JP4057057B2 - 一定のｐＨ、温度及び時間条件下での細胞の自己消化によるβ−グルカン−マンナン調製物の製造 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的活性β−グルカン−マンナン調製物、及びそれらの単離方法に関する。特に、本発明は、β−グルカン−マンナン調製物、たとえば、微生物、たとえば酵母（但し、これだけには限定されない）により生成されるβ（１−３）グルカン、及び濃アルカリ又は酸の使用を回避するβ−グルカン−マンナン調製物の製造方法に関する。
発明の背景
多糖類は天然において広く分布しており、そして細菌、真菌、及び植物細胞の構造的統合性の維持におけるそれらの役割のために特に重要である。グルカンはＤ−グルコースのポリマーであり、そしてＤ−グルコース単位は種々の手段で一緒に連結される。たとえば、１−３，１−４，１−６、及び１−２結合を有するグルカンはすべて知られている。可能な種々の結合は、グルカンが通常、高い枝分れ鎖の化合物であることを意味する。それらの化学的性質のために、グルカンは化学、食品及び医薬産業において広く使用されて来た。たとえば、それらは粘度付与剤、乳化剤、繊維、フィルム、被覆物質、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル電気泳動のための支持体として、細胞培養培地において、フィルターパッドとして及びセメントにおいて有用である。それらはまた、食品増粘剤として及びダイエット繊維の源として、及び医薬製品におけるキャリヤー及び被覆剤としても広く使用される。
グルカン、特にβ（１−３）−グルカンは非常に広範に研究されており、そして前述の他に、種々の薬理学的活性、たとえば抗コレステロール血症活性、低血糖活性、重金属排泄の促進、及び免疫システムの刺激を有することが示されているが、しかしこれらのみには限定されない。β−グルカンの免疫刺激活性は、それらが抗癌剤として及びHIV感染の処理において、創傷治癒の刺激のための剤として、又は抗感染剤として、単独で又は抗生物質と組合せての使用のために有用である示唆を導びいた。
β−グルカンはまた、植物における疾病に対する耐性応答、たとえばフィトアレキシン生成及びしおれを誘発することができる。これは、それらが植物において抗感染剤及び成長促進剤として使用され得るという示唆を導びいた。
集中的な家禽、動物、魚又は甲殻類製造において必然的に伴う問題のために、感染の発生を減じ、そして従って、成長を促進し、そして抗生物質の必要性を減じるためにそれらの飼料への添加剤としてのβ−グルカンの使用がまた、提案されて来た。
β（１−３）−グルカンは酵母細胞の重要な細胞壁成分である。サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞壁は、β（１−６）−結合を通しての分子間及び分子内枝分れのマイナー成分と共に、主にβ（１−３）−結合されたグルコース単位の主鎖であるβ−結合グルカンから主として構成される。食品及び醸造産業、並びに工業銘柄のアルコールの製造における広範囲の酵母の使用のために、使用済酵母細胞は主な産業副産物である。酵母由来の生成物自体は、たとえば、酵母抽出物、風味剤、風味増強剤、たとえばグアノシン−リン酸及びイノシン−リン酸のような生成物において、酵素、ファインケミカル、及び生化学及び医薬産業への使用のための製品、たとえばトレハロース、チミジン、ヌクレオシド及びヌクレオチドの製造において相当な商業的価値を有する。醸造産業からの廃棄酵母は、β−グルカンの主要源である。
さらに、他の種の酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシアエ、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）及びカンジダ株、たとえばカンジダ・ウチリス（Candida utilis）の株もまた、β−グルカンの源として有用であるが、但しそれらだけには限定されない。それらの酵母株のすべては、バッチ発酵又は連続発酵のいづれかにより、食品銘柄の栄養物における培養を用いて生成され得る。多くの他の種の微生物、たとえば細菌、真菌及び単細胞藻類がβ−グルカンの源として当業界において報告されている。
酵母及び他の微生物からのβ−グルカンの精製は、広範に研究されており、そして種々の方法が知られている。それらのほとんどは、アルカリ又は有機溶媒におけるβ（１−３）−グルカンの不溶性に依存する。主な既知の方法は次のものである：
（ａ）濃水酸化ナトリウムによる高温抽出、続く酸による高温抽出及びエタノールによる沈殿（たとえば、Manners，D.J．など．，Biochem.J．135：19-30（1973），Jamas，S．など．，アメリカ特許第4810646号、第5028703号及び第5250436号、及びオーストラリア特許第628752（Philips Defroleum Companyによる）を参照のこと。それらのプロトコールの多くは、酵母細胞の予備均質化を必要とし、そして多くは個々の抽出段階の複数回の反復を必要とする；
（ｂ）グルカンを変性し、又は精製するための濃水酸化ナトリウムによる抽出、続く高温酸抽出及び酵素処理（たとえば、アルカリ−酸抽出、続くアミラーゼ活性を有する酵素による処理によるβ−Ｄ−グルカンの精製を報告する、Masler，L.などによるチェコ特許出願番号第890038号を参照のこと）；
（ｃ）濃フェノール：水（１：１）による酵母の自己消化又は酵素分解に起因する酵母細胞壁調製物の抽出（たとえば、Truscheit，E．などによるアメリカ特許第4138479号を参照のこと）；
（ｄ）単独で又はアルカリの存在下での有機溶媒、たとえばイソプロパノール、エタノール、アセトン又はメタノールによる抽出（たとえば、日本特許出願公開第7051081号、第6340701号、第5295003号及び第3002202号；ヨーロッパ特許出願第515216号を参照のこと）。
酸処理は、グルカン材料におけるβ（１−６）−結合の数を減じることが知られており、そしてこれは粘度の上昇をもたらす。
酵母の細胞壁は主に次のものから構成される：
（ｉ）β（１−６）−結合のグルカンの枝分れ側鎖を有する細繊維のアルカリ不溶性β（１−３）−結合のグルカン；
（ii）β（１−６）−結合のグルカンの枝分れ側鎖を有するアルカリ溶解性β（１−３）−結合のグルカン；
（iii）断続的なβ（１−３）−結合を有する非晶性酸−溶解性β（１−６）−グルカン；
（iv）タンパク質に結合される非晶性アルカリ−溶解性マンナン。
細繊維性グルカン成分は、酵母形質膜に隣接して位置し、そしてマンノタンパク質から主に構成される非晶性層により外部から被覆されている（Kopecka M.など．，J.Cell Biol．，62：68-76（1974））。サッカロミセス・セレビシアエの細胞壁から単離された粒状物質（ザイモザン）（Zymosan）は、非特異的免疫刺激体として作用する能力を有することが知られている。酵母細胞壁粒状物の生物学的活性は、β（１−３）−結合のグルカンの存在に大きく帰するが、しかしグルカン及びマンナンの他の２つの形もまた、免疫系を刺激するいくらかの能力を有する。マンナンは、免疫系の細胞による粒状物質、たとえば不溶性β（１−３）−グルカンの吸着及び食作用を仲介することが報告されている（Giaimis，J.,など．，Journal of Leukocyte Biology 54：564-571（1993）；Sun-Song，J．，など．，Journal of Cell Biology 96：160-166（1983））。
β−グルカンを単離するための存在する方法は通常、複数−段階アルカリ−酸抽出方法を使用する（Manners，D.J.，など．，J.Gen.Micro．80：411-417（1974））。アルカリ抽出段階は、非晶性マンノタンパク質及びグルカン材料のほとんどを除去し、そして続く酸抽出段階は、細繊維の主要β（１−３）結合のグルカンからグリコーゲン及びβ（１−６）−枝分れ側鎖のほとんどを除去する。最終溶媒抽出段階は時々、脂質を除去するために使用される。いくつかの用途のためのグルカンの小売価格が与えられているが、存在する公開された又は特許された方法を用いてのグルカンの製造費用は商業的に実施可能でないことが明確である。それらの方法は次の問題を有する：
（ｉ）それらはグルカンの細繊維性アルカリ−不溶性形の製造のみを目的としている。細胞壁に存在する他の形のグルカン及びマンナンは前記方法の副生成物として除去される。それらは、グルカン収率を有意に高めたかもしれずそして機能的に重要であるかもしれないが追加の量のグルカンを表わす。
（ii）既存の方法は有意な設備投資を必要とする。
（iii）既存の方法は、高温での高濃度の苛性アルカリ及び酸処理の必要性のために、危険である。
（iv）前記方法は、従来の技法に基づいて分離することが困難であるアルカリ−不溶性グルカンを含む溶液をもたらし、そしてこれは不十分な回収率をもたらす。
（ｖ）製造費用は、多くの用途における生成物の価値に比較して高い。
酵母細胞壁の電子顕微鏡研究（Kopecka M．，など．，J.Cell Biol．，62：68-76，1974）は、その細胞壁の細繊維成分が、マンノタンパク質の非晶性外部層が酵素による処理により除去される場合に表わされることを示した。
高濃度のアルカリ又は酸の使用及び高温の使用を回避し、アルカリ可溶性グルカン及びマンナンの損失を回避し、グルカン及びマンナンの改良された回収率を有し、そして生物学的に活性的な調製物をもたらす、β−グルカン抽出のための迅速且つ安価な方法についての明確な必要性が当業界において存在する。
本発明者は、β−グルカン−マンナン調製物が中性近くのpH及びわずかに高い温度で、単純な自己消化方法を用いて単離され得、そして食細胞活性、スーパーオキシド生成、病原体及び感染に対する高められた耐性を含む高い免疫刺激活性を有する生成物の卓越した収率が得られることを驚くべきことには見出した。自己消化は酵素又は他の剤による穏やかな条件下での処理により補足され得、そして所望により、グルカン−マンナン生成物の性質は、酸処理、均質化の程度、又は使用される酵素の形の変更により変性され得る。
発明の要約
第１の観点によれば、本発明は、自己消化される生成物から固体材料を分離する前、５〜６のpH及び35〜60℃の温度で６〜48時間、微生物細胞を自己消化する段階を含んで成る、免疫刺激性β−グルカン−マンナン調製物の製造方法を提供する。
第２の観点においては、本発明は、自己消化を引き起こす条件に微生物細胞をゆだねる段階を含んで成る、前記微生物細胞から免疫刺激性グルカン−マンナン調製物の製造のための改良された方法を提供し、ここで前記方法は、前記条件が自己消化された生成物から固体材料を分離する前、５〜６のpH及び35〜60℃の温度で６〜48時間、前記微生物をインキュベーションすることを含んで成ることを特徴とする。
