BG1325U1

BG1325U1 - Фуражна добавка, съдържаща разтворими мананолигозахариди

Info

Publication number: BG1325U1
Application number: BG1697U
Authority: BG
Inventors: Спас Петков; Валери НАЗАРОВ
Original assignee: "Хювефарма" Ад
Priority date: 2009-11-02
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2010-06-30

Abstract

Полезният модел се отнася до фуражна добавка, която съдържа разтворими мананолигозахариди и намира приложение в зоотехниката. Добавката се получава чрез култивиране на дрожди, които синтезират извънклетъчни мананолигозахариди. Дрождите са от рода Candida, Klebsiela, Torula, Rhodotorula или Saccharomyces. Фуражната добавка, съдържаща разтворими мананолигозахариди, намира приложение при храненето на известни животински видове, включително свине, птици, преживни, риби и аквакултури, като се постига подобряване на прираста на отглежданите животни и усвояването на фуража.

Description

Област на техниката

Полезният модел се отнася до фуражна добавка, която съдържа разтворими мананолигозахариди и намира приложение в зоотехниката. Добавката се получава чрез култивиране на дрожди, които синтезират извън клетъчни мананолигозахариди. Приложението на добавката към фуражи за животни води до подобряване на прираста на отглежданите животни и подобряване усвояването на фуража.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е използването на антибиотици като хранителни добавки в диетите на индустриално отглежданите животински видове, което е широко застъпено в практиката и води до подобряване на зоотехническите параметри, намалява смъртността и заболеваемостта на третираните животни. Включването на антибиотици в хранителните диети на животните може да доведе до кръстосана резистентност на някои патогени при човека. Все повече се налага тенденцията за ограничаване приложението на антибиотиците като растежни фактори в храната на животните и тяхната замяна с пробиотични и пребиотични препарати.

Пребиотиците се дефинират като неусвоими съставки на храните, чийто положителен ефект върху здравето на приемащите ги организми се дължи на стимулиране на растежа и/ или активността на полезната микрофлора или на потискане на развитието на нежеланата микрофлора в храносмилателния тракт на животните и/или човека. Най-често пребиотиците представляват неусвоими олиго- или полизахариди, като бета-глюкани, манани, мананолигозахариди и фруктоолигозахариди.

Съществуват научни съобщения за положителния ефект на мананолигозахаридите при храненето на известни животински видове, включително свине, птици, преживни, риби и аква-култури. Мананолигозахаридите потискат развитието на патогенните микроорганизми в гастроинтестиналния тракт чрез ограничаване на възможността им за колонизация и проявяват имуномодулаторен и бифидогенен ефект [1].

Известни като основен източник на мана нолигозахариди към момента са клетъчните стени на дрождите. В литературата съществуват данни за използването на фуражни добавки съдържащи мананолигозахариди, които са получени чрез изолиране от дрождеви клетъчни стени. За целта често се използват пивни дрожди, които се явяват отпадъци при пивопроизводството. Недостатък на тези продукти е необходимостта от предварителна обработка на дрождените клетъчни стени с цел изолиране на мананолигозахаридите. Мананът, влизащ в състава на клетъчните стени на дрождените клетки е под форма на фосфо-манан-протеинов комплекс. Изолирането на манана от клетъчните стени е трудно осъществимо поради формирания стабилен комплекс манан-протеин.

В известното ниво на техниката, в процеса на изолиране на въглехидратната фракция от дрождевите клетъчни стени основно се прилага алкална екстракция, което води до значително намаляване степента на полимеризация на манана в резултат на протичащо деполимеризиране по механизма на бета-елиминация. От гледна точка на приложението на тези продукти при храненето на животните този ефект на намаляване степента на полимеризация е нежелан. По-нискомолекулните продукти по-лесно могат да се хидролизират в киселата среда на стомаха до съставящите ги монозахариди, което улеснява тяхната резорбция и усвояване. По този начин тази предварителна обработка би намалила очаквания положителен ефект върху чревната микрофлора и имунномодулираща и бифидогенна функция.

