DE60035604T2

DE60035604T2 - Heilmittel

Info

Publication number: DE60035604T2
Application number: DE60035604T
Authority: DE
Inventors: Takanari Otsu-shi TOMINAGA; Syusaku Otsu-shi YAMASHITA; Shigetoshi Mizutani; Hiroaki Kusatsu-shi SAGAWA; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: CN100384433C; WO2001013925A1; CN1382055A; AU6593400A; EP1226826B1; KR20020031411A; JP4202645B2; DE60035604D1; ATE367166T1; EP1226826A1; JP2009051836A; KR100675541B1; EP1226826A4

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft Anwendungen von physiologisch aktiven Substanzen, die aus aquatischen Organismen stammen als Arzneimittel, Nahrungsmittel, Getränke oder Futtermittel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Unter physiologisch aktiven Substanzen, die aus aquatischen Organismen stammen, ist ein Fucoidan bekannt. Dieses Fucoidan ist ein sulfatisiertes, Fucose enthaltendes Polysaccharid, welches in Algen, Stachelhäutern (Echinodermata) oder dergleichen vorkommt. Und zwar umfasst das Fucodian eine sulfatisierte Fucose als ein konstituierendes Saccharid.
Als physiologische Wirkung des Fucoidans sind Krebszellproliferation unterdrückende Aktivität, Krebsmetastasen unterdrückende Aktivität, Antikoagulationsaktivität, antivirale Aktivität und dergleichen bekannt, und es wurde von dem Fucoidan erwartet, dass Anwendungen als Arzneimittel entwickelt werden ausgerichtet gewesen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf den Befunden neuer physiologischer Aktivität des Fucoidan, und ihr Gegenstand ist, ein Arzneimittel, Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel bereitzustellen, in der die regulierende Wirkung des Fucoidan auf Zytokin-Produktion oder dergleichen genutzt wird. In der vorliegenden Beschreibung wird das therapeutische Agens oder prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung in einigen Fällen als Arzneimittel bezeichnet.
In der Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung betrifft eine erste Erfindung der vorliegenden Erfindung ein therapeutisches Agens oder prophylaktisches Agens für eine Erkrankung, die eine Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, eine Erkrankung, die die Produktion von Stickstoffmonoxid erforderlich macht oder eine allergische Erkrankung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst.
Eine zweite Erfindung der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel, für die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxidproduktion oder als Antiallergikum, wobei das Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst.
Zusätzlich betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, einer Erkrankung, die die Produktion von Stickstoffmonoxid erforderlich macht oder einer allergischen Erkrankung; sie betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Herstellung eines therapeutischen Agens oder eines prophylaktischen Agens für eine Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, eine Erkrankung, die die Produktion von Stickstoffmonoxid erforderlich macht oder eine allergische Erkrankung; oder sie betrifft ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, einer Erkrankung, die die Produktion von Stickstoffmonoxid erforderlich macht oder einer allergischen Erkrankung, in der ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion, der Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, ein antiallergisches Agens oder ein Agens zur Suppression der IgE-Produktion, welches als einen wirksamen Inhaltstoff ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Herstellung eines Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, eines Agens gegen eine Allergie oder zur Suppression der IgE-Produktion.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Herstellung eines Nahrungsmittels, Getränkes oder Futtermittels zur Regulierung der Zytokin-Produktion, der Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder gegen eine Allergie.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, zur Unterdrückung einer Allergie oder zur Suppression der IgE-Produktion, bei der ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als ein wirksamer Inhaltstoff verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, zur Unterdrückung einer Allergie oder zur Suppression der IgE-Produktion.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon eine bemerkenswerte Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion bei der Sensibilisierung mit einem Antigen, zum Beispiel bei der Präsentation eines Antigens für T-Zellen auf den Antigen präsentierenden Zellen. Auch ist Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon bemerkenswert wirksam bei der Behandlung einer allergischen Erkrankung nach Sensibilisierung mit einem Antigen, und besonders wirksam bei der Suppression von Antigen-spezifischer IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen. In der vorliegenden Erfindung umfasst die Regulierung der Zytokin-Produktion die Regulierung der produzierten Menge an Zytokin durch Verstärkung, Beschleunigung oder dergleichen der Zytokin-Produktion.
Daher betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein therapeutisches Agens oder prophylaktisches Agens für eine Erkrankung, die Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen erforderlich macht, oder für eine allergische Erkrankung nach Sensibilisierung mit einem Antigen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das therapeutische Agens oder prophylaktische Agens ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst.
Zusätzlich betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel zur Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen oder gegen Allergie nach Sensibilisierung mit einem Antigen, worin das Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen erforderlich macht, oder einer allergischen Erkrankung nach Sensibilisierung mit einem Antigen; die Verwendung eines Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon für die Herstellung eines therapeutischen Agens oder eines prophylaktischen Agens für eine Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen erforderlich macht, oder eine allergische Erkrankung nach Sensibilisierung mit einem Antigen; oder ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen erforderlich macht, oder einer allergischen Erkrankung nach Sensibilisierung mit einem Antigen, wobei ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen, als Antiallergikum nach Sensibilisierung mit einem Antigen oder Suppression von IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen, welches ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon für die Herstellung eines Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen, als Antiallergikum nach Sensibilisierung mit einem Antigen oder Suppression von IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon für die Herstellung eines Nahrungsmittels, Getränkes oder Futtermittels zur Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen oder als Antiallergikum nach Sensibilisierung mit einem Antigen.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen, Unterdrückung einer Allergie nach Sensibilisierung mit einem Antigen oder Unterdrückung von IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen, wobei ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als ein wirksamer Inhaltstoff verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon zur Regulierung der Zytokin-Produktion während der Sensibilisierung mit einem Antigen, Unterdrückung einer Allergie nach Sensibilisierung mit einem Antigen oder Unterdrückung von IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen.
Das Fucoidan, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist besonders beschränkt. Als Beispiele werden bevorzugt ein Fucoidan, das aus einer Alge oder aus Echinodermata stammt genannt.
Ebenso kann als Abbauprodukt des Fucoidan, zum Beispiel ein saures Abbauprodukt eines Fucoidan, ein enzymatisches Abbauprodukt eines Fucoidan und dergleichen verwendet werden.
Das Fucoidan und ein Abbauprodukt des Fucoidan, zum Beispiel das saure Abbauprodukt des Fucoidan oder das enzymatische Abbauprodukt des Fucoidan, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders beschränkt begrenzt, solange sie eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, die Induktion von Stickstoffmonoxid-Produktion oder antiallergische Wirkung, wie etwa Unterdrückung von IgE-Produktion, ausüben. Das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon kann in geeigneter Weise auf der Basis seiner Wirkung und dergleichen hergestellt werden.
Zusätzlich ist der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck „Zytokin" dasjenige Zytokin, bei dem das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon eine Wirkung auf die Regulierung der Produktion ausüben kann. Das Zytokin umschließt zum Beispiel ein Interleukin (zum Beispiel Interleukin-12) und ein Interferon (zum Beispiel Interferon-γ)
Darüber hinaus betrifft die antiallergische Wirkung eine Wirkung der Unterdrückung von Allergie, die durch das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon ausgeübt werden kann, die beispielhaft als die Wirkung der Unterdrückung der IgE-Produktion dargestellt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine grafische Darstellung die ein Elutionsmuster des Fucoidan, das von Kjellmaniella crassifolia stammt, von einer DEAE-Cellufine-A-800-Säule wiedergibt.
2 ist eine grafische Darstellung, die die NO₂-Konzentration im Kulturmedium zeigt, wenn die Zellen unter Zugabe von 7-12SFd-F kultiviert werden.
3 ist eine grafische Darstellung, die die NO₂-Konzentration im Kulturmedium zeigt, wenn die Zellen unter Zugabe von Fraktion 1 kultiviert werden.
4 ist eine grafische Darstellung, die die NO₂-Konzentration im Kulturmedium zeigt, wenn die Zellen unter Zugabe von Fraktion II kultiviert werden.
5 ist eine grafische Darstellung, die die NO₂-Konzentration im Kulturmedium zeigt, wenn die Zellen unter Zugabe von Fraktion III kultiviert werden.
6 ist eine grafische Darstellung, die die NO₂-Konzentration im Kulturmedium zeigt, wenn die Zellen unter Zugabe von LPS, der positiven Kontrolle, kultiviert werden.
7 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung des Fucoidan und eines Abbauproduktes hiervon auf die Induktion der Produktion von IFN-γ zeigt.
8 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung des Fucoidan und eines Abbauproduktes hiervon auf die Induktion der Produktion von IL-12 zeigt.
9 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung des Fucoidan, das von Kjellmaniella crassifolia stammt, auf zytotoxische Immunpotenzierung von Lymphozyten der Milz von Mäusen zeigt.
10 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von G-Fucoidan auf die Induktion der Produktion von IFN-γ zeigt.
11 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von G-Fucoidan auf die Induktion der Produktion von IL-12 zeigt.
12 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von verschiedenen Antikörpern. gegen die Wirkung des Fucoidan auf die Produktion von IFN-γ oder die Produktion von IL-12 zeigt.
13 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung des jeweiligen Fucoidan auf die Induktion der Produktion von IFN-γ zeigt.
BESTE ART DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das in der Erfindung verwendete Fucoidan betrifft ein Polysaccharid, in dem eine sulfatisierte Fucose als ein konstituierendes Saccharid enthalten ist. Das Fucoidan ist nicht besonders beschränkt solange das Fucoidan eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion ausübt, zum Beispiel Wirkung auf die Regulierung der Produktion von Interferon-γ oder Wirkung auf die Regulierung von Interleukin-12 während der Antigen-Präsentationsreaktion zwischen Antigen präsentierenden Zellen (APC) und T-Zellen ausübt; Wirkung auf die Induktion der Produktion von Stickstoffmonoxid ausübt; oder antiallergische Wirkung, zum Beispiel eine Wirkung als Unterdrückung der IgE-Produktion ausübt. Zum Beispiel sind Algen, besonders Meeresalgen wie etwa Laminariales, Chordariales und Fucales, einschließlich Kjellmaniella crassifolia, Kjellmanieila gyrata, Fucus, Cladiosiphon okamuranus, Undaria, Ecklonia kurome, Eisenia bicyclis, Ecklonia cava, Riesentang, Lessonia nigrescens und Ascophyllum nodosum reich an Fucoidanen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Aus diesem Grund sind sie als Ausgangsmaterial zu bevorzugen. Zusätzlich können Fucoidane verwendet werden, die aus Echinodermata, zum Beispiel aus Seegurke, Seeigeln, Seesternen und dergleichen stammen.
Diese Fucoidane können jeweils durch ein bekanntes Verfahren präpariert werden. Es kann in der vorliegenden Erfindung ein gereinigtes Produkt eines Fucoidan, eine Fucoidan enthaltende Substanz und dergleichen verwendet werden.
Zum Beispiel wird ein Fucoidan aus Kjellmaniella crassifolia präpariert, und das gewonnene Fucoidan kann weiter in Glucuronsäure enthaltendes Fucoidan (als „U-Fucoidan" bezeichnet) und nicht Glucuronsäure enthaltendes Fucoidan (als „F-Fucoidan" bezeichnet) aufgetrennt werden. Diese Fucoidane können als ein wirksamer Inhaltstoff für das therapeutische Agens, das prophylaktische Agens oder dergleichen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Auch sulfatisiertes Fucogalaktan (als „G-Fucoidan" bezeichnet) kann aus Kjellmaniella crassifolia hergestellt und verwendet werden.
Nach der Präparation der Fucoidane aus Kjellmaniella crassifolia werden U-Fucoidan und F-Fucoidan unter Verwendung eines Anionen-Austauschharzes, eines oberflächenaktiven Stoffes oder dergleichen getrennt. Das bestehende Verhältnis, ausgedrückt in einem Gewichtsverhältnis, von U-Fucoidan zu F-Fucoidan aus Kjellmaniella crassifolia beträgt etwa 1:2. U-Fucoidan enthält Fucose, Mannose, Galaktose, Glucuronsäure und dergleichen, und sein Sulfatgehalt beträgt etwa 20 Gewichtsprozente. F-Fucoidan enthält Fucose und Galactose und sein Sulfatgehalt beträgt etwa 50 Gewichtsprozente. Das Molekulargewicht ist für beide Substanzen verteilt mit einem Mittelwert bei etwa 200.000 (Summary of 18th Sugar Symposium, S. 159, 1996).
U-Fucoidan und F-Fucoidan können zum Beispiel getrennt werden, indem eine Fucoidan-Lösung, die aus Kjellmaniella crassifolia präpariert wurde, auf eine DEAE-Cellufine-A-800-Säule aufgetragen wird und die Flution durch die Konzentrationsgradiententechnik unter Verwendung von NaCl enthaltender Pufferlösung durchgeführt wird. Eines dieser Beispiele wird in 1 dargestellt. Konkret ist 1 ein Diagramm, das die Trennung von U-Fucoidan und F-Fucoidan zeigt, wobei der frühere Peak im Graphen U-Fucoidan und der spätere Peak F-Fucoidan darstellt.
Zusätzlich kann das zuvor genannte G-Fucoidan gewonnen werden, indem das Fucoidan, das aus Kjellmaniella crassifolia stammt, mit einem für F-Fucoidan spezifischen Abbau-Enzym, das von Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) produziert wird, und mit einem für U-Fucoidan spezifischen Abbau-Enzym, das von Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) produziert wird, abgebaut wird und das Abbauprodukt entfernt wird.
Auch kann zum Beispiel jeweils das Fucoidan, das aus Fucus stammt, das Fucoidan, das aus Cladosiphon okamuranus stammt, das Fucoidan, das aus Undaria stammt, und das Fucoidan, das aus Sporophyll von Undaria pinnatifida (Wakame Mekabu) stammt, unter Verwendung eines bekannten Verfahrens präpariert und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das aus Echinodermata stammende Fucoidan, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umschließt zum Beispiel Fucoidane, die in Seegurken enthalten und im offengelegten japanischen Patent Nr. Hei 4-91027 beschrieben worden sind. Das Fucoidan kann aus Seegurken in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in der Veröffentlichung beschrieben wird, hergestellt werden.
Zusätzlich kann das Abbauprodukt des Fucoidan, das eine Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, Induktion von Stickstoffmonoxid-Produktion und antiallergische Wirkung aufweist, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unter Verwendung eines bekannten Verfahrens, wie etwa eines enzymologischen Verfahrens, eines chemischen Verfahrens oder eines physikalischen Verfahrens präpariert werden, wobei ein gewünschtes Abbauprodukt die gewünschte Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, Induktion von Stickstoffmonoxid-Produktion oder antiallergische Wirkung aufweist, ausgewählt wird. Das resultierende Abbauprodukt kann verwendet werden.
Das Verfahren zur Herstellung des Abbauproduktes von Fucoidan umfasst zum Beispiel ein saures Abbauverfahren. Indem das Fucoidan einem sauren Abbau unterworfen wird, kann ein Abbauprodukt hergestellt werden, das eine Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, Immunpotenzierung, Induktion von Stickstoffmonoxid-Produktion oder eine antiallergische Wirkung aufweist.
Die Bedingungen für den sauren Abbau in dem vorstehend genannten sauren Abbauverfahren sind nicht besonders beschränkt, solange die Bedingungen es ermöglichen, das Abbauprodukt zu erzeugen, das eine Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, Induktion von Stickstoffmonoxid-Produktion oder antiallergische Wirkung aufweist (hierin nachstehend als „Abbauprodukt der vorliegenden Erfindung" bezeichnet).
Zum Beispiel wird das Fucoidan in einer Säure gelöst oder suspendiert und der Reaktion unterworfen, wodurch ein Abbauprodukt der vorliegenden Erfindung erzeugt wird. Das Reaktionsgemisch kann auch während der Reaktion erhitzt werden, wodurch der Zeitraum verkürzt wird, der zur Bildung des Abbauproduktes der vorliegenden Erfindung erforderlich ist.
Die Art der Säure zum Lösen oder Suspendieren des Fucoidans ist nicht besonders beschränkt. Es können eine anorganische Säure wie etwa Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure, eine organische Säure wie etwa Zitronensäure, Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure oder Ascorbinsäure und eine feste Säure wie etwa kationisches Austauschharz, kationische Austauschfaser oder kationische Austauschmembran verwendet werden.
Die Konzentration der Säure ist nicht besonders beschränkt, und die Säure kann bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,0001 bis 5 N, mehr bevorzugt von etwa 0,01 bis 1 N verwendet werden. Zusätzlich ist die Reaktionstemperatur nicht besonders beschränkt, und die Reaktionstemperatur kann bevorzugt zwischen 0°C bis 200°C, mehr bevorzugt zwischen 20°C bis 130°C eingestellt werden.
Zusätzlich ist die Reaktionszeit nicht besonders beschränkt, und die Reaktionszeit kann bevorzugt zwischen mehreren Sekunden und mehreren Tagen angesetzt werden. Die Art und Konzentration der Säuren, die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit können in Abhängigkeit von der erzeugten Menge des Abbauproduktes der vorliegenden Erfindung und dem Grad der Polymerisation des Abbauproduktes in geeigneter Weise gewählt werden. Zum Beispiel ist es während der Herstellung des Abbauproduktes der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, dass eine organische Säure wie etwa Zitronensäure, Milchsäure oder Apfelsäure verwendet wird, und dass die Konzentration der Säure aus dem Bereich von mehreren Dutzend mM bis zu mehreren M, und dass die Temperatur der Erhitzung aus dem Bereich von 50°C bis 110°C, mehr bevorzugt 70°C bis 95°C, und dass die Erhitzungszeit aus dem Bereich von mehreren Minuten bis zu 24 Stunden genau ausgewählt wird, wodurch das Abbauprodukt der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann.
Das saure Abbauprodukt des Fucoidan wird durch das saure Abbauprodukt des aus Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan beispielhaft dargestellt, und dieses Abbauprodukt kann als Ballaststoff verwendet werden, die neue physiologische Funktionen einer starken Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, besonders auf die Regulierung der Produktion von Interferon-γ während der Antigen-Präsentationsreaktion zwischen APC und T-Zellen, auf Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion und antiallergische Wirkung aufweist.
Das Abbauprodukt der vorliegenden Erfindung kann auf der Basis seiner Wirkung auf die Regulierung von Zytokin-Produktion, auf Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder seiner antiallergischen Wirkung fraktioniert werden. Zum Beispiel kann das Abbauprodukt, basierend auf einem Molekulargewicht, mit Hilfe eines Gel-Filtrationsverfahrens, eines Fraktionierungsverfahrens, das eine Membran zur Molekulargewichtsfraktionierung verwendet oder dergleichen weiter fraktioniert werden.
Als ein Beispiel für das Gel-Filtrationsverfahren kann Cellufine-GCL-300 verwendet werden, um einzelne Molekulargewichtsfraktionen herzustellen, zum Beispiel eine mit einem Molekulargewicht, das größer als 25.000 ist, eine mit einem Molekulargewicht von 25.000 bis größer als 10.000, eine mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis größer als 5.000, eine mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder weniger. Cellufine- GCL-25 kann verwendet werden, um alle Molekulargewichtsfraktionen aus der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder weniger herzustellen, zum Beispiel eine mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis mehr als 3.000, eine mit einem Molekulargewicht von 3.000 bis mehr als 2.000, eine mit einem Molekulargewicht von 2.000 bis mehr als 1.000, eine mit einem Molekulargewicht von 1.000 bis mehr als 500, eine mit einem Molekulargewicht von 500 oder weniger.
Zusätzlich kann die Molekulargewichtsfraktionierung unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran industriell durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 30.000 oder weniger hergestellt werden, indem FE10-FUSO382, hergestellt von DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD., verwendet wird, oder eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 6.000 oder weniger kann hergestellt werden, indem FE-FUS-T653 vom selben Hersteller verwendet wird. Darüber hinaus kann eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 500 oder weniger durch die Verwendung einer Nanofilter-Membran erhalten werden. Jede beliebige Molekulargewichtsfraktion kann durch Kombination dieser der Gel-Filtrationsverfahren und Verfahren zur Molekulargewichtsfraktionierung hergestellt werden.