第３の観点においては、本発明は、自己消化を引き起こす穏やかな条件に微生物細胞をゆだねる段階を含んで成る、前記微生物細胞から免疫刺激性β−グルカン−マンナン調製物の生成のための環境的安全な方法を提供し、ここで前記条件は、自己消化された生成物から固体材料を分離する前、５〜６のpH及び35〜60℃の温度で６〜48時間、前記微生物をインキュベートすることを含んで成る。
第４の観点においては、本発明は、微生物細胞の自己消化を引き起こすために上記のような条件を用いての免疫刺激性β−グルカン−マンナン調製物の製造のための経済的方法を提供する。
上記方法により提供されるインキュベーション条件は、グルカン及びマンナンから成る可能性ある免疫刺激性調製物の安価で、効果的で且つ危険性のない態様での調製を可能にする。
特に好ましい態様においては、上記方法は、β（１−３）−グルカンを含んで成る免疫刺激性調製物、より好ましくはβ（１−３）−グルカン−マンナン調製物の製造を導びく。
前記方法に使用される微生物細胞はまた、好ましくは、塩化ナトリウム、エタノール、タンパク質分解性酵素、マンナナーゼ、アミラーゼ及びβ−グルカナーゼから成る群から選択された１又は複数の剤の存在下で、４〜６のpH及び35〜60℃の温度で６〜48時間の追加の自己消化、及び自己消化された生成物からの固体材料の分離にゆだねられる。
所望により、酵素は、細胞の初期自己消化の後に使用され得る。すなわち、自己消化は、自己消化された生成物から固体材料を分離する前、タンパク質分解性酵素、マンナナーゼ、アミラーゼ及びβ−グルカナーゼから成る群から選択された１又は複数の剤の存在下で追加の段階として行なわれる。
好ましくは、自己消化は、50〜60℃の温度で18〜24時間、行なわれる。
１つの特に好ましい態様においては、このようにして生成されたβ−グルカン−マンナン調製物の免疫刺激能力は、２〜４のpHに酸性化することによってさらに改良され；さらにより高い改良性が２〜４のpHへの酸性化、続く熱処理により達成される。前記調製物は、食細胞活性又は非特異的免疫応答を高めることによって、免疫システムを刺激する。
より好ましくは、このようにして生成されたβ−グルカン−マンナン調製物の免疫刺激能力及び粘度は、機械的破壊法、たとえば微粉砕、超音波処理又は加圧均質化を用いて、抽出された材料の粒子サイズを２ミクロン未満、より好ましくは１ミクロン未満に減じることによってさらに高められる。
もう１つの態様においては、微粉砕された酵母が、β−グルカン−マンナン調製物を得るために使用される。酵母細胞は、上記のような条件を用いて、微粉砕期間の間又はそれに続いて、自己消化及び酵素消化にゆだねられる。
もう１つの特に好ましい態様においては、β−グルカン−マンナン調製物の免疫刺激能力及び粘度は、抽出工程に使用される酵素の性質を変えることによって変更される。
発酵産業からの使用済酵母は本発明の方法において特に好ましいが、本発明は、いづれかの源、たとえばβ−グルカンが有意な割合で存在する微生物又は植物材料に適用できることは明確に理解されるであろう。β−グルカンの有用な源であるものとして報告されている微生物は、細菌、たとえばアルカリゲネス（Alkaligenes）、特にAlkaligenes faecalis Var．mixogenes（アルカリゲネス・ファエカリスVar．mixogenes）（ATCC-21680）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）；セルロモナス（Cellulomonas）、たとえばATCC 21399及びセルロモナス・フラビケナ（Cellulomonas flavigena）（ATCC 53707）；及びペスタロチア（Pestalotia）；菌類、たとえばアウレオバシダム（Aureobasidum）、たとえばアウレオバシダム プルランス（Aureobasidum pullulans）株IFO446及びアウレオバシダム種K-1（FERM P1289）；プレウロタス オストレアタス（Pleurotus ostreatus）；マクロホモプシス（Macrophomopsis）、たとえばKOB55株、；ガノデルマ（Ganoderma）；スキゾフィラ（Schizophylla）；ファキマ ホエレン（Fachyma hoelen）；ペスタロチア（Pestalotia）；及びコリオラス（Coriolus）を包含するが、但しこれらだけには限定されない。醸造酵母の他に、食品及び発酵産業に使用される他の酵母も、本発明の目的のために適切である。それらは、粘度付与剤、乳化剤、繊維、フィルム、被覆物質、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル電気泳動のための支持体の製造において、細胞培養培地において、フィルターパッドとして、及びセメントにおいて使用される酵母を含有するが、但しそれらだけには限定されない。それらはまた、食品増粘剤として、及びダイエット繊維の源として、並びに医薬製品におけるキャリヤー及び被覆剤として広く使用される。
当業者は、本発明の方法が酵母以外の生物に使用され得る最とも適切な条件を容易に決定することができるであろう。
当業者は、β−グルカン及びマンナンのいくつかの用途に関しては、本発明の方法を用いて生成される調製物は乾燥形で好都合には供給されることを気づくであろう。調製物は、いづれか適切な方法、たとえば凍結乾燥、ローラードラム乾燥、オーブン乾燥、噴霧乾燥、リング乾燥（但し、それらだけには限定されない）により適切に乾燥され、又はフィルム−形成装置を用いて乾燥され、そして追加の処理を伴わないで使用され得るか又は好ましくは20ミクロン以下の粒子サイズにいづれか適切な装置を用いて微粉砕され得る。他の用途に関しては、湿潤性生成物、たとえば粘性ペーストが適切であり、そしてその調製物は、追加の加工、又は続く機械的粉砕を伴わないで、その粘度を高め、そして粒子サイズを低めるために使用され得る。
第５の観点によれば、本発明は、本発明の方法により製造されるβ−グルカン−マンナン調製物を供給する。本発明のグルカン−マンナン調製物は好ましくは、主にグルカン（たとえば80％まで）及びいくらかのマンナン（たとえば50％まで）を含んで成る。調製物は、β１−２，β１−３，β１−４及びβ１−６グルカンから成る。
調製物は単独で使用され得る。しかしながら、ほとんど通常には、それは他の成分と一緒に供給されるであろう。従って、本発明のこの観点においては、好ましい態様、１又は複数の獣医的に許容できる食品成分と一緒に本発明のβ−グルカン−マンナン調製物を含んで成る、家禽、魚、甲殻類又は貝類飼料組成物；医薬的に許容できるキャリヤーと一緒に本発明のβ−グルカン−マンナンを含んで成る、免疫刺激性、抗コレステロール血症性、低血糖、又は重金属排泄刺激組成物；キャリヤー又はアジュバンドとして、又は固体投与形、たとえば錠剤又はカプセルのための被膜としての本発明のβ−グルカン−マンナン調製物及び医療的活性剤を含んで成る医薬組成物；及び農業的に許容できるキャリヤー及び任意には、農業的に許容できる栄養物又は殺虫剤と一緒に本発明のβ−グルカン−マンナン調製物を含んで成る植物保護組成物を包含するが、但しこれらのみには限定されない。β−グルカン−マンナン調製物はまた、家禽類又は動物への飲料水において、又は魚類、甲殻類もしくは貝類への周囲水においても供給され得る。
本発明の調製物は一般的に、β−グルカンが有用であることが知られている製品への使用のために適切であることが明確に理解されるであろう。いくつかの場合、追加の精製が所望され又は必要であり、そしてそのような場合、それ自体知られている精製段階が使用され得る。
発明の詳細な記載
本発明は現在、次の非制限的な例により詳細に説明されるであろう。
例１ 自己消化抽出
酵母サンプルを自己消化抽出法にゆだねた。使用済醸造酵母（15％の乾量）１ｌを、撹拌しながら、35〜60℃で６〜48時間インキュベートした。pHを、必要なら２ＭのNaOH又は２ＭのHClを用いて、５〜６に調節した。それらの条件は酵母の自己消化、及び細胞壁分解酵素の開放を促進する。前記材料を遠心分離し（3000ｇ、４〜20℃、15分間）、そして沈降物を等量の水により洗浄し、その後、噴霧−又は凍結乾燥せしめた。
例２ 酵素抽出
例１の自己消化抽出法によるグルカン−マンナンの製造を、酵母自己消化を誘発することが知られている物質の添加により改良した。
使用済壌造酵母（15％の乾量）１ｌを、例１の酵素工程により処理した。追加の自己消化を、タンパク質分解性酵素〔パパイン，オプトマーゼ（Optomase APL440）（Solvay）、プロトメックス（Protomex）（Novo）及び／又はマンナナーゼ（Gist Brocades）〕及び／又はα−アミラーゼ〔オプティデックス（Optidex）L300（Solvay），バン（Ban）240L（Novo））及び／又はグルカナーゼSP299（Novo），トニカーゼ（Tonicase）（Solvoy）の添加により誘発した。pHを、必要なら２ＭのNaOH又は２ＭのHClを用いることにより、酵素活性のための最適なpHに調節した。酵母を、撹拌しながら、35〜60℃で６〜48時間インキュベートした。前記材料を遠心分離し（3000ｇ、４〜20℃、15分間）、そして沈降物を等体積の水により洗浄した。沈降物を上記のようにして乾燥せしめた。
例３ 本発明の方法（自己消化及び酵素）により生成されるグルカン−マンナンと従来技術の方法（アルカリ−酸）により生成されたグルカンとの比較
比較目的のため、精製されたβ（１−３）グルカンのサンプルを、Manners，D.J.，など．，Biochemical Journal 135：19-30（1973）の方法に基づくアルカリ−酸抽出方法を用いて調製した。
使用済壌造酵母（20％の乾量）１ｌを、撹拌しながら、水酸化ナトリウム（４％ｗ／ｖ）の等体積により100℃で３時間、抽出し、マンノタンパク質を除去した。材料を遠心分離し（3000ｇ、15分間、４℃）、上清液を捨て、そしてペレットを水酸化ナトリウム（４％ｗ／ｖ）によりさらに４度、抽出した。最終苛性アルカリ抽出段階からの沈降物を、水（２ｌ）により２度洗浄し、そして100℃で３時間、撹拌しながら、酢酸（0.15Ｍ）により抽出し、グリコーゲンを除去した。前記材料を遠心分離し（3000ｇ、15分、４℃）、そして酸抽出段階をさらに３回、くり返した。最終酸段階からの沈降物を水（２ｌ）により２度、洗浄し、そして次に、エタノール（96％ｖ／ｖ）150mlにより洗浄した。前記材料を遠心分離し（3000ｇ、15分、４℃）、その後、その材料を噴霧乾燥し、又は凍結乾燥せしめた。
従来技術の方法（上記）を用いて調製されたサンプル又はアルカリ−酸抽出により調製された市販のサンプルを、本発明に従って調製されたグルカンに比較した。
近似分析をOfficial Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists，Methods 27.8.04，27.6.08，3.2.1.14（mod），27.8.05，Sixteenth Edition，1995に従って実施した。それらの分析の結果は、表Ｉに示される。

