DE3050077T1 - Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice - Google Patents

Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice

Info

Publication number
DE3050077T1
DE3050077T1 DE803050077T DE3050077T DE3050077T1 DE 3050077 T1 DE3050077 T1 DE 3050077T1 DE 803050077 T DE803050077 T DE 803050077T DE 3050077 T DE3050077 T DE 3050077T DE 3050077 T1 DE3050077 T1 DE 3050077T1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
fraction
burdock
solution
mutability
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE803050077T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3050077C2 (de
Inventor
K Morita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanebo Ltd
Original Assignee
Kanebo Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanebo Ltd filed Critical Kanebo Ltd
Publication of DE3050077T1 publication Critical patent/DE3050077T1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3050077C2 publication Critical patent/DE3050077C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

KRAUS & WEISERT 3Q50077
PATENTANWÄLTE ".
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON ΟΘ9/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd
TELEGRAMM KRAUSPATENT
PCT/JP/ 80/00289
P 30 50 077.7. 2977 AW/My
KANEBO LTD.
Tokyo, Japan
Beschreibung
Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines in Klettensaft enthaltenen, desmutagenen Faktors
Gebiet der Technik
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines in Klettensaft enthaltenen, desmutagenen Faktors.
Stand der Technik
Es ist seit einiger Zeit gut bekannt, daß praktisch alle Carcinogene Mutagenizität zeigen. Weiterhin ist die Möglichkeit, daß die Mutagene carcinogen sind, groß. Beispiele hierfür sind Substanzen, die in unserem täglichen Leben angetroffen werden, wie AF-2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)-acrylamid, Trp-P-1-(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4.3-b]indol)und Trp-P-2-(3-amino-1-methyl-SH-pyrido-[4.3-b]indol), wobei die beiden letzteren in den angekohlten oder verschmorten Teilen von beispielsweise gebratenem, geröstetem oder gekochten Fleisch und Fisch anzutreffen sind. Es wurde berichtet, daß diese Substanzen Mutagenizität aufweisen und Substanzen sind, die in Säugetieren eine Careinogenese induzieren.
Die Anmelderin hat kürzlich ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines in Kohlsaft vorhandenen, desmutagenen Faktors vorgeschlagen (vergl. JA-OS 122715/79). Dieses Verfahren umfaßt die Stufen:
(1) Zentrifugieren des Kohlsaftes, ;
(2) Ultrazentrifugieren der entstehenden überste-' henden Lösung,
(3) Behandlung der überstehenden Lösung mit einer Anionenaustausch-Cellulose,
(4) Aufbringen der durchgelaufenen Fraktion auf eine Kationenaustausch-Cellulose enthaltende Säule,
(5) Sammeln der aktiven Fraktion, die bei niedriger Salzkonzentration eluiert wird,und "
(6) Adsorbieren der Fraktion an einem Molekularsieb zur weiteren Reinigung der Fraktion.
Die schließlich erhaltene Fraktion zeigt charakteristische Absorptionsspektra bei 280 nm und 404 nm und ist ein Hämoprotein, das gegenüber Hitze stabil ist, das aber die Eigenschaft aufweist, daß es durch proteolytische Enzyme desaktiviert wird.
Von diesem desmutagenen Faktor, der durch Isolierung aus Kohlsaft erhalten wird, ist bekannt, daß er nicht nur die Mutabilität von Trp-P-1-(3-amlno-1,4-
dimethyl-5H-pyrido[4.3.-b]indol) und Trp-P-2-(3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4.3-b]indol) inhibiert, sondern ebenfalls die von N-Butyl-N^acetoxy-nitrosoamin, den Reaktionsprodukten der Sorbinsäure mit Nitriten, 2-Aminoanthracen, Äthidiumbromid wie auch verschiedene Mutagene, die eine Mutagenizität als Ergebnis des Metabolismus der Pyrolysate solcher Aminosäuren, wie Tryptophan, Ornithin usw., manifestieren.
Die letzte Fraktion, die aus Kohlsaft erhalten wird, besitzt jedoch den Nachteil, daß sie bei gleichzeitiger Anwesenheit eines proteolytisehen Enzyms desaktiviert wird. Weiterhin kann sie nicht nur die Mutabilität solcher Mutagene nicht inhibieren, die ohne Metabolisierung Mutagenizität ;"*.." manifestieren, wie die Oxidationsfarben (z.B. 4-Nitro-o- „.:"" phenylendiamin und 2-Nitro-p-phenylendiamin), sondern sie besitzt weiterhin die Wirkung, daß sie die Mutabilität :__._: wesentlich verstärkt (d.h. aktiviert). ---„ ;
Die Anmelderin hat in Agric. Biol.Chem. 42 (6), Seiten : : : 1236-1238, 1978, qualitativ berichtet, daß die überstehende Lösung, die man durch Zentrifugieren von Kohl, Broccoli, grünem Paprika, Auberginen, Äpfeln, Kletten, Schalotten, Ginger, Ananas und Pfefferminzblättern erhält, die Mutabilität von Pyrolysaten des Tryptophans inhibieren.
Obgleich alle diese Gemüse und Früchte, die Aktivität aufweisen, die Mutabilität, die solchen Pflanzen zuzuordnen ist, die Mutagenizität bei der Metabolisierung manifestieren, zu inhibieren, haben weitere Untersuchungen gezeigt, daß von diesen nur die aktive Fraktion, die aus der Klette erhalten wird und in gereinigtem Zustand vorliegt, eine überlegene Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität aufweist, die solchen Substanzen zuzuordnen ist, die die Mutagenizität manifestieren, ohne daß sie metabolisiert werden, wie den Oxidationsfarben. Es wurde jetzt gezeigt, daß die aus Kletten erhaltene Fraktion eine überraschend einzigartige Aktivität aufweist.
Bei den Untersuchungen wurde weiterhin gefunden, daß die wasserlösliche Substanz, die auf gleiche Weise wie Klettensaft aus Pflanzen der gleichen zusammengesetzten Familie, wie die der Kletten, erhalten wird, beispielsweise
aus dem Saft von Shungiku, Pestwurz (butterbur) und Salat, nicht die Aktivität aufweist, die Mutabilität, die diesen Substanzen zuzuordnen ist, zu inhibieren, d.h. die Mutagenizität zu manifestieren, ohne daß sie metabolisiert worden sind. ■■■.:·
In der oben erwähnten Literaturstelle werden nur die überstehenden Materialien beschrieben, die man beim Zentrifu-.. gieren von Gemüse- und Pflanzensäften erhält. Es finden sich keine Hinweise oder Angaben hinsichtlich eines Verfahrens zur Isolierung der aktiven Komponente aus diesen ^ überstehenden Materialien bzw. Lösungen und hinsichtlich : ihrer Reinigung. Somit findet sich kein Hinweis oder Angabe bezüglich der aktiven Komponente im gereinigten Zustand.