Das Abbauprodukt des Fucoidan mit Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder antiallergischer Wirkung, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird beispielhaft durch die Verbindungen vertreten, die in den Formeln (I) bis (IV) dargestellt werden, und diese Verbindungen können in Übereinstimmung mit den im Patent WO 97/26896 und den genauen Beschreibungen für die Internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/JP99/00606 und PCT/JP00/00965 offenbarten Verfahren hergestellt werden. Zusätzlich umfasst das Abbauprodukt von Fucoidan der vorliegenden Erfindung Abbauprodukte des Fucoidan, die in WO 97/26896 und den genauen Beschreibungen für die Internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/JP99/00606 und PCT/JP00/00965 beschrieben werden. Ein Fucoidan und ein Oligosaccharid, die eine wiederholte Struktur der Verbindung, die durch die Formel (1) dargestellt wird, aufweisen, können ebenfalls vorteilhaft in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
worin R OH oder OSO₃H ist_;
worin R OH oder OSO₃H ist;
worin R OH oder OSO₃H ist; und
worin R OH oder OSO₃H ist;
Beispiele für die Verbindung, die durch die Formel (I) dargestellt werden, umschließen die Verbindung, die durch die später angegebene Formel (V) dargestellt wird.
Die Verbindung, die durch die Formel (I) dargestellt wird, kann zum Beispiel gewonnen werden, indem das vorstehend genannte F-Fucoidan mit endosulfatisiertes Polysaccharid abbauendem Enzym (für F-Fucoidan spezifisches Abbau-Enzym) behandelt wird, das von Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) produziert wird, und das Abbauprodukt gereinigt wird. Nach dem Gehalt und der Lage der Sulfatgruppe in der Verbindung können jeweils beliebige Produkte aus dem Abbauprodukt gereinigt werden. Zusätzlich ist das Polymer der Verbindung, die durch die Formel (I) dargestellt wird, in dem Abbauprodukt enthalten und kann in Abhängigkeit von seinen Verwendungszwecken abgetrennt und gereinigt werden.
Jede der Verbindungen, die durch die Formel (II) und der Verbindung, die durch die Formel (III) dargestellt werden, können gewonnen werden, indem zum Beispiel das vorstehend genannte U-Fucoidan mit endo-sulfatisiertes Polysaccharid abbauendem Enzym (für U-Fucoidan spezifisches Abbau-Enzym) behandelt wird, das von Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) produziert wird, und das Abbauprodukt gereinigt wird. Nach dem Gehalt und der Lage der Sulfatgruppe in der Verbindung können jeweils beliebige Produkte aus dem Abbauprodukt gereinigt werden. Zusätzlich ist das Polymer, dessen Basis-Rückratstruktur die Verbindung umfasst, die durch die chemische Formel (II) dargestellt wird, aber keine Doppelbindungen aufweist, ebenfalls in dem Abbauprodukt enthalten und kann in Abhängigkeit vom Verwendungszweck abgetrennt und gereinigt werden.
Die Verbindung, die durch die Formel (IV) dargestellt wird, kann gewonnen werden, indem zum Beispiel G-Fucoidan mit endo-sulfatisiertes Polysaccharid abbauendem Enzym, das spezifisch G-Fucoidan abbaut, (für G-Fucoidan spezifisches Abbau-Enzym) behandelt wird, das von Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) produziert wird, um ein Abbauprodukt von G-Fucoidan zu erhalten, und das Abbauprodukt gereinigt wird. Bezüglich Gehalt und der Lage der Sulfatgruppe in der Verbindung können beliebige Produkte aus dem Abbauprodukt gereinigt werden. Zusätzlich ist das Polymer, dessen Grund-Rückratstruktur die Verbindung umfasst, die durch die Formel (IV) dargestellt wird, ebenfalls in dem Abbauprodukt enthalten und kann in Abhängigkeit vom Verwendungszweck abgetrennt und gereinigt werden.
Die Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, auf Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder antiallergische Wirkung des Fucoidan oder eines Abbauproduktes hiervon kann zum Beispiel mit den Verfahren untersucht werden, die in den nachstehend angeführten Beispielen 1, 2, 7 und 8 beschrieben werden. In einem Fall, in dem das zu untersuchende Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon die vorstehend genannte Wirkung aufweist, wird das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, auf der Basis dieser Wirkung ausgewählt.
In der vorliegenden Erfindung ist das Zytokin, dessen Produktion durch das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon reguliert werden kann, nicht besonders beschränkt. Als Beispiele dienen zum Beispiel Interleukine (IL)-1 bis -18, Interferon (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, Lymphotoxine, Tumor-Nekrose-Faktoren (TNF), Stammzell-Faktoren (SCF), Granulozyten-Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozytenkolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF) und dergleichen.
Diese Zytokine umfassen jene, die an Expression und Regulierung verschiedener zellulärer Immunantworten wie etwa hypersensitiven Reaktionen des verzögerten Typs und Ziel-Cytotoxizität beteiligt sind (IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-β und dergleichen); jene, die an den regulierenden Funktionen für die Mechanismen der Antikörperproduktion beteiligt sind (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 und dergleichen); jene, die direkt unterdrückende Wirkung auf Proliferation oder zerstörende Wirkung auf Tumorzellen aufweisen (INF-α, TNF-β, IFN und dergleichen); jene, die in der Lage sind, Proliferation und Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen und Vorläuferzellen im Knochenmark zu beschleunigen IL-1 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, GM-CSF, G-CSF, M-CSF und dergleichen); jene, die an Entzündungsreaktionen beteiligt sind (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, TNF-β, IFN und dergleichen); jene, die an einer allergischen Reaktion beteiligt sind (IL-3, IL-4, IL-5 und dergleichen); jene, die in der Lage sind, die Aktivität von NK-Zellen zu verstärken (IL-12); und dergleichen. Die Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, die das in der vorliegenden Erfindung verwendete Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon besitzen, betrifft die Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, die nur in einem Fall selektiv induziert werden kann, in dem es notwendig ist, die zelluläre Immunität auf Grund der Existenz eines Antigens, das entfernt werden soll, wie etwa einer viralen Infektion oder Krebs, zu verstärken, zum Beispiel die Wirkung auf die Produktion von IFN-γ oder die Produktion von IL-12, oder Wirkung auf die Verstärkung oder Beschleunigung ihrer Produktion. Daher verursacht Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon keine Aktivierung des Immunsystems und seine Verstärkung in einem unnötigen Status, so dass sie keine Erkrankung wie etwa eine allergische Erkrankung oder eine Autoimmunerkrankung hervorrufen. Daher ist das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon ein sehr sicherer und wirksamer Inhaltstoff. Zusätzlich kann das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon Verstärkung der zytotoxischen Immunität bewirken, zum Beispiel über Verstärkung der zytotoxischen Aktivität von Lymphocyten.
Daher kann durch die Verwendung von Fucoidan und/oder einem Abbauprodukt hiervon zur Regulierung der Produktion dieser Zytokine eine Erkrankung, die die Regulierung dieser Zytokin-Produktion erforderlich macht, behandelt oder verhindert werden, wie etwa eine Erkrankung, die die Expression und Regulierung von zellulärer Immunantwort erforderlich macht, wie etwa eine Krebserkrankung; eine Erkrankung, die die Regulierung einer Antikörper-Produktion erforderlich macht, wie etwa eine Autoimmunerkrankung; eine Erkrankung, die die Differenzierung von Zellen erforderlich macht, wie etwa Anämie oder Diabetes; oder eine Erkrankung, die die Unterdrückung einer Entzündungsreaktion. erforderlich macht, wie etwa septischer Schock, entzündliche Enteropathie, chronischer Gelenkrheumatismus, Multiple Sklerose oder Uveitis.
Das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, haben eine Fähigkeit zur Regulierung der Zytokin-Produktion, so dass ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agens für die vorstehend genannte Erkrankung, die Zytokin-Produktion erforderlich macht, hergestellt werden kann, indem diese Verbindungen als wirksame Inhaltstoffe verwendet werden.
Zusätzlich haben das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Wirkung auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion. Durch Verwendung dieser Verbindungen als Wirkstoffe kann eine Erkrankung behandelt oder verhindert werden, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht, wie etwa Arteriosklerose, die Erschlaffung des glatten Gefäßmuskels, Unterdrückung der Adhäsion von Thrombocyten, Granulozyten und Monozyten an Gefäßwände, Hemmung der Proliferation von sekretorischen glatten Muskelzellen und dergleichen erfordert. Das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon weisen auch einen immunpotenzierenden Effekt durch die vorstehend genannte Wirkung auf. Zusätzlich umfasst die Wirkung auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion eine Wirkung auf die Verstärkung oder Beschleunigung der Stickstoffmonoxid-Produktion.
Darüber hinaus weisen das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, antiallergische Wirkung auf, wie etwa Wirkung auf Unterdrückung der IgE-Produktion. Durch Verwendung dieser Verbindungen als wirksame Inhaltstoffe kann eine allergische Erkrankung behandelt oder verhindert werden, wie etwa ein Symptom, das durch IgE-Produktion vermittelt oder verstärkt wird, einschließlich zum Beispiel allergischer Erkrankungen, die durch IgE verursacht werden, wie etwa Bronchialasthma, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, allergische Konjunktivitis, Urtikaria und anaphylaktischer Schock.
Ein bestimmtes fraktioniertes Produkt des vorstehend genannten Fucoidan, besonders F-Fucoidan, U-Fucoidan oder G-Fucoidan ist ein fraktioniertes Fucoidan-Produkt, dessen Grundstruktur zum ersten Mal geklärt worden ist. Jedes Abbauprodukt, das durch die Verwendung eines Enzyms hergestellt wird, welches spezifisch auf jedes fraktionierte Produkt einwirkt, besonders auf ein fraktioniertes Produkt des Abbauproduktes, wie etwa die Verbindungen mit den Formeln (I) bis (IV), hat ein geringeres Molekulargewicht im Vergleich zu dem von Fucoidan, und die gleiche Höhe an physiologischer Aktivität wie die des Fucoidan. Aus diesem Grund sind diese fraktionierten Produkte oder Abbauprodukte auf bemerkenswerte Weise noch hervorragender im Vergleich zu einem einfach nur isolierten Fucoidan oder zu einer Fucoidan enthaltenden Substanz, deren Struktur, Zusammensetzung oder Eigenschaften undefiniert sind.
In der vorliegenden Erfindung wird ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agens für eine Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, eine Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht, oder für eine allergische Erkrankung bereitgestellt, welches das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst.
Besonders für das therapeutisches Agens oder das prophylaktisches Agens der vorliegenden Erfindung, für eine Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, ist unter dem Gesichtspunkt der Wirksamkeit ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agens für eine Erkrankung, die die Regulierung von Interleukin oder Interferon erforderlich macht, vorteilhaft, und ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agens für eine Erkrankung, die die Regulierung der Produktion von Interferon-γ oder Interleukin-12 erforderlich macht, ist noch bevorzugter. Auch das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung für eine allergische Erkrankung ist ein sehr nützliches antiallergisches Agens unter dem Gesichtspunkt, dass man eine Unterdrückung der IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen und Unterdrückung der IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen durch orale Verabreichung bewirken kann. Darüber hinaus ist das therapeutische oder prophylaktische Agens für eine allergische Erkrankung der vorliegenden Erfindung besonders unter dem Gesichtspunkt bemerkenswert hervorragend, dass die für ein Antigen spezifische IgE-Produktion bei einem Symptom, das durch ein Antigen sensibilisiert worden ist, wie etwa Pollinose, durch orale Verabreichung unterdrückt werden kann. Daher ist als das therapeutische Agens oder prophylaktische Agens für eine allergische Erkrankung ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agens für eine Erkrankung vorteilhaft, die die Unterdrückung von IgE-Produktion erforderlich macht.
Das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung umschließt als einen aktiven Inhaltstoff das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, und wird zur Herstellung einer Zubereitung durch die Kombination mit einem bekannten medizinischen Vehikel erhalten. Die Zubereitung wird allgemein hergestellt, indem das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon mit einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit oder einem festen Vehikel formuliert wird, und optional ein Lösungsmittel, ein Dispersionsmittel, ein Emulgator, ein Puffer, ein Stabilisator, ein Exzipient, ein Bindemittel, ein Sprengmittel, ein Gleitmittel oder dergleichen zugegeben wird, und das entstandene Gemisch zu einem festes Agens, wie etwa eine Tablette, ein Granula, ein Pulver, ein feines Pulver oder eine Kapsel oder zu einem flüssigen Agens wie etwa ein allgemeines flüssiges Agens, eine Suspension oder eine Emulsion geformt wird. Zusätzlich kann auch ein trockenes Produkt hergestellt werden, das in flüssige Form überführt werden kann, indem ein geeignetes Vehikel unmittelbar vor Gebrauch zugegeben wird.
Das pharmazeutische Vehikel kann in Abhängigkeit von der, der Verabreichungsform und der Zubereitungsform des therapeutischen Agens oder des prophylaktischen Agens der vorliegenden Erfindung entsprechend ausgewählt werden.
In dem Fall einer oral zu verabreichenden Zubereitung sind zum Beispiel Stärke, Laktose, Saccharose, Mannit, Carboxymethylcellulose, Maisstärke, anorganische Salze und dergleichen verfügbar. Zusätzlich können während der Herstellung der oral zu verabreichenden Zubereitung darüber hinaus ein Bindemittel, ein Sprengmittel, eine oberflächenaktive Substanz, ein Gleitmittel, ein Fließbeschleuniger, ein Geschmackstoff, ein Farbstoff, ein Duftstoff oder dergleichen formuliert werden.
Andererseits kann die Zubereitung in dem Fall einer nicht oral zu verabreichenden Zubereitung im Einklang mit dem herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, indem das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das ein aktiver Inhaltstoff der vorliegenden Erfindung ist, in destilliertem Wasser zur Injektion, physiologischer Kochsalzlösung, wässriger Glukoselösung, Pflanzenöl zur Injektion, Sesamöl, Erdnussöl, Sojaöl, Maisöl, Propylenglykol, Polyethylenglykol oder dergleichen als ein Verdünnungsmittel gelöst oder suspendiert werden, und optional können ein Konservierungsmittel, ein Stabilisator, ein osmotischer Regulator, ein schmerzlinderndes Agens oder dergleichen zugegeben werden.
Das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung kann über einen Verabreichungsweg verabreicht werden, der für die jeweilige Zubereitungsform geeignet ist. Das Verabreichungsverfahren ist nicht auf ein spezifisches beschränkt. Das Agens kann intern oder extern (oder topisch) oder durch Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan oder dergleichen verabreicht werden. Externe Zubereitungen umfassen ein Zäpfchen. Unter dem Gesichtspunkt seiner Wirksamkeit ist das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens bevorzugt ein therapeutisches Agens zur oralen Verabreichung oder ein prophylaktisches Agens zur oralen Verabreichung.
Die Dosis für das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung ist veränderbar und kann in Abhängigkeit von seiner Zubereitungsform, des Verabreichungsverfahrens, des Anwendungszweckes, Alters, Körpergewichtes, des Symptoms oder dergleichen des Patienten, dem das Agens verabreicht wird, oder dergleichen, in geeigneter Weise angepasst werden. Die Dosis für einen Erwachsenen pro Tag beträgt allgemein bevorzugt von 0,1 bis 2.000 mg/kg als der Menge an Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon, die in dem Präparat enthalten ist. Daher kann der Inhalt an Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon in dem therapeutischen Agens oder dem prophylaktischen Agens der vorliegenden Erfindung genau bestimmt werden, so dass das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon durch Verabreichung des therapeutischen Agens oder des prophylaktischen Agens mindestens in dem vorstehend genannten Bereich verabreicht werden kann. Selbstverständlich variiert die Dosis in Abhängigkeit von den verschiedenen Bedingungen, die vorstehend genannt worden sind, so dass eine Menge, die geringer als die vorstehend genannte Dosis ist, ausreichend sein kann, oder eine Menge, die den Dosisbereich überschreitet, erforderlich sein kann. Das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung kann unmittelbar oral verabreicht werden, oder das Agens kann jedem beliebigen Nahrungsmittel zugefügt werden, so dass es auf einer täglichen Basis aufgenommen wird. Das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon kann auch als ein Rohmaterial für Nahrungsmittel oder Futtermittel zur Regulierung der Zytokin-Produktion, der Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder als antiallergisches Mittel verwendet werden.
Zusätzlich wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon bereitgestellt, um eine Erkrankung, die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, eine Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht oder eine allergische Erkrankung zu behandeln oder zu verhindern; oder ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung, die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, einer Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht oder einer allergische Erkrankung, bei dem Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon verwendet wird.
Um eine Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, eine Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht oder eine allergische Erkrankung zu behandeln oder zu verhindern, kann das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon zum Beispiel in dem vorstehend genannten Bereich verabreicht werden. Zum Beispiel wird das therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise verabreicht.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion bereit gestellt, wie etwa ein Agens zur Regulierung von IFN-γ oder ein Agens zur Regulierung von IL-12; ein Agens zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion; oder ein antiallergisches Agens, wie etwa ein Agens zur Unterdrückung der IgE-Produktion, jedes von ihnen umfasst als einen wirksamen Inhaltstoff das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon. Diese Arzneimittel können in der gleichen Weise hergestellt werden, wie das vorstehend genannte therapeutische Agens oder das prophylaktische Agens. Zum Beispiel ist das Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion für funktionale Studien an Zytokinen und das Durchmustern von Arzneimitteln gegen eine Erkrankung, die mit Zytokinen verbunden ist, nützlich. Die Zubereitungsform und die verwendete Menge dieser Arzneimittel ist nicht besonders beschränkt, solange eine gewünschte Wirkung, die das Arzneimittel aufweist, in Abhängigkeit der jeweiligen Verwendung erhalten wird. Diese Agenzien können auch gegen die vorstehend beispielhaft angeführten Erkrankungen eingesetzt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verwendung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, zur Unterdrückung einer Allergie oder Unterdrückung der IgE-Produktion; oder ein Verfahren zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, zur Unterdrückung einer Allergie oder Unterdrückung der IgE-Produktion, worin das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon verwendet wird, bereit gestellt.
Um die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, Unterdrückung einer Allergie oder Unterdrückung der IgE-Produktion durchzuführen, kann zum Beispiel das Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion, zur Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder dergleichen in der Weise verwendet werden, dass eine gewünschte Wirkung in Abhängigkeit von der jeweiligen Verwendung erhalten wird.
Die ermitelte pharmakologische Wirkung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird nachstehend erläutert werden.
Für die Induktion der Produktion von IFN-γ in Lymphozyten ist die Induktion über direkte Stimulierung von T-Zellen durch Mitogen wie etwa Con A und über interzelluläre Wechselwirkung zwischen Antigen präsentierenden Zellen (APC) und T-Zellen während der Sensibilisierung mit einem Antigen bekannt gewesen. Ersteres ist die Induktion durch direkte Bindung des Mitogen an den T-Zell-Rezeptor, und letzteres ist die Induktion der Produktion durch Stimulierung des jeweiligen Rezeptors sowohl von APC als auch T-Zelle und der Wirkung von IL-12, das von den APC durch die Stimulierung produziert worden ist. Bezüglich der Reaktion für den Rezeptor, der an der Induktion der IL-12-Produktion beteiligt ist, sind folgende einzelne Reaktionen bekannt gewesen, Seiten-Stimulierung, wie Stimulierung von CD40L auf der T-Zell-Seite mit CD40 auf der APC-Seite, und Stimulierung von CD28 auf der T-Zell-Seite mit B7 auf der APC-Seite zusätzlich zu der Reaktion von T-Zell-Rezeptor(TCR)/Major Histokompatibilitäskomplex (MHC).
Normalerweise ist berichtet worden, dass ein Fucoidan, das aus Laminaria japonica stammt, die IFN-γ-Produktion von Lymphozyten aus der Milz, die aus normalen Mäusen stammen, induziert, um die Aktivierung von NK-Zellen zu verstärken (Chugoku Kaiyo Yakubutsu Zasshi (Zhongguo Haiyang Yaown, 1995, Dritte Periode, 9–13)). Jedoch ist dies die Induktion, die durch direkte Stimulierung von naiven T-Zellen in einer Ruhephase verursacht wird.
Betrachtet man andererseits die Wirkung auf die IFN-γ-Produktion des Fucoidan, das aus Kjellmaniella crassifolia stammt, und einer Fraktion hiervon, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bestätigt wurde, wie in den Beispielen dargestellt, wurde die Induktionswirkung für die direkte Stimulierung oder die Alloantigen-Stimulierung von Lymphozyten nicht festgestellt, und die IFN-γ-Produktion war nur unter der Antigen-Stimulierung durch sensibilisierte Lymphozyten erhöht. Darüber hinaus wurde in diesem Fall auch die Induktion von IL-12-Produktion festgestellt. Die Wirkung auf die Induktion der IFN-γ-Produktion während dieser Antigen präsentierenden Reaktion war so, dass etwa 50% der Wirkung unterdrückt wird, wenn das produzierte IL-12 durch einen anti-IL-12-Antikörper neutralisiert wird, und dass die Wirkung vollständig unterdrückt wird, wenn die Reaktion von CD40 und CD28 mit ihren Rezeptoren durch einen anti-CD40-Antikörper und einen anti-CD28-Antikörper gehemmt wird. Aus dieser Tatsache wird für den Wirkungsmechanismus für die Induktion der IFN-γ-Produktion von Fucoidan, das von Kjellmaniella crassifolia stammt, und einer Fraktion hiervon abgeleitet, dass die Induktion von IFN-γ eine Folge der Verstärkung der IL-12-Produktion von APC ist, indem das Fuciodan und eine Fraktion hiervon auf APC während der Antigen präsentierenden Reaktion einwirkt, und das Fuciodan und eine Fraktion hiervon auf die T-Zelle, die durch die Wechselwirkung von APC und T-Zelle aktiviert worden ist, einwirkt.