従来技術の方法（アルカリ−酸）により生成されるグルカンは、表Ｉに示されるように、本発明の方法により生成されたサンプルに比較して、低いタンパク質及び高い炭水化物含有量を有することを示した。
グルカン調製物のフーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルを、Perkins-Elmen分光光度計を用いて記録した。サンプルを凍結乾燥し、残留湿気を除去し、テトラクロロエチレンにスラリーし、そして水平減衰合計反射率（ATR）セルに基づいて分析した。完全なスペクトルは図１に示される。
従来技術（アルカリ−酸）により調製されたサンプルのFTIRスペクトルは、本発明の方法（図１に示されるような自己消化又は酵素）により調製されたサンプルのスペクトルとは異なった。従来技術の方法により調製されたサンプルは、2955〜2855cm／秒（飽和脂肪酸の表示）、1744cm／秒（グリコシドの表示）、1650cm／秒（タンパク質の表示）において強い吸光度を欠いた。従来技術の方法（アルカリ−酸）により調製されたグルカンサンプルのスペクトルは、950cm／秒のバンドでの強い吸光度を伴って、精製されたβ−グルカン調製物に類似した。
従来技術（アルカリ−酸）及び本発明（自己消化及び酵素）により調製されたサンプルにおけるグルカン及びマンナンの量を、選択抽出及び比色分析（Stewart，P.R.，Methods In Cell Biology ＸII：111-145（1975）に基づく）により決定した。従来の方法により調製されたグルカンサンプルは、表IIに示されるように、本発明の方法により調製されたサンプルに比較して、少ないマンナンを含む。
サンプルをまた、加水分解し、そしてガスクロマトグラフィーにより分析し、糖成分を同定した。サンプルを４Ｍのトリフルオロ酢酸を用いて110℃で４時間、アルゴン下で加水分解した。酸を窒素流下での蒸発により除去し、これに続いて、サンプルを、Harris，P.J.など．，Carbohydrate Research 127：59-73（1984）に記載のようにして、還元し、そしてアセチル化した。加水分解物を、フレームイオン化検出を用いてBP×70カラム上でのガスクロマトグラフィーにより分析した。注入器及び検出器の温度はそれぞれ280及び300℃であった。オーブンを185℃で１分間、維持し、そして次に260℃に３℃／分で上昇せしめ、そして最終温度で５分間、維持した。
従来技術の方法により調製されたグルカンサンプルは、グルコースのみに対応するピークを示し、これは炭水化物成分が表IIに示されるように、主にグルカンであることを示唆する。本発明の方法により調製されたサンプルは、グルコース及び実質的な量のマンノース糖を含み、これは、炭水化物成分がマンノース及びグルカンの混合物であることを示唆する。不溶性β（１−３）−グルカンはマンナンに比較して、酸加水分解に対して比較的耐性であり；従って、ガスクロマトグラフィー法は、比色法に比較して、グルコース（及び従って、グルカン）の濃度を評価する。

