测了作为生成物的麦芽糖的H4及H4′共振的强度。由于GM1或酶完全不存在共振和重叠，因此本申请人监测了来自这些麦芽糖的共振。
图9、10及11示出当不含GM1的HPA的存在下从1mg/ml的淀粉生成麦芽糖时，然后当与上述酶的1∶1及1∶4的摩尔比的淀粉∶GM1的存在下从1mg/ml的淀粉生成麦芽糖时的1HNMR谱的重叠。图12和图13更好地说明了表示规定数据的覆盖的相对效果。其中，图14示出在GM1的不存在及存在下的麦芽糖的相对的生成，图15绘制用于获得反应速度参数，即，速度常数k的对时间的(1-生成的麦芽糖分率)自然对数，如图14及图15中可知，显然，GM1显著钝化麦芽糖的生成。值得注意的是，当淀粉∶GM1的摩尔比为1∶4时，水解的速度降低了约4倍。
然后，如图16、17及18所示，利用PPA进行了相同的NMR实验。这些反应速度数据的分析如图19所示。值得注意的是，使用PPA时，速度常数稍大一些。尽管如此，这个倾向显然与使用HPA时相同。并且，预期的K值稍有不同。对于PPA的K为约78μM，其值HPA约为80μM，稍大。这与PPA的结合强于GM1的HPA的结合一致。作为对照，在单独的GM1中添加HPA及PPA，但什么也没有生成。即，正如所料，GM1不被这些酶水解。
为了评价GM1对淀粉的淀粉酶介导水解的效果，将人类胰腺淀粉酶及猪胰脏淀粉酶(均为0.1μM、10单位)与可溶性淀粉(0.4mg/ml或1mg/ml)一同使用，在不存在GM1及存在1∶0、1∶1及1∶4的淀粉∶GM1的摩尔比的GM1的情况下追踪了作为生成物的麦芽糖的形成速度。在0～80分钟时间点获得1H NMR谱，监测了作为生成物的麦芽糖的H4及H4′共振的强度。反应速度参数通过绘制随时间(1-生成的麦芽糖分率)的自然对数来确定。从该图的斜率基本上与以逆时间(inverse time)为单位(min-1或s-1)获得速度常数k。利用方程(Vmax/V)-1＝[I]/K1粗略地估计Kr值，其中，使用k值代替V值。
结果及审核
GM1与HSA和PPA的结合。初期1H NMR数据尝试使用2DNMR谱，但是受限的酶的量使实验不一致，并且信噪比相对较差。取而代之，在GM1的不存在及各种浓度的GM1的存在下，利用HSA及PPA获得ID1H NMR谱，并且在添加GM1时发生由淀粉酶蛋白质引起的1H共振的干扰。
如20、21及22所示，这些NMR数据证明GM1实际上与人类的唾液淀粉酶及猪的胰腺淀粉酶均结合。图中的前四个载玻片示出使用HSA观察到共振波动的NMR谱中的几个区域。
由于这些淀粉酶比较大(即，约为60kDa)，因此预想在观察时可选择并观察NMR谱的变化。实际上，可以得出结论，GM1不会显著改变两种淀粉酶的整体折叠结构，因为大部分淀粉酶共振在GM1存在下维持不受干扰的状态。
为了进一步详细说明这些载玻片，图20示出具有16个色氨酸残基的HSA的色氨酸(Trp)区域。值得注意的是，大部分在GM1的存在下维持不受干扰的状态，但是尤其一个不受干扰。如图21所示的主链NH区域的一部分、如图23所示的β-片αH区域的一部分及如图24所示的谷氨基酸(Glu)及谷氨酰胺(Gln)侧链区域的一部分可以说是相同的。将PPA及HPA的x射线结构与结合的阿卡波糖的结构一同覆盖在载玻片5上。
注意到这是酶的活性部位，其β-片包含关键的色氨酸及谷氨酰胺残基。无法确定GM1是否在同一个部位相互作用，但是推测这是否为这种情况是非常有趣的。
图24～26示出PPA的部分NMR数据。HSA及PPA的谱看似不同，但这并不意外。但是，上述的对HSA的结论是相同的。1)GM1与PPA结合，2)结合具有选择性，3)未出现对PPA的结构的主要干扰。对这些结合数据的分析揭示，Kci值在μM范围内，可能约为50μM，并且比HSA更强地与PPA结合。
材料及方法
材料
猪的胰腺淀粉酶购自Megazyme公司。除非作出不同的明示，其他所有淀粉酶、化学品及试剂均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯材料)。
多糖制备
作为PAZ320成分的GMα及GMβ(以1∶4的摩尔比混合)分别为来源于胡芦巴及瓜尔豆胶的多糖的水解分率，两者的重量平均分子量为约200kDa(ref)。GMα及GMβ主要为Man/Gal的比率分别为1.2及1.1的1，4-P-o-半乳甘露聚糖。
溶液
所有溶液、PPA及抑制剂由含有20mM的磷酸钾、2μM的氯化钙(CaCl2)、10μM的DSS及0.02％的NaN3、PH为6.9的“淀粉酶”缓冲液制备而成。PPA为使用10kDa的Amicon Ultra-0.5mL的离心过滤器交换6次的缓冲液。使用NanoDrop 8000紫外-可见分光光度计的A280程序测定滤液，在使用前稀释至20μM，细分并冷冻。不进一步调整人类胰腺淀粉酶(HPA)，并且利用上述缓冲液稀释并测定及使用。
通过将GM添加到淀粉酶缓冲液中，涡流(voltexing)15分钟，并在室温下震荡过夜来制备GMα及GMβ的储备溶液。涡流淀粉/GM溶液后，立即使用或在室温下过夜培养。
淀粉-碘试验
Xiao等人报道的(2006)淀粉-碘试验被修改。利用100μL的6种浓度(0～1.0mg/ml)的GM及100μL的可溶性淀粉制定标准曲线。在30℃的温度下，将总计100μL的1mg/ml的可溶性淀粉加入或不加GM并培养20分钟，加入5μL的酶，使总浓度为1μMPPA/孔，在520nm处读取吸光度。
NMR分光法
NMR实验在具有H/C/N三重共振探针及x/y/z三重轴脉冲场梯度单元的BrukerAvance的700MHz或850MHz的分光计上在300K进行。常规的1H NMR实验在15ppm的扫描宽度下进行。二维1H-13C HSQC的梯度灵敏度的改进版本分别与408(t1)×2048(t2)复合数据点一起用于碳和质子维度。
NMR样品含有600μL的1mg/ml可溶性淀粉和/或麦芽六糖及10％的D20+/-GM或阿卡波糖。NMR谱在添加酶之前获得，将HPA或PPA以1μM的浓度直接添加到NMR管中，并且获得作为时间函数的连续的NMR谱。利用NMR管(Delaglio et al.，1995)处理了原始数据，并且利用NMR图(约翰逊和布莱文思(Johnson and Blevins)，1994)进行了分析。测定峰值强度并利用已知的浓度的麦芽糖测定的标准曲线测定浓度。