Das Fucoidan, das in dem vorstehend genannten Bericht, der eine direkte Induktionswirkung des Fucoidan auf T-Zellen in einer Ruhephase untersucht, beschrieben wird, unterscheidet sich von dem Fucoidan, das aus Kjellmaniella crassifolia stammt, und in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Aus diesem Grund weisen deren Fucoidane eine vollständig andere Wirkung auf.
Zusätzlich ist ebenfalls in einem System, das eine Makrophagen-Zelllinie, eine der Antigen präsentierenden Zellen, verwendet, gezeigt worden, dass das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon die Stickstoffmonoxid-Produktion induziert und die immunpotenzierende Wirkung durch Induktion zeigt. Jedoch gab es selbst in diesem System keine Induktion der IFN-γ-Produktion durch das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon. Es wird angenommen, dass das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, keine Aktivität für eine direkte Induktion der IFN-γ-Produktion besitzt, und dass die Stickstoffmonoxid-Produktion parallel zur Produktion von IL-12 verstärkt wird. Aus dem vorstehend Genannten kann abgeleitet werden, dass die Verstärkung der IFN-γ-Produktion durch das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon gemäß der vorliegenden Erfindung über die Verstärkung der IL-12-Produktion von APC durch die Wirkung des Fucoidan und eines Abbauproduktes hiervon auf die APC während der Antigen präsentierenden Reaktion verursacht wird, und nicht durch die Induktion von IFN-γ-Produktion durch direkte Stimulierung von T-Zellen in einer Ruhephase, und dass die Verstärkung der IFN-γ-Produktion durch die Wirkung des Fucoidan und eines Abbauproduktes hiervon auf T-Zellen induziert wird, die durch die Wechselwirkung von APC und T-Zellen aktiviert worden sind. Unter diesem Gesichtspunkt zeigen das Fucoidan und ein Abbauprodukt hiervon, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine vollständig andere Wirkung als jenes aus dem vorstehend genannten Bericht, der die direkte Induktionswirkung untersucht.
Hier wird IFN-γ produziert, wenn ein T-Zell-Rezeptor einer T-Zelle (Th1) durch eine Antigen präsentierende Zelle (APC) und dergleichen stimuliert wird, und die IFN-γ-Produktion wird durch IL-12, das von der APC produziert wird, verstärkt. IFN-aktiviert zelluläre Immunität, an der NK-Zellen, Makrophagen und dergleichen beteiligt sind, in einem Fall wie etwa einer viralen Infektion, Mykose und Krebserkrankungen, wodurch die Fähigkeit zur Biophylaxe verstärkt wird.
Andererseits ist bekannt gewesen, dass IFN-γ die Aktivierung von Th2-Zellen unterdrückt, von denen angenommen wird, Verursacher der Erzeugung von allergischen Erkrankungen wie etwa Asthma, Pollinosis, atopischer Dermatitis und dergleichen zu sein. Th2-Zellen induzieren die Produktion des Immunglobulin E-Antikörpers (IgE). Das produzierte IgE wird an einen Rezeptor auf der Zellmembran einer Mastzelle gebunden, wodurch die Freisetzung eines chemischen Mediators aus der Mastzelle verursacht wird. Das allergische Symptom wird auf Grund dieses entzündlichen Mediators als eine direkte Folge entwickelt.
Das antiallergische Agens der vorliegenden Erfindung unterdrückt die IgE-Produktion bei oraler Verabreichung nach Sensibilisierung mit einem Antigen und ist dadurch sehr nützlich für die Abschwächung von Symptomen bei allergischen Erkrankungen wie etwa Asthma, Pollinosis, atopischer Dermatitis und dergleichen nach deren Auftreten.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Nahrungsmittel oder Getränk zur Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder mit antiallergischer Wirkung, wobei das Nahrungsmittel oder Getränk das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst.
Betreffend besonders das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung zur Regulierung der Zytokin-Produktion, ist unter dem Gesichtspunkt der Wirksamkeit ein Nahrungsmittel oder Getränk zur Regulierung der Interleukin-Produktion oder der Interferon-Produktion bevorzugt, und ein Nahrungsmittel oder Getränk zur Regulierung der Produktion von interferon-γ oder der Produktion von Interleukin-12 ist mehr bevorzugt.
Ebenso ist das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung mit antiallergischer Wirkung ein sehr nützlicher Nahrungsmittelzusatz unter den Gesichtspunkten der Wirkung auf Unterdrückung von IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen, und der Entfaltung der Wirkung auf Unterdrückung der IgE-Produktion nach Sensibilisierung mit einem Antigen durch seine Einnahme. Daher ist als Nahrungsmittel oder Getränk mit antiallergischer Wirkung ein Nahrungsmittel oder Getränk zur Unterdrückung der IgE-Produktion bevorzugt.
Für das nachstehend beschriebene Futtermittel ist aus den gleichen Gesichtspunkten wie vorstehend genannt das Futtermittel bevorzugt, welches die vorstehend beschriebene Wirkung aufweist.
Da das Nahrungsmittel oder Getränk eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion und antiallergische Wirkung aufweist, ist das Nahrungsmittel oder Getränk sehr nützlich für die Abschwächung oder Verhinderung von Symptomen einer Erkrankung, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, einer Erkrankung, die die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht, oder einer allergischen Erkrankung, die auf das Fucoidan oder ein Abbauprodukt hiervon anspricht.
Der Ausdruck „umfasst oder umfassend" der in Bezug auf das Nahrungsmittel, Getränk oder Futtermittel oder die Kosmetik (nachstehend beschrieben) der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt die Bedeutungen von beinhalten, zusetzen und verdünnen mit ein. Der Ausdruck „beinhalten" betrifft eine Ausführungsform, in der der wirksame Inhaltstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in dem Nahrungsmittel, Getränk oder dergleichen enthalten ist; der Ausdruck „zusetzen" betrifft eine Ausführungsform, in der der wirksame Inhaltstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einem Rohmaterial für das Nahrungsmittel, Getränk oder dergleichen zugesetzt wird; und der Begriff „verdünnen" betrifft eine Ausführungsform, in der ein Rohmaterial für das Nahrungsmittel, Getränk oder dergleichen dem wirksame Inhaltstoff, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, zugesetzt wird.
Das Verfahren zur Herstellung des Nahrungsmittels oder Getränkes der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt. Das Nahrungsmittel oder Getränk kann im Einklang mit einem herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel schließt das Verfahren Kochen, Weiterverarbeitung und jedes beliebige Verfahren das allgemein zur Herstellung eines Nahrungsmittels oder Getränkes verwendet wird ein, solange das entstandene Nahrungsmittel oder Getränk das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff enthält, wobei das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder eine antiallergische Wirkung aufweist.
Das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt. Das Nahrungsmittel oder Getränk schließt jene, die das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfassen ein, einschließlich zum Beispiel weiterverarbeiteter Produkte aus Landwirtschaft oder Forstwirtschaft, weiterverarbeiteter Produkte aus der Viehwirtschaft, weiterverarbeiteter Meeresprodukte und dergleichen, einschließlich weiterverarbeiteter Getreideprodukte, wie etwa weiterverarbeitete Weizenprodukte, weiterverarbeitete Stärkeprodukte, weiterverarbeitete Produktvormischungen, Nudeln, Makaroni, Brot, Bohnenpaste, Buchweizennudeln, Weizen-Glutenbrot, Reisnudeln, fen-tiao und abgepackter Reiskuchen; weiterverarbeitete Fett- und Ölprodukte wie etwa künstliches Fett und Öl, Tempura-Öl, Salatöl, Mayonnaise und Salatsoße; weiterverarbeitete Sojaprodukte wie etwa Tofu-Produkte, Sojabohnenpaste und fermentierte Sojabohnen; weiterverarbeitete Fleischprodukte wie etwa Schinken, Speck, Pressschinken und Würstchen; Meeresprodukte wie etwa gefrorener gemahlener Fisch, gekochte Fischpaste, geformte Stäbchen aus gekochter Fischpaste, Fischkuchen aus gemahlenem Fisch, frittierte Pasteten aus Fischpaste, Fischbällchen, Sehne, Schinken und Würstchen aus Fischfleisch, getrockneter Thunfisch, Produkte aus weiterverarbeiteten Fischeiern, Fischkonserven und haltbare Nahrungsmittel, gekocht in Sojasoße (tsukudani); Milchprodukte wie etwa der Ausgangsstoff Milch, Sahne, Joghurt, Butter, Käse, Kondensmilch, Milchpulver und Speiseeis; weiterverarbeitete Gemüse- und Fruchtprodukte wie etwa Paste, Konfitüre, eingelegte Gemüse, Fruchtgetränke, Gemüsegetränke und gemischte Getränke; Süßwaren wie etwa Schokoladen, Kekse, süße Brötchen, Kuchen, Reiskuchen-Snacks und Reis-Snacks; alkoholische Getränke wie etwa Sake, chinesischer Likör, Wein, Whisky, japanischer destillierter Likör (shochu) Wodka, Brandy, Gin, Ram, Bier, alkoholische Erfrischungsgetränke, Obstschnaps und -likör; Luxusgetränke wie grüner Tee, Tee, Olong-Tee, Kaffee, Erfrischungsgetränke und Milchsäuregärgetränke; Würzmittel wie Sojasoße, Soße, Essig und süßer Reiswein; Lebensmittel in Konserven, verpackte oder eingeschweißte Lebensmittel wie etwa Reis über gekochtem Fleisch und Gemüse, Reis, zusammen mit Fleisch und Gemüse in einem kleinen Topf gekocht, gedämpfter Reis mit roten Bohnen, Curry-Mehlschwitze und Reis und andere vorgekochte Gerichte; halbgetrocknete oder konzentrierte Nahrungsmittel wie Leberpasteten und andere Aufstriche, Suppen für Buchweizennudeln oder Weizennudeln und konzentrierte Suppen; getrocknete Nahrungsmittel wie etwa Instant-Nudeln Instant-Curry-Mehlschwitze, Instantkaffee, Saftpulver, Suppenpulver, Instant-Sojabohnenpasten (miso) –suppe, vorgekochte Nahrungsmittel, vorgekochte Getränke und vorgekochte Suppe; tiefgefrorene Nahrungsmittel wie etwa Sukiyaki, im Topf gedämpfter Eintopf, aufgeschlagener und gegrillter Aal, Fleisch für Hamburger, shao-mai, Knödel, gefüllt mit Schweinehackfleisch, verschiedene Sticks und Fruchtcoctails; Feste Nahrungsmittel; flüssige Nahrungsmittel (Suppen); Gewürze; und dergleichen.
Das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung umfasst das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das eine physiologische Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder mit antiallergischer Wirkung und dergleichen aufweist, und seine Form ist nicht besonders beschränkt, solange eine Menge enthalten ist, die notwendig ist, dass das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon die physiologische Wirkung aufweisen kann. Das Nahrungsmittel oder Getränk umfasst zum Beispiel Produkte, die in die Form von Tabletten, Granulat, Kapseln oder dergleichen gebracht worden sind, welche oral eingenommen werden können.
Der Gehalt an Fucoidan und/oder einem Abbauprodukt hiervon in dem Nahrungsmittel oder Getränk kann auf der Basis der sensorischen und physiologischen Aktivität genau ausgewählt werden. Der Gehalt beträgt zum Beispiel 10^–9 Gewichtsanteile oder mehr, bevorzugt von 10^–7 bis 2 Gewichtsanteile pro 100 Gewichtsanteile des Nahrungsmittels, oder zum Beispiel 10^–9 Gewichtsanteile oder mehr, bevorzugt von 10^–7 bis 2 Gewichtsanteile pro 100 Gewichtsanteile des Getränkes. Zum Beispiel kann das Nahrungsmittel oder Getränk in der Weise eingenommen werden, dass das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon in einer Menge von 0,01 bis 2.000 mg/kg pro Tag von einem Erwachsenen eingenommen werden kann.
Hier sind das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon mit der physiologischen Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, der Wirkung auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, antiallergischer Wirkung oder dergleichen, außerordentlich nützliches Produktionsmaterial für ein Nahrungsmittel oder Getränk als ein Gesundheits-Nahrungsmittel, das sowohl physiologische Wirkung als auch Ballaststofffunktion aufweist.
Zusätzlich, wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Futtermittel für ein Tier bereit gestellt, welches das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst, welches die physiologische Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, der Wirkung auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, antiallergischer Wirkung oder dergleichen aufweist.
Ebenso wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Fütterung eines Organismus bereitgestellt, das die Verabreichung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon umfasst, welches die vorstehend genannte physiologischen Wirkung aufweist.
In diesen Erfindungen, umfassen die Organismen zum Beispiel in Kultur gehaltene oder gezüchtete Tiere, Haustiere und dergleichen. Die in Kultur gehaltenen oder gezüchteten Tiere werden beispielhaft durch Rinder, Versuchstiere, Geflügel, Fische, Krebstiere oder Schalentiere vertreten.
Als Beispiel für das Futtermittel dient ein Futtermittel zur Verbesserung des körperlichen Zustandes auf der Basis der physiologischen Wirkung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon.
Das Agens zum Füttern der Organismen umschließt Immersionsagenzien, Futtermittelzusätze und Getränkezusätze.
In diesen Erfindungen weist das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, welches die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, eine Wirkung auf die Verbesserung der Fütterungswirksamkeit bei einem Organismus auf, zum Beispiel Überlebensrate, Mastverhältnis, Verhältnis der Eiproduktion, Verhältnis der Kälberproduktion, Entwöhnugsverhältnis oder dergleichen.
In dem Verfahren zur Fütterung eines Organismus, welches die Verabreichung des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon an einen Organismus umfasst, kann das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, gewöhnlich in einer Menge von bevorzugt 0,01 bis 2.000 mg pro 1 kg Körpergewicht des betreffenden Organismus pro Tag verabreicht werden. Die Verabreichung kann erfolgen, indem zum Beispiel das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon einem Rohmaterial für ein künstlich formuliertes Futtermittel zugesetzt oder mit diesem vermischt wird, oder indem das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon mit einem Rohmaterialpulver für ein künstlich formuliertes Futtermittel vermischt wird, und anschließend andere Rohmaterialien dem entstandenen Gemisch zugesetzt oder mit ihm vermischt werden. Zusätzlich kann das Futtermittel der vorliegenden Erfindung in der Weise verabreicht werden, dass die vorstehend genannte Dosis an Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon erreicht werden kann.
Der Gehalt an Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon, das die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, in dem Futtermittel ist nicht besonders beschränkt. Das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon kann im Einklang mit seinem Bestimmungszweck verwendet werden, und eine bevorzugte Proportion in dem Futtermittel beträgt von 0,001 bis zu 15 Gewichtsprozent.
Das künstlich formulierte Futtermittel umschließt künstlich formulierte Futtermittel, die als Rohmaterialien von Tieren stammende Rohmaterialien wie etwa Fischmehl, Kasein und Tintenfischmehl; aus Pflanzen stammendes Rohmaterial wie etwa gemahlene Sojabohnen, Mehl, Stärke und Hefen für Futtermittel; tierische Fette und Öle wie etwa Dorschleberöl und Tintenfischleberöl; Pflanzenfette und Öle wie etwa Sojaöl und Rapsöl; Vitamine, Mineralien, Aminosäuren und Antioxidantien; und dergleichen umfassen. Zusätzlich sind Futtermittel für Fische wie etwa gehacktes Fischfleisch ebenfalls eingeschlossen.
Zusätzlich können funktionale Futtermaterialien, einschließlich der funktionalen Oligosaccharide wie etwa Fruktooligosaccharide und Isomaltooligosaccharide; Ballaststoffe wie Polydextrose, schwer verdauliches Dextrin und β-1,3-Glucan; Propolis, Zuckeralkohole wie Maltitol, Palatinit und Erythritol; EPA, γ-Linolsäure, Häm, Chlorella-Extrakte, Spirulina-Extrakte und Weißbeeren-Extrakte; kariostatische Materialien wie etwa Polyphenole als Rohmaterial für das Futtermittel der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Hier, als das Futtermittel der vorliegenden Erfindung, kann ein Futtermittelzusatz und ein Nahrungsergänzungsstoff für ein Futtermittel umfasst sein.
Das Verfahren zur Herstellung des Futtermittels der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, solange eine wirksame Menge des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon mit der physiologischen Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, mit antiallergischer Wirkung und dergleichen in dem hergestellten Futtermittel enthalten ist.
Ebenso kann das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, direkt verabreicht werden, indem das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon dem Wasser, Meereswasser oder dergleichen in einem Becken, Wassertank, einem Wasserreservoir oder einer Futterraufe zugesetzt wird, und der betreffende Organismus in die entstandene Lösung getaucht wird. Dieses Tauchverfahren ist besonders wirksam, wenn die Menge der Futteraufnahme des betreffenden Organismus verringert ist.
Die Konzentration des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon in Wasser oder Meereswasser ist nicht besonders beschränkt, und das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon kann im Einklang mit seinem Anwendungszweck verwendet werden. Es ist vorteilhaft, dass die Konzentration zwischen 0,00001 bis 1 Gewichtsprozent liegt.
Auch ein Getränk, das das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, umfasst, kann einem betreffenden Organismus als ein flüssiges Futter gegeben werden.
Die Konzentration des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon, das die vorstehend genannte physiologische Wirkung besitzt, in dem Getränk ist nicht besonders beschränkt, und das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon kann im Einklang mit seinem Anwendungszweck verwendet werden. Es ist vorteilhaft, dass die Konzentration zwischen 0,0001 bis 1 Gewichtsprozent liegt.
Das Futtermittel für den Organismus, zum Beispiel ein Immersionsmittel, ein Futtermittelzusatz oder ein Getränkezusatz, der als wirksamen Bestandteil das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon mit der vorstehend genannten physiologischen Wirkung umfasst, kann mit einem bekannten Verfahren hergestellt werden.
Der Organismus, dem die vorliegende Erfindung verabreicht werden kann, ist nicht beschränkt. Die in Kultur gehaltenen oder gezüchteten Tiere schließen Vieh wie etwa Equus, Bos, Porcus, Ovis, Capra, Camelus und Lama; Labortiere wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen; Geflügel wie etwa Chrysolophus, Enten, Meleagris und Struthioniformes; Fische wie etwa Pagrus, Oplegnathidae, Paralichthys, Scholle, Seriola, junge Seriola, Gelbschwanzmakrele, Thunna, Caranx delicatissimus, Plecoglossus, Salmo, Oncorhynchus, Fugu, Anguilla, Misguirus und Parasilurus; Krebstiere wie etwa Penaidae, Schwarze Tigergarnele, Penaeus roentalis, und Portulus trituberculatus; und Schalentiere wie etwa Seeohren (awabi), Kreiselschnecken, Jakobsmuscheln und Austern ein; und die Haustiere schließen Hunde, Katzen und dergleichen ein, so dass das Futtermittel in einem weiten Bereich an Tiere an Land und im Wasser verabreicht werden kann.
Indem einem betreffenden Organismus gestattet wird, das Futtermittel aufzunehmen, welches das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst, das die physiologische Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder der antiallergischen Wirkung und dergleichen, besitzt, oder indem ein betreffendes Tier in eine Lösung getaucht wird, die das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon enthält, werden die körperlichen Zustände, Gesundheit, biologische Homöostase, Stoffwechsel und dergleichen von Vieh, Versuchstieren, Geflügel, Fischen, Krebstieren, Schalentieren, Haustieren und dergleichen verbessert, so dass die vorliegende Erfindung sehr nützlich für eine Vorbeugung der Alterung eines Tieres ist.
Darüber hinaus ist das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das die physiologische Wirkung, ausgewählt aus der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder der antiallergischen Wirkung und dergleichen, besitzt, nützlich als ein wirksamer Inhaltstoff für Kosmetikum. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Kosmetikum zur Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion, mit antiallergischen Wirkung oder dergleichen bereit gestellt, in dem das Kosmetikum das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon als einen wirksamen Inhaltstoff umfasst.
Der Gehalt an Fucoidan und/oder einem Abbauprodukt hiervon, der in diesen Kosmetika oder dergleichen enthalten ist, beträgt gewöhnlich zwischen 0,0001 bis 20 Gewichtsprozent, mehr bevorzugt zwischen 0,001 bis 5 Gewichtsprozent.
Das Kosmetikum der vorliegenden Erfindung ist sowohl bei oraler Verabreichung als auch bei perkutaner Applikation wirksam. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kosmetikum bereitgestellt, das sowohl bei perkutaner Applikation als auch bei oraler Verabreichung wirksam ist. Besonders das Kosmetikum mit antiallergischer Wirkung ist auf Grund seiner anti-atopischen Wirkung nützlich für die Behandlung oder Verhinderung von atopischer Dermatitis. Hier kann die Höhe der Dosis und die Applikationsmenge genau eingestellt werden, um die gewünschten Wirkungen zu erzielen.
Das Kosmetikum der vorliegenden Erfindung kann gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Als Kosmetikum zur Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder mit antiallergischer Wirkung kann zum Beispiel eine Lotion, eine Milch, Creme, eine Gesichtspackung, ein Badezusatz, ein Gesichtsreinigungsmittel, eine Badeseife, ein Haarwasser, eine Haarspülung oder ein Shampoo hergestellt werden.
Zusätzlich wurde kein Todesfall festgestellt, selbst wenn das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon mit der Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion oder mit antiallergischer Wirkung, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einer Ratte oral in einer Einzeldosis von 1 g/kg verabreicht wird.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Beispiele genauer beschrieben, ohne dadurch den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken. Die Angabe „%" in den Beispielen bedeutet hier "Gewichtsprozente".
Referenzbeispiel 1