アルカリ−酸抽出及び本発明の方法（自己消化及び酵素）を用いて調製されたグルカンサンプルにおけるグルコース残基間の結合のタイプを、Harris，P.J.など．，Carbohydrate Research 127：59-73（1984）の方法に基づく方法を用いて、メチル化分析により決定した。
表IIIにおける結果は、アルカリ−酸方法により調製されたサンプルが、本発明の方法により調製されたサンプルに比較して、（１−３）−結合のグルコースから主に構成されたことを示す。

グルカンサンプルを、マウモデルを用いて、生物学的活性について試験した。３種の方法の個々により生成された材料は、主に100〜300ミクロンの粒子サイズを有した。乾燥された材料を20ミクロン以下の粒子直径にビーズミルにおいて微粉砕し、そしてそれを用いて、マウスに腹腔内注射した（２mg／マウス）。72時間後、腹膜滲出液中に誘発された細胞を腹腔から収穫し、熱殺害された酵母細胞と共にインキュベートし、そして食細胞の％を計算した。
本発明（自己消化又は酵素）に従って調製された材料は、炎症細胞を誘引する注入された材料の化学走化性効果のために、腹腔における細胞の数の上昇、及び食細胞性好中球の数の上昇により示されるように、アルカリ／酸抽出方法により調製される材料よりも、非特異的免疫応答の誘発で、より効果的である。それらの結果は、表IVに示される。