В WO 1995/004467 е посочено използването на бета-глюкани изолирани от дрождени клетъчни стени като фактор, подобряващ зоотехническите параметри при отглеждане на свине. Основното в патента е необходимата предварителна обработка на дрождевите клетъчни стени с цел изолиране на бета-глюкана от останалите компоненти на клетъчната стена, за да се засили неговият ефект. Използваната обработка на неразтворимите дрождени стени с цел изолиране на р-глюканите включва третиране с ензими, силно алкални и силно кисели разтвори.

В US 6444448 В1 са посочени основните методи за изолиране на въглехидратната компонента от клетъчните стени на пивни дрожди:

(i) Екстракция при висока температура с

1325 Ul концентрирана натриева основа, последвано от високотемпературна екстракция с разтвор на киселина и утаяване с етанол.

(й) Екстракция при висока температура с концентрирана натриева основа, последвано от високотемпературна екстракция с разтвор на киселина и ензимно третиране с цел промяна или пречистване на въглехидратната фракция.

(iii) Екстракция от предварително автолизирани или ензимно лизирани дрожди.

(iv) Екстракция с алкални разтвори на органични разтворители като изопропанол, етанол, ацетон или метанол.

Необходимостта от посочените технологични процеси води до трудността при производството на ефективни фуражни добавки, съдържащи мананолигозахариди. Присъствието на мананите в дрождевите клетъчни стени под формата на неразтворими фосфо-протеинови комплекси и трудното им освобождаване от клетъчни стени прави употребата на фуражни добавки получени от такива източници или скъпа или неефективна.

Техническа същност на полезния модел

Същност на настоящия полезен модел е фуражна добавка, съдържаща разтворими мананолигозахарид и, получени чрез култивиране на дрожди, които синтезират извънклетъчни мананолигозахариди. Така получените продукти могат да бъдат използвани като добавка към фуражи за животни и водят до подобряване прираста на отглежданите животни и подобряване усвояването на фуража.

Някои микроорганизми, в това число дрожди, продуцират в големи количества извънклетъчни поли- и олигозахариди. Дрожди от рода Candida, Klebsiela, Rhodotorula и Saccharomyces синтезират в големи количества извънклетъчни мананолигозахариди, които са в разтворима форма и не са в комплекс с други съединения. Количеството и състава на синтезирания полизахарид зависи от биосинтетичните способности на използвания щам, условията на култивиране и съставът на хранителната среда. Употребата на така получените фуражни добавки, съдържащи разтворими мананолигозахариди е атрактивна поради процеса на получаване и възможността за по-висока ефективност от приложението им, което е вследствие на това, че те са в свободна форма и разтворими във водни среди.

В частност целта на полезния модел е да опише фуражна добавка, която съдържа мананолигозахариди, получени чрез ферментация на дрожди от рода Rhodotorula и приложението на получения препарат за подобряване на зоотехничските показатели при отглеждането на животински видове. В резултат на дълбочинното култивиране на дрожди от рода Rhodotorula sp. в културалната течност се натрупва значително количество извънклетъчен мананолигозахарид. Полученият манан е в разтворима форма, което не изисква допълнителни процедури за изолиране на манана от клетъчните стени. Така получения продукт е лесен за получаване и е безопасен за употреба. Възможно е чрез известни методи за екстракция и пречистване да се получи високопречистен мананолигозахарид, което не е възможно при използването на дрождеви клетъчни стени като източник на манан. Като алтернатива, ферментационната течност може да се подложи на сушене за получаване на технически продукт, който съдържа разтворим мананолигозахарид.

Ферментацията на дрожди с цел получаване на разтворими мананолигозахариди се провежда чрез метода на дълбочинно култивиране. Оптималната среда за развитие, която задължително съдържа източници на въглерод, азот и микроелементи се стерилизира и се посява с чиста култура на щам-продуцента. По време на процеса се следи съдържанието на въглеродния източник и е възможно да се подаде допълнително количество. По време на процеса щама натрупва извънклетъчно мананолигозахарид, което води до увеличаване на вискозитета на ферментационната среда. Примерен метод за ферментация на дрожди, които продуцират разтворими мананолигозахариди е даден в примери 1 и 2.