粘度测定
利用“淀粉酶”缓冲液(参照上文)从浓缩的储备溶液制备GM+/-淀粉(15ml)的每种混合物。每种样品以5000rpm离心分离5分钟以去除气泡。在室温下，使用配备有利用Bob和Cup几何形状的同心气缸的TA Instrument AR-G2流变仪进行粘度测定。首先，对样品进行应变计频率扫描以定义线性粘弹性区域。随后以1～100、100～0.01和最后1～1000的斜率剪切速度(1/s)进行振动型多步骤流动过程。利用Rheology Advantage数据分析软件使结果可视化。
表1
利用淀粉-碘试验及NMR由MT2/MT3共振强度测定淀粉的淀粉酶介导水解的速度。用于评价与淀粉的水解有关的GMα及GMβ的效果的淀粉酶抑制潜力。在400μM的0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml及4mg/ml的阿卡波糖及1mg/ml的淀粉中进行了试验。U/mi＝(As62对照组-As62样品)/(As62淀粉×20分钟×0.1ml反应体积)，并被解释为表示X。所示的U/ml的值表示四次或五次单独试验的平均值，每次试验重复三次。
尽管提出了示例性实施方式以阐述上述教导，但是这些教导不限于这些示例性的实施方式。
虽然已经根据各种实施方式描述了本发明，但是这些教导可在所附发明要求保护范围的精神及范围内的许多不同的和更多变的实施方式中实施。
当根据本公开内容中引用的参考文献的教导理解时，本说明书得到最好的理解。本说明书中的实施方式提供本发明的实施方式的说明，并不限定本发明的范围。本领域技术人员可易于理解，本发明包括许多不同的实施方式。本领域技术人员仅使用常规的实验就能确定本说明书中所记载的发明的特定实施方式的多个等同替代物。这种等同替代物包含在所附的发明要求保护范围内。

Claims (10)

1.一种通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，包括将包含至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖及低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖的组合物与至少一种低聚糖和/或单糖并用来进行给药的步骤。
2.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，上述组合物包含至少一种50kD～300kD的高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖。
3.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，上述组合物包含至少一种5kD～50kD的低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖。
4.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，上述组合物以2∶1～100∶1的重量比包含低分子量的甘露聚糖多糖和高分子量的甘露聚糖多糖。
5.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，在上述组合物中，从一种以上的大豆种子分离至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖及至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖中的至少一种，上述一种以上的大豆种子包括阿勃勒、长角豆、刺云实、胡芦巴和/或瓜尔豆中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，在上述组合物中，至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖及至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖被纯化为至少90％的聚合物碳水化合物。
7.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，在上述组合物中，至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖及至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖含有小于1％的包含蛋白质、生物碱、配糖生物碱的天然非多糖杂质并被纯化，以提供低刺激性膳食纤维。
8.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，在上述组合物中，至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖及至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖被纯化，以去除至少一部分的包含重金属、杀虫剂、除草剂、微生物毒素及霉菌毒素的环境污染物及农业污染物。
9.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，上述组合物包含至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖包埋在至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖中而形成的至少一种结合甘露聚糖多糖；上述至少一种结合甘露聚糖多糖包埋在至少一种低聚糖和/或单糖中。
10.根据权利要求1所述的通过抑制分解碳水化合物的水解酶的作用来减少葡萄糖向血流的释放的方法，其特征在于，上述组合物包含1～25重量百分比的至少一种高分子量的第一纯化可溶性甘露聚糖多糖、20～80重量百分比的至少一种低分子量的第二纯化甘露聚糖多糖及40～60重量百分比的至少一种低聚糖和/或单糖。
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