観察される有益な効果についていづれの提案される機構にも拘束されることを所望しないが、本発明者は、マンナン及び非−β（１−３）−結合のグルカンがより良好な免疫応答を生成するために細繊維性β（１−３）−結合のグルカンと共に相乗的に作用することを確信する。
例４ 酸性化によるグルカン−マンナン調製物の効力の改良
使用済壌造酵母（15％の乾量）１ｌを、例１の酵素方法により処理した。沈降物のアリコートを凍結乾燥せしめた。残る沈降物のpHを塩酸又は酢酸のいづれかにより２〜４に調整し、そして次に、その沈降物を凍結乾燥するか又は80℃でオーブン乾燥せしめた。糖結合を、例３に記載されるようにして、GC-MSにより分析した。
グルカン−マンナン材料を20ミクロン以下に微粉砕し、そして例３に記載されるようにして、食細胞を誘発する能力について試験した。表Ｖの結果は、酸性化、続くオーブン乾燥が免疫応答の刺激でのグルカン−マンナンの能力を改良し、そして酸性化、続く熱処理がβ（１−６）−結合のグルカンのいくらかを分解し、たぶん、微細繊維グルカンにおける活性部位の多くを表わすことを示す。

例５ 粒子サイズを変えることによるグルカン−マンナン調製物の効力の改良
いくつかの材料の効力はその粒子サイズを変えることによって有意に変更され得ることが知られている。使用済壌造酵母（10％の乾量）１ｌを、例１の酵素方法により処理した。最終沈降物を水に再懸濁した（20％の乾量）。この段階で、グルカン−マンナン材料は、顕微鏡的には、約４〜６ミクロンの直径の別々の球体として見えた。その懸濁された沈降物のアリコートを、0.25〜１mmの直径の種々のビーズサイズのガラスビーズを用いて、Braun細胞ホモジナイザーにより６分間処理した。これにより、グルカン球体は２ミクロン以下のサイズの粒子に破壊され、そしてホイップドクリームのような稠度を有する高粘性生成物をもたらした。その生成物は、例３に記載される方法により試験される場合、非特異的な免疫応答を刺激する良好な効力を示した。
前記方法の変法においては、新鮮な収穫された酵母細胞をビース微粉砕し、細胞を破壊した。その微粉砕の間又はそれに続いて、酵母細胞を、例１又は２に記載される条件に類似する条件を用いて、自己消化及び酵素消化にゆだねた。不溶性材料を遠心分離により収穫し、そしてマウスモデルを用いて生物学的活性について試験した。結果は表VIに要約される。

酵母又はグルカン粒子の砕解のためには、多くの他の湿潤微粉砕方法及び装置が使用され得る。それらは、圧力均質化（Manton Gaulin）、ビーズ微粉砕、及びボール微粉砕（Dryno−ミル、Draisミル、Netzschミル）を含有するが、但しこれらだけには限定されない。
例６ 使用される酵素の性質を変えることによるグルカン−マンナン調製物の効力の改良
新しい酵母スラリー（16.5％の乾量）を水により洗浄し、そして次に、撹拌しながら、50℃で17時間インキュベートした。自己消化された酵母を100℃に30分間、加熱し、そして次に、２つのバッチに分けた。
１つのバッチをSolvayからの酵素により処理した。酵母を１％（ｗ／ｗ）オプチマーゼ（Optimase）APL-440（タンパク質分解酵素）と共に47℃及びpH９で２時間、撹拌しながらインキュベートした。次に、pHを7.5に下げ、そして１％（ｗ／ｗ）ツニカーゼ（Tunicase）FN（グルカナーゼ）酵素を添加した。６時間のインキュベーションの後、１％オプチデックス（Optidex）（グルコアミラーゼ）を添加し、そしてその混合物を、60℃及びpH4.5で６時間、さらにインキュベートした。粘性沈降物が得られた。その沈降物を乾燥せしめ、そしてボール微粉砕した。
第２バッチを、Novoからの酵素と共にインキュベートした。酵母を、１％（ｗ／ｗ）BAN（グルコアミラーゼ）及び１％（ｗ／ｗ）ムタナーゼ（Mutanase）SP299（グルカナーゼ）酵素と共にpH5.5で６時間、撹拌しながらインキュベートした。１％プロトメックス（Protomex）（タンパク質分解性酵素）を添加し、そしてその混合物を55℃及びpH5.5でさらに16時間インキュベートした。
異なる実験において、例１に従って調製されたグルカン−マンナンを、１％（ｗ／ｗ）ツニカーゼ（Tunicase）により処理した（pH7.5、35℃、６時間）。ツニカーゼ（Tunicase）により処理されたグルカン−マンナンは、粘度が高くなった。その調製物を遠心分離し、そして沈降物を凍結乾燥せしめ、そして微粉砕した。前記ツニカーゼ（Tunicase）処理されたグルカンからの上清液を蒸留水に対して集中的に透析し、そして凍結乾燥せしめた。
グルコース残基とグルカンサンプルとの間の結合のタイプを例３に記載のようにして分析した。生物学的活性をまた、マウスモデルを用いて試験した。結果は表VIIに示され、これは酵素がグルカン調製物の性質を変えるために使用され得ることを示す。たとえば、ツニカーゼ（Tunicase）（Solvay）による処理は、グルカン調製物において減じられたβ（１−６）−結合を有する粘性の生成物をもたらす。酵素をまた用いて、グルカンの生物学的活性の可溶性形を生成することができる。