Полученият чрез ферментация разтворим мананолигозахарид може да бъде изолиран чрез известни методи. Когато целта е да се постигне пречистен продукт, най добре е да бъде отделена дрождевата биомаса чрез филтрация или центрофугиране и получения филтрат (или центрофугат), който съдържа разтворения мананолигозахарид да бъде подложен на утаяване чрез добавяне на алкохол. Например, при добавяне на три части етилов алкохол към една част от супернатантата се постига утаяване на чист мананолигозахарид, който може да бъде отделен

1325 Ш чрез филтрация и изсушен. Характеристиките на пречистения мананолигозахарид са дадени поподробно в пример 3. Установено е, че чрез утаяване е възможно да се получи продукт, който съдържа над 60% въглехидрати, с високо съдържание на манан. Чрез последващо разтваряне във вода и утаяване с алкохол може да бъде получен по-пречистен продукт.

Когато полученият мананолигозахарид е предназначен за употреба като фуражна добавка, не е необходимо да се извършва изолиране и пречистване. Причина за това е факта, че дрождевата биомаса и ферментационната среда съдьржат хранителни компоненти, които не са вредни и имат висока хранителна стойност, като източник на белтъчини, въглехидрати и микроелементи. В този случай, оптималния вариант е след края на ферментацията, цялата културална течност да бъде подложена на изсушаване, чрез разпрашително сушене или друг метод. По този начин се получава прахообразен продукт, който може да се добавя към фуража или да се смесва с други микроелементи, витамини или нутритивни вещества, преди да бъде използван като фуражна добавка. Една от техническите трудности, която трябва да се преодолее при разпрашителното сушене на ферментационна течност, съдържаща разтворими мананолигозахариди, е предотвратяване на залепването по сушилнята и намаляване хигроскопичността на получения продукт. Това се постига чрез влагане на минерални или други вещества, които подобряват течливостта на продукта и намаляват неговата хигроскопичност. Като подобряващи течливостта вещества се използва калциев карбонат, силициев двуокис, натриев сулфат, калциев сулфат. Като вещества, които намаляват хигроскопичността на продукта се употребяват силициев двуокис, калциеви силикати и други. Получаването на течлив прахообразен продукт съдържащ мананолигозахариди е описано в Пример 4.

Получените мананолигозахариди влизат в състава на фуражни добавки. Фуражните добавки са вещества, които се добавят към фуража с цел да подобрят нутритивната стойност на фуража. Фуражните добавки могат да се състоят от едно или повече вещества или компоненти. В този смисъл е ясно, че получените разтворими мананолигозахариди, било в пречистен вид или като технически продукт чрез разпрашително сушене, могат да бъдат самостоятелно използвани като фуражна добавка или да бъдат смесени с други такива и да представляват само една част от състава на фуражната добавка.

При използване на получените фуражни добавки с високо съдържание на манан в диетата на промишлено отглеждани животински видове се наблюдава подобряване на зоотехническите характеристики. Зоотехническите характеристики се определят чрез два основни показателя: прираст и ефективност на усвояване на фуража. Прирастът представлява увеличаване теглото на отглежданите видове. Той може да бъде подобрен, ако се достига по-бързо някакво предварително определено (регламентирано) тегло, или ако накрая на предварително определен период се достига по-голямо тегло.

Ефективността на усвояване на фуража представлява съотношението между изконсумираният фураж и постигнатия за дадения период прираст. Колкото това съотношение е по-ниско, толкова по-голяма е ефективността от работата на фермата, тъй като за постигане на едно и също тегло, е необходимо по-малко количество фураж.

Примери за изпълнение на полезния модел

Следващите примери илюстрират ефекта от полезния модел, но не бива да се счита, че го ограничават по какъвто и да е начин.

Пример 1.