Beschreibung der Erfindung
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen desmutagenen Faktor, der in Kletten vorhanden ist, in gereinigtem Zustand zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß soll ein desmutagener Faktor in gereinigtem Zustand zur Verfügung gestellt werden, der die Aktivität aufweist, daß er die Mutabilität dieser Substanzen, die die Mutagenizität manifestieren, ohne daß sie metabolisiert worden sind, besitzt.
Erfindungsgemäß soll in gereinigtem Zustand ein desmutagener Faktor zur Verfügung gestellt werden, der im wesentlichen keine Abnahme in seiner Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität zeigt, selbst wenn er bei erhöhten Temperaturen behandelt oder mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird.
■ ■·.-■-«-
Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem ein desmutagener Faktor wirksam aus Kletten isoliert und gereinigt werden kann.
Diese Aufgabe und die Vorteile der Erfindung werden in der", folgenden Beschreibung erläutert. ..:'.
Die aktive Fraktion, die sich von der Klette ableitet und: die erfindungsgemäß in gereinigtem Zustand zur Verfügung ·■-. gestellt wird, ist eine wasserlösliche, in Kletten enthal-. tene Substanz, die an Anionenaustausch-Cellulose, jedoch : : nicht an Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert wird. Sie. besitzt einen Absorptionswellenlängenpeak im Bereich von " 280 bis 300 nm und weist die Aktivität auf, daß sie die Mutabilität inhibiert.
Der erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt, desmutagene Faktor kann auf Kletten isoliert und gemäß einem Verfahren gereinigt werden, welches die Stufen umfaßt:
(a) Zentrifugieren des Klettensaftes bzw. der Klettenmilch zur Entfernung von Fremdmaterial daraus,
(b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit der entstehenden, überstehenden Lösung, gefolgt von Aussalzen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln des Niederschlags,
(c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung, gefolgt von einer Dialyse der entstehenden Lösung und anschließend
(d) Unterwerfen der Dialyselösung einer Ultrafiltration, um eine konzentrierte Lösung zu entnehmen, die gegebenenfalls unter Bildung eines Pulvers lyophilisiert werden kann.
Die Klette, wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, ist die Pflanze Arctium lappa Linne oder Arctium lappa L. der Gattung Arctium der zusammengesetzten bzw. entsprechenden Familie.
Die Klette, die bei der vorliegenden Erfindung für die IaoK lierung der aktiven Fraktion verwendet wird, kann nicht nur die Wurzeln der Klette, sondern ebenfalls ihre Früchte, Stiele und Blätter umfassen. Es ist somit möglich, die geerntete Klette direkt zu verwenden, ohne sie in ihre Teile zu zerlegen. Weiterhin kann sie entweder in frischemY oder getrocknetem Zustand verwendet werden.
Es wurde durch Untersuchungen festgestellt, daß die aktive Fraktion, die aus der Klette erfindungsgemäß erhalten wird, überlegene.Eigenschaften hinsichtlich ihrer Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität zeigt und keine wesentliche Abnahme aufweist, selbst wenn die Fraktion bei erhöhten Temperaturen von beispielsweise etwa 100°C während 15 Minuten behandelt wird oder wenn sie mit einem proteolytisehen Enzym behandelt wird, obgleich sie Proteine enthält.
Bezüglich der anderen Eigenschaften dieser aktiven Fraktion wurde gefunden, daß die Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität stark durch Manganionen abnimmt, daß aber keine wesentliche Abnahme durch Magnesium- oder CaI-ciumionen auftritt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung der Substanz, die die Mutabilität inhibiert, und ihre Reinigung aus Kletten wird zuerst das Fremdmaterial, das in dem Klettensaft enthalten ist, mittels Zentrifugieren entfernt.
Der Klettensaft kann auf folgende Weise hergestellt werden. Nach dem Waschen der Kletten mit Wasser werden sie in eine Entsaftungsvorrichtung gegeben, die mit einem Filter versehen ist, um den Hauptteil des faserförmigen Materials zu entfernen und um frischen Saft herzustellen. Alternativ kann ein Pulver aus getrockneten Kletten während einer aus-· reichend langen Zeit in Wasser oder einer Phosphatpuffer- ; lösung gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur suspendiert-... werden oder während es mit einer Zermahlungsvorrichtung "■*. zerrieben wird. Das Pulver aus getrockneten Kletten sollteso fein wie möglich sein. Wenn man ein solches Pulver ver^J wendet, sollte der Saft bevorzugt hergestellt werden, in-;.., dem man das Pulver bei normalerweise etwa 20 bis etwa 850C während etwa 2 bis 24 Stunden behandelt, während das Pulver mit einer Mühle bzw. Zerreibevorrichtung vermählen wird.
Der so hergestellte Klettensaft wird zur Entfernung von Fremdmaterial daraus zentrifugiert. Das Zentrifugieren kann als übliches Zentrifugieren bei 7000-15 000 χ G durchgeführt werden. Man kann jedoch auch eine Utrazentrifugierung bei 100 000 - 200 000 x-G verwenden. Es ist weiterhin möglich, zuerst die übliche Zentrifugierung und dann eine Ultrazentrifugierung zu verwenden. Die übliche Zentrifugierung wird normalerweise während 30 bis 60 Minuten durchgeführt. Bei dem Zentrifugieren werden die Faserstoffe, wie die Chloroplasten oder Mitochondrien, entfernt. Andererseits wird das Ultrazentrifugieren bevorzugt während normalerweise 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Bei dieser Behandlung werden die Microsomen oder Ribosomen entfernt.
Zu dem überstehenden Material, welches man nach Entfernen des Fremdmaterials aus dem Klettensaft, wie oben beschrieben, erhält, gibt man dann eine Phosphatpufferlösung. Wenn
der Saft hergestellt worden ist, indem man Klettenpulver zu einer Phosphatpufferlösung gibt, ist es nicht erforderlich, weitere Phosphatpufferlösung zuzugeben. Diese Ausführungsform fällt ebenfalls unter die vorliegende Erfindung. :
Als Phosphatpufferlösung verwendet man bevorzugt eine Lösung, deren pH-Wert normalerweise im Bereich von etwa 6,5: bis etwa 7,5 liegt. Es ist weiterhin bevorzugt, eine Phosphatpufferlösung zu verwenden, deren Konzentration normalerweise etwa 1 bis 2 Mol beträgt. Eine solche Phosphat- : pufferlösung wird bevorzugt in einer Menge von 1/20 bis 1/100 Vol-Teilen, bezogen auf das überstehende Material, zugegeben. Die Phosphatpufferlösung sollte bevorzugt in einer solchen Menge zugegeben werden, daß die Konzentration der Phosphationen, die in Form der Phosphatpufferlösung zu dem überstehenden Material zugegeben werden, etwa 10 bis etwa 400 mMol beträgt.
