CN114848528B - 一种重组人溶菌酶提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人溶菌酶提取物的制备方法、利用该制备方法得到的重组人溶菌酶提取物、以及该重组人溶菌酶提取物的用途。此外，本发明还提供了含有该重组人溶菌酶提取物的化妆品组合物以及化妆品。根据本发明制备方法得到的重组人溶菌酶提取物具有更强的抗菌抑菌、抗氧化、美白祛斑效果，且没有皮肤刺激性，适于作为化妆品的成分使用。

Description

一种重组人溶菌酶提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种溶菌酶提取物及其制备方法和用途。
背景技术
溶菌酶(lysozyme)，又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于自然界，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合体，使病毒失活。溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。其中根据其来源的不同，可以将其分为四类，分别是植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。据研究，溶菌酶具有抗细菌、抗真菌、抗病毒作用，目前已应用于药学领域，在人体内非特异性免疫中发挥着重要作用，具有杀菌抗炎、促进组织修复以及增强免疫力等多种生物活性作用，以及作为一种安全、广谱的杀菌防腐剂应用于食品工程领域。
近年来，溶菌酶也逐渐应用于化妆品领域。例如中国专利申请CN202110173038.9提供了一种清爽型长效保湿美白化妆品，在该化妆品的制备方法中使用了相转变溶菌酶溶液，作为制备该化妆品过程中使用的改性材料，但是在最终的化妆品中并不含有直接含有溶菌酶。中国专利申请CN201810909401.7提供了一种用于化妆品的溶菌酶组合抑菌剂，由特定质量百分比的溶菌酶、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸、以及戊二醇/己二醇酸组成。《中国已使用化妆品原料名称目录(2021版)》中也已经收录溶菌酶(No.05560)，表示其作为化妆品原料已得到认可。
人溶菌酶是一种低分子量的、能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。作为机体免疫防御机制的组成部分之一，溶菌酶能溶解细菌细胞壁而起到杀菌作用。在人体内，溶菌酶存在于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞内；也存在于黏膜分泌液中，成为体表防御因素之一。溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性。作为化妆品成分，使用人溶菌酶相对于其他类型的溶菌酶具有更加安全的特性。
在转基因水稻胚乳中表达重组人溶菌酶具有无病原菌污染、生产成本低、不受原料限制的特点，可为人类提供安全、廉价和充足的人溶菌酶，用于人类多种疾病的治疗。同时本转基因的终产品需经纯化后的蛋白质，不进入食物链，因而不会对人体产生毒性。现有技术中已有报导利用水稻生产人溶菌酶的技术，例如一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶。
发明内容
从作为化妆品原料的角度来说，需要一种刺激性小、抗菌作用更强且具有有益化妆品性质(例如可美白祛斑性质)的重组人溶菌酶产品及其制备方法。针对这一需求，发明人经过深入研究，在现有技术的基础上不断改进，提供了本发明的技术方案。
本发明提供了一种重组人溶菌酶提取物的制备方法，包括以下步骤或由以下步骤组成：
(1)获取表达重组人溶菌酶的农作物种子；
(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7-8的0.03-0.08mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3-5小时后过滤，留取滤液备用；
(3)将步骤(2)所得的滤液在零下30℃至零下20℃的温度条件下进行冻融循环3-6次，每次间隔20分钟；
(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为400-1000W，时间为10-30分钟；
(5)对经过步骤(4)处理的滤液在0-10℃下高速离心，离心速度为8000-120000转/分，离心时间为20-30分钟，取上清液；
(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.0-7.2，搅拌20分钟后放置5-8小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，3000-5000转/分钟离心，留取上清液；
(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置12-24小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在0-5℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
(9)配置溶菌酶精制液：按照5-10g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照70-90g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
进一步地，本发明提供了一种重组人溶菌酶提取物的制备方法，由以下步骤组成：
(1)获取表达重组人溶菌酶的农作物种子；
(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7.5的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置4小时后过滤，留取滤液备用；
(3)将步骤(2)所得的滤液在零下25℃的温度条件下进行冻融循环4次，每次间隔20分钟；
(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为700W，时间为20分钟；
(5)对经过步骤(4)处理的滤液在5℃下高速离心，离心速度为10000转/分，离心时间为25分钟，取上清液；
(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.1，搅拌20分钟后放置6小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，4000转/分钟离心，留取上清液；
(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置20小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在3℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