(1) Kjellmaniella crassifolia wurde ausreichend gerocknet, und anschließend wurden 20 kg des getrockneten Produktes in einer „Free-mill" (hergestellt von Nara Kikai Seisakusho) zu Pulver zermahlen.

In 900 Litern Leitungswasser wurden 7,3 kg Calciumchloriddihydrat (hergestellt von Nippon Soda Co., Ltd.) gelöst, und 20 kg des pulverisierten Produktes aus Kjellmaniella crassifolia wurden dann hiermit vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde über 40 Minuten erhitzt, bis die Temperatur der Flüssigkeit durch durchgeleiteten Dampf von 12°C auf 90°C erhöht wurde. Danach wurde das Gemisch unter Rühren über 1 Stunde auf 90°C bis 95°C gehalten und dann abgekühlt, um 1100 Liter eines abgekühlten Produktes zu ergeben.
Anschließend wurde das abgekühlte Produkt der Fest-Flüssig-Trennung mit einem Fest-Flüssig-Separator (hergestellt von West Farrier Separator, Model: CNA) unterworfen, um etwa 900 Liter Überstand nach der Fest-Flüssig-Trennung zu ergeben.
Die Menge von 360 Litern des Überstandes nach der Fest-Flüssig-Trennung wurde mit FE10-FC-FUS0382 (Fraktionsmolekulargewicht: 30.000), hergestellt von DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD., auf ein Volumen von 20 Litern konzentriert. Danach wurden die Schritte des Zugebens von 20 Liters Leitungswasser und wiederum Konzentrierens des entstandenen Flüssigkeitsgemisches auf ein Volumen von 20 Litern 5-mal wiederholt, und das Konzentrat wurde einer Ensalzungs-Behandlung unterzogen, um 25 Liter eines von Kjellmaniella crassifolia stammenden Extraktes zu ergeben.
Ein Liter des Extraktes wurde lyophilisiert, um 13 g eines getrockneten, von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan-Produktes zu ergeben.