Als Salz, das zu der entstehenden Lösung für die Aussalzung zugegeben wird, kann man wasserlösliche Metallsalze oder Ammoniumsalze anorganischer Säuren verwenden. Beispiele anorganischer Säuren sind Mineralsäuren, wie Kohlensäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Als Alkalimetallsalze oder Ammoniumsalze solcher anorganischen Säuren sind normalerweise bevorzugt Kaliumcarbonat, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumphosphat, etc.;das wasserlösliche Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz der anorganischen Säure wird bevorzugt in einer Menge von etwa 30 bis 80 Gew.%, bezogen auf das Gemisch aus überstehendem Material und Phosphatpufferlösung, zugegeben.
Die so ausgesalzte Lösung, die einen Niederschlag enthält, wird dann einer Behandlung unterworfen, bei der der Niederschlag daraus abgetrennt wird. Für die Isolierung des
Niederschlags kann man verschiedene Methoden, wie ein Filtrieren oder Zentrifugieren, verwenden. Die Filtration kann bei atmosphärischem, verringertem oder superatmosphärischem Druck durchgeführt werden. Die Isolierung des Niederschlags erfolgt jedoch bevorzugt durch Zentrifugie-i "· ren. Das Zentrifugieren wird normalerweise bei den zuvor ..: erwähnten Bedingungen der üblichen Zentrifugiertechnik durchgeführt. -
Der bei der Isolierung erhaltene Niederschlag wird dann ineiner Phosphatpufferlösung (pH 6,5 bis 7,5) gelöst und als Lösung der Dialyse unterworfen. Die Phosphatpufferlösung wird bevorzugt in einer Menge von normalerweise etwa 5 bis 10 ml/g Niederschlag verwendet. Obgleich die Dialyse gegenüber Wasser oder einer Phosphatpufferlösung durchgeführt werden kann, ist es im allgemeinen bevorzugt, die letztere zu verwenden.
Die Dialyselösung, aus der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse entfernt worden sind, wird dann der Ultrafiltration unterworfen. Die Konzentration der Dialyselösung findet durch Ultrafiltration statt. Es ist bevorzugt, daß die Ultrafiltration weitergeführt wird, bis das Volumen der Dialyselösung 1/3 bis 1/5 des ursprünglichen Volumens beträgt. Als Filter, die bei der Ultrafiltration verwendet werden können, können z.B. erwähnt werden PM-3O, XM-5O, XM-1OO und XM-3OO (hergestellt von Amicon Far East Ltd.). Von diesen ist die Ultrafiltrationsmembran XM-300 besonders bevorzugt, durch die Moleküle mit Molekulargewichten unter etwa 300 000 hindurchgehen.
Die konzentrierte Lösung, die man so erhält, nachdem die Ultrafiltration durchgeführt wurde, enthält die erfindungsgemäße aktive Fraktion. Diese konzentrierte Lösung kann ebenfalls gegebenenfalls nach einem üblichen Lyophilisierungsverfahren pulverisiert werden.
Wenn die konzentrierte Lösung der Lyophilisierung unterworfen wird, ist es bevorzugt, daß Wasser in etwa der 3-bis 5fachen Volumenmenge zu der Lösung zugegeben wird und daß darauf die Lösung erneut einer Ultrafiltration unterworfen wird, bevor die Lyophilisierung durchgeführt wird.
Die den desmutagenen Faktor enthaltende, aktive Fraktion in Form einer konzentrierten Lösung oder eines Pulvers und in gereinigtem Zustand, die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt wird, wird als solche Menschen oder Säugetieren, ausgenommen Menschen, oder nachdem sie mit geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Adjuvantien ver- mischt worden sind, verabreicht.
Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, die die erfindungsgemäße aktive Fraktion zusammen mit einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Adjuvans enthält, oder ein Arzneimittel, das die Zusammensetzung enthält. Als Träger oder Adjuvantien können alle die verwendet werden, die dem Fachmann geläufig sind, wie Arzneimittelträgerstoffe, Schmiermittel, Desintegratoren, Beschichtungsmittel für Kapseln, usw.. Das Arzneimittel kann in Form von Tabletten, Granulaten, mit Zucker überzogenen Pillen, Pulvern, Sirupen, Lösungen oder Kapseln vorliegen.
Wenn die erfindungsgemäße aktive Fraktion in einer der zuvor angegebenen Formen vorliegt, wird sie bevorzugt oral verabreichet. Die erfindungsgemäße aktive Fraktion kann ebenfalls extern (z.B. durch Anwendung auf die Haut) verabreicht werden. In diesem Falle ist es bevorzugt, sie in Form einer Salbe, z.B. einer, bei der ein öllösliches Grundmaterial, wie Wachs,verwendet wird, oder in Form einer Wasser enthaltenden Emulsion oder einer wäßrigen Lösung zu verwenden.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Prophylaxe des Auftretens von Mutationen in solchen Säugetieren zur Verfügung gestellt, die gegenüber der Mutagenese empfänglich sind, bei dem solchen Säugetieren eine pharmazeutisch wirksame Menge der aktiven erfindungsgemäßen Fraktion ge-'·.'"' gebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägeiji oder Adjuvantien verabreicht wird. Die Dosismenge kann auf,*., geeignete Weise entsprechend den zu behandelnden Tieren "— bei Spezialisten, wie Ärzten und Pharmazeuten, bestimmt wer"-den. Sie beträgt im allgemeinen etwa 100 ing bis 2,5 g/kg Körpergewicht/Tag. :..:.:
Wie aus der Tatsache folgt, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion eine Komponente ist, die in Kletten enthalten ist, welche als Nahrungsmittel gegessen werden, ist sie praktisch frei von Toxizität.
Der Ausdruck "Tiere, die gegenüber der Mutagenese empfänglich sind" bedeutet solche Tiere, die ein Mutagen mit der Nahrung aufgenommen haben oder in Kontakt mit einem Mutagen gekommen sind oder von denen man erwarten kann, daß sie ein Mutagen mit der Nahrung aufnehmen oder in Kontakt mit einem Mutagen kommen.
Die durch Lyophilisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene aktive Fraktion wird zweckdienlich zur Herstellung von irgendeiner Form von Arzneimittel verwendet. Sie ist ein wasserlösliches und stabiles, braunes Pulver, welches von Verfärbungen frei ist und ihre Lagerungsstabilität ist extrem gut.