Получаване на извънклетъчен разтворим мананолигозахарид.

Настоящият пример описва получаването на извънклетъчен манан от Rhodotorula mucilaginosa MUCL 45531. Процесът на култивиране се извършва в ерленмайлерови колби от 500 cm³ с обем на запълване 100 cm³. Съставът на хранителната среда е представен в Табли -ца 1.

1325 Ul

Таблица 1. Компонентен състав на хранителната среда

Компонент	Концентрация,
Меласа	10-100
(NHO2SO4	0.1 -10
Пивни дрожди	0.1-100
КН2РО4	0.01-10
MgSO4.TH₂O	0.01-10
NaCl	0.01-10
СаСЬЖгО	0.01-10

Хранителната среда се стерилизира при 118°С за 30 min. След стерилизация хранителната среда се охлажда до 36°С, след което се инокулира с 10 % (v/v) вегетативен посевен материал. Култивирането се осъществява при непрекъснато разбъркване на клатачен апарат при 200 rpm за 90-100 h. В края на ферментационния процес културалната среда представлява вискозна течност и съдържа мананолигозахариди в разтворен вид.

Пример 2. Получаване на разтворим мананолигозахарид във ферментатори.

Целта в настоящия пример е да се опише получаването на извънклетъчен манан от Rhodotorula mucilaginosa MUCL 45531 в биореактор с обем 100 dm³. Процесът на култивиране се извършва в биореактор с тотален обем 100 ³θ dm³ и обем на запълване 60 dm³. Съставът на хранителната среда е представен в таблица 1. Подготовката на хранителната среда и ферментационният процес се провеждат съгласно методиката, описана в пример 1. Култивирането ³⁵се осъществява при непрекъснато разбъркване, надналягане 0.3-0.5 bar, аерация 0.5 dm³/dm³.min и продължителност 90-100 h. Вискозитетът на културалната среда е 80.0-90.0 сРа.

Пример 3. Изолиране на продуцирания извънклетьчен манан и характеризиране на получения разтворим мананолигозахарид

Настоящият пример описва процеса на изолиране на продуцирания извънклетъчен манан и неговият компонентен състав. Биосинтезът на извънклетъчния манан се осъществява съгласно Пример 1 и Пример 2. След прекратяване на процеса на култивиране, културална течност се центрофугира при 1000 rpm за 15 min с цел отстраняване на биомасата. Получената супернатанта се отдекантира и се използва за изолиране на извънклетъчния манан. Изолирането на манана се осъществява чрез утаяване с охладен етанол. За пълно утаяване на манана към супернатантата се прибавят 4 обема охладен етанол. В резултат на прибавянето на етанола се образува бяла парцалеста утайка от утаен манан. Утайката се изсушава. Количественото определяне на монозахаридния състав на получените продукти е извършено чрез газова хроматография. Измерват се около 6.0 mg от изследвания продукт, след което се хидролизират с 2.0 М CF₃COOH (2.0 ml) за 3 h при 120°С. Излишъкът от CF₃COOH се изпарява в азотна среда при 40°С до сух остатък. След изсушаването, пробата се разтваря в 1 ml разтвор на вътрешния стандарт ро-нитрофенил-бета-О-глюкопиранозид в пиридин. Пробата се загрява на кипяща водна баня за 5 min. След охлаждане получените метилгликозиди се дериватизират с хексаметилендисилазан (0.5 ml) в присъствието CF₃COOH (0.15 ml) като катализатор. Полученият разтвор се анализира на газов хроматограф GC/FID (HewlettPackard 6890) с колона HP-5 5% фенил-метилсилоксан (30 т; 0.32 тт; 0.25 microm). Условията на анализа са: начална температура 190°С, която се увеличава до 280°С със скорост 20°C/min. Дериватизирани метилгликозиди (стандарти) са използвани за идентификация и количествено определяне на монозахаридите.

Компонентният състав на получената утайка е представен в Таблица 2.