(2) 7 Gramm des getrockneten Fucoidan-Produktes, das in Punkt (1) des Referenzbeispiels 1 beschrieben worden ist, wurde in 700 ml einer 20 mM Imidazol-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) gelöst, die 50 mM Natriumchlorid und 10% Ethanol enthielt, und unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand nach der Zentrifugation wurde auf eine DEAE-Cellulofine-A-800-Säule (0 11,4 cm × 48 cm) aufgetagen, mit der selben Pufferlösung equilibriert und dann mit der selben Pufferlösung gewaschen. Die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten von 50 mM bis 1,95 M Natriumchlorid (250 ml pro Fraktion) durchgeführt. Ein Gesamtzuckergehalt und ein Uronsäuregehalt wurden durch das Phenolschwefelsäure-Verfahren und das Carbazolschwefelsäure-Verfahren bestimmt, und ergaben die Fraktionen 43 bis 49, Fraktionen 50 bis 55, und Fraktionen 56 bis 67, in der Reihenfolge der Elution. Als nächstes wurden diese Fraktionen durch Elektrodialyse entsalzt und lyophilisiert, um jeweils die Fraktion I (340 mg) aus den Fraktionen 43 bis 49, Fraktion 11 (870 mg) aus den Fraktionen 50 bis 55 und Fraktion III (2,64 g) aus den Fraktionen 56 bis 67 zu ergeben.

1 stellt ein Elutionsmuster des aus Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan aus der DEAE-Cellulofine-A-800-Säule dar. In 1, stellt die Ordinate die Absorption bei 530 nm dar, die durch das Carbazolschwefelsäure-Verfahren bestimmt worden ist (ausgefüllte Kreise in der Grafik), die Absorption bei 480 nm, die durch das Phenolschwefelsäure-Verfahren bestimmt worden ist (offene Kreise in der Grafik) und die elektrische Leitfähigkeit (mS/cm: offene Quadrate in der Grafik), und auf der Abszisse ist die Nummer der Fraktion angegeben.
Referenzbeispiel 2

(1) Ein 2-Liter-Erlenmeyerkolben wurde mit 600 ml eines Kulturmediums befüllt, welches ein künstliches Meerwasser (hergestellt von Jamarin Laborstory), pH-Wert 8,2 umfasste, das 0,25% Glukose, 1,0% Pepton und 0,05% Hefeextrakt enthielt, und wurde dann sterilisiert (bei 120°C über 20 Minuten). Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) wurde in das Kulturmedium geimpft und bei 25°C über 26 Stunden kultiviert, um ein Saat-Kulturmedium zu ergeben. Ein 30-Liter-Glasfermenter wurde mit 20 Litern eines Kulturmediums befüllt, das ein künstliches Meerwasser, pH-Wert 8,0, umfasste, das 1,0% Pepton, 0,02% Hefeextrakt, 0,2% sulfatistertes Polysaccharid, wie nachstehend unter Punkt (2) des Referenzbeispiels 2 beschrieben, und 0,01% Antischaummittel (hergestellt von Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KM70) enthielt, und wurde bei 120°C über 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden 600 ml des vorstehend genannten Saat-Kulturmediums beimpft und bei 24°C über 24 Stunden unter den Bedingungen von 10 Litern Luftzufuhr pro Minute und einer Rührrate von 250 rpm kultiviert. Nach Beendung der Kultur wurde das Kulturmedium zentrifugiert, um Zellen und Kulturüberstand zu ergeben. Der erhaltene Kulturüberstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 10.000 aufwiesen, konzentriert, und das Konzentrat wurde dann der Aussalzung mit einem zu 85% gesättigten Ammoniumsulfat unterworfen. Sich bildende Präzipitate wurden durch Zentrifugation geerntet und ausreichend gegen eine 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,2) dialysiert, welche ein künstliches Meerwasser in einer 1/10-Konzentration enthielt, um 600 ml einer Lösung eines endo-sulfatisiertes Polysaccharid abbauenden Enzyms (F-Fucoidan spezifisches Abbauenzym) zu ergeben, welches selektiv auf das sulfatisierte Polysaccharid einwirkt.
(2) Zwei Kilogramm getrocknete Kjellmaniella crassifolia wurden mit einer Schneidemühle (hergestellt von Masuko Sangyo), die mit einem Sieb mit einem Durchmesser von 1 mm ausgestattet war, zerschnitten, und die entstandenen Algenschnitzel wurden in 20 Litern 80%igem Ethanol suspendiert. Die Suspension wurde bei 25°C über 3 Stunden gerührt und durch ein Filterpapier filtriert, und anschließend wurde der Rest ausreichend gewaschen. Der erhaltene Rückstand wurde in 40 Litern einer 20 mM Natriumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 6,5, suspendiert, welche auf 95°C erhitzt wurde, die Pufferlösung enthielt 50 mM Natriumchlorid. Die Suspension wurde mit 95°C über 2 Stunden mit gelegentlichem Umrühren behandelt, um ein sulfatisiertes Polysaccharid zu extrahieren.

Die Suspension des Extraktes wurde gefiltert, um ein Filtrat zu ergeben. Anschließend wurde der Filtrationsrest mit 3,5 Litern 100 mM Natriumchlorid gewaschen, um ein zusätzliches Filtrat zu ergeben.
Beide Filtrate wurden kombiniert, und dann wurde die Temperatur auf 30°C gesenkt. Nachdem 3.000 U Alginsäure-Lyase K (hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo) zu dem entstandenen Gemisch zugegeben worden waren, wurden 4 Liter Ethanol hierzu hinzugegeben. Das entstandene Gemisch wurde bei 25°C über 42 Stunden gerührt. Als nächstes wurde das Gemisch zentrifugiert, und der entstandene Überstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, auf ein Volumen von 4 Litern konzentriert. Darüber hinaus wurde die Ultrafiltration mit 100 mM Natriumchlorid, das 10% Ethanol enthielt, fortgeführt, bis keine farbige Substanz mehr ausgefiltert wurde.
Präzipitate, die in einer nicht-Filtrat-Lösung gebildet wurden, wurden durch Zentrifugation entfernt, und die Temperatur des entstandenen Überstandes wurde auf 5°C gesenkt. Der pH-Wert wurde mit 0,5 N Hydrochlorsäure auf 2,0 eingestellt, und anschließend wurden die gebildeten Präzipitate, wie etwa ein Protein, durch Zentrifugation entfernt. Der pH-Wert des entstandenen Überstandes wurde mit 1 N Natriumhydroxid schnell auf 8,0 eingestellt.
Als nächstes wurde eine Ultrafiltration mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, durchgeführt, und das Lösungsmittel wurde vollständig durch 20 mM Natriumchlorid, pH-Wert 8,0, substituiert. Anschließend wurde der pH-Wert erneut auf 8,0 eingestellt, und das entstandene Gemisch wurde zentrifugiert und dann lyophilisiert, um etwa 95 g eines sulfatisierten Polysaccharides zu ergeben.

(3) Zwei Kilogramm getrocknete Kjellmaniella crassifolia wurden mit einer Schneidemühle, die mit einem Sieb mit einem Durchmesser von 1 mm ausgestattet war, zerschnitten, und die entstandenen Algenschnitzel wurden in 20 Litern 80-%igem Ethanol suspendiert. Die entstandene Suspension wurde bei 25°C über 3 Stunden gerührt und durch ein Filterpapier filtriert, und anschließend wurde der Rest ausreichend gewaschen. Der erhaltene Rückstand wurde in 20 Litern einer Pufferlösung (pH-Wert 8,2) suspendiert, die 30 ml einer Lösung des endosulfatisiertes Polysaccharid abbauenden Enzyms, das unter Punkt (1) des vorstehend genannten Referenzbeispiels 2 hergestellt worden war, 10% Ethanol, 100 mM Natriumchlorid, 50 mM Calciumchlorid und 50 mM Imidazol enthielt, und das entstandene Gemisch wurde bei 25°C über 48 Stunden gerührt. Diese Suspension wurde durch ein rostfreies Sieb mit einem Öffnungsdurchmesser 32 μm filtriert, und der Rückstand wurde mit 10% Ethanol, der 50 mM Calciumchlorid enthielt, gewaschen. Darüber hinaus wurde der Rückstand in 10 Litern 10%igem Ethanol, der 50 mM Calciumchlorid enthielt, suspendiert, und die Suspension wurde über 3 Stunden gerührt, und anschließend durch das rostfreie Sieb filtriert, und der Rückstand wurde gewaschen. Darüber hinaus wurde der Rückstand unter gleichen Bedingungen suspendiert, und die Suspension wurde durch das rostfreie Sieb mit einem Durchmesser von 32 μm filtriert, und der Rückstand wurde gewaschen.

Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten, die auf diese Weise gewonnen wurden, wurden gesammelt, und das kombinierte Gemisch wurde der Ultrafiltration mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 3.000 aufwiesen, unterworfen, wodurch eine filtrierte Lösung von einer nicht filtrierten Lösung getrennt wurde.
Diese filtrierte Lösung wurde mit einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von etwa 3 Litern konzentriert, und anschließend wurde das Konzentrat zentrifugiert, um einen Überstand zu ergeben. Der erhaltene Überstand wurde mit einem elektrischen Dialysator, der mit einer Membran ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 300 aufwies, entsalzt. Der entstandenen Lösung wurde Calciumacetat zugegeben, um eine Konzentration von 0,1 M zu ergeben, und sich bildende Präzipitate wurden durch Zentrifugation entfernt. Der entstandene Überstand wurde auf eine DEAE-Cellulofine-Säule (Menge des Harzes: 4 Liter) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Calciumacetat equilibriert worden war, und gründlich mit 50 mM Calciumacetate und 50 mM Natriumchlorid gewaschen. Anschließend wurde die Elution mit einem Konzentrationsgradienten von 50 mM bis 800 mM Natriumchlorid durchgeführt. Die gesammelte Menge betrug in diesem Fall 500 ml pro Fraktion. Die gesammelte Fraktion wurde durch Zelluloseacetatmembran-Elektrophorese [Analytical Biochemistry, 37, 197–202 (1970)] analysiert. Als ein Ergebnis war ein sulfatisiertes Saccharid, das bei einer Konzentration von etwa 0,4 M Natriumchlorid (in Nachbarschaft zu Fraktion Nr. 63) eluiert wurde, homogen.
Dann wurde eine Lösung von Fraktion Nr. 63 zuerst auf ein Volumen von 150 ml konzentriert, und anschließend wurde Natriumchlorid zugegeben, so dass eine Konzentration von 4 M erhalten wurde. Die entstandene Lösung wurde auf eine Phenyl-Cellulofine-Säule (Menge des Harzes: 200 ml) aufgetragen, die zuvor mit 4 M Natriumchlorid äquilibriert worden war, und gründlich mit 4 M Natriumchlorid gewaschen. Nicht-adsorbierte sulfatisierte Saccharid-Fraktionen wurden gesammelt und mit einem elektrischen. Dialysator, der mit einer Membran ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 300 aufwies, entsalzt, um 505 ml einer entsalzenen Lösung zu ergeben.
40 Milliliter der entsalzten Lösung, die erhalten worden war, wurden auf eine Cellulofine-GCL-90-Säule (4,1 cm × 87 cm) aufgetragen, die mit 0,2 M Natriumchlorid, das 10% Ethanol enthielt, äquilibriert worden war, um die Gelfiltration durchzuführen. Die Sammlung wurde mit 9,2 ml pro Fraktion durchgeführt.
Alle Fraktionen wurden durch das Phenolschwefelsäure-Verfahren [Analytical Chemistry, 28, 350 (1956)] auf ihren Gesamtzuckergehalt analysiert.
Da die sulfatisierten Saccharide einen einzelnen Peak bildeten, wurden als ein Ergebnis die Fraktionen Nr. 63 bis 70, die diejenigen Fraktionen waren, die einem zentralen Teil des Gipfels entsprachen, gesammelt. Die kombinierte Fraktion wurde mit einem elektrischen Dialysator, der mit einer Membran ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 300 aufwies, entsalzt und anschließend lyophilisiert, um 112 mg eines getrockneten Produktes der Verbindung zu ergeben, die durch die nachstehende Formel V dargestellt wird.
Referenzbeispiel 3