Entsprechend unseren Untersuchungen wird angenommen, daß die desmutagene Aktivität der aktiven erfindungsgemäßen Fraktion auf solche Weise manifestiert wird, daß sie die Mutabilität, die durch die Mutagene inhibiert
wird, inhibiert, indem sie direkt auf die Mutagene wirkt. Die erfindungsgemäße aktive Fraktion wird somit bevorzugt präventiv besonders solchen Säugetieren verabreicht, von denen man erwartet, daß sie Mutagene mit der Nahrung auf-, nehmen, oder solchen Tieren, von denen eindeutig bekannt : ist, daß sie Mutagene mit der Nahrung aufgenommen haben. -
Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren zur Isolie-:„. rung und Reinigung der aktiven Fraktion gemäß dem erfin- * dungsgemäßen Verfahren, wie auch die desmutagene Aktivität der aktiven Fraktion und ihre anderen Eigenschaften. :.
Beispiel
(1) Isolierung der aktiven Fraktion aus Kletten und ihre Reinigung.
5000 g Kletten werden mit Wasser gewaschen und dann in einem Entsafter (Modell JC-540A, hergestellt von Toshiba Co.) zerkleinert. Man erhält etwa 3400 ml Klettensaft. 1400 ml dieses Saftes werden bei 9000 x G während 30 min zentrifugiert. Man erhält 2200 ml eines klaren, braunen, überstehenden Lösung.
1/20 Volumenmenge einer 1 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8) wird mit dieser überstehenden Lösung vermischt, danach wird das Gemisch ausgesalzt, indem man zu 1100 ml des Gemisches 80 Gew.% eines Gemisches aus Ammoniumsulfat zugibt. Das ausgesalzte Gemisch wird dann 15 min bei 9000 χ G zentrifugiert. Man erhält 80 g eines Niederschlags. 60 g dieses Niederschlags werden in einer 50 mMol Phosphatpuff er lösung (pH 6,8) gelöst und auf 600 ml aufgefüllt. Die Lösung wird bei 4°C gegenüber der zuvor erwähnten Phosphatpufferlösung (pH 6,8) dialysiert. Man erhält 696 ml Dialyselösung.
464 ml dieser Dialyselösung werden dann auf 1/3 ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, indem man sie einer Ultrafiltration unterwirft und ein Membranfilter XM-3OO (hergestellt von Amicon Far East Ltd.) verwendet. Die konzentrierte Lösung wird auf 200 ml durch Zugabe einer f-50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,8) aufgefüllt und sie wird;" erneut durch Ultrafiltration konzentriert, indem man das gleiche Filter, wie zuvor erwähnt, verwendet. Man erhält : 140 ml einer konzentrierten Lösung.
Von der bei der Ultrafiltration erhaltenen, konzentrierte^" : Lösung werden 70 ml bei -540C während 24 h unter Verwendung einer Lyophilisiervorrichtung (Modell FDX-1-54, hergestellt von Central Chemical Co.) lyophilisiert. Man erhält 450mg trockenes Pulver.
(2) Proteingehalt der aktiven Fraktion.
Wird eine wäßrige Lösung von 150 mg dieses lyophilisierten Pulvers in 30 ml Wasser quantitativ gemäß dem Lowry-Verfahren analysiert, so beträgt der Gehalt an Protein/ml Lösung 3,2 mg. Man stellt so fest, daß der Gesamtproteingehalt des lyophilisierten Pulvers 64 Gew.56 beträgt.
(3) Ultraviolett-Absorptionseigenschaften der aktiven Fraktion.
Fig.1 zeigt die ultraviolette Absorptionskurve, die man erhält, indem man die Messungen, die mit einer wäßrigen Lösung des lyophilisierten Pulvers durchgeführt wurden, graphisch aufträgt. In Fig. 1 ist die Absorption auf der Ordinate aufgetragen und die Wellenlänge (nm) ist auf der Abszisse aufgetragen. Aus Fig. 1 folgt, daß die erfindungsgemäße Fraktion einenAbsorptionswellenlängenpeak im Bereich von 280 bis 300 nm (maximale Wellenlänge etwa 290 nm) aufweist.
(4) Adsorption der aktiven Fraktion an einem Anionenaustauschharz und einem Katiönenaustauschharz.
27 ml der gemäß dem obigen Verfahren (1) erhaltenen, konzentrierten Lösung werden an einer Säule aus DEAE-Cellulose (eine Anionenaustausch-Cellulose) bei folgenden Bedingungen: Säulengröße =2,5 x 12 cm, Eluierungsrate =36 m/h und Menge an eluiertem Material = 10 ml/Reagenzglas chromatographiert. Die Adsorption wird geprüft, indem man die Eluierung unter Verwendung einer Eluierungspufferlösung, nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung, durch- .' führt, in der man Kaliumchlorid mit einem Konzentrations-"--gradienten im Bereich von 50 mM bis 2 M gelöst hat. Frak-;--tionen, die eine Hemmaktivität aufweisen, werden bei den Fraktionen nicht nachgewiesen, die eluiert wurden, ohne daß sie an der DEAE-Cellulose-Säule adsorbiert worden sind.
7 ml der konzentrierten Lösung werden auf ähnliche Weise an einer Säule aus CM-Cellulose (Kationenaustausch-Cellulose) bei den folgenden Bedingungen chromatographiert: Säulengröße = 2,5 x 7 cm, Eluierungsrate = 40 ml/h, Menge an eluiertem Material = 5,8 ml/Reagenzglas. Die Adsorption wird geprüft, indem man die Eluierung unter Verwendung einer Eluierungspufferlösung, nämlich einer 50 mM Phosphatpufferlösung, durchführt, in der man Kaliumchlorid mit einem Konzentrationsgradienten im Bereich von 50 mM bis 0,1 M gelöst hat.
Die gesamte Lösung wird eluiert, ohne daß sie an der CM^1 Cellulosesäule adsorbiert wurde. Eine Eluierungskurve, wie sie in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist, wird erhalten. Wird die eluierte Fraktion auf ihre Inhibitorwirkungen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren geprüft, so stellt man fest, daß die desmutagene Rate beträgt. Dieser Wert ist etwa der gleiche (87,4?6) wie
der einer wäßrigen Lösung eines trockenen Pulvers (87,4%), die 1 mg/ml trockenes Pulver enthält, in einer Menge von 500/Ul/Platte, wie aus der folgenden Tabelle 2 folgt. Aus den bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnissen ist weiter-„ hin erkennbar, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion : ein Polyelektrolyt ist, der eine starke anionische Base enthält.