(9)配置溶菌酶精制液：按照7g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照80g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
进一步地，本发明中所用的表达重组人溶菌酶提取物的农作物种子为水稻种子。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种重组人溶菌酶提取物，其通过本发明所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法制备。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种化妆品组合物，其包含根据本发明所述的重组人溶菌酶提取物，或者包含通过本发明所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法制备得到的重组人溶菌酶提取物。
本发明还提供了一种包含上述化妆品组合物的化妆品，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
本发明还提供了上述重组人溶菌酶提取物用于制备化妆品的用途，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
相对于现有技术而言，本发明的重组人溶菌酶提取物及包含该提取物具有更强的抗菌抑菌、抗氧化、美白祛斑效果，且源于植物成分，没有皮肤刺激性，安全性良好，适于作为化妆品的成分使用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明所用的表达人溶菌酶的转基因水稻可以为根据现有技术获得的任意种类或任何手段获得的表达人溶菌酶的转基因水稻，例如美国专利申请10/584,225中公开的转基因水稻，本发明的制备例1-3中所用的转基因水稻为根据美国专利申请10/584,225说明书实施例1(质粒的构建)和实施例2(转基因水稻植株的产生)记载的方法获得。
制备例1重组人溶菌酶提取物的制备
按照如下方法制备重组人溶菌酶提取物：
(1)获取表达重组人溶菌酶的农作物种子，该农作物种子为转基因水稻；
(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7的0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3小时后过滤，留取滤液备用；
(3)将步骤(2)所得的滤液在零下30℃的温度条件下进行冻融循环3次，每次间隔20分钟；
(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为400W，时间为10分钟；
(5)对经过步骤(4)处理的滤液在0℃下高速离心，离心速度为8000转/分，离心时间为20分钟，取上清液；
(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.0，搅拌20分钟后放置5小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，3000转/分钟离心，留取上清液；
(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置12小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在0℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
(9)配置溶菌酶精制液：按照5g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照70g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
制备例2重组人溶菌酶提取物的制备
按照如下方法制备重组人溶菌酶提取物：
(1)获取表达重组人溶菌酶的农作物种子，该农作物种子为转基因水稻；
(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 8的0.08mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置5小时后过滤，留取滤液备用；
(3)将步骤(2)所得的滤液在零下20℃的温度条件下进行冻融循环6次，每次间隔20分钟；
(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为1000W，时间为30分钟；
(5)对经过步骤(4)处理的滤液在10℃下高速离心，离心速度为12000转/分，离心时间为30分钟，取上清液；
(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.2，搅拌20分钟后放置8小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，5000转/分钟离心，留取上清液；
(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置24小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在5℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
(9)配置溶菌酶精制液：按照10g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照90g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
制备例3重组人溶菌酶提取物的制备
按照如下方法制备重组人溶菌酶提取物：
(1)获取表达重组人溶菌酶的农作物种子，该农作物种子为转基因水稻；
(2)将步骤(1)中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7.5的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置4小时后过滤，留取滤液备用；
(3)将步骤(2)所得的滤液在零下25℃的温度条件下进行冻融循环4次，每次间隔20分钟；
(4)对经过步骤(3)处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为700W，时间为20分钟；
(5)对经过步骤(4)处理的滤液在5℃下高速离心，离心速度为10000转/分，离心时间为25分钟，取上清液；
(6)在步骤(5)所得的上清液中加入氯化镁15mmol/L、EDTA 2mmol/L、AEBSF3.6mmol/L、APMSF 3mmol/L、PMSF 0.7mmol/L，调节pH至7.1，搅拌20分钟后放置6小时，然后再加入35％的饱和硫酸铵产生沉淀，4000转/分钟离心，留取上清液；
(7)在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置20小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