(1) Zwei Kilogramm getrocknete Kjellmaniella crassifolia wurde mit einer Schneidemühle (hergestellt von Masuko Sangyo) pulverisiert, die mit einem Sieb ausgestattet war, welches einen Lochdurchmesser von 1 mm aufwies. Nachdem das pulverisierte Produkt in 20 Litern 80%igem Ethanol bei 25°C über 3 Stunden gerührt worden war, wurde das Gemisch filtriert, und der Rückstand wurde gewaschen. Der entstandene Rückstand wurde in 20 Litern einer 30 mM Imidazolpufferlösung (pH-Wert 8,2) suspendiert, die 50 mM Calciumchlorid, 100 mM Natriumchlorid, 10% Ethanol und 1 U des endo-sulfatisiertes Polysaccharid abbauenden Enzyms (für F-Fucoidan spezifisches Abbau-Enzym) von Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747), das unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 2 hergestellt worden war, enthielt. Die entstandene Suspension wurde bei 25°C über 2 Tage gerührt und anschließend durch ein rostfreies Sieb mit einem Lochdurchmesser von 32 μm filtriert, und der Rückstand wurde gewaschen. Der entstandene Rückstand wurde in 40 Litern einer Natriumphosphatpufferlösung (pH-Wert 6,6) suspendiert, die 100 mM Natriumchlorid, 10% Ethanol und 4 g einer Alginsäure-Lyase (hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo) enthielt. Die entstandene Suspension wurde bei 25°C über 4 Tage gerührt und anschließend zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Um Produkte der Alginsäure mit geringem Molekulargewicht, die in dem erhaltenen Überstand enthalten waren, zu entfernen, wurde der Überstand mit Hilfe eines Ultrafilters, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, auf ein Volumen von 2 Litern konzentriert, und anschließend wurde das Lösungsmittel gegen 100 mM Natriumchlorid, welches 10% Ethanol enthielt, ausgetauscht. Zu der entstandenen Lösung wurde unter Rühren ein Äquivolumen an 400 mM Calciumacetat gegeben, und anschließend wurde das Gemisch zentrifugiert. Der pH-Wert des entstandenen Überstandes wurde unter Kühlen auf Eis mit 1 N Chlorwasserstoffsäure auf 2 eingestellt. Sich bildende Präzipitate wurden durch Zentrifugation entfernt, und der pH-Wert des entstandenen Überstandes wurde mit 1 N Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Diese Lösung wurde durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 1 Liter konzentriert, und anschließend wurde das Lösungsmittel gegen 100 mM Natriumchlorid ausgetauscht. Präzipitate, die sich dieses Mal bildeten, wurden durch Zentrifugation entfernt. Um hydrophobe Substanzen in dem entstandenen Überstand zu entfernen, wurde Natriumchlorid zu dem Überstand zugegeben, so dass sich eine Konzentration von 1 M ergab, und das entstandene Gemisch wurde auf eine Säule aufgetragen, die 3 Liter Phenyl-Cellulofine (Hergestellt von Seikagaku Corporation), äquilibriert mit 1 M Natriumchlorid, enthielt, um eine ausfließende Fraktion zu sammeln. Die Fraktion wurde mit einem Ultrafilter konzentriert, und anschließend wurde das Lösungsmittel gegen 20 mM Natriumchlorid ausgetauscht. Die entstandene Lösung wurde lyophilisiert, und das Gewicht des lyophilisierten Produktes betrug 29,3 g.
(2) 15 Gramm des vorstehend genannten lyophilisierten Produktes wurden in 1,5 Litern 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung gelöst, die 400 mM Natriumchlorid und 9 U eines endo-sulfatisiertes Polysaccharid abbauenden Enzyms (für U-Fucoidan spezifisches Abbau-Enzym) enthielt, welches in gleicher Weise aus einer Kultur gewonnen worden war, wie unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 2 beschrieben, wobei die Kultur hergestellt worden war, indem Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) kultiviert wurde, wie in W097/26896 offenbart. Nachdem die entstandene Lösung der Umsetzung bei 25°C über 6 Tage unterworfen worden war, wurde das Umsetzungsgemisch mit einem Verdampfer auf ein Volumen von etwa 300 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Ausschluss-Molekulargewicht von 3.500 gegeben und gründlich dialysiert. Die in dem Dialyseschlauch verbliebene Lösung wurde auf eine Säule aufgetragen, die 4 Liter DEAE-Cellulofine-A-800, äquilibriert mit 50 mM Natriumchlorid, enthielt, und gründlich mit 50 mM Natriumchlorid gewaschen. Anschließend wurde die Flution mit einem Konzentrationsgradienten von 50 bis 650 mM Natriumchlorid durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Flution in der selben Säule ausreichend mit 650 mM Natriumchlorid durchgeführt. Aus den eluierten Fraktionen wurden die Fraktionen, die mit 650 mM Natriumchlorid eluiert worden waren, als eine sulfatisierte Fucogalactan-Fraktion gesammelt und mit einem Ultrafilter mit einem Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 konzentriert. Anschließend wurde das Lösungsmittel durch 10 mM Natriumchlorid ersetzt, und die entstandene Lösung wurde lyophilisiert, um 0,85 g eines lyophilisierten Produktes an sulfatisiertem Fucogalactan zu ergeben. Es stellte sich heraus, dass das erhaltene Fucogalactan (G-Fucoidan) Galactose und Fucose als konstituierende Saccharide in einem molaren Verhältnis von etwa 2:1 enthielt.