例７ グルカン−マンナン調製物の粘度の変更
例２に記載されるようにして調製されたグルカン−マンナンの粘度をまた、酸性化（例４）、微粉砕（例５）、及び使用される酵素のタイプを変える（例６）ことにより変更することができる。粘度を、60mmプレートを有するCSL100レオメーターを用いて測定した。測定は、10％（ｗ／ｖ）グルカン上清液を用いて100／秒の剪断速度で、20℃で測定され、そしてその結果は表VIIIに要約される。

従って、グルカン−マンナン調製物の粘度を加熱、酸、酵素及び粒子サイズの変更により変えて、粘性材料を製造することができる。これは、クリーム、ゲル又は同様のものとして使用され得る。
例８ 魚における免疫エンハンサーとしてのグルカン−マンナン調製物の有効性
ニジマス（オンコリンカス ミキス（Oncorhynchas mykiss））を、ビクトリアの魚業から得た。そのニジマスは平均13ｇの体重を有し、そして６×260ｌの実験用タンクに分配され、そして個々の水槽は12匹の魚を有した。魚を、実験の開始前、７日間、順応せしめた。
標準のニジマス用ペレット用い、そして魚は、１日当たり体重の約５％で毎日２度、飼料を与えられた。グルカン−マンナン調製物を規定食中に導入し、最終飼料中、0.1％（ｗ／ｗ）の最終濃度にした。対照規定食を包含するすべての規定食を再ペレット化し、そして50℃で乾燥せしめた。飼料供給上での３週間後、魚をベンゾコカイン（１：10,000）により麻酔し、そして殺害した。
前腎を、ml当たり１単位のヘパリンを含む組織培養培地中に収穫した。組織を、ステンレス鋼製80ゲージのメッシュ篩を通してほぐし、単一の細胞を単離した。細胞懸濁液をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Gibco Laboratories）により洗浄した。細胞をニトロブルテトラゾリウムアッセイにゆだね、スーパーオキシドアニオンの生成を検出し（Rook，J．，など．，J.Immunol.Methods 82：161-167（1985）に基づく）、そして食作用測定にゆだね、酵母細胞を食作用する能力を決定した。
例２に記載されるようにして、生成されたグルカン−マンナンは、表IXに示されるように、ニジマスにおける前腎から単離された細胞においてスーパーオキシドアニオンの生成及び食細胞活性を高めることが見出された。データは、例２に記載されるようにして生成されたグルカン−マンナンがニジマスにおいて免疫システムを刺激することができることを示す。

例９ 魚における死亡率を下げるグルカン−マンナン調製物の能力
生後、一年未満のニジマス（オンコリンカス・ミキス）を、タスマニア（Tasmania）における魚業から得た。それらは65ｇの平均体重を有した。魚を６つの隔離された水槽間に分配し、そして16匹の魚を個々の水槽に分配した。魚を、15℃の空気温度及び13〜18℃の水温で維持し、そして実験の開始の前７日間、順応化した。
魚には、１日当たり体重の約2.5％の、Gibsonのマス用ペレットを飽きるまで毎日、飼料として与えられた。グルカン調製物（例２に従って調製されたグルカン又はアルカリ／酸抽出方法を用いて生成されたグルカンのいづれか）を、５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液中に導入し、そしてペレット上に被覆し、最終飼料において0.1％（ｗ／ｗ）のグルカン濃度を付与した。対照の魚に与えられるペレットをゼラチンのみにより被覆した。次の飼料供給スケジュールが利用された：補充された飼料に基づいて14日、続いて補充されていない飼料に基づいて42日、そして次に、補充された飼料に基づいてさらに14日。補充の第２期間の１週間後、魚はビブリオ・アングイラリウム（Vibrio anguillarum）によりチャレンジされた。
Ｖ．アングイラリウム血清型ＣのTasmania株（血清型01に等しい）を用いた（Munday，B．，など．，Immunology and Cell Biology 70：391-397（1992））。前記生物は、２％NaClを補充した栄養ブイヨン培地において増殖された。
魚は、Ｖ．アングイラリウム３×10⁷c.f.u.（LD₅₀の用量）を腹腔内注射することによって前記生物よりチャレンジされ、そして10日間、毎日、少なくとも２度観察された。死亡したすべての魚は、Ｖ．アングイラリウムについて培養された。
死亡は、接種に続いて３日の間に生じた。接種に続いて、３日及び４日目に、対照グループの多くが不活発になり、そしてひれの基部で及び腹部上に充血を有したが、しかし追加の死亡はこのグループにおいては記録されなかった。
Ｖ．アングイラリウムによるチャレンジに続いて、本発明のグルカンの保護効果は明らかであった。アルカリ−酸方法を用いて調製されたグルカンは表Ｘに示されるように、効果が低かった。