(8)用质量分数为15％的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在3℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
(9)配置溶菌酶精制液：按照7g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照80g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
(10)精制溶菌酶：在每升步骤(9)制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤(8)制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
实施例1制备含重组人溶菌酶提取物的乳液
按照下述方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，包括以下步骤：
(1)按照如下重量百分比备料：含重组人溶菌酶提取物(通过实施例1制备得到)3％，山梨醇3％、硬脂酸脂基团2％、乳化剂2％、棕榈酸乙基己酯10％、黄原胶3％、维生素E醋酸酯0.2％、肤感调节剂5％、尿囊素0.5％、乙二胺四乙酸二钠0.5％、苯氧乙醇0.6％、乙基己基甘油0.5％、香精0.08％、余量为去离子水。
(2)将黄原胶分散于甘油中，同时添加山梨醇、尿囊素、乙二胺四乙酸二钠，然后添加去离子水，搅拌混合均匀后加热温度至85℃，作为A相；
(3)将其余物质混合均匀后加热温度至60℃，作为B相；
(4)将B相加入A相，在60℃下均匀搅拌10分钟后开始降温，并持续不断搅拌直至将至室温，出料，灌装，得到乳液。
实施例2制备含重组人溶菌酶提取物的乳液
按照实施例1的方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，其中仅将重组人溶菌酶提取物更换为制备例2得到的人溶菌酶提取物，其余条件、组成、步骤保持不变。
实施例3制备含重组人溶菌酶提取物的乳液
按照实施例1的方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，其中仅将重组人溶菌酶提取物更换为制备例3得到的人溶菌酶提取物，其余条件、组成、步骤保持不变。
对比例1含鸡蛋清溶菌酶的乳液
按照实施例1的方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，其中仅将重组人溶菌酶提取物更换为从鸡蛋清中提取的溶菌酶提取物(该提取物通过CN105602918A实施例1的制备方法制得，原料选择鸡蛋清)，其余条件、组成、步骤保持不变。
对比例2含淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的乳液
按照实施例1的方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，其中仅将重组人溶菌酶提取物更换为淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白提取物(该提取物通过CN104894085A具体实施方式部分记载的制备方法制得)，其余条件、组成、步骤保持不变。
对比例3含咸鸭蛋清溶菌酶的乳液
按照实施例1的方法制备含重组人溶菌酶提取物的乳液，其中仅将重组人溶菌酶提取物更换为咸鸭蛋清溶菌酶提取物(该提取物通过CN1299869A实施例部分记载的制备方法制得)，其余条件、组成、步骤保持不变。
测试例1安全性测试
选取普通志愿者组成受试人群，分6组；每组志愿者人数为10人，其中女性5名，男性5名，年龄均在20-40岁之间，测试受试者试用实施例1-3以及对比例1-3化妆品是否出现不良反应。具体测试过程为在受试者左、右手臂内侧距离手掌基部6cm处，各确定4×4cm大小的面积作为实验部位。每组受试者分别涂抹按上述方法制备的乳液前，先将实验部位洗净，晾干后涂抹，涂抹于左臂内侧和右臂内侧。每天早晚各涂抹一次，连续测试1个月。另外，设置空白对照组，以生理盐水代替乳液进行测试。实验结果如表1所示。
表1实施例1-3和对比例1-3的乳液的安全性测试结果
乳液 水肿 红斑 剥脱 刺激强度
实施例1 0 0 0 无刺激性
实施例2 0 0 0 无刺激性
实施例3 0 0 0 无刺激性
对比例1 0 1 0 轻微刺激性
对比例2 2 0 0 轻微刺激性
对比例3 1 0 0 轻微刺激性
空白对照组 0 0 0 无刺激性
表1的结果表明，本发明实施例1-3的含本发明重组人溶菌酶提取物的乳液的安全性良好，相比于同类产品，消除了本发明产品的刺激性。
测试例2抗菌抑菌效果测试
取实施例1-3以及对比例1-3的乳液进行抗菌抑菌效果测试。具体方法如下：取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将菌株经MH琼脂平板过夜培养后，分别以接种环挑取单个大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落，于5mL MH肉汤接种，恒温培养箱培养48小时(35℃)。于两菌种各自的肉汤液体培养基(10mL)中分别加入1滴实施例1-3和对比例1-3的乳液，混均。另外，制备不添加任何乳液的空白对照组。各样品于37℃培养箱培养24小时后，计算各自抑菌率，抑菌率的计算方式可参考标准QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》。结果如表2所示。
表2实施例1-3和对比例1-3的乳液的抗菌抑菌效果测试
乳液 大肠杆菌抑菌率(％) 金黄色葡萄球菌(％)
实施例1 95.1 93.1
实施例2 89.2 89.5
实施例3 97.3 95.2
对比例1 72.8 81.8
对比例2 72.2 70.8
对比例3 2.1 1.1
空白对照组 0.3 0.7
从表2可以看出，本发明的重组人溶菌酶提取物相较于同类产品具有强效的抗菌抑菌效果。
测试例3抗氧化效果测试
取实施例1-3以及对比例1-3的乳液进行抗氧化效果测试。
采用总抗氧化能力试剂盒(ABTS法)(碧云天生物技术有限公司)测定总抗氧化能力。按照试剂盒说明，首先配置ABTS+·储备液配制：配制2.45mmol/L过硫酸钾溶液，用过硫酸钾溶液溶解ABTS粉末，配成7mmol/L的ABTS+·储备液，避光、于4℃冰箱中保存备用。然后配置ABTS+·测定液：将ABTS+·储备液以10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释至吸光度(A0)为0.70±0.02(734nm)。将实施例1-3以及对比例1-3的乳液分别稀释500倍后得到待测样品，并将生理盐水按照同样方式稀释后作为空白对照，然后向样品检测孔中加入10μL待测样品，轻轻混匀，室温孵育6分钟后，测定加待测样后的吸光度(A)。ABTS+·清除率(S)计算公式为：S＝(A0－A)/A0×100％。其中，ABTS+·清除率反映了加入成分对体系内ABTS+·自由基的清除比率，可以说明加入成分的总抗氧化能力。