Referenzbeispiel 4
Ein Kilogramm eines getrockneten Produktes eines käuflich zu erwerbenden Sporophylls von Undaria pinnatifida (Wakame Mekabu) wurde in einer Schneidemühle, die mit einem Sieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ausgestattet war, pulverisiert. Anschließend wurde das pulverisierte Sporophyll in 10 Litern 80%igem Ethanol suspendiert, und die Suspension wurde über 3 Stunden gerührt und anschließend durch ein Filterpapier filtriert, um einen Rückstand zu ergeben. Der Rückstand wurde in 20 Litern einer 40 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,5), die 50 mM Natriumchlorid enthielt, suspendiert und über 2 Stunden mit 95°C behandelt. Die behandelte Lösung wurde auf 37°C abgekühlt, und anschließend wurde Ethanol hinzu gegeben, bis eine Konzentration von 10% gegeben war. 12.000 U einer käuflich zu erwerbenden Alginsäure-Lyase K (hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo) wurden hinzu gegeben, und anschließend wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur über 24 Stunden gerührt. Die entstandene behandelte Lösung wurde zentrifugiert, und der entstandene Überstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, auf ein Volumen von 2 Litern konzentriert. Anschließend wurden sich bildende Präzipitate durch Zentrifugation entfernt. Der entstandene Überstand wurde auf 5°C abgekühlt, und anschließend wurde 0,5 N Chlorwasserstoffsäure zugegeben, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Nachfolgend wurden das entstandene Gemisch über 30 Minuten gerührt, und sich bildenden Niederschläge wurden durch Zentrifugation entfernt. Der pH-Wert des entstandenen Überstandes wurde mit 0,5 N Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt, und das Lösungsmittel wurde mittels Ultrafiltration durch 20 mM Natriumchlorid ersetzt. Der pH-Wert der entstandenen Lösung wurde auf 8,0 eingestellt, und anschließend wurde der Überstand, der durch Zentrifugation gewonnen wurde, lyophilisiert, um 90,5 g Fucoidan vom Sporophyll von Undaria pinnatifida zu erhalten.
Referenzbeispiel 5
Ein Kilogramm eines getrockneten Produktes von Fucus vesiculosus wurde in 10 Litern 80%igem Ethanol suspendiert, und die Suspension wurde über 3 Stunden gerührt und anschließend durch ein Filterpapier filtriert, um einen Rückstand zu ergeben. Der Rückstand wurde in 30 Litern einer 30 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0), die 100 mM Natriumchlorid enthielt, suspendiert und bei 95°C über 2 Stunden behandelt. Nachdem die behandelte Suspension auf 37°C abgekühlt war, wurden 100 g aktivierter Kohlenstoff zugegeben, und das Gemisch wurde über 30 Minuten gerührt. Nachdem 3.000 U einer käuflich zu erwerbenden Alginsäure-Lyase K zugegeben worden war, wurde Ethanol zugegeben, so dass eine Konzentration von 10% gegeben war, und das entstandene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über 24 Stunden gerührt. Die entstandene behandelte Lösung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, auf ein Volumen von 2 Litern konzentriert. Anschließend wurden sich bildende Präzipitate durch Zentrifugation entfernt, und der entstandene Überstand wurde mit einem zugegebenen Extrakt ultrafiltriert, um ein Pigment zu entfernen. Die nicht filtrierte Lösung wurde auf 5°C abgekühlt und anschließend wurde 0,5 N Chlorwasserstoffsäure hinzu gegeben, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Anschließend wurde die entstandene Lösung über 30 Minuten gerührt, und sich bildende Präzipitate wurden durch Zentrifugation entfernt. Der pH-Wert des Überstandes wurde mit 0,5 N Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt, und das Lösungsmittel wurde mittels Ultrafiltration durch 20 mM Natriumchlorid ersetzt. Der pH-Wert der entstandenen Lösung wurde auf 8,0 eingestellt, und anschleißend wurde der durch Zentrifugation erhaltene Überstand lyophilisiert, um 71 g Fucoidan aus Fucus vesiculosus zu ergeben.
Referenzbeispiel 6
Zwei Gramm Fucoidan von Kjellmaniella crassifolia, hergestellt mit dem Verfahren, das unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 1 beschrieben worden ist, wurden in 100 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit Zitronensäure auf den pH-Wert 3 eingestellt. Anschließend wurde das entstandene Gemisch bei 100°C über 3 Stunden behandelt, um ein Hydrolysat mit der Säure des Fucoidan zu erhalten. Dieses Hydrolysat wurde der Molekulargewichtsfraktionierung durch Gelfiltration auf Cellulofine-GCL-300 oder Cellulofine-GCL-25 unterworfen, um das Hydrolysat in folgende Fraktionen aufzuteilen: größer als MW 25.000 (Fraktion A), größer als MW 10.000 bis MW 25.000 (Fraktion B), größer als MW 5.000 bis MW 10.000 (Fraktion C), größer als MW 2.000 bis MW 5.000 (Fraktion D), größer als MW 500 bis MW 2.000 (Fraktion E) und MW 500 oder kleiner (Fraktion F). Darüber hinaus wurden jede dieser Fraktionen und das Hydrolysat entsalzt und dann lyophilisiert, um das Hydrolysat und jede einzelne Fraktion des Hydrolysates zu ergeben.
Referenzbeispiel 7
Fünf Kilogramm Seegurken wurden seziert, und die Organe wurden entfernt, um somatische Schichten zu gewinnen. Pro 200 g Nassgewicht an somatischen Schichten wurden 500 Milliliter Aceton zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Homogenisator behandelt. Anschließend wurde das Homogenat filtriert, und der Rückstand wurde mit Aceton gewaschen, bis keine farbigen Substanzen mehr zurückblieben. Dieser Rückstand wurde unter Absaugung getrocknet, um 140 g eines getrockneten Produktes zu ergeben. Zu diesem getrockneten Produkt wurden 2,8 Liter einer 0,4 M Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 100°C über 1 Stunde behandelt. Anschließend wurde das Gemisch filtriert, und der entstandene Rest wurde gründlich mit einer 0,4 M Kochsalzlösung gewaschen, um 3,7 Liter eines Extraktes zu ergeben. Zu diesem Extrakt wurde 5%iges Cetylpyridinchlorid zugegeben, bis sich keine weiteren Präzipitate mehr bildeten, und die gebildeten Präzipitate wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Niederschläge wurden in einer 0,4 M Kochsalzlösung suspendiert und wiederum zentrifugiert. Ein Liter einer 4 M Kochsalzlösung wurde zu den entstandenen Präzipitaten zugegeben, und das Gemisch wurde mit einem Homogenisator behandelt. Anschließend wurden 4 Liter Ethanol unter Rühren hinzu gegeben, und das entstandene Gemisch wurde über 1 Stunde gerührt und anschließend filtriert, um Präzipitate zu ergeben. Die Schritte der Suspendierung der Präzipitate in 80%igem Ethanol und anschließender Filtrierung der Suspension wurden wiederholt, bis die Absorption des Überstandes bei 260 nm 0 betrug. Die erhaltenen Präzipitate wurden in 2 Litern einer 2 M Kochsalzlösung suspendiert, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit einer Membran mit einem Ausschluss-Molekulargewicht von 30.000 ausgestattet war, ultrafiltriert und vollständig entsalzt. Anschließend wurde das entstandene Produkt lyophilisiert, um 3,7 g Fucoidan aus Seegurken zu ergeben.
Referenzbeispiel 8
625 Gramm einer käuflich zu erwerbenden, mit Salz konservierten Cladosiphon okamuranus wurden in 4375 ml einer 30 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) suspendiert und mit einem Homogenisator bei 8.000 rpm über 5 Minuten behandelt. Anschließend wurde das Homogenat bei 95°C über 1 Stunde behandelt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Zu dem entstandenen Überstand wurden 10 Gramm aktivierter Kohlenstoff gegeben, und das entstandene Gemisch wurde dann über 30 Minuten gerührt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der entstandene Überstand wurde mit einem Ultrafilter, der mit Hohlfasern ausgestattet war, welche ein Ausschluss-Molekulargewicht von 100.000 aufwiesen, auf ein Volumen von 2 Litern konzentriert, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch 20 mM Natriumchlorid ersetzt. Die entstandene Lösung wurde lyophilisiert, um 10,9 g eines getrockneten Produktes einer von Cladosiphon okamuranus stammenden Fucoidan-Fraktion zu ergeben.
Beispiel 1
RAW-264.7-Zellen (ATCC TIB 71) wurden in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Kulturmedium (hergestellt von Bio Whittaker; 12-917 F) ohne Phenol-Rot, das 10% fötales Rinderserum (hergestellt von Gibco), 2 mM L-Glutamin (hergestellt von Life Technologies Oriental, 25030–149) enthielt, suspendiert, sodass eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erhalten wurde. Die Zellsuspension wurde in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 48 Vertiefungen mit einem Volumen von jeweils 500 μl gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C in Anwesenheit von 5% CO₂-Gas über 12 Stunden oder 24 Stunden kultiviert. Jede der wässrigen Lösungen der Proben, die nachstehend beschrieben werden, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Zellen wurden für einen gegebenen, vorstehend genannten Zeitraum kultiviert. Anschließend wurde die Konzentration an NO₂, das sich durch die Oxidation von Stickstoffmonoxid (NO) im Kulturmedium gebildet hatte, bestimmt. Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des aus Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan, welches unter Punkt (2) des Referenzbeispiels 1 beschrieben wurde, und die Verbindung, die durch die Formel V dargestellt wird, die unter Punkt (3) des Referenzbeispiels 2 beschrieben worden ist (hierin nachstehend als 7-12SFd-F bezeichnet), die als die Proben verwendet wurden, wurden zugegeben, so dass die Endkonzentration von 1, 10 oder 100 μg/ml erhalten wurde. Ebenfalls wurde als Kontrolle steriles, destilliertes Wasser mit gleichen Volumen wie dem der Proben zugegeben. Als positive Kontrolle wurde ein Lipopolysaccharid (LPS, hergestellt von Sigma) zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 1 μg/ml erhalten wurden.
Nach der vorstehend genannten Kultivierung wurden 100 μl eines 4%igen Griess-Reagenz (hergestellt von Sigma, G4410) zu 100 μl des Kulturmediums zugegeben, und man liess das entstandene Gemisch, bei Zimmertemperatur über 15 Minuten stehen. Anschließend wurde die Absorption bei 540 nm bestimmt. Die NO₂-Konzentration im Kulturmedium wurde aus einer Kalibrierungskurve berechnet, die zuvor unter Verwendung von NaNO₂, das im vorstehend genannten Kulturmedium in einer bekannten Konzentration gelöst worden war, aufgezeichnet worden war. Alle Messungen wurden dreimal durchgeführt.
Als ein Ergebnis wurde geklärt, dass sowohl 7-12SFd-F als auch Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan die Induktion der NO-Produktion beschleunigten und eine immunpotenzierende Wirkung hatten. Die Ergebnisse werden in den 2 bis 5 dargestellt. im Einzelnen ist 2 ein Diagramm, das die NO₂-Konzentration im Kulturmedium darstellt, wenn unter Zugabe von 7-12SFd-F kultiviert wird, 3 ist diejenige unter Zugabe von Fraktion I, 4 ist diejenige unter Zugabe von Fraktion II und 5 ist diejenige unter Zugabe von Fraktion III. Auch 6 ist ein Diagramm, welches die NO₂-Konzentration im Kulturmedium darstellt, wenn unter Zugabe von LPS als positive Kontrolle kultiviert wird. In den 2 bis 6 sind auf der Abszisse die Kulturbedingungen aufgetragen, und die Ordinate gibt die NO₂-Konzentration an (μM).
Aus diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F eine Induktionswirkung auf die NO-Produktion ausübten und gleichzeitig eine immunpotenzierende Wirkung aufwiesen.
Auch die anderen Fucoidane und Abbauprodukte hiervon, die in den einzelnen Referenzbeispielen beschrieben werden, zeigten eine ähnliche Induktionswirkung auf die NO-Produktion.
Zusätzlich wurde im selben Kulturmedium wie dem Kulturmedium, das für die Bestimmung der NO₂-Konzentration verwendet worden war, die Menge an IFN-γ unter Verwendung eines ELISA-Kit (Genzyme) bestimmt. In diesem System wurde jedoch keine Induktion der IFN-γ-Produktion durch Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan, 7-12SFd-F und anderen Fucoidanen und Abbauprodukten hiervon, die in den einzelnen Referenzbeispielen beschrieben worden sind, festgestellt.
Beispiel 2
(1) Induktionswirkung auf die IFN-γ-Produktion von nicht stimulierten Lymphozyten.
Eine ICR-Maus (weiblich, 7 Wochen alt, Körpergewicht etwa 25 g) wurde vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. Die Milz wurde aus der Maus entnommen, fein zerrieben und in RPMI-1640-Kulturmedium (Gibco) suspendiert, welches 10% fötales Rinderserum (Hiclone) enthielt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Adhärente Zellen wurden entfernt, indem sie an eine Plastik-Petrischale angeheftet wurden, und nicht adhärente Zellen wurden als Lymphozyten der Milz verwendet. Die Lymphozyten der Milz wurden in RPMI-1640-Kulturmedium suspendiert, das 10% fötales Rinderserum enthielt, deren Konzentration wurde auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und die Zellsuspension wurde mit einem Volumen von 180 μl/Vertiefung auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jede Probe wurde in destilliertem Wasser gelöst, und die Konzentration wurde auf 100 mg/ml eingestellt. Die entstandene Lösung wurde mit dem Kulturmedium auf eine 10-fache Konzentration der angegebenen Konzentration verdünnt. Als Kontrolle wurde das Kulturmedium in gleichem Volumen wie das der Probe zugegeben. Zu jedem einzelnen Fucoidan, Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F, die in den Referenzbeispielen beschreiben wurden, welche eine Konzentration von 10 bis 500 beziehungsweise 100 μg/ml aufwiesen, wurde eine 100 μg/ml-Lösung von Concanavalin A (Con A; Nakalaitesque) in einer Menge von 20 mg/ml in jede Vertiefung außer zu der Kontrollgruppe zugegeben, und die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5% CO₂-Gas bei 37°C über 2 Tage oder 4 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand geerntet, und die Menge an IFN-γ wurde unter Verwendung eines ELISA-Kit (Genzyme) bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde keine Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion bei nicht stimulierten Lymphozyten für das jeweilige Fucoidan, Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F, die in den Referenzbeispielen beschrieben werden, bei einer Dosis von 500 μg/ml oder weniger festgestellt. Andererseits wurde eine starke Induktion für die IFN-γ-Produktion bei den Zellen festgestellt, denen Con A zugegeben worden war.
(2) Induktionswirkung für IFN-γ-Produktion unter Alloantigen-Stimulierung
Eine BALG/c-Maus (weiblich, 6 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) und eine C57BL/6-Maus (weiblich, 6 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) wurden vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. Die MHz wurde aus den Mäusen die unterschiedliche Haplotypen aufwiesen (BALG/c: H-2d, C57BL/6: H-2b) jeweils enukleiert (ausgeschält) und die Lymphocyten der Milz wurden durch das vorstehend beschriebene Verfahren gewonnen. Die Zellkonzentration jeder Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und mit einem Volumen von jeweils 100 μl auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Jedes der Fucoidane, Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F, die in den Referenzbeispielen beschrieben werden, welche eine entsprechende Konzentration von 10 bis 500 μg/ml aufwiesen, und 10 μg/ml Con A wurden in gleicher Weise wie unter Punkt (1) des Beispiels 2 zu jeder Vertiefung außer zu der Kontrollgruppe zugegeben. Als Kontrolle. wurde das Kulturmedium mit gleichen Volumen wie dem der Probe zugegeben. Die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5% CO₂-Gas bei 37°C über 4 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand geerntet, und die Menge an IFN-γ wurde unter Verwendung eines ELISA-Kit (Genzyme) bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde keine Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion bei den Lymphozyten im Status der Alloantigen-Stimulierung für das jeweilige Fucoidan, Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F, die in den Referenzbeispielen beschrieben werden, bei einer Dosis von 500 μg/ml oder weniger festgestellt. Andererseits wurde eine starke Induktion für IFN-γ bei den Zellen festgestellt, denen Con A zugegeben worden war.
(3) Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion von sensibilisierten Lymphozyten unter Antigen-Stimulierung
Eine C57BL/6-Maus (weiblich, 6 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) wurde vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. Die Maus wurde intraperitoneal immunisiert, indem 1 × 10⁶ Zellen von mausstämmigen Meth-A-Sarkomzellen inokuliert wurden. 14 Tage nach der Inokulation des Tumors wurde die Milz aus der Maus enukleiert, und Lymphozyten der Milz wurden durch das vorstehend beschriebene Verfahren gewonnen. Die Zellkonzentration der Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, und mit einem Volumen von jeweils 100 μl auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Zur Herstellung von stimulierten Zellen wurde Mitomycin C (hergestellt von KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.) in einer Konzentration von 50 μg/ml zu den mausstämmigen Meth-A-Sarkomzellen zugegeben, welche in RPMI-1640-Kulturmedium suspendiert waren, deren Konzentration auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt war. Das Gemisch wurde bei 37°C über 30 Minuten behandelt und zweimal gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in RPMI-1640-Kulturmedium suspendiert, welches 10% fötales Rinderserum enthielt, deren Konzentration auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt war. Die hergestellten stimulierten Zellen wurden in einer Menge von 100 μl/Vertiefung über jede Vertiefung der Platte, die Lymphozyten der Milz enthielt, geschichtet und in einem Inkubator mit 5% CO₂-Gas bei 37°C über 4 Tage kultiviert. Diejenigen, die als Proben verwendet wurden, wurden präpariert und in gleicher Weise wie jene von Punkt (1) des Beispiels 2 zugegeben, so dass das von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan eine Konzentration von 1 bis 100 μl/ml aufwies; Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan und 7-12SFd-F jeweils eine Konzentration von 10 bis 500 μg/ml hatten; und dass die positive Kontrolle eine Konzentration von 10 μg/ml Con A aufwies. Die Zellen wurden ebenfalls in gleicher Weise wie der unter Punkt (1) des Beispiels 2 kultiviert. Als Kontrolle wurde das Kulturmedium mit gleichem Volumen wie das der Probe zugegeben. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand geerntet, und die Menge an IFN-γ wurde unter Verwendung eines ELISA-Kit bestimmt. Die Menge an IL-12 wurde im selben Kulturüberstand unter Verwendung eines ELISA-Kit (ENDOGEN) bestimmt.
Die Ergebnisse werden in den 7 und 8 dargestellt. Im Einzelnen ist 7 ein Diagramm, das die Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion durch das Fucoidan und das Abbauprodukt hiervon darstellt. In der Abbildung zeigt die Ordinate die Menge der IFN-γ-Produktion (pg/ml), und die Abszisse stellt jede Probe und die zugegebene Menge (μg/ml) dar.
Auch 8 ist ein Diagramm, das die Induktionswirkung für die IL-12-Produktion durch das Fucoidan und das Abbauprodukt hiervon darstellt. In der Abbildung zeigt die Ordinate die Menge der IL-12-Produktion (pg/ml), und die Abszisse stellt jede Probe und die zugegebene Menge (μg/ml) dar.
Wie in den 7 und 8 dargestellt, werden verstärkende Wirkung für die IFN-γ-Produktion und die IL-12-Produktion bei sensibilisierten Lymphozyten unter Antigen-Stimulierung in einer von der Dosis abhängigen Weise bei einer Dosis von 1 bis 100 μg/ml für das Fucoidan, das von Kjellmaniella crassifolia stammt, und bei einer Dosis von 10 bis 500 μg/ml für Fraktion I, Fraktion II, Fraktion III und 7-12SFd-F gezeigt. Zusätzlich zeigen andere Fucoidane und Abbauprodukte hiervon, die in den jeweiligen Referenzbeispielen beschrieben werden, ebenfalls ähnliche Wirkung.
Beispiel 3
Eine C57BL/6-Maus (weiblich, 7 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) wurde vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. Die Milz wurde aus der Maus enukleiert, fein zerrieben und in RPMI-1640-Kulturmedium (Bio Whittaker) suspendiert, das 10% fötales Rinderserum (Hiclone) enthielt, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben. Die Lymphozyten der Milz wurden in RPMI-1640-Kulturmedium suspendiert, das 10% fötales Rinderserum enthielt, dessen Konzentration auf 3 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt wurde, und in einem Volumen von 10 ml in einen T25-Kolben (Iwaki) gegeben. Zwei identische Kolben wurden vorgelegt: Ein Kolben, der mit dem Kulturmedium allein befüllt wurde, und der andere Kolben wurde mit dem von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan befüllt, so dass sich eine Konzentration von 10 μg/ml ergab. Die Zellen wurden bei 37°C in Anwesenheit von 5% CO₂ kultiviert.
10 Tage nach Beginn der Kultivierung wurden die Zellen geerntet, mit RPMI-1640 Kulturmedium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, in der Weise verdünnt, dass eine gegebene Konzentration erhalten wurde, und in jede der 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit abgerundetem Boden in einem Volumen von jeweils 100 μl gegeben.
Als die zytotoxische Aktivität der Zellen wurde die Menge an γ-Strahlung, die im Kulturüberstand freigesetzt wurde, bestimmt, indem mit ⁵¹Cr markierte EL4-Thymom-Zellen (hierin nachstehend als EL4-Zellen bezeichnet) als Zielzellen verwendet wurden. Konkret wurden 1850 kBq des Chrom-51-Radionuklides (New England Nuclear) EL4-Zellen zugegeben, und die Zellen wurden bei 37°C über 1 Stunde kultiviert und dreimal mit RPM1-1640-Kulturmedium durch einen Zentrifugationsschritt gewaschen. Die Zellen wurden in RPM1-1640-Kulturmedium suspendiert, das 10% fötales Rinderserum enthielt und dessen Konzentration auf 1 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt war. Die Suspension wurde in jede der 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit abgerundetem Boden in einem Volumen von jeweils 100 μl gegeben, und die Zellen wurden bei 37°C in Anwesenheit von 5% CO₂ über 5 Stunden kultiviert. 100 Mikroliter des Überstandes wurden aufgenommen, und anschließend wurde die Menge an γ-Strahlung, die im Überstand freigesetzt wurde, mit einem Gammastrahlen-Szintillationszähler bestimmt. Die zytotoxische Aktivität wurde wie folgt bestimmt:
Der Gesamtwert an Radioaktivität ist hier die Menge an γ-Strahlung in dem Fall, in dem 100 μl 0,1% Triton-X anstatt der kultivierten Milzzellen verwendet werden. Ebenso ist der Kontrollwert diejenige Menge an γ-Strahlung in dem Fall, in dem 100 μl des Kulturmediums anstatt der kultivierten Milzzellen verwendet werden, und der experimentelle Wert ist diejenige Menge an γ-Strahlung in dem Fall, in dem die kultivierten kultivierten Milzzellen verwendet werden.
Die Ergebnisse werden in 9 dargestellt. Konkret ist 9 ein Diagramm, das die zytotoxische immunpotenzierende Wirkung von mausstämmigen Lymphozyten der Milz durch das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan darstellt. Die Ordinate zeigt die zytotoxische Aktivität (%), und die Abszisse stellt das Verhältnis der Effektor-Zellen der Kontrolle und der Effektor-Zellen (E), die durch Kultivierung der Zellen unter Zugabe des von Kjellmaniella crassifolia stammenden, in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Fucoidan, erhalten werden, so dass sich eine Konzentration von 10 μg/ml ergibt, zu den Zielzellen (T) (E/T-Verhältnis). Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert für 5 Mäuse für jede Gruppe und der Standardfehler.
Wie in 9 dargestellt, zeigten die kultivierten mausstämmigen Milzzellen (Effektor-Zellen) eine zytotoxische Aktivität gegenüber EL4-Zellen (Ziel-Zellen) (Kontrolle). In den Zellen die unter Zugabe des Fucoidan kultiviert wurden, so dass sich eine Konzentration von 10 μg/ml ergab, war die zytotoxische Aktivität gegenüber EL4-Zellen potenziert. Die Gruppe, der Fucoidan zugegeben worden war, zeigte trotz eines niedrigeren Verhältnisses von Effektorzellen zu Zielzellen höhere zytotoxische Aktivität, so dass zytotoxische Immunität durch das Fucoidan potenziert worden ist.
Zusätzlich zeigten jedes der anderen Fucoidane und Abbauprodukte hiervon, Fraktion I, Fraktion II, Fraktion III und 7-12SFd-F, die in den Referenzbeispielen beschrieben wurden, ebenfalls ähnliche Aktivität.
Beispiel 4
Induktionswirkung für IFN-γ-Produktion von nicht stimulierten Lymphozyten
Eine C57BL/6-Maus (weiblich, 6 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) wurde vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. G-Fucoidan, das unter Punkt (2) des Referenzbeispiels 3 hergestellt worden war, wurde zugegeben, so dass sich in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Konzentration von 10 bis 500 μg/ml ergab, zu der Lymphozyten der Milz, die durch das vorstehend genannte Verfahren hergestellt worden waren, zugegeben wurden. Die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5% CO₂-Gas bei 37°C über 4 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand geerntet, und die Menge an IFN-γ wurde unter Verwendung eines ELISA-Kit bestimmt.
Als ein Ergebnis wurde bei der untersuchten Dosierung keine Induktionswirkung für IFN-γ-Produktiofl durch G-Fucoidan gefunden.
(1) Induktionswirkung für IFN-γ-Produktion bei sensibilisierten Lymphozyten unter Antigen-Stimulierung
Eine C57BL/6-Maus (weiblich, 6 Wochen alt, Körpergewicht etwa 20 g) wurde vom Japan SLC bezogen und für das Experiment verwendet, nachdem die Maus zuvor über eine Woche gehalten worden war. Für die Probe wurde G-Fucoidan, das unter Punkt (2) des Referenzbeispiels 3 hergestellt worden war, in destilliertem Wasser gelöst, und dessen Konzentration wurde auf 100 mg/ml eingestellt und auf eine Konzentration von zehnmal der angegebenen Konzentration mit dem Kulturmedium verdünnt. Das hergestellte G-Fucoidan wurde in der Weise zugegeben, dass eine Endkonzentration von 10 bis 500 μg/ml für jede Vertiefung der Mikrotiterplatte erhalten wurde, zu denen die Lymphozyten der Milz, die durch das vorstehend genannte Verfahren hergestellt worden waren, und mausstämmige Meth-A-Sarkom-Zellen zugegeben wurden. Die Zellen wurden bei 37°C in einem Inkubator mit 5 CO₂-Gas über 4 Tage kultiviert. Als die Kontrolle wurde das Kulturmedium im gleichen Volumen wie die Proben zugegeben, und die Zellen wurden kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand geerntet, und die Menge an IFN-γ und die Menge an IL-12 wurden unter Verwendung eines ELISA-Kit bestimmt.
Die Ergebnisse werden in den 10 und 11 dargestellt. Konkret ist 10 ein Diagramm, das die Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion durch G-Fucoidan darstellt, wobei die Ordinate die Menge an IFN-γ-Produktion (pg/ml) angibt, und die Abszisse zeigt Probe und zugegebene Menge (μg/ml). 11 ist ebenfalls ein Diagramm, das die Induktionswirkung für die IL-12-Produktion durch G-Fucoidan darstellt, worin die Ordinate die Menge der IL-12-Produktion (pg/ml) angibt, und die Abszisse gibt Probe und zugegebene Menge (μg/ml) an. Wie in den 10 und 11 dargestellt, wurde herausgefunden, dass G-Fucoidan eine potenzierende Wirkung auf die IFN-γ-Produktion von sensibilisierten Lymphozyten unter Antigen-Stimulierung in einer von der Dosis abhängigen Weise bei einer Dosis von 10 bis 500 μg/ml aufweist. Für IL-12 wurde eine deutliche potenzierende Wirkung auf die Produktion bei einer Dosis von 500 μg/ml festgestellt.
Beispiel 5
Wirkung von anti-IL-12-Antikörper und anti-Kostimulierungsrezeptor (CD 28 und CD 40) –Antikörper auf die Induktionswirkung für IFN-γ-Produktion durch Fucoidan, das von Kjellmaniella crassifolia stammt
Milzlymphozyten von C57BL/6-Mäusen, präpariert durch das vorstehend genannte Verfahren, und mausstämmige Meth-A-Sarkomzellen wurden vermischt und in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan, hergestellt wie unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 1, wurde in alle Vertiefungen zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 100 μg/ml bestand. Darüber hinaus wurde den Vertiefungen, mit Ausnahme der Kontrolle, anti-IL-12-Antikörper (R & D) zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 1 μg/ml bestand, oder anti-CD 28-Antikörper oder anti-CD 40-Antikörper wurden zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 10 μg/ml bestand. Die Zellen wurden bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂-Gas über 4 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand gewonnen, und die Menge an IFN-γ und die Menge an IL-12 wurden durch einen ELISA-Test bestimmt. Die Ergebnisse werden in 12 dargestellt. Konkret ist 12 ein Diagramm, das eine Wirkung von verschiedenen Antikörpern auf die Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion oder IL-12-Produktion durch das Fucoidan darstellt. In der Abbildung stellt die linke Ordinate die Menge an IFN-γ-Produktion (pg/ml) dar, die rechte Ordinate zeigt die Menge an IL-12-Produktion (pg/ml), und die Abszisse zeigt den jeweilig verwendeten Antikörper.
Wie in 12 dargestellt, wurde die Induktion der IL-12-Produktion durch das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan während der Reaktion der Antigen-Präsentation vollständig durch anti-IL-12-Antikörper, anti-CD 28-Antikörper oder anti-CD 40-Antikörper unterdrückt. Andererseits wurde die Induktion für die IFN-γ-Produktion der sensibilisierten Lymphozyten zu etwa 50% durch anti-IL-12-Antikörper unterdrückt und durch anti-CD 28-Antikörper oder anti-CD 40-Antikörper vollständig unterdrückt.
Beispiel 6
Vergleich der Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion von verschiedenen Fucoidanen
Eine C57BL/6-Maus wurde durch Induktion mit mausstämmigen Meth-A-Sarkomzellen immunisiert, und die Milz wurde aus 24 Tage nach der Induktion aus der Maus enukleiert. Mausstämmige C57BL/6-Lymphozyten der Milz, hergestellt durch das vorstehend genannte Verfahren, und mausstämmige Meth-A-Sarkomzellen wurden vermischt und in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Als Proben wurden das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan, hergestellt wie in Referenzbeispiel 1, das von Cladosiphon okamuranus stammende Fucoidan, hergestellt wie in Referenzbeispiel 8, das von Fucus vesiculosus stammende Fucoidan, hergestellt wie in Referenzbeispiel 5, und das vom Sporophyll von Undaria pinnatifida stammende Fucoidan, hergestellt wie in Referenzbeispiel 4, verwendet. Jede Fucoidan-Lösung wurde in der Weise hergestellt, dass eine Endkonzentration von 10 bis 500 μg/ml erhalten wurde, und sie wurde in gleicher Weise wie unter Punkt (1) des Beispiels 2 zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C in einem -Inkubator mit 5% CO₂-Gas über 4 Tage kultiviert. Als die Kontrolle wurde das Kulturmedium mit gleichem Volumen wie das der Probe zugegeben und kultiviert. Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand gewonnen, und die Menge an IFN-γ wurde unter Verwendung des ELISA Kit bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 13 dargestellt. Im Einzelnen ist 13 ein Diagramm, das die Induktionswirkung für die IFN-γ-Produktion von jedem Fucoidan darstellt. In der Abbildung stellt die Ordinate die Menge an IFN-γ-Produktion (pg/ml) dar, und die Abszisse zeigt die jeweilige Probe und die zugegebene Menge (μg/ml).
Wie in 13 dargestellt, stellte sich unter Berücksichtigung der Induktionsfähigkeit für die IFN-γ-Produktion von sensibilisierten Lymphozyten unter Antigen-Stimulierung heraus, dass das von Fucus vesiculosus stammende Fucoidan im Vergleich zu dem von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan gleichwertig war, und die von Cladosiphon okamuranus und dem Sporophyll von Undaria pinnatifida stammenden Fucoidane schwächer waren.
Beispiel 7
Vier oder fünf 5 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (Japan SLC) pro Gruppe wurden sensibilisiert, indem 100 μl 0,01% Ovalbumin (Sigma) in wässriger physiologischer Kochsalzlösung und 100 μl Alum (Handelsname: Imject Alum; hergestellt von Pierce) intraperitoneal verabreicht wurden. 14 Tage später wurde aus dem Abdominalgefäß Blut entnommen.
Nach der Zentrifugation (2000 rpm, 5 Minuten) des gewonnenen Blutes wurde das Plasma abgetrennt, und die Menge an Antigen-spezifischem IgE wurde durch eine passive Kutane-Anaphylaxie (PCA) unter Verwendung einer Ratte bestimmt. Im Einzelnen wurden unter Verwendung von physiologischer Kochsalzlösung 2-fache bis 64-fache serielle Verdünnungen des Plasmas hergestellt, und jede Verdünnung wurde in einer Menge von jeweils 0,1 ml intradermal in den rasierten Rücken einer 7 Wochen alten männlichen Wistar-Ratte injiziert. 48 Stunden nach der intradermalen Injektion wurde 1 ml einer vermischten Lösung aus 0,05% Ovalbumin und 0,5% Evans blue (Hergestellt von Nakalaitesque) in die Schwanzvene injiziert. 30 Minuten nach der Injektion in die Schwanzvene wurde die Ratte enthauptet, und man ließ sie ausbluten. Blaue Flecken, die auf dem Rücken erschienen, wurden beobachtet, und die maximalen Verdünnungsfaktoren wurden als IgE-Titer ausgedrückt, wobei ein Fleck mit einem Durchmesser von 5 mm oder mehr als positiv definiert wurde.