前記結果は、例２に記載されるようにして生成されたグルカン−マンナンがビブリオ・アングイラリウムによる感染に対するニジマスの耐性を改良するために使用され得、そして従来技術のグルカン調製物よりも卓越していることを示す。
例10 エビ ペナエウス・モノドン（Penaeus monodon）における死亡率を低めるグルカン−マンナン調製物の能力
５〜10ｇのＰ．モノドン エビを、クイーンスランド（Qneensland）の魚業から得た。12匹のエビを、12×60ｌの水槽中に計量測定した。エビは、水槽において５日間、順応せしめられ、そして次に、対照又は処理用規定食を与えられた。23日後、エビに、ビブリオ・ハルベイ（Vibrio harveyi）をLD₅₀量で注射した。死亡率を７日間モニターした。この期間、エビは対照又は処理用規定食のいづれかを与えられた。
すべてのエビは、蒸気ペレット化された標準規定食（CP100）を与えられた。本発明のグルカン−マンナンを、上記ペレットの表面へのゼラチンによる接着により処理用規定食に添加した。約５％（ｗ／ｖ）のゼラチン溶液を調製し、そして100ml／kgペレットの割合で対照規定食中に混合した。処理用規定食のために使用されるゼラチン溶液は、例２に従って調製された十分なグルカン−マンナン又はアルカリ／酸抽出方法を用いて生成されたグルカンを含み、最終規定食において0.1％（ｗ／ｗ）の最終濃度を確保した。飼料を与える割合は、１日当たりエビの体重の５〜6.5％であった。
Ｖ．ヘルベイの病原株、すなわち死にかけているＰ．エスキュレンタス（P．esculentas）エビから単離された656株を、チャレンジ研究のために使用した。細胞を、ビタミンを含む海水液体ブイヨンにおいて26〜28℃で一晩、継代培養した。細胞を0.73％（ｗ／ｖ）塩溶液により３回洗浄し、そして2,000rpmで40℃で30分間、遠心分離した。振盪混合を個々の段階で用いた。細菌懸濁液の一連の希釈溶液を調製し、そして個々の希釈溶液を、LD₅₀用量を計算するために未処理のテナガエビ中に注射した。個々の一連の希釈溶液からの0.1ml溶液を、ビタミンを含む42℃の海産寒天（MAV）25mlと共に混合し、そしてペトリ皿中に注いだ。26〜28℃での24時間後、コロニーを計数し、そして個々の接種懸濁液における細菌の数を計算した。注入プレートを用いて、0.05mlの注射体積における細菌の数を計算した。
0.05ml中、１〜２×10⁵個の用量で注射される株656Ｖ．ハルベイを最終的に、LD₅₀挑戦のために選択した。エビの第２の腹部セクションに注射した。死亡率を、次の７日間、毎日、記録し、そして死亡率は次のようにして計算された：

エビの動作及び健康を、Ｖ．ハルベイによるチャレンジの前、飼料供給段階においてモニターした。成長に対しての有意な効果は存在しないけれども、例２に記載されるようにして調製されたグルカン−マンナンの規定食に基づくエビは、良好な食欲を有し、より活発に存在し、そして低い死亡発生率を示した。
Ｖ．ハルベイによるチャレンジの後、本発明のグルカンの保護効果は明確であった。アルカリ／酸方法に従って調製されたグルカンは、表ＸＩに示されように、ほとんど効果的ではなかった。

従って、例2に記載されるようにして調製されたグルカン−マンナンは、エビＰ．モノドンの疾病耐性を都合良く改良するために使用され得る。
例11 家禽類における耐疾病性を強めるグルカン−マンナン調製物の能力
240匹の雌雌混合のブロイラー鶏を、４種の異なった規定食処理間に割り当てた。ブロイラーひよこを、２つのバタリー育すう器に収容し、そして区画当たり10匹のひよこで24の区画に均等に割り当てた。ひよこは、標準の非薬物添加の市販の規定食（対照）又は１ｇ／kg飼料で飼料中に導入されたグルカン−マンナンを有する標準の規定食のいづれかにより飼料を与えられた。グルカン−マンナンは、例２の方法又は例５の方法（微粉砕の間、又はそれに続いての酵素作用）に従って調製された。ひよこは、生後１日〜21日の間に、規定食を任意に与えられた。成長速度を、毎週モニターした。
飼料供給試験の最後で、個々の処理からの18匹の鳥から採血した。血液をヘパリン処理された管に収集し、そしてPBSにより２度洗浄した。循環血液リンパ球の殺菌活性を、小血液サンプルから白血球を単離し、そしてスタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の生存懸濁液と共にインキュベートすることによって評価した。１時間のインキュベーション期間の後、血液細胞を溶解し、そして生存細菌の数を測定した。
個々の処理からのさらなる20匹の鳥をバブル分離器に移し、ここで１つの分離器には１つの処理グループが存在した。個々の鳥から採取された便の綿棒標本は、鳥がサルモネラ菌を有さないことを確証した。鳥を、サルモネラ・タピムリウム（Salmonella typhimurium）の操作された菌株（ナリジキシン酸耐性）により経口接種した。個々の処理からの５匹の鳥を、種々の間隔で殺し、そしてサルモネラ菌の数を、胃腸管から計数した。結果は表ＸII及びＸIIIに要約される。