(5) Inhibitorwirkungen der aktiven Fraktion
(a) Der Test zur Bestimmung der Inhibitorwirkun- ' gen wird auf folgende Weise durchgeführt. Zu einer Lösung'., des Mutagens in 0,02 ml Dime thy lsulf oxid gibt man 0,5 ml :.. einer Fraktion, die man bei jeder der Stufen des obigen Verfahrens (1) erhalten hat, oder die Endfraktion (die aktive erfindungsgemäße Fraktion). Danach erfolgt die Reaktion bei 37°C während 30 min. Zum Vergleich wird die Reaktion auf gleiche Weise, aber unter Verwendung von 0,5 ml Phosphatpufferlösung anstelle der verschiedenen Fraktionen durchgeführt. Die Reaktionsgemische werden dann durch Erhitzen bei 100°C während 10 min sterilisiert. Nach Beendigung der Wärmebehandlung werden 3 ml weicher Agar (0,6% Difco Agar) und 0,1 ml einer Suspension von Salmonella TA98 (Histidin, erfordernd His~) zugegeben und die Gemische werden dann auf das zuvor beschriebene, selektive Agarmedium ausgegossen. Die Züchtung erfolgt bei 37°C während 2 Tagen. Danach werden die Kolonien aus Revertanten (Histidin, die kein HiS+ erfordern) gezählt.
Wird ein Mutagen verwendet, das Mutabilität nur bei der Metabolisierung zeigt, wie 2-Aminoanthracen, Äthidiumbromid, Trp-P-1 oder Trp-P-2, erfolgt der Test auf gleiche Weise, aber nach der Zugabe zu den zuvor erwähnten 0,3 ml weichem Agar eines S-9-Gemisches, welches wie im folgenden beschrieben hergestellt wird. Zur Bestätigung wird SD Rattenleber verwendet, ein Leberhomogenat, dessen meta-
bolische Enzymaktivität durch PCB verstärkt wurde und welches unter Bildung einer Lebermicrosomfraktion (S-9) zentrifugiert wurde. Das S-9-Gemisch wird dann hergestellt, indem man zu dem Lebermicrosom, die man so erhält, an- : organische Salze in den folgenden Mengen zugibt. ■ ";
Anorganische Salze, die zu dem S-9-Gemisch zugegeben werdeni
Lebermicrosom 3 ml .----.
0,25 M Phosphatpufferlösung 4 ml """-
0,16 M MgCl2 0,5 ml " :
0,66 M KCl 0,5 ml .--.·.
. 0,05 M G-6-P 1,0 ml ■■*""
0,04 NADP 1,0 ml
Zusammensetzung des selektiven Agarmediums:
MM (X20) 50 ml
4096 Glucose 10 ml
0,896 Difco Nährbrühe 10 ml
Biotin (100/Ug/ml) 1 ml
Agar 15 g
destilliertes Wasser 930 ml
Zusammensetzung von MM (X-20) :
(NH4)2S04 2,096
KH2PO4 20,096
MgSO4.7H2O 0,296
Natriumeitrat 1,096
pH 7,0 mit KOH
Die Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität der Mutagene wird auf die zuvor beschriebene Weise geprüft. Nimmt man die Menge (ml) der Fraktion, die für die Inhibierung von 5096 der Mutabilität erforderlich ist, so wird die Aktivität auf Grundlage der Menge (mg) Protein, die pro Einheitsvolumen (ml) der Fraktion vorhanden ist, angegeben.
(■b) Inhibierung der Mutabilität von 2-Nitro-pphenylendiamin (200/ug/Platte)
Das Aktivitätsverhältnis der Inhibitorwirkungen der Fraktionen, die man bei den verschiedenen Stufen des obigen Verfahrens (1) erhält, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle
Volumen Einheit Protein Aktivität (ml) (mg/ml) (Einheiten/mg)
9000 χ G überstehendes Material 1100
Dialyselösung
ultrafiltrierte, konzentrierte Lösung
wäßrige Lösung d.trockenen Pulvers
13 4
9 930
14,0
4,2
7,5
1,0
0,89 4,8
18,5 18,6
In Tabelle 2 ist der Einfluß der Konzentration auf die desmutagene Wirkung des trockenen Pulvers (erfindungsgemäße aktive Fraktion) angegeben.
Tabelle
Menge an 2-Nitro-p-phenylendiamin
(/ug/Platte)
Menge der wäßr.
Lösung von
trockenem FuI-ver(1)(/ul/Platte)
Desmutagene Rate (2)
80 80 80 80 80
500
300
100
10
87,4 85,1 79,4 22,3 0
(1) Eine wäßrige Lösung des trockenen Pulvers ist eine solche, bei der das lyophilisierte Pulver in Wasser bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst wurde,
(2) Desmutagene Rate =
- b
χ 100
worin
a = Zahl der Kolonien an Revertanten von 2-Nitrop-phenylendiamin, behandelt mit einer Phosphatpufferlösung,
b = Zahl der Kolonien an Revertanten von 2-Nitrop-phenylendiamin, behandelt mit der erfindungsgemäßen aktiven Fraktion, :
c = Zahl der Kolonien an natürlichen Revertanten.--;
Aus den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß die Inhibitoraktivität der aktiven Fraktion (der ultrafiltrierten, konzentrierten Lösung und des lyophilisierten Pulvers) gemäß der Erfindung etwa das 2Ofache von der der 9000 χ G überstehenden Lösung (Vergleich) beträgt und daß sie auf etwa das 4fache verstärkt wurde, verglichen.mit der Dialyselösung, die man nach dem Aussalzen erhält (Tabelle 1). Aus den Ergebnissen der Tabelle 2, die den Einfluß der Konzentration der erfindungsgemäßen aktiven Fraktion auf die Inhibitorwirkung zeigt, ist erkennbar, daß die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wenn 2-Nitrop-phenylendiamin verwendet wird.
Tabelle 3 zeigt die Inhibitorwirkungen der erfindungsgemäßen aktiven Fraktion (letzte Fraktion) bei verschiedenen Mutagenen.
J»
- Vt- 		8-9 Gemisch
zugesetzt
oder nicht
zugesetzt		 3050077
Tabelle 3 nicht zuges
zugesetzt
Mutagen Konzentra
tion
( /u/Platte		 nicht zuges
zugesetzt		 Desmuta-
gene Rate
(90
2-Nitro-p-phenylen-
diamin		 80
80		 dito . 89,9 :*-..:
92,5 :·*
4-Nitro-o-phenylen-
diamin		 40
40		 dito . 60,7 "Ϊ
56,9
Äthidiumbromid 10 dito 96,5 '·-:
2-Amino-anthracen 4 dito 97,8 '""-.;
Trp-P-1 0,2 96,1 .: .