经过测试后，实施例1-3以及对比例1-3各样品的结果如表3所示。
表3实施例1-3和对比例1-3的乳液的抗氧化效果测试
乳液 清除率(％)
实施例1 94.1
实施例2 90.3
实施例3 97.3
对比例1 62.3
对比例2 19.7
对比例3 66.8
空白对照组 2.7
从表3可以看出，本发明的重组人溶菌酶提取物相对于同类产品具有强效的抗氧化效果。
测试例4美白祛斑效果测试
取实施例1-3以及对比例1-3的乳液进行美白祛斑效果测试。具体方法为：各试验组均选取20名志愿者，年龄25-45岁，均存在皮肤暗沉、色斑现象。乳液使用方法：洁面后，取适量于掌心，搓热后按摩面部皮肤，每晚1次，连续试用16周，拍照存档。评价方法：对比第0天和第16周照片并询问志愿者的使用感，其中脸部皮肤变得白皙、有光泽、色斑明显减少的为强效；脸部皮肤暗沉得到改善、色斑减轻的为有效；脸部皮肤没有改善的为无效。将生理盐水替代乳液作为空白对照组。具体测试结果如下表4。
表4实施例1-3和对比例1-3的乳液的美白祛斑效果测试
Figure GDA0004271733700000111
Figure GDA0004271733700000121
从表4可以看出，本发明的重组人溶菌酶提取物相对于同类产品具有强效的美白祛斑效果。
显而易见的是，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种重组人溶菌酶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）获取表达重组人溶菌酶的农作物种子；
（2）将步骤（1）中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7-8的0.03-0.08 mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3-5小时后过滤，留取滤液备用；
（3）将步骤（2）所得的滤液在零下30℃至零下20℃的温度条件下进行冻融循环3-6次，每次间隔20分钟；
（4）对经过步骤（3）处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为400-1000W，时间为10-30分钟；
（5）对经过步骤（4）处理的滤液在0-10℃下高速离心，离心速度为8000-120000 转/分，离心时间为20-30分钟，取上清液；
（6）在步骤（5）所得的上清液中加入氯化镁15 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、AEBSF 3.6mmol/L、APMSF 3 mmol/L、PMSF 0.7 mmol/L，调节pH至7.0-7.2，搅拌20分钟后放置5-8小时，然后再加入35%的饱和硫酸铵产生沉淀，3000-5000转/分钟离心，留取上清液；
（7）在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置12-24小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
（8）用质量分数为15%的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在0-5℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
（9）配置溶菌酶精制液：按照5-10g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照70-90g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
（10）精制溶菌酶：在每升步骤（9）制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤（8）制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶；
其中，步骤（1）中所述的农作物种子为水稻种子。
2.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶提取物的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
（1）获取表达重组人溶菌酶的农作物种子；
（2）将步骤（1）中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7.5的0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置4小时后过滤，留取滤液备用；
（3）将步骤（2）所得的滤液在零下25℃的温度条件下进行冻融循环4次，每次间隔20分钟；
（4）对经过步骤（3）处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为700W，时间为20分钟；
（5）对经过步骤（4）处理的滤液在5℃下高速离心，离心速度为10000 转/分，离心时间为25分钟，取上清液；
（6）在步骤（5）所得的上清液中加入氯化镁15 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、AEBSF 3.6mmol/L、APMSF 3 mmol/L、PMSF 0.7 mmol/L，调节pH至7.1，搅拌20分钟后放置6小时，然后再加入35%的饱和硫酸铵产生沉淀，4000转/分钟离心，留取上清液；
（7）在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置20小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；
（8）用质量分数为15%的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在3℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；
（9）配置溶菌酶精制液：按照7g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照80g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；
（10）精制溶菌酶：在每升步骤（9）制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤（8）制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶。
3.一种重组人溶菌酶提取物，其特征在于根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法制备。
4.一种化妆品组合物，其特征在于包含根据权利要求3所述的重组人溶菌酶提取物。
5.一种化妆品，其特征在于包含根据权利要求4所述的化妆品组合物。
6.根据权利要求5所述的化妆品，其中所述化妆品为乳液。
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