Таблица 2. Компонентен състав на изолирания извънклетъчен манан

Компонент	Концентрация, %
Белтък	5.25
Пепел	3.00
Влага	11.6
Общи въглехидрати	65.3
Монозахариден компонентен състав на въглехидратната фракция (%):
Маноза	89.1
Глюкоза	4.00
Галактоза	0.75
Арабиноза	1.00
Фукоза	1.15
Фруктоза	0.90

Пример 4. Получаване на пребиотична фуражна добавка, съдържаща разтворим £θ мананолигозахарид.

Целта в настоящия експеримент е получаването на препарат с високо съдържание на непречистен манан, за използването му като пребиотична фуражна добавка. Биосинтезът на извън- 25 клетъчния манан се осъществява съгласно пример 1 и пример 2.

След прекратяване на ферментацията получената културална среда се суши чрез разпръсквателно сушене. Към културалната среда преди сушене се прибавя 2 g/Ι СаСО₃ като носител за подобряване на течливостта на получения продукт. Полученият продукт е със състав съгласно Таблица 3.

Таблица 3. Компонентен състав на получения продукт с високо съдържание на непречистен манан

Компонент	Концентрация, %
Белтък	8.66
Пепел	27.6
Влага	7.50
Общи въглехидрати	49.8
Монозахариден компонентен състав на въглехидратната фракция (%):
Маноза	88.5
Глюкоза	5.30
Галактоза	0.70
Арабията	1.00
Фукоза	1.2
Фруктоза	1.8

Така полученият продукт може да се използва директно като пребиотична фуражна добавка източник на разтворими мананолигозахариди или да бъде смесен с пълнители или други нутритивни компоненти преди да бъде вложен във фуража.

Пример 5. Използване напребиотични фуражни добавки, съдържащи разтворим мананолигозахарид при хранене на птици.

Целта на изследването е да се определи ефекта от приложение на продукта получен съгласно Пример 4 като добавка към фуража на пилета-бройлери. Приложени бяха дози от 1 kg/ t, 2 kg/t и 4 kg/t фураж, през целия период на отглеждане. В изследването бяха включени 120 броя 1-дневни, сексирани пилета-бройлери от хибрида Hybro G. Пилетата бяха от двата пола по равно, разделени на пет групи (2 контролни и 3 опитни), по 24 броя пилета във всяка (12 мъжки и 12 женски). Изследването продължи 42 дни. Получените резултати от изследването са предс5 тавени в Таблица 4.

Таблица 4.

Параметър (Период: 0-42 ден)	Групи
I	П	Ш	IV
Отрицателна контрола	Добавка lg/kg фураж	2g/kg фураж	Добавка 4g/kg фураж
Брой птици	48	24	24	24

Средно тегло, g / %	2156.8 ± 277.7	2147.1 ±282.3	2231.9 ±357.0	2306.1 ±3142
100.0	99.6	103.5	106.9
Среден дневен прцрает,я	50.0 ±6.60	49.8 ±6.74	51.8 ±8.46	53.6 ±7.48
Конверсия на фуража, kg/%	2.044	1.987	1.855	1.983
100.0	97.2	90.8	97.0
Смъртност, η	1	0	0	2

Определено е, че използването на добавката резултира в постигане на по-високи продуктивни показатели (крайно средно живо тегло и разход на фураж за 1 kg прираст), в сравнение βθ с контролните (нетретирани) пилета-бройлери. При дозата от 1 kg/t се постига значително подобряване на конверсията за фураж. При дозите от 2 kg/t и 4 kg/t са постигнати статистически значими разлики в теглото и конверсията на 35 фуража.