表ＸIIは、グルカン−マンナンが成長速度において２〜３％の改良をもたらしたことを示す。グルカン−マンナン調製物はブロイラー鶏における免疫応答を強化し、そして耐感染性能力を増強し、他方、表ＸIIIは、規定食へのグルカン−マンナンの添加がブロイラー鶏におけるサルモネラ菌のコロニー形成の発生率及び程度を有意に減じたことを示す。
例12 機能飲料物
本発明のグルカン−マンナン調製物を飲料物又は食品（たとえばヨーグルト）に添加し、感染しやすいヒト、たとえば免疫無防備状態の個人、集中的なトレーニング中の運動選手、及び消耗性ライフスタイルを有するか、又は胃腸管問題を有する個人の健康を改善することができる。非アルコール飲料として使用するための適切な配合物は次の通りである：ニンジン、トマト及び／又はオレンジの25％ジュース含有物及び１％（ｗ／ｖ）のグルカン調製物。
要 約：
（ｉ）マンナンを含み、そして免疫刺激活性を有する粒状グルカン調製物の生成のための本発明者の方法は、アルカリ−酸、フェノール、水又は溶媒抽出に基づく、これまで知られている方法とは相当に異なる。
（ii）本発明の方法により生成されたグルカン−マンナン材料は、アルカリ−酸抽出方法により生成されたものよりも低い純度のものであるが、それは、マウスにおける非特異的免疫応答を刺激するより高い効力を有する。
（iii）本発明のグルカン−マンナン材料の活性は、熱−乾燥の前に、その材料を酸性化することによって改良され得る。
（iv）本発明のグルカン−マンナン材料の粘度及び生物学的活性は、その粒子サイズ、酸処理及び酵素処理により有意に変更され得る。
本発明のグルカン−マンナン材料は、次の多くの分野において有用であるが、但し、それだけには限定されない：
ｉ）水産養殖：種々の水上感染に対する骨性魚及び甲殻類の耐性を高めるためである。そのグルカン材料は、調製された魚用飼料に投与され得る。
ii）動物農業：グルカン材料は、貯蔵飼料、ペットフード及び流体形で、動物及び家禽類に投与され得る。
iii）獣医学的及び医学的使用：グルカン−マンナン材料は、局所用創傷−治癒クリームもしくはフィルムとして投与され得、又は経口的に、鼻腔内的に、又は非経口注射により投与され得る。
iv）食品補充物として：副生成物として生成される酵母細胞壁材料は、増粘剤として、又はサラダドレッシング、スープ、スプレッド、ソース等にダイエット用繊維を供給するために使用されるすでに許容されている食品添加物であり、そして疾病に対する耐性を促進するために“機能的”食品及び飲料物において有用である。
ｖ）化粧品：日焼けを減じるためにクリーム及びローション及び過敏性皮膚のための配合物に使用される。
vi）医薬：創傷−治癒剤、抗癌剤、又は免疫抑制された患者又は感染しやすい患者における抗感染剤として使用される。本発明の生成物は、クリーム、ローション、錠剤、マウスウォッシュにおいて使用され得、又はその材料は、火傷のための包装材料としての使用のためのフィルムに乾燥せしめられ得る。それは、ワクチン、抗生物質又は他の医薬製剤と共にアジュバンドとして使用され得る。
本発明のグルカン−マンナン生成物は、従来技術に記載されているβ−グルカンの使用に適用できることは明確に理解されるであろう。
本発明は明確さ及び理解のためにいくらか詳細な記載されて来たが、本明細書に記載される態様及び方法に対する種々の修飾及び変更が本発明の範囲内で行なわれ得ることは、当業者に明らかであろう。

Claims (17)

1,3-β-グルカン及び1,6-β-グルカンを含んで成るβ-グルカン類並びにマンナン類を含んで成る免疫刺激性調製物の製造方法であって、
ａ）β−グルカンを含む細胞を、５〜６のpH及び35〜60℃の温度での６〜48時間第一自己消化にかけて、100〜300ミクロンの粒子サイズを有する物質を生成せしめ、ここで当該β−グルカンを含む細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）及びカンジダ（Candida）から成る群から選択された属の酵母、アルカリゲネス（Alkaligenes）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）及びペスタロチア（Pestalotia）から成る群から選択された属の細菌、又はアウレオバシダム（Aureobasidum）、プロウロタス（Pleurotus）、マクロフォモプシス（Macrophomopsis）、ガノデルマ（Ganoderma）、シゾフィラ（Schizophylla）、ファチメ（Fachyma）及びコリオラス（Coriolus）から成る群から選択された属の菌類であり；
ｂ）前記自己消化生成物から固体材料を分離し；
ｃ）前記工程ｂ）からの固体材料を、タンパク質分解酵素、マンナーゼ、アミラーゼ及びβ-グルカナーゼから成る群から選択された１又は複数の剤の存在下で、４〜６のpH及び35〜60℃の温度にて６〜48時間の第二の自己消化にかけ；
ｄ）前記自己消化生成物から固体材料を分離し；そして
ｅ）前記固体材料を、２ミクロン未満の粒子に小粒化する；
ことを特徴とする方法。

前記第一自己消化の工程を50〜60℃の温度で行なう、請求項１に記載の方法。

前記どちらか一方又は両方の自己消化工程を18〜24時間行なう、請求項１又は２に記載の方法。

前記第一自己消化を、塩化ナトリウム、エタノール、タンパク質分解酵素、マンナナーゼ、アミラーゼ、及びβ−グルカナーゼから成る群から選択された１又は複数の剤の存在下で行なう、請求項１に記載の方法。

前記タンパク質分解酵素が、バシルス・リケニホルメス（Bacullus licheniformis）の発酵により生産される細菌性アルカリ性プロテアーゼ及びバシルス・スペーシス（Bacillus species）から得られるプロテアーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。

前記β−グルカナーゼが、アースロバクター・スペーシス（Arthrobacter species）の発酵により生産される酵母細胞壁分解酵素及びトリコデルマ・ハリアヌム（Trichoderma harianum）の発酵により生産される酵素複合体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

前記アミラーゼが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の株により生産されるグルコアミラーゼ及びバシルス・アミロリケンファシエンス（Bacillus amylolichnfaciens）の発酵により生産されるα−アミラーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。

前記β−グルカン及びマンナン調製物が更に、pH２〜４の酸性化にかけられる、請求項１に記載の方法。

前記酸性化の後に熱処理を行なう、請求項８に記載の方法。

前記β−グルカン及びマンナン調製物の粒子サイズを１μMより小さくすることにより、当該調製物の粘度を高める、請求項１に記載の方法。

前記粉砕方法が、微粉砕、超音波処理及び加圧均質化から成る群から選択される請求項10に記載の方法。

前記生成方法に使用されるタンパク質分解酵素により、前記β−グルカン−マンナン調製物の免疫刺激性能力及び粘度を変更する、請求項７に記載の方法。

前記固体物質の直径が１μm未満である、請求項１に記載の方法。

前記工程ｅ）の生成物が、少なくとも８％のマンナンを含んで成る、請求項１に記載の方法。

機械的破砕工程を用いることによる、粒子サイズを減少させる、請求項10に記載の方法。

前記第一自己消化工程のpHが５〜６であり、35〜60℃の温度での６〜48時間の自己消化にかけられ、そして直径が２ミクロン未満である、請求項１に記載の方法。

前記工程ｅ）の生成物が1,3−連結及び1,6−連結グルコースモノマーを含んで成り、1,3−連結グルコースモノマーと1,6−連結グルコースモノマーとの比率が4.9：１〜7.3：１である、請求項１に記載の方法。

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