In der Gruppe, in der das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan, das wie unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 1 hergestellt worden war, verabreicht wurde, wurde das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan einer Wasserflasche in einer Konzentration von 0,1% oder 1% über einen Zeitraum von 7 Tagen vor dem Tag der Sensibilisierung mit Antigen bis zu dem Tag der Blutabnahme zugegeben, und der Ratte war gestattet, Wasser ad libitum aufzunehemen. Auch in der Kontrollgruppe wurde Leitungswasser in gleicher Weise gegeben. Als ein Ergebnis wurde eine Erhöhung der Menge des Antigen-spezifischen IgE durch Ovalbumin-Sensibilisierung deutlich unterdrückt, indem Trinkwasser aufgenommen wurde, das 1-% des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan enthielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

	Tier Nr.	IgE-Antikörper-Titer
Kontrolle	1	8
	2	64
	3	16
	4	16
	5	32
0,1% Fucoidan,	1	8
von	2	32
Kjellmaniella Crassifolia	3	32
stammend	4	32
1% Fucoidan	1	< 2
von	2	< 2
Kjellmaniella Crassifolia	3	< 2
stammend	4	4
	5	8

Beispiel 8
Den Ratten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 7 sensibilisiert worden waren, wurden unter den gleichen Bedingungen 19 Tage nach Beginn der Sensibilisierung eine Auffrischung gegeben. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurde Blut aus dem Abdominalgefäß abgenomen. Die Menge an Antigen-spezifischem IgE wurde für das abgenommene Blut durch eine PCA-Antwort in gleicher Weise wie vorstehend bestimmt.

In der Gruppe, in der das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan, das wie unter Punkt (1) des Referenzbeispiels 1 hergestellt worden war, verabreicht wurde, wurde das von Kjellmaniella crassifolia stammende Fucoidan einer Wasserflasche in einer Konzentration von 0,1% oder 1% über einen Zeitraum von dem Tag der Auffrischung bis zu dem Tag der Blutabnahme zugegeben, und der Ratte war gestattet, Wasser ad libitum aufzunehmen. Auch in der Kontrollgruppe wurde Leitungswasser in gleicher Weise gegeben. Als ein Ergebnis wurde eine Erhöhung der Menge des Antigen-spezifischen IgE durch Ovalbumin-Sensibilisierung bemerkenswert unterdrückt, indem Trinkwasser aufgenommen wurde, das 1% des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan enthielt. Aus dem Vorstehenden zeigt sich, dass Fucoidan bei therapeutischer Verabreichung vom Zeitpunkt der Sensibilisierung mit einem Antigen an auch in der prophylaktischen Verabreichung wirksam ist. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

	Tier Nr.	IgE-Antikörper-Titer
Kontrolle	1	8
	2	32
	3	32
	4	32
	5	32
0,1% Fucoidan	1	16
von	2	16
Kjellmaniella Crassifolia	3	32
stammend	4	32
1% Fucoidan	1	2
von	2	2
Kjellmaniella Crassifolia	3	2
stammend	4	4
	5	2

Beispiel 9

(1) Die Rohmaterialien wurden in der Weise formuliert, dass 1,5 g einer Zusammensetzung aus 20 mg des von Kjellmaniella crassifolia stammenden Fucoidan als Fucoidan, einem Gesamtanteil von 82 mg Polyphenolen eines käuflich zu erwerbenden Apfelextraktes (Handelsname: Applephenon, hergestellt von: The Nikka Whisky Distilling Co. Ltd.), einem käuflich zu erwerbenden Traubenkernextraktes (Handelsname: Gravinol, hergestellt von KIKKOMAN CORPORATION), einem käuflich zu erwerbenden "ten-cha"-Extrakt (Handelsname: Sunten-cha S, hergestellt von SUNTORY LIMITED) besteht, aufgefüllt mit Fleischextrakt (hergestellt von DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD.), Bierhefe (hergestellt von KIRIN BREWERY COMPANY, LIMITED), Laktose, Maisstärke (hergestellt von Kato Kagaku K.K.), reduzierte Maltose (hergestellt von Towa Chemical Industry Co., Ltd.). Die Zusammensetzung wurde in einem Extrusionsgranulationsapparat hergestellt, um die vorliegende Erfindung als Futtermittelzusatz (1 mm im Durchmesser) zu verwenden, und jeweils 1,5 g des Futtermittelzusatzes wurden einer Hülle zugegeben.
(2) Der vorstehend genannte Futtermittelzusatz wurde als Nahrungsergänzung jedem der Futtermittel in einer Menge von 3 Hüllen pro Tag für einen großen Hund (Körpergewicht: etwa 30 kg), 2 Hüllen pro Tag für einen mittelgroßen Hund (Körpergewicht: etwa 10 kg) oder 1 Hülle pro Tag für einen kleinen Hund (Körpergewicht: 5 kg) zugegeben.

Durch die Aufnahme des Futtermittelzsatzes der vorliegenden Erfindung wurden alle großen Hunde, mittelgroßen Hunde und kleinen Hunde aktiver, und ihr Appetit war gesteigert. Zusätzlich verbesserte sich das Fellkleid, und Körpergeruch und Geruch der Exkremente wurde auf Grund der Wirkung auf eine Verbesserung des körperlichen Zustandes vermindert. Diese Auswirkungen zeigten sich in deutlicher Weise besonders bei alten Hunden, und das Futtermittel der vorliegenden Erfindung war sehr nützlich für die Verbesserung der körperlichen Bedingungen, Wiederherstellung der Gesundheit und Verjüngung bei alten Hunden.
Hinterlegte Biologische Materialien
(1) Name der Hinterlegungsbehörde

Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Nationales Institut für Biowissenschaften und Humantechnologie, Agentur für industrielle Wissenschaft und Technologie 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (Postleitzahl 305-8566)

(2) Hinterlegte Mikroorganismen

(i) Alteromonas sp. SN-1009 Erstes Datum der Hinterlegung: 13. Februar 1996 Datum der Anfrage auf Internationale Hinterlegung: 15. November 1996 Zugangsnummer: FERM BP-5747
(ii) Flavobacterium sp. SA-0082 Erstes Datum der Hinterlegung: 29. März 1995 Datum der Anfrage auf Internationale Hinterlegung: 15. Februar 1996 Zugangsnummer: FERM BP-5402

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Arzneimittel bereitgestellt, welches bei einer Erkrankung, die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, bei einer Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht und bei einer allergischen Erkrankung wirkt, wobei das Arzneimittel als einen wirksamen Inhaltstoff ein Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst, welches eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, eine Wirkung auf die Induktion der Stickstoffmonoxid-Produktion und eine antiallergische Wirkung aufweist. Das Arzneimittel hat eine regulierende Aktivität zur Produktion eines Interleukins, Interferons oder dergleichen in einem lebenden Körper, so dass das Arzneimittel als ein therapeutisches Agens oder ein prophylaktisches Agent bei einer Erkrankung nützlich ist, die die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, wie etwa Krebserkrankungen und immunologische Erkrankungen.
Zusätzlich ist das Arzneimittel als ein Agens zur Regulierung der IFN-γ-Produktion, ein Agens zur Regulierung der IL-2-Produktion und als ein Agens zur Induktion der NO-Produktion besonders nützlich bei Erkrankungen, die Anwendungen dieser Agenzien erforderlich machen.
Die Aktivierung und Verstärkung des Immunsystems unter unnötigen Zuständen kann in einigen Fällen Erkrankungen wie Allergien und Autoimmunerkrankungen verursachen. Jedoch sind die Zytokin-Verstärkung und Immunpotenzierung durch das Präparat der vorliegenden Erfindung selektiv. Daher ist das Präparat der vorliegenden Erfindung sehr nützlich für den Schutz eines lebenden Körpers, denn die Zytokin-Verstärkung und Immunpotenzierung werden nur in dem Fall induziert, in dem es notwendig ist, die zelluläre Immunität auf Grund der Existenz von Antigenen, die aus dem lebenden Körper entfernt werden müssen, zu verstärken, wie etwa in einem Fall einer viralen Infektion oder einer Krebserkrankung.
Zusätzlich wird die Aktivierung von zu starker humoraler Immunisierung durch das Präparat der vorliegenden Erfindung unterdrückt, so dass das Präparat der vorliegenden Erfindung sehr nützlich für die Unterdrückung von Allergien ist.
Darüber hinaus kann ein Nahrungsmittel oder ein Futtermittel hergestellt werden, in dem das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon, das eine Wirkung auf die Regulierung der Zytokin-Produktion, eine Wirkung auf die Induktion der Stickstoffoxid-Produktion und eine antiallergische Wirkung aufweist, verwendet wird. Durch eine Aufnahme des Fucoidan und/oder eines Abbauproduktes hiervon auf einer täglichen Basis als Nahrungsmittel kann Milderung der Symptome einer Erkrankung, die Regulierung der Zytokin-Produktion erforderlich macht, einer Erkrankung, die Stickstoffmonoxid-Produktion erforderlich macht, wie etwa Arteriosklerose, einer allergischen Erkrankung oder dergleichen erreicht werden.
Auf diese Weise ist das funktionale Nahrungsmittel oder Futtermittel, das als einen wirksamen Inhaltstoff das Fucoidan und/oder ein Abbauprodukt hiervon umfasst, ein funktionales Nahrungsmittel oder Futtermittel, das auf Grund der physiologischen Wirkung seines wirksamen Inhaltstoffes nützlich für das Aufrechterhalten der Homöostase eines lebenden Körpers ist.
Zusätzlich wird ein Agens zur Regulierung der Zytokin-Produktion geliefert, und das Agens zur Regulierung ist nützlich für Funktionsstudien über Zytokin und Durchmusterung auf ein Arzneimittel gegen Erkrankungen, die mit Zytokinen verbunden sind.

Claims

Verwendung eines Fucoidans und/oder eines Abbauprodukts davon für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Vorbeugen einer allergenen Erkrankung.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Fucoidan von einer Alge oder Echinodermata stammt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Medikament für eine orale Verabreichung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament in Gestalt eines Nahrungsmittels, Getränks oder Futters vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament für äußerliche Anwendung ist.