Trp-P-2 0,2 95,5 ' -: :
Aus den Ergebnissen der Tabelle 3 folgt insbesondere, daß die erfindungsgemäße aktive Fraktion bemerkenswerte Inhibitorwirkungen zeigt. Das heißt, daß der Inhibitorfaktor, der in den Säften von Kohl und Broccoli vorhanden ist, Pflanzen, die in der zuvor erwähnten Literaturstelle beschrieben werden, nur Inhibitorwirkungen zeigt, wenn er mit solchen Mutagenen verwendet wird, die Mutabilität manifestieren, nachdem sie metabolisiert wurden(Äthidiumbromid, 2- Aminoanthracen, Trp-P-1 und Trp-P-2), aber keine Inhibitorwirkungen, wenn sie mit einem Teil der Oxidationsfarben verwendet werden, der Mutabilität manifestiert, ohne metabolisiert zu sein (z.B. 2-Nitro-p-phenylendiamin oder 2-Nitro-o-phenylendiamin), zeigt die erfindungsgemäße Fraktion, wie aus Tabelle 3 folgt, eine bemerkenswerte Inhibitorwirkung nicht nur, wenn sie zusammen mit der ersteren Klasse der Mutagene verwendet wird, sondern selbst, wenn sie mit der letzteren Klasse zusammen verwendet wird. Ihre Funktion und Wirkungen sind somit überraschend einzigartig.
(6) Wärmebeständigkeit der aktiven Fraktion.
Als nächstes wird die Wärmebeständigkeit der erfindungsgemäßen Endfraktion geprüft. 500 ml der erfindungsgemäßen Endfraktion (eine wäßrige Lösung eines lyophilisierten Pulvers) werden 15 min auf 10O0C unter Rückfluß erhitzt und abgekühlt. 500 ml einer wäßrigen Lösung der Endfraktion, die nicht in der Wärme behandelt worden ist, werden mit den verschiedenen Mutagenen mit den in Tabelle 4 angegebenen Konzentrationen vermischt. Danach werden die Gemische 30 min bei 370C umgesetzt. Danach wird der Test zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen, wie in (5) oben angegeben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Mutagen Konzentra- Endfraktion Desmutagene
tion(/Ug/ (500/Ul/ Rate _Platt6} Platte) (%)
2-Nitro-p-pheny-
lendiamin		 .200 nicht wärmebeh.
wärmebehandelt		 88,6
86,1
2-Aminoanthracen 4 nicht wärmebeh.
wärmebehandelt		 96,8
95,5
Äthidiumbromid 10 nicht wärmebeh.
wärmebehandelt		 95,5
93,5
Trp-P-1 0,2 nicht wärmebeh.
wärmebehandelt		 96,8
96,2
Trp-P-2 0,2 nicht wärmebeh.
wärmebehandelt		 95,8
96,0
Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, daß die erfindungsgemäße Endfraktion bzw. letzte Fraktion gegenüber Wärme stabil ist und durch diese nicht entaktiviert wird und daß sie weiterhin zufriedenstellende Inhibitorwirkungen aufweist.
(7) Stabilität der aktiven Fraktion gegenüber proteolytischen Enzymen.
Die Stabilität der Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines lyophilisierten Pulvers) gegenüber proteolytischen Enzymen wird ebenfalls geprüft. Als proteolytische Enzyme werden DNase 1 (ein Enzym, welches DNA abbaut), RNase (ein Enzym, welches RNA abbaut) und Pronase (ein Enzym, welches verschiedene Proteine abbaut, ein Produkt der Kaken Chemical Co., Ltd.) verwendet. Sie werden jeweils zu der Endfraktion in solcher Menge zugegeben, daß die Endkonzentration etwa 20/ug/ml beträgt, und das Gemisch wird dann 30 min bei 37°C umgesetzt.
Diese Reaktionsprodukte (500 /ul) werden dann mit den in Tabelle 5 aufgeführten Mutagenen vermischt, die die darin angegebenen Konzentrationen aufweisen. Die Gemische werden 30 min bei 37° C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Versuch zur Bestimmung der Inhibitorwirkungen, wie oben unter (5) beschrieben, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5
Mutagen A: wenn Konzentra Desmutagene A B Rate (90 + D
tion ( /Ug/
Platte)		 86,6 84,7 C 87,0
2-Nitro-p-pheny-
lendiamin		 200 96,3 94,1 83,9 96,7
2-Aminoanthracen 4 95,1 93,1 93,2 95,1
Äthidiumbromid 10 96,7 94,6 92,0 97,1
Trp-P-1 0,2 95,2 97,3 93,7 95,6
Trp-P-2 0,2 3n ein solches 91,8 mit
das Mutae« ist, das
der Endfraktion behandelt wurde;
. B: wenn das Mutagen ein solches ist, das mit der Endfraktion behandelt wurde, die mit DNase 1 behandelt worden ist;
C: wenn das Mutagen ein solches ist, das mit der Endfraktion behandelt wurde, die mit RNase behandelt worden ist;
D: wenn das Mutagen ein solches ist, das mit der Endfraktion behandelt wurde, die mit Pronase behandelt worden ist.
Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfin- * dungsgemäße Endfraktion, die gegenüber den proteolytisehen' Enzymen extrem stabil ist, durch diese nicht entaktiviert wird und weiterhin zufriedenstellend Inhibitorwirkungen manifestiert. ;
(8) Stabilität der aktiven Fraktion gegenüber polyvalenten Metallionen oder Protein-Denaturierungsmitteln.
Die Stabilität der erfindungsgemäßen Endfraktion gegenüber verschiedenen mehrwertigen Metallionen oder Protein-Denaturierungsmitteln wird ebenfalls geprüft.
Magnesiumchlorid, Manganchlorid und Calciumchlorid werden jeweils vermischt und gelöst, so daß die Konzentration (Endkonzentration) in der entstehenden Lösung 10 mM an erfindungsgemäßer Endfraktion (einer wäßrigen Lösung eines lyophilisierten Pulvers) beträgt. Andererseits wird im Falle von EDTA, einem Protein-Denaturierungsmittel, die Mischung und Lösung davon auf solche Weise durchgeführt, daß die Konzentration 2,5 mM beträgt, während sie im Falle von SDS (Natriumdodecylbenzolsulfonat),ebenfalls einem Protein-Denaturierungsmittel, die Mischung und Lösung so durchgeführt wurde, daß ihre Konzentration O,1# beträgt. Die versch
behandelt.
Die verschiedenen Lösungen werden dann 30 min bei 37°C
Danach werden die Reaktionsgemische (500 /ul) mit den in Tabelle 6 aufgeführten Mutagenen bei den angegebenen
Konzentrationen vermischt, und anschließend erfolgt die Reaktion bei 37°C während 30 min. Nach Beendigung der Reaktion werden die Reaktionsprodukte auf ihre Inhibitorwirkungen, wie oben bei (5), untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. :
Tabelle 6
Mutagen Konz. ΛΚ/Platte) A Desmutagene Mn"*"1" Rate W+ • SDS.