Пример 6. Сравнително използване на пребиотични фуражни добавки, съдържащи разтворим мананолигозахарид и мананогозахарид от клетъчни стени на дрожди при хранене на птици до

Целта на изследването е да се определи ефекта от приложение на продукта получен съгласно Пример 4 като добавка към фуража на пи лета-бройлери и се сравни неговия ефект с ефекта от приложение на мананолигозахариди, получени от дрождеви стени. Като положителна контрола е използван продукта Biomos (Alltech Inc.), който съдържа мананолигозахариди получени от клетъчни стени на дрожди. И двата продукта са приложени в дози от 2 kg/t, 1 kg/t и 0.5 kg/t фураж съответно през стартерния (1-15 ден, гроуерния (15-28 дни) и финишерния (28-42 дни) период на отглеждане на бройлерите. Постановката на опита е пълен рандомизиран-блок дизайн със съответно 13 повторения на всяка от 3-те групи. Общо 1287 еднодневни бройлера, сексирани, мъжки от породата Ross-308 са използвани в опита. Получените резултати от изследването са представени в Таблица 5.

1325 Ul

Таблица 5

Параметър (Период: 0-42 ден)	Групи
I	П	Ш
Отрицателна контрола	Biomos 2-1-0.5 kg/ton	Добавка* 2-1-0.5 kg/ton
Брой птици	48	24	24
Средно тегло, g/%	₂₇₇₉ь	₂₇₇₇s	2834*
100.0	99.9	102.0
Среден дневен rq»$aCT,g	65.2®	65.2⁶	66.5*
Конверсия на фуража, kg /%	1.657*	1.651 *	1.638*
100.0	99.6	98.9
Смъртност, η	1	0	0

Характеристиките на добавката са съгласно продукта от Пример 4.

Между резултати с различни индекси има статистически значима разлика от р<0.05%.

Определено е, че използването на добавката резултира в постигане на по-високи продуктивни показатели (крайно средно живо тегло и разход на фураж за 1 kg прираст), в сравнение с контролните (нетретирани) пилета-бройлери и бройлерите третирани с Biomos. Трета експериментална група, която е третирана с добавка, съдържаща разтворими мананолигозахариди е завършила със статистически значимо по-високо средно тегло, статистически значим по-висок среден дневен прираст и числено по-ниска конверсия на фуража. В същото време се вижда, че поне при този опит, приложението на Biomos не води до статистически значима или дори числена разлика с контролната група.

Пример 7. Използване на пребиотични фу25 ражни добавки, съдържащи разтворим мананолигозахарид при хранене на прасета.

Целта на изследването е да се определи ефекта от приложение на продукта, получен съгласно Пример 4 като добавка към фуража на прасета. Тестваната доза на приложение 1 kg/t фураж. В опита са използвани 620 прасенца след отбиване на възраст 4 седмици със средно тегло около 8.0 kg. В контролната група, без добавка на мананолигозахарид са включени 360 прасенца, разпределени в 36 батерии по 10 прасенца в батерия. В тестовата група са включени 260 броя прасенца, разпределени в 26 батерии по 10 прасенца във всяка. Зоотехническите резултати от изследването са показани в Таблица 6.

1325 Ш

Параметър	Единици	Група
Контрола	Добавка 1 кг/тон
Брой прасенца	П	360	260
Средно тегло след отбиване	kg	8,025	8,000
Разтежен период	дай	75	64
	S	520,0* ±0,047	543,0 ±0.033
ирсдно-днсвбн прирзст	%	100,0	104,4
Фураж за 1 кг прираст	Kg	2,400	2,040
%	100,0	85,0
Смъртност	%	3,0	2,92

Определено е, че използването на добавката резултира в постигане на по-високи продуктивни показатели. Среднодневният прираст е повишен със статистическа значимост. Също така е ускорена растежната фаза и намалено количеството фураж за постигане на 1 kg прираст.

Claims

Претенции

1. Фуражна добавка, характеризираща се с това, че съдържа разтворими мананолигозахариди, получени чрез ферментация на дрожди.
2. Фуражна добавка съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че дрождите са от рода Candida, Klebsiela, Torula, Rhodotorula или Saccharomyces.
3. Фуражна добавка съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че дрождите са Rhodotorula mucilaginosa MUCL 45531.

Литература

1. Р. Spring, Competitive Exclusion Products, January 1998, Feed Compounder.

2. WO 1995/004467.

3. US 6444448 Bl.