(A Ca"·""1" EDTA
2-Nitro-p-pheny- 200 82,8 12,0 82,3
lendiamin 4 W
95,2		 84,9 8,5 80,3 84,0 9475
2-Aminoanthracen 10 93,8 94,1 10,2 90,1 W
92,0		 93Ϊ5
Äthidiumbromid 0,2 95,3 92,1 9,8 94,1 93,2 96VÖ
Trp-P-1 0,2 96,2 96,7 8,7 93,0 92,3 93,2
Trp-P-2 95,1 94,0 95,7
+A: wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der Endfraktion behandelt wurde;
Mg +: wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der Endfraktion behandelt wurde, die mit Magnesiumchlorid behandelt worden ist;
-1,1
Mn : wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der mit Manganchlorid behandelten Endfraktion behandelt wurde;
Ca : wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der mit Calciumchlorid behandelten Endfraktion behandelt wurde;
EDTA: wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der mit EDTA behandelten Endfraktion behandelt wurde;
SDS: wenn das verwendete Mutagen ein solches ist, das mit der mit SDS behandelten Endfraktion behandelt wurde.
Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Endfraktion einzigartige Eigenschaften besitzt
und daß sie gegenüber Protein-Denaturierungsmitteln und Magnesiumchlorid und Calciumchlorid extrem stabil ist und bei der Einwirkung von Manganchlorid eine große Abnahme in ihrer desmutagenen Aktivität zeigt. :
Die erfindungsgemäße Endfraktion ist somit, wie aus den verschiedenen obigen Ergebnissen folgt, ein Polyelektrolyt mit einem Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 bis 300 nm und einer starken anionischen Base. Sie ist eine antimutagene Substanz mit hoher Inhibitorwirkung, die die Mutabilität von vielen Mutagenen inhibiert und insbesondere von solchen Mutagenen» die Mutabilität manifestie-: ren, ohne daß sie metabolisiert worden sind. Ihre Inhibitoraktivität ist gegenüber Wärme stabil und zeigt im wesentlichen keine Abnahme durch ein proteolytisches Mittel, nimmt jedoch durch Manganionen sehr stark ab.

Claims (15)

Patentansprüche
1. Eine aus Kletten erhaltene, aktive Fraktion, die bei der Inhibierung der Mutabilität Aktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion eine wasserlösliche Substanz ist, die in der Klette enthalten ist, und einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 mn ;. bis 300 nm aufweist, wobei die Fraktion eine Substanz ist," die an Anionenaustausch-Cellulose adsorbiert, jedoch an Kationenaustausch-Cellulose nicht adsorbiert wird.
2. Aktive Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekenn-*" zeichnet, daß die Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität keine wesentliche Abnahme zeigt, selbst wenn die "-Fraktion auf etwa 100° C während 15 Minuten erhitzt wird.
3. Aktive Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität keine wesentliche Abnahme zeigt, selbst wenn die Fraktion mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird.
4. Aktive Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität bei der Inhibierung der Mutabilität stark durch Manganionen abnimmt.
5. Aktive Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutabilität durch ein Mutagen verursacht wird, das die Mutabilität manifestiert, ohne einen Metabolismus in vivo zu erleiden.
6. Aktive Fraktion nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutagen eine Verbindung aus der Gruppe 2-Nitro-p-phenylendiamin und 4-Nitro-o-phenylendiamin ist.
7. Pharmazeutische Zubereitung für die Inhibierung der Mutabilität von Mutagenen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine aktive Fraktion» die man aus Kletten erhält und die die Aktivität aufweist, die Mutabilität zu inhibieren, wobei die Fraktion eine wasserlösliche Substanz ist, die in Kletten enthalten ist und :. einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 bis* 300 nm aufweist, wobei die Fraktion eine Substanz ist, die an einer Anionenaustausch-Cellulose, jedochnicht an .-einer Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert wird, zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Adjuvans enthält.
8. Verfahren zur Verhinderung der Mutagenese bei :* Säugetieren, die gegenüber Mutagenen empfänglich sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine pharmazeutisch wirksame Menge an aktiver Fraktion, die man aus Kletten erhält und die die Aktivität aufweist, die Mutabilität zu inhibieren, wobei die Fraktion eine wasserlösliche Substanz ist, die in Kletten enthalten ist und einen Absorptions-Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist, wobei die Fraktion eine Substanz ist, die an einer Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an einer Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert ist, gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Adjuvans verabreicht.
9. Verfahren zur Herstellung einer aktiven Fraktion, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen aufweist:
(a) Zentrifugieren des Saftes von Kletten zur Entfernung von Fremdmaterialien daraus;
(b) Mischen einer Phosphatpufferlösung mit dem entstehenden, überstehenden Material, gefolgt von Aussal-
zen des entstehenden Gemisches durch Zugabe eines wasserlöslichen Alkalimetallsalzes oder Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure und anschließendem Sammeln eines Niederschlags;
(c) Auflösen des Niederschlags in einer Phosphatpufferlösung und anschließende Dialyse der entstehenden ;-. Lösung und danach :-
(d) Durchführen einer Ultrafiltration mit der \ Dialyselösung unter Abnahme einer konzentrierten Lösung, ..**" gefolgt gegebenenfalls von Lyophilisieren der konzentrier-;*" ten Lösung unter Pulverisierung, wobei ein desmutagener Faktor isoliert und gereinigt wird, der einen Absorptions---„ Wellenlängenpeak im Bereich von 280 nm bis 300 nm aufweist;* wobei der desmutagene Faktor eine Substanz ist, die an : Anionenaustausch-Cellulose, jedoch nicht an Kationenaustausch-Cellulose adsorbiert wird, wobei die Aktivität des desmutagenen Faktors,Mutationen zu inhibieren, stark durch Manganionen abnimmt, aber im wesentlichen keine Abnahme durch Erhitzen bei 1000C während 15 Minuten oder Behandlung mit einem proteoIytisehen Enzym zeigt.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphatpufferlösung in einer Menge von 1/20 bis 1/100, ausgedrückt durch das Volumen, mit der überstehenden Lösung, die nach Entfernen des Fremdmaterials aus dem Klettensaft durch Zentrifugieren erhalten wird, vermischt.
11. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches Ammoniumsalz einer anorganischen Säure Ammoniumsuifat verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß man das wasserlösliche Alkalimetallsalz oder Ammonium-
salz der anorganischen Säure in einer Menge von etwa 30
bis 80 Gew.96, bezogen auf das Gewicht des Gemisches aus
überstehender Lösung und Phosphatpufferlösung, zugibt.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den gesammelten, ausgesalzten Niederschlag in der :. Phosphatpufferlösung in einem Verhältnis von 5 bis 10 ml * . des letzteren/g des ersteren vermischt. r*:
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet," daß man die Dialyse gegenüber einer Phosphatpufferlösung
durchführt. ..
15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnety daß man die Dialyselösung auf 1/3 bis 1/5 ihres ursprünglichen Volumens durch Ultrafiltration konzentriert.
DE803050077T 1979-11-26 1980-11-26 Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice Granted DE3050077T1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP54153267A JPS5942657B2 (ja) 1979-11-26 1979-11-26 ゴボウジュ−スよりアニオン性高分子電解物質を分離精製する方法
PCT/JP1980/000289 WO1981001517A1 (en) 1979-11-26 1980-11-26 Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3050077T1 true DE3050077T1 (de) 1982-03-18
DE3050077C2 DE3050077C2 (de) 1988-11-17

Family

ID=15558713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE803050077T Granted DE3050077T1 (de) 1979-11-26 1980-11-26 Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4474771A (de)
EP (1) EP0040641B1 (de)
JP (1) JPS5942657B2 (de)
DE (1) DE3050077T1 (de)
GB (1) GB2074447B (de)
WO (1) WO1981001517A1 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58177919A (ja) * 1982-04-09 1983-10-18 Kanebo Ltd 突然変異阻害活性を有する高分子量物質
US4986985A (en) * 1987-11-02 1991-01-22 Bar Ilan University Method of treating skin virus infections
US5135626A (en) * 1988-12-01 1992-08-04 Allied-Signal Inc. Method for purification of bases from materials comprising base and salt
US4976838A (en) * 1988-12-01 1990-12-11 Allied-Signal Inc. Method for purification of bases from materials comprising base and salt
JP2549515Y2 (ja) * 1991-05-21 1997-09-30 オムロン株式会社 動作確認用押ボタン付き電磁継電器
US6440448B1 (en) 1998-03-16 2002-08-27 Joseph Intelisano Food supplement/herbal composition for health enhancement
US7022368B2 (en) * 2001-06-26 2006-04-04 Ocean Spray Cranberries, Inc. Process for producing sugars and acids-rich juice and phytochemical-rich juice
DE10223486A1 (de) * 2002-05-27 2003-12-11 Beiersdorf Ag Kosmetische und/oder dermatologische Zubereitung mit 2,3-Dibenzylbutyrolactonen
RU2567049C2 (ru) 2010-03-15 2015-10-27 Ульрих ДИТЦ Применение нитрокарбоновых кислот для лечения, диагностики и профилактики агрессивных форм заживления
CN107488598B (zh) * 2017-09-12 2021-01-05 山东农业大学 一种牛蒡基蛹虫草菌丝体及其制备方法
CN109280691A (zh) * 2018-10-18 2019-01-29 吉林农业科技学院 大千生不同部位总黄酮对大肠杆菌的体外抑制作用的研究方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS603287B2 (ja) * 1978-03-14 1985-01-26 カネボウ株式会社 キヤベツジユ−ス中より突然変異原性物質の突然変異性を阻害する因子を分離精製する方法
DE2810293A1 (de) * 1978-03-09 1979-09-20 Kanebo Ltd Anti-mutagener faktor, verfahren zu seiner gewinnung und arzneimittel

Also Published As

Publication number Publication date
GB2074447A (en) 1981-11-04
GB2074447B (en) 1984-01-11
JPS5942657B2 (ja) 1984-10-16
EP0040641B1 (de) 1984-07-04
US4474771A (en) 1984-10-02
EP0040641A4 (de) 1982-02-16
WO1981001517A1 (en) 1981-06-11
EP0040641A1 (de) 1981-12-02
JPS5675434A (en) 1981-06-22
DE3050077C2 (de) 1988-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69232672T2 (de) Tabak Behandlung
DE69521158T2 (de) Proteinextrakt aus Cucumis melo mit Antioxydationswirkung und Verfahren zur Herstellung, kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung oder Nahrungszubereitung die so ein Extrakt enthält
DE2822150A1 (de) Lebensmittelzusammensetzung, enthaltend ein kolloidales molkenfaellungsprodukt
DE3050077C2 (de)
CH628649A5 (de) Verfahren zur herstellung von stickstoffhaltigen polysacchariden.
DE2952059C2 (de)
DE69618152T2 (de) Verfahren zur herstellung haltbarer gemüsepresssäfte
EP2358642B1 (de) Verfahren zur reduktion der konzentration von aminen und deren salzen
EP2895177B1 (de) Verwendung eines huminsäurepräparats zur behandlung von warmblütern
DE60114122T2 (de) Verfahren zur herstellung einer aus pflanzen stammenden, antibakteriellen substanz
EP0061508B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Bienenkittharz enthaltenden Produkten und Bienenkittharz enthaltende Produkte
JP3455436B2 (ja) 抗酸化物質の製造法
KR20110072772A (ko) 김치 분획물 및 이의 제조방법
WO1999042115A1 (de) Verwendung eines presssaftes, verdauungssaftes oder extraktes von fleischfressenden pflanzen zur hemmung von proteinkinasen
DE2601698C2 (de) Verfahren zur Fäulnisverhütung in Nahrungsmitteln
DE60306877T2 (de) Die Blut-Fluidität verbessernde Lebensmittel
DE2358434A1 (de) Verfahren zur reinigung von pflanzlichen flavonextrakten
DE10113324A1 (de) Kombinierte Zusammensetzung aus Pflanzenkoagulat, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
DE69229587T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Produkten aus Pflanzen, insbesondere maritimen Ursprungs
DE334274C (de) Verfahren zur Verbesserung des Geschmackes und Geruches von Gemuese- und Futterpflanzen aus der Familie der Kruziferen sowie aus verwandten Familien
DE3237245A1 (de) Verfahren zum herstellen eines gesundheitsgetraenkes sowie gesundheitsgetraenk
DE888833C (de) Verfahren zur Herstellung von Kulturen des Termobakteriums mobile Lindner
DE878876C (de) Verfahren zur Herstellung von ohne Geschmacks- und Geruchsbeeintraechtigung des Erntegutes anwendbaren Schaedlingsbekaempfungsmitteln auf der Grundlage von Hexachlorcyclohexan
DE1467934C (de) Verwendung von Getreideauszugen fur kosmetische Mittel
AT325783B (de) Verfahren zum abtrennen des glykofrangulin-komplexes aus pflanzlichen rohstoffen, insbesondere aus der getrockneten rinde des faulbaumes

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee