WO1981001517A1 - Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice - Google Patents

Process for isolating and purifying a fraction capable of inhibiting mutagenicity of a mutagenic material from burdock juice Download PDF

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WO1981001517A1
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mutagenicity
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active fraction
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K Morita
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Kanebo Ltd
K Morita
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
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    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction

Definitions

  • the present invention relates to a factor inhibiting the mutagenicity of a mutagenic substance in burdock and a method for separating and purifying the same.
  • Trp-P-1 (3-amino-3,4-dimethyl-5-pyridone) present in kogane components such as 2-furyl / acrylic acid) and grilled meat and grilled fish [4
  • the present inventors have previously proposed a method for separating and purifying a factor that inhibits the mutagenic mutation in cabbage juice (Japanese Patent Publication No. 54-122 715). .
  • the isolated and purified inhibitory factor is 2p-P-1 (3-amino-1,4-dimethyl-5-ox-pyrido [4,3-ro-]-indole), T-I P-2 (3 — Rino- 1-methyl-5-ox-pyrid [4,
  • the water-soluble substance obtained in the same manner as that of burdock is used as a plant belonging to the family Asteraceae similarly to burdock. It has also been clarified that they also do not show an activity of inhibiting mutagenicity by a substance which expresses metabolism or mutagenicity such as an acid dye.
  • an object of the present invention is to provide a mutagenic inhibitor contained in burdock in a purified state.
  • Another object of the present invention is to provide a purified mutagenic inhibitor having an activity of inhibiting mutagenicity of a substance that expresses mutagenicity without metabolism.
  • Still another object of the present invention is to provide a mutagen-injecting inhibitor which substantially reduces the activity of inhibiting mutagenicity even when treated at an elevated temperature or treated with a protease. It is to provide in a purified state.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for efficiently separating and purifying the above mutagenic inhibitor from burdock.
  • the purified active fraction obtained from burdock is a water-soluble substance contained in burdock, which is adsorbed on anion-exchanged cellulose but has a cation Not adsorbed by the replacement cellulose, and
  • the provided mutagenic inhibitor comprises:
  • a phosphate buffer solution is mixed with the obtained supernatant, and a water-soluble non-acid-free alkali metal salt or ammonium salt is added to the mixture, and salting out is performed.
  • burdock refers to asteraceae (Co posi 'ae)
  • the burdock used as a target for separating and purifying the active fraction may be burdock root, burdock fruit or burdock stem, leaf or the like. Therefore, the burdock can be harvested and used as it is without separating the burdock into these parts.
  • burdock root is particularly preferably used. Burdock can also be used raw or dried.
  • the active fraction obtained from the provided burdock according to the present invention shows that its mutagenic inhibitory activity is increased at an elevated temperature, for example, about 100 ° C. Clearly, it has excellent properties that it does not substantially decrease even after 5 minutes of treatment, or that it contains protein but does not decrease substantially by treatment with proteolytic enzymes. It was done.
  • the active fraction is also characterized by other features, such as manganese ions.] 9
  • the inhibitory activity is significantly reduced by magnesium or calcium ions, but the inhibitory activity is not substantially reduced by magnesium or calcium ions. It was also revealed that it had a quality.
  • burdock juice is centrifuged to remove contaminants contained therein.
  • Burdock juice can be obtained by washing raw burdock with water and filtering with a filter to obtain most of the fiber-free raw juice, or dry burdock powder in water or phosphate buffer. Suspension at elevated temperature or mortaring machine if necessary for a sufficient time]. -Dried burdock powder should be as fine as possible, and when using this powder it should be crushed using a mortar, usually at about 20 ° to about 85, for about 2 to 24 hours to produce juice. Is preferred.
  • the burdock juice thus produced is subjected to centrifugation to remove contaminants.
  • the centrifugation may be a normal centrifugation of 700 to 150,000 X, or an ultracentrifugation of 100,000 to 200,000. Ultracentrifugation may be performed after normal centrifugation.
  • Normal centrifugation is usually performed for 30 to 60 minutes, thereby removing iron, chloroblast or mitochondria in the juice.
  • Ma is preferably carried out for 1 to 2 hours, which further removes microsomes or ribbons.
  • a phosphate buffer solution is then added to the supernatant obtained by removing contaminants from burdock juice as described above.
  • a phosphate buffer solution is added to burdock powder to produce a juice, a case may be added.
  • a phosphate buffer solution may be added. It will be understood that this case is also included in the scope of the present invention.
  • phosphate buffer solution having a concentration of about 1 to 2 molar.
  • Such-phosphate buffer solution is preferably added in 1 / ao 1 00 parts by volume with respect to the supernatant.
  • the phosphate buffer solution is preferably added so that the concentration of phosphate ions in the supernatant to which the phosphate buffer solution has been added is about 10 to about 400 M.c
  • the salt to be subsequently added to the obtained solution for salting out is a water-soluble inorganic alkali metal salt or an ammonium salt.
  • the inorganic acid include mineral acids such as carbonic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid.
  • the alkali metal salts or ammonium salts of the inorganic acids preferably used are potassium carbonate, ammonium sulfate, sodium sulfate, potassium phosphate and the like.
  • the amount of the alkali metal salt or ammonium salt of the water-soluble inorganic acid used is preferably about 30 to 80% by weight, based on the volume of the supernatant-phosphate buffer mixture.
  • the solution containing the precipitate thus salted out is then allowed to separate the precipitate.
  • C Various methods such as filtration or centrifugation are used for the separation.
  • the filtration can be performed at normal pressure, reduced pressure or increased pressure. It is desirable to separate by centrifugation.
  • the centrifugation is usually performed by the so-called ordinary centrifugation under the conditions described above.
  • the precipitate obtained separated to then be is dissolved in phosphate buffer solution ( ⁇ ? Ox 6.5 to 7.5) and subjected to dialysis as a solution. It is generally desirable to use a phosphate buffer solution in a ratio of about 5 to 10 precipitates 1 ⁇ 5. Dialysis can be performed with water, a phosphate buffer, or the like, but is usually preferably performed with a phosphate buffer.
  • the dialysis solution, from which the low molecular weight substances have been removed by dialysis, is then subjected to an ultrathin.
  • the dialysis solution is concentrated by ultrafiltration. It is desirable to continue the ultrafiltration until the dialysis reaches 1 to 3 to 5 volumes.
  • Filters that can be used for extraneous radiation include ⁇ 1 ⁇ 2 "-30 and ⁇ -50.
  • the concentrated solution thus subjected to the ultrafiltration constitutes the active fraction of the present invention.
  • the present invention ⁇ , ⁇ '? 1 According to the above, such a concentrated liquid can be further subjected to ordinary freeze-drying as required to obtain a powder.
  • the active fraction containing the mutation inhibitor in the purified state in the form of a concentrated solution or powder provided by the present invention, can be used as such or as appropriate with other pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants. And administered to humans or other animals other than Iruma. .
  • composition comprising the active fraction of the present invention, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant, or an agent comprising the composition.
  • carrier or adjuvant examples include excipients, lubricants, disintegrants, capsule encapsulating agents, and the like which are generally known to those skilled in the art.
  • the form of the drug for example, tablets, granules, sugar coatings, powders, syrups, solutions, capsules and the like are used.
  • the active fraction of the present invention in the above-mentioned form is preferably administered orally. Further, the active fraction of the present invention can also be used for topical administration (application to the skin). In this case, it is preferable to use in the form of an ointment such as an ointment using an oil-soluble base material such as a wax, a water-containing emulsion, an aqueous solution and the like.
  • a pharmaceutically effective amount of the active fraction of the present invention is optionally mutated together with a pharmaceutically acceptable carrier or adjuvant by a mutagen.
  • a method is provided for administering to an animal which is likely to induce a mutation to prevent the mutation from occurring in the animal.
  • the dosage can be appropriately determined by a doctor or a pharmacist or the like for the subject animal to be administered, but is usually about 100 to 2.5? Weight / day etc.
  • the active fraction of the present invention is a component contained in burdock that is eaten as food.] Its toxicity is almost high.
  • the animal that is likely to be mutated refers to, for example, an animal that ingests or contacts a mutagenic substance, or is expected to ingest or contact a mutagenic substance. .
  • the active fraction obtained by freeze-drying is convenient for use as a drug of any form.
  • it is a water-soluble and stable odorless, brown powder. Therefore, storage stability is particularly excellent.
  • the mutation inhibition activity exhibited by the active fraction of the present invention is such that the active fraction acts so that the mutagenicity expressed by the mutagenic substance directly acts on the substance. was considered to be expressed.
  • the active fraction of the present invention prophylactically so as to prevent the expression of mutagenicity, particularly in animals that may or may have taken mutagenic substances. .
  • This juice 140 Q was centrifuged at 900 X G for 30 minutes to obtain a brown transparent supernatant 222. '
  • UV absorption characteristics of active fraction-- Figure 1 shows the UV absorption curve measured for the aqueous solution of the lyophilized powder.
  • the vertical axis indicates absorbance] 9
  • the horizontal axis indicates wavelength (w w).
  • the active fraction of the present invention has an absorption wavelength peak (maximum wavelength of about 290 nm) in the range of 280 nm to 300 nm.
  • the elution buffer was eluted within a range of 50 M (50 chlorinated lime dissolved in D-phosphate buffer to 2 M potassium chloride by increasing the concentration in order.
  • CM-cell ⁇ -size positive exchange cell ⁇ -size
  • the conditions are column size 2.5 x 7 CTZ, elution speed 4 ? 'Elution volume 5.
  • Elution buffer is 5 OM phosphoric acid-MPI
  • the elution was carried out in a range from a chloride solution of 50 dissolved in a buffer solution to a 0.1 M salt solution with increasing the concentration of the desired compound, to examine the adsorptivity.
  • the active fraction of the present invention was a polymer electrolyte having a strong anionic group.
  • the mutagenic substance expresses mutagenicity for the first time due to metabolism.
  • E.g. 2 - amino anthracene, E histidinol ⁇ beam bromide My de, ⁇ - ⁇ - 1 and TVp- 3 - 2, etc. for the case of using the a, obtained by adjusting, as described later in the process S - Except for adding 0.3 to 9a; S-9 m3 ⁇ 4; ⁇ Prepared as follows. That is, using a 5 series rat, according to _PC! ) After obtaining a liver homogenate with enhanced drug metabolizing enzyme activity, the liver homogenate is subjected to centrifugation to obtain a liver microsomal fraction (S-9). -The S-9mm was prepared by adding an inorganic salt having the following composition to the obtained liver microsomal zyme.
  • the activity of the inhibitory effect was determined for the mutagenic substance by the inhibitory effect test performed as described above.
  • the amount of the fraction required for inhibition i.m.p.
  • the amount of the protein contained in the unit volume of the fraction was determined based on the amount of the protein contained in the fraction.
  • Table 1 shows the activity ratio of the inhibitory effect of the fraction obtained in each step of the method (1) described above.
  • Table 2 shows the concentration dependency of the dry powder (the active fraction of the present invention) on the mutation inhibitory effect.
  • 3 ⁇ 4 1 An aqueous solution of dry powder is prepared by dissolving a lyophilized powder in water as described in Step 1.
  • C FI a Reversion mutation of 2-nitro paraphenylene diamine treated with phosphate buffer
  • b Reversion mutation of 2-nitro paraphenylenediamine treated with the active fraction of the present invention
  • the number of colonies c the number of spontaneously revertant colonies
  • the inhibitory activity of lyophilized powder was about 20 times that of 900 XG supernatant (control) and about 4 times that of dialysate after salting out (Table 1).
  • the final fraction of the invention exhibited a concentration-dependent (Table 2) power, and in any case exhibited a good inhibitory effect on 2-nitroparaphene diamine.
  • Table 3 shows the inhibitory effect of the active fraction (final fraction) of the present invention on the mutagenicity of various mutagenic substances.
  • the inhibitory factor present in the use of cabbage or prococcoli which is a plant reported in the above-mentioned literature, is a mutagenic substance that expresses mutagenicity through metabolism (etididum bromide). , 2-aminoanthracene, T-P-1 Trp-P-2), but only some of the oxidative dyes that express mutagenicity without metabolism (2-
  • the fractions according to the present invention have an inhibitory effect on nitro mouth paraphene range, and 4-nitrol sofene range. It also exerts a remarkable inhibitory effect as shown in Table 3 on the substance, and the specificity of the effect is remarkable.
  • the heat resistance of the final fraction of the present invention was examined. That is, the final fraction (aqueous solution of a lyophilized powder) of the present invention was heated at 100 ° C. for 15 minutes under reflux cooling, and the final fraction (aqueous solution) heated was subjected to heating at 50 ° C. 0 ml was mixed with each of the mutagens at the concentrations shown in Table 4 and reacted with 3 for 30 minutes.
  • Trp-P-2 0.2 Heated 9 5.8 Heated 9 6.0
  • magnesium chloride, manganese chloride, and calcium chloride are mixed and dissolved so that the concentration (final concentration) in the solution obtained with respect to the final fraction of the present invention (aqueous solution of lyophilized powder) becomes 10.
  • concentration which is a protein denaturant
  • the concentration was set to 2.5 M.
  • a protein denaturant sodium sodium dodecylbenzenesulfonate
  • they were mixed and dissolved so as to be 0.1. Each of these solutions was treated at 37 ° C for 30 minutes.
  • Trv -P-l 0.2 9 5.3 9 6.7 9.8 9 3.0 9 2.3 9 6.0 Trp-P-2 0.2 9 6.2 9 5.1 8.7 9 40 9 5.7 9 3.2
  • the final fraction of the present invention is extremely stable against protein denaturants, magnesium chloride, and calcium chloride, but has the specificity that manganese chloride greatly reduces the inhibitory activity on sudden mutation. It was confirmed that it was provided. -As described above, in short, the final fraction of the present invention has a strong aniline group and a peak of an absorption wavelength in the range of 280 w to 300 as apparent from the above-mentioned results.
  • the inhibitory activity is greatly reduced, but the inhibitory activity is not significantly reduced depending on the proteolytic agent. It is a mutagenic substance with a high inhibitory activity, which inhibits the mutagenicity of a mutagenic substance, particularly a mutagenic substance that expresses mutagenicity after metabolism.

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Description

明 細 書
ゴボゥジュース中よ 突然変異原性物質の突然穸異性を阻害する 因子の分離精製法
技術分野
本発明は、 ゴボウ中の、 突然変異原性物質の突然変異性を阻害する因 子およびその分離精製する方法に関する。
背景技術
最近、 発ガン性物質の殆んどは突然変異原性を示すことや、 突然変異 原性物質はガン原柱物質である可能性が強いこともよく知られている。 特に生活に身近な A _F - 2 ( 2 - ( 2 — フ リ ル） - 3 - （ 5 -ニ ト ロ -
2 - フ リ ル ）ァクリル了ミ ド）並びに焼肉や焼魚等のコゲ成分中に存在 する Trp - P - 1 ( 3 -ァミ ノ - 1 , 4 -ジメチル - 5 - ピリ ド〔 4
3 - ろ 〕 -イ ン ド一ル）並びに？ p— P— 2 ( 3 -ァミノ — 1 ，メチル - 5 -ピリ ド〔 4 ， 3 - ろ 〕イ ンドール）等が変異原性を示し、 動物 に発ガン性を誘発する物質であることが報告されている。
本発明者等は先にキャベツジュース中よ 突然変異原性物質の突然変 異性を阻害する因子を分離精製する方法を提案した （日本国特許公開公 報昭 5 4 - 1 2 2 7 1 5 )。
この方法は
(1) キャベツジュースを遠心する工程、
(2) その上清を超遠心する工程、
ί (3) その上清を陰イオン交換セル口一スと接蝕する工程、
(4) 陰ィ才ン交換セルロースに吸着し い画分に陽イオン交換セル ロースに適用する工程、
(5) 低塩濃度で溶出する活性画分を採取する工程、
(6) 該画分をさらに分子ふるいに吸着して精製する工程
とを含むことを特徵とする方法である。 かくして得られた最終画分は
2 8 0 wおよび 4 0 4 に特異的 ¾吸収スぺク トルを有し、 熱に安 定でタンパク分解酵素で失活する特性を有するヘム蛋白である。
このキャベツジュース中よ ]9分離精製した阻害因子は 2 p - P - 1 ( 3 —ァミ ノ — 1 ， 4 -ジメチル - 5丑 -ピリ ド〔 4 ， 3 — ろ 〕 —イ ン ドール） 、 T 一 P - 2 ( 3 —了ミ ノ - 1 -メチル - 5丑 - ピリ ド〔 4 ，
3 - & 〕イ ン ドール） を始め N ―ブチル - iV -ァセ トキシュ ト ロソ了ミ ン、 ソルビン酸と亜硝酸塩との反応生成物、 2 -アミ ノアントラセン、 ェチジゥムブ口マイ ド、 ト リブトファンやオル二チン等のアミノ酸のカ卩 熱分解産物等の代謝によ 突然変異原性を発現する各種突然変異原性物 質の突然変異原性を阻害することを認めている。
しかしるがら、 キャベツジュースからの最終画分は蛋白分解酵素の共 存下においては失活し、 又酸化染料（例えば 4 -二 ト 口 -オルト フエ二 レンジ了 ミ ン並びに 2 -ニ ト ロ -パラフエ二レンジ了ミン等）の如き代 謝るしに突然変異原性を発現する突然変異原性掬質の突然変異性を阻害 することができ ¾いのみ ¾らず、 かえって突然変異性を著しく増強 （促
ΟΜΡΙ V IPO 進）する欠点がある。
本発明者は先に c . B i o l , C h e m, 4 2 ( 6 ) 、 1 2 3 6〜 1 2 3 8頁、 1 9 7 8に、 キャベツ、 ブロッコリ、 シシトウガラシ、 ナ ス、 リ ンゴ、 ゴボウ、 エシャロッ ト、 ジンジャー、 ノヽ。ィナツプルおよび ミ ン トの葉のジュースを遠心して得られた上清は、 トリプトファンの熱 分解物の突然変異原性を阻害することを定性的に報告した。
これらの野菜および果物はいずれも代謝されて突然変異原性を発現す る物質による突然変異性を阻害する活性を示すが、 本発明者のその後の 研究によれば、 そのうち、 ゴボウから得られた精製された状態にある活 性画分のみが酸性染料の如き代謝なしに突然変異原性を発現する物質に よる突然変異性を阻害する優れた活性を示し、 極めて特異的る作用を有 することが明らかとされた。
また、 本発明者の研究によれば、 ゴボウと同様にキク科に属する植物 である、 伊 jえばシユンギク、 フキ、 レタスのジュース力 ら、 ゴボウのジ ユースからと同様にして得た水溶性物質もまた酸性染料の如き代謝 ¾し に突然変異原性を発現する物質による突然変異性を阻害する活性を示さ いことも明らかとされた。
るお、 上記文献には、 野菜および果物のジュースを遠心分離して得た 上清が開示されているにすぎず、 該上清液から活性成分を分離、 精製す る方法従って精製された状態にある該活性成分については記載も示唆も なされていない。 発明の開示
それ故、 本発明の目的は、 ゴボウが含有する突然変異原性阻害因子を 精製された状態で提供することにある。
本発明の他の目的は、 代謝なしに突然変異原性を発現する物質の突然 変異性を阻害する活性を有する突然変異原性阻害因子を精製された状態 で提供することにある。
本発明の更に他の目的は、 高められた温度で処理しても、 あるいは蛋 白質分解酵素で処理しても、 突然変異性を阻害する活性を実質的に低下 しるい突然変異原注阻害因子を精製された状態で提供することにある。
本発明の更に他の目的は、 上記の如き突然変異原性阻害因子をゴボウ から効率的に分離し且つ精製して取得する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的および利点は以下の説明から明らかと ¾ろう。
本発明によ] 3提供される、 ゴボウから取得される精製された状態にあ る活性画分は、 ゴボウに含有される水溶性物質であって、 陰イオン交換 セルローズに吸着されるが陽イオン交換セルローズに吸着されず、 且つ
2 8 0 n 〜 3 0 0 π mの範囲に吸収波長のピークを有する、 突然変異 性の阻害活性を有する、 ゴボウから取得される活性画分である。
また、 本発明によ！)提供される上記突然変異性阻害因子は、
(a) ゴボウジュースを遠心分離することによ 、 夾雑 ¾を除去する、
(b) 得られた上清にリ ン酸緩衝液を混合し、 この混合 ¾に水溶性の無接 酸のアル力リ金属塩又は了ンモニゥム塩を添加して塩析し、 その後沈
OI.IFI . Υν ?0 殿を分取する、
(c) その沈殿をリ ン酸緩衝液に溶解した後、 その溶液を透析する、
(め 透析液を限外^過して濃縮液を取出すか、 またはその濃縮液を凍結 乾燥によ！)粉末化する、
各工程を含むことを特徵とする方法によって、 ゴボウから分離し且つ精 製して取得することができる。
本発明においてゴボウとは、 キク科（ C o posi' ae ) ゴボウ属
[Arctium) M'f' ζ> -^-f c t ium L φφα znneyHi Ar c t %um Lappa L, といわれるものである。
本発明において、 該活性画分を分離精製する対象として用いられるゴ ボウはゴボウの根、 ゴボウの果実あるいはゴボウの茎、 葉等であってよ 。 従って、 ゴボウをこれらの各部分に分離せずに、 収獲しぇゴボウを そのまま用いることもできる。 本発明にお ては特にゴボウの根が好ま しく用いられる。 また、 ゴボウは生のままあるいは乾燥して用いること もできる。
本発明者の研究によれば、 本発明によ]?提供されるゴボウから取得さ れる該活性画分は、 その突然変異性の阻害活性が、 高められた温度例え ば約 1 0 0 で 1 5分間の処垤によっても実質的に低下せずあるいは蛋 白質を含有しているにもかかわらず蛋白質分解酵素による処理によって も実質的に低下しるいという優れた特性を備えていることが明らかにさ れた。
一〇 ?I また、 同様に該活性画分はその他の特徵としてマンガンイオンによ ]9 , 該阻害活性を大きく低下せしぅられるが、 マグネシウムあるいはカルシ ゥムイオンによっては該阻害活性が実質的に低下せしめられ い f生質を 有していることも明らかとされた。
本発明方法によ])、 ゴボウから該突然変異性阻害^質を分離、 精製す るに際しては、 先ずゴボウジュースを遠心分離することによ]?その内に 含まれる夾雑物を除去する。
ゴボウジュースは、 生のゴボウを水洗しフィルターを備えたジュ一サ —にかけて大部分の繊維質を除去した生ジュースとして取得するかある いは乾燥したゴボウの粉末を水あるいはリン酸緩衝液中に十分な時間必 要に応じ高められた温度下に懸濁させてもしくは擂漬機です]?つぶしつ つ製造することができる。 - 乾燥したゴボウの粉末はできるだけ細かい方がよくまたこの粉末を用 いるときには擂漬機です つぶしつつ通常、 約 2 0 °〜約 8 5 で、 約 2〜 2 4時間処理しジュースを製造するのが好ましい。
かくして製造されたゴボウジュースは遠心分難に付され夾雑物を除去 される。 遠心分離は 7 0 0 0〜 1 5, 0 0 0 Xひの通常の遠心分離であつ てよく、 また 1 0万〜 2 0万 の超遠心分離であってもよい。 また、 通常の遠心分離を行ったのち超遠心分離を行ってもよい。
通常の遠心分離は通常 3 0〜 6 0分行 われ、 それによ]?ジュース中 の鐵維質、 クロロブラス トあるいはミ トコンドリ了等が除去される。 ま た、 超遠心分離は通常 1〜 2時間行うのが好ましく、 これによ]?更にミ クロソームあるいはリボン一ム等が除去される。
ゴボウジュースから上記のようにして夾雑物を除去した上清に次いで リン酸緩衝溶液が添加される。ゴボウ粉末にリン酸緩衝溶液を加えてジュ ースを製造した場合には、 場合によ]?更にリン酸緩衝溶液を加え くて もよい。 この場合も、 本発明の範囲に包含されることは理解されるであ ろう。
リン酸緩衝溶液としては通常 丑約6. 5〜約7. 5の範囲のものが好ま しく用いられる。
また、 リン酸緩衝溶液としては通常約 1〜 2モルの濃度のものを用い るのが便利である。
かかるリ ン酸緩衝溶液は、 上清に対し1/ a o 1 00 容量部で添加する のが好ましい。
リン酸緩衝溶液は、 リン酸緩衝溶液を添加された上清中においてリン 酸イオンの濃度が約 1 0〜約 4 0 0 Mと るように添加するのがよい c
得られた溶液に対し次 で塩析のために添加される塩は、 水溶性の無 機酸のアルカリ金属塩又はアンモニゥム塩である。 無機酸としては、 例 えば炭酸、 硫酸、 塩酸あるいはリン酸等の鉱酸があげられる。 かかる無 機酸の了ルカリ金属塩又はアンモニゥム塩としては、 好ましくは炭酸力 リ ウム、 硫酸アンモニゥム、 硫酸ナ ト リ ウム、 リ ン酸カリ ウム等が用い られる。
O FI
T.v IPO
， >* 水溶性の無機酸のアルカリ金属塩又はアンモニゥム塩の使用量は上清- リ ン酸緩衝液混合物の容量を基準として、 約 3 0〜8 0重量 が好ましい。 かくして塩析された、 沈殿を含む溶液はついで該沈殿を分離せしめられる c 分離には種々の手段例えば萨過あるいは遠心分離等が用いられる。 過は常 圧、 減圧あるいは加圧下に行うことができる。 遠心分離によ]?分齄するのが 望ましい。 遠心分離は上記の如き条件下に通常いわゆる通常の遠心分離によ 行なわれる。
分離して取得された沈殿物は、 次いでリン酸緩衝溶液（ ί?丑 6. 5〜 7. 5 ) に溶解せしめられ、 溶液として透析に付される。 リ ン酸緩衝溶液は通常沈殿 物 1 ^当 ]5約 5〜1 0 の割合で用いるのが望ましい。 透析は、 水あるいは リン酸緩衝液等によって行うことができるが、 通常はリン酸緩衝液によって 行うことが好ましい。
透析によ かくして低分子量の物質を除去せしめられた透析溶液は、 次い で限外 過に付される。
透析溶液は限外 過によって濃縮される。 限外泸過は透析が1 Ζ3〜 5 容 量に至るまで続けるのが望ましい。
限外萨過に使用し得るフィ ルタ一としては、 ΡΪ½" - 3 0、 ΧΜ - 5 0 .
Μ - 1 0 0、 ΧΜ - 3 0 0 (了ミコン社製）等を挙げることができるが、 分 子量約 3 0 0, 0 0 0以下の分子を通過する限外 過膜の 3 0 0は特に 好ましい。
かくして限外泸過を受けた濃縮液は本発明の活性画分を構成する。 本発明 ο，· '？1 によれば、 かかる濃縮液は、 更に必要に応じ通常の凍結乾燥に付され粉末と することもできる。
凍結乾燥に付す場合には、 その前に濃縮液に対し約 3〜 5倍容量の水を加 えて再度限外泸過に付すことが望ましい。
本発明によ 提供される濃縮液又は粉末状の形態にある、 精製された状態 の、 突然変異阻害因子を含む活性画分は、 そのままであるいは適宜他の薬学 的に許容され得る担体又は了ジュバントと一緒にされて人間又は入間以外の 他の動物に投与される。 .
本発明によれば、 それ故、 本発明の活性画 を適宜薬学的に許容され得る 担体又はアジュバントと一緒に含んで成る薬学的組成物又は該組成物から成 る薬剤が同様に提供される。
担体又は了ジュバントとしては通常当業者に周知の例えば賦形剤、 滑剤、 崩壌剤、 カプセル用被包剤等をあげることができる。
薬剤の形態としては、 例えば錠剤、 顆粒剤、 糖衣剤、 粉剤、 シロ ップ、 溶 液又はカプセル剤等が用いられる。
本発明の活性画分は、 上記形態のものにあっては経口投与によ 投与する のが好ましい。 また、 本発明の活性画分は、 外用投与（良膚塗布） に用いる こともできる。 この場合には、 軟膏例えば油溶性基材例えばワックスを用い た軟膏、 水含有ェマルジヨ ン、 水溶液等の形態で用いるのが好ましい。
本発明によれば、 本発明の活性画分の薬学的有効量を、 必要によ )薬学的 に許容され得る担体又は了ジュバントと一緒に、 突然変異原性物質によ 突 然変異を誘発される恐れのある動物に対し投与し、 該動物に突然変異が生じ るのを予防する方法が提供される。 投与量は医者あるいは薬剤士等の専門家 が投与すべき対象動物に対し適宜決めることができるが、 通常約 1 0 0 〜 2. 5 ？ 体重/日等である。
本発明の活性画分は食物として食せられているゴボウが含有する成分であ ることから理解されるとお]?その毒性は殆んど ¾い。
突然変異を誘発される恐れのある動物とは、 例えば突然変異原性物質を摂 取または該物質に接触するかあるいは摂取または接触することが予定される 動物等をいう。 .
本発明方法によ ]3提供される、 凍結乾燥によ 得られた活性画分は、 何れ の形態の薬剤とするにも便利であ ] また、 水溶性でかつ安定 ¾無臭、 褐色 の粉末であって、 保存安定性が特に優れている。
本発明の活性画分が示す突然変異阻害活性は、 本発明者の研究によれば、 突然変異原性物質によって発現される突然変異性を該物質に直接作用するよ うに該活性画分が働いて阻害するように、 発現されると考えられた。
それ故、 本発明の活性画分は、 特に突然変異原性物質を摂取する可能性の ある動物あるいは明らかに摂取した動物に対し、 突然変異性が発現されない ように予防的に使用することが望ましい。
以下、 実施例によ]?、 本発明方法による活性画分の分齄 ·精製する方法並 びに本発明の活性画分の突然変異阻害活性およびその他の特性を更に詳細に 説明する。
OMPI CIPO 実 施 例
(1) ゴボウからの活性画分の分離、 精製：
ゴボウ （ 5 0 0 0 ） を水洗後、 ジューサー （東芝 - 5 4 0 A )によ 破砕し、 約 3 4 0 0 のゴボウジュースを得た。
このジュース 1 4 0 Q を 9 0 0 0 X Gで 3 0分遠心分離し、 褐色の透明 上清 2 2 0 0 を得た。 '
この上清に 1 Mのリン酸緩衝液（ ？)丑6. 8 ) を 1 Z 2 0量（容量）を混合 した。 次にこの混合物 1 1 0 にその重量に対して 8 0 %量の硫安を添加 して塩析を行なった。 その後この塩析混合物を 9 0 0 0 X Gで 1 5分間遠心 分離して、 沈殿物を 8 0 ^得た。
この沈殿物 6 0 ^を 5 0 Mリン酸緩衝液（ p ? 6. 8 )を用いて溶解し、 全量を 6 0 0 とした。 '
この液を 4 °Cにおいて前記のリン酸緩衝液（ p丑6. 8 )にて透析し、 透析 液 6 9 6 /^を得た。
次にこの透析液の 4 6 4 をメンブランフィルター - 3 0 0 (アミ コ ン社製） を用いて限外^過して 1 Z 3容量に饞縮した。 この濃縮液に 5 0 mMリン酸緩衝液（ 6. 8 ) を加えて全量を 2 0 0 として、 再び上記と 同じフィルターを用いて限外萨過して濃縮をし、 その饞縮液 1 4 0 m£を得た c このうちの 7 0 /^の限外 過嬝縮液を凍結乾燥器（ セント ラル科学社製、 D Z - 1 - 5 4 ) を用いて - 5 4 °Cで、 2 4時間、 凍結乾燥を行 い、 乾 燥粉末 4 5 0 を得た。 ' (2) 活性画分の蛋白質含量
この凍結乾燥粉末の 1 5 を水 3 0 に溶解した水溶液について、 口一 リ一法で蛋白定量した結果、 溶液 1； ^当]?の蛋白量は 3. 2 Wであ]?従って凍 結乾燥粉末中の総蛋白質含有量は 6 4重量 であることが判明した。
(3) 活性画分の紫外線吸収特性 ― - 凍結乾燥粉末の水溶液について測定した紫外線吸収曲線を第 1図に示した。 第 1図において、 縦軸は吸光度であ ]9、 横軸は波長（ w w )を示している。
本発明の活牲画分は第 1図から明らかなとお 、 2 8 0 n 〜 3 0 0 n m の範囲に吸収波長のピーク （極大波長約 2 9 0 n m ) を有している。
(4) 活性画分の陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂に対する吸着性 上記 (1)の方法で得られた濃縮液 2 Ί m£を D E A E -セルローズ（陰イオン 交換セルローズ）のカラムクロマトに送入した。 その条件はカラムサイズ
2. 5 X 1 2 、 溶出速度 3 ら Z hr、 溶出量 1 0 ノ試験管とした。 溶出 緩衝液は 5 0 M(Dリン酸緩衝液に溶解した 5 0 の塩化力リゥムから順 次濃度を上げて2 Mの塩化カリゥムまでの範囲内で溶出を行って前記吸着性 を調べえ。
その結果、 -セルローズカラムに吸着せずに溶出した画分には阻 害活性を示す画分は検出され ¾かった。
又、 同様に上記濃縮液 Ί m&を C M -セル π—ズ（陽ィ才ン交換セル π—ズ） のカラムクロマトに送入した。 その条件はカラムサイズ 2. 5 X 7 CTZ、 溶出速 度4 ん？ '溶出量5. 8 ノ試^管とした。 溶出緩衝液は 5 O Mリ ン酸 一〇MPI 緩衝液に溶解した 5 0 の塩化力リゥムから願次濃度を上げて 0.1 Mの塩 化カリゥムまでの範囲内で溶出を行って、 前記吸着性を調べた。
その結果、 CM-セルローズカラムに吸着せず、 全て溶出した。 その溶出 曲線は添付図面の第 2図の通 である。 尙、 溶出した画分について後述する 阻害効果試験を行った結果、 突然変異阻害率は、 8 8 %を示した。 これは後 述する第 2表の乾燥粉末の水溶液（乾燥粉末を 1 ^ で含む） の量が 500 Λ^Ζプレートの突然変異阻害率（ 8 7.4 ） とほぼ一致した。
この変異阻害率の結果からも本発明の活性画分は強いァニオン性基を具備 した高分子電解質であることを認めた。
(5) 活性画分の阻害効果
(a) 阻害効果試験は、 ジメチルスルフ才キシ ド 0.0 2 に溶解した当該 突然変異原性物質に前述の (1)の方法の各工程で得られた画分又は当該最終画 分（本発明の活性画分） 0. を加え 3 7 U 3 0分間反応させた。 尙、 対照 として各分画試料の代])にリン酸緩衝液を 0. 5 に混合し同様の反応を行 ¾ つた。
その後該反応系中を無菌化するため、 1 0 0 cにて 1 0分間加熱処理した。 加熱処理後、 ソフ 了力-— { 0. 6 ^>Dif c o - Agar ) 3 を力 IIえ、 サルモ ネラ 8 ( ヒスチジン要求性） の菌液 0. 1 を加えて、 後記の選択用寒 天培地へ流し、 3 7 C 2日間培養し、 ヒ スチジン非要求性の復帰変異コロニ 一数を数える。
又、 前記突然変異原性物質が、 代謝によ]?初めて突然変異性を発現するも の （例えば 2 -アミノアント ラセン、 ェチジゥムブロマイ ド、 Ττ - Ρ - 1 並びに TVp- 3 - 2等） を用いた場合については、 前記方法において後述の 如く調整して得られる S - 9 a;を前記ソフトァガーへ 0. 3 追加する外は 同様にして調べた。 S - 9 m¾; ±次の様にして調製した。 即ち 5 系ラット を用い、 _PC によ！)薬物代謝酵素活性を高めた肝ホモジネートを得た後、 この肝ホモジネ一トを遠心分離処理によ 肝ミク口ゾーム画分（ S - 9 ) を 得る。 - 得られた肝ミク口ゾームを以下の組成から る無機塩を加えることによつ て該 S - 9m ¾を調製した。
S - 9に加えられる無機塩：
肝ミクロゾーム 3 m&
0. 2 5 リン酸緩衝液 4 mi
0.1 6M MaCし 0.5 τπ£
0. 6 6M KC I 0.5 n
0.0 5 G - e - P 1.0 τη£
0. 0 4 NADP
選択用寒天培地
MM { X 2 0 5 0 m£
4 Q Glue os e 0 mi
0.8 Dzj c o nutrient ろ roiん 0 m£
ビ才チン （ 1 0 0 ί f/m&) m& 了ガー 1 5
蒸留水 9 3 0 m£
MM ( Z 2 0 )の組成
( 4 )2 SOi 2.0
KE2PO^ 2 0.0 ^
MgSO, - Ί E20 0.2 ^
クェン酸ナ ト リ ウム 1. 0 デ。
KOH て φΗ 7. 0に調整
阻害効果の活性は、 上記の如くして行った阻害効果試験によって突然変異 原性物質について求めた、 突然変異性を 5 0ダ。阻害するに必要 画分の量 . i m£ ) を 1単位とし、 該画分の単位容量 当]?に含まれる蛋白質量（ を基準にして表示した。 '
(&) 2 -ニ ト ロ - : P -フエ二レンジ了ミ ン （ 2 0 0 ί ? /プレー ト ）に 対する突然変異性阻害効果
前述の (1)の方法の各工程で得られた画分の阻害効果の活性比を第 1表に示 す。
Ο ΡΙ IFO 1表
単位 活性
( i ) ( mi ) 単位 )
9 0 0 0 X 上清液 0 0 3 7 0 0 4. 0 0. 8 9 透机液 2 0 0 4 0 0 0 4. 2 4. 8 限外^過濃縮液 7 0 9 7 0 0 7. 5 1 & 5 乾燥粉末の水溶液 5 0 9 3 0 0 1 8. 6
また、 乾燥粉末（本発明の活性画分）の突然変異阻害効果に及ぼす濃度依 存性を第 2表に示す。
第 2表
、
✓·、 i;i 9
2 一二トロ- ラフ ェニレン 乾燥粉末の水溶液の:
ジ了ミンの- V— ( A ノブレ一ト ） fo )
h )
8 0 5 0 0 8 7. 4
8 0 3 0 0 8 5.
8 0 0 0 7 9. 4
8 0 2 2. 3
8 0
¾ 1 ：乾燥粉末の水溶液とは凍結乾燥粉末を 1 に ¾る様に水に溶解し
た水溶液である。 2 ：突然変異阻害率 = X 1 0 0
a一 c
C FI a ： リ ン酸緩衝液で処理した 2 -ニ ト 口パラフエ二レンジ了 ミ ンの復帰変異 ロ二一数 b ：本発明の活性画分で処理した 2 -ニ ト ロパラフエ二レンジァミ ンの復帰 変異コロニ一数 c ：自然復帰変異コロニー数 以上の結果から明らかるように、 本発明の当該画分（限外泸過濃縮液及び
凍結乾燥粉末）の阻害活性は、 9 0 0 0 X G上清（対照）の阻害活性の約 2 0倍に、 また塩析後透析液の約 4倍に高められ（第 1表）、 そして本発明 の当該最終画分はその濃度依存性を示す（第 2表）力、 いずれにしても 2 - ニ ト ロパラフエ二レンジ了 ミ ンに対して良好な阻害効果を示した。 本発明の活性画分（最終画分）が種々の突然変異原性物質による突然変異 性に及ぼす阻害効果を第 3表に示した。
.第 3 突然変異原性物質 S - 9 ¾ cc添方口の有^
μ ^ /プレート） 有（ 十）、 無（ 一 ）
2 —二 トロ 。ラフエ 8 0 8 9. 9 二レンジァミ ン
8 0 + 9 2. 5
4 一二 ト ロオルソフ 4 0 6 0. 7
ェニレン、ジ了ミ ン
4 0 + 5 6. 9 ェチジゥムブ口マイ 1 0 + 9 6. 5
ト、'
2 -了ミノ -了ントラセン 4 + 9 7. 8 Tr p - P - 1 0. 2 + 9 6. 1 Tr p - P - 2 0. 2 + 9 5. 5
G:.';?I , ' ' ' ' 第 3表の結果は本発明の活性画分の特に顕著 ¾阻害効果を示している。 す なわち、 前記文献に報告されている植物であるキャベツやプロッコリ一のジ ユース中に存在する阻害因子は、 代謝を経て突然変異性を発現する突然変異 原性物質（ ェチジゥムブロマイ ド、 2 -ァ ミノアンスラセン、 T - P - 1 Trp- P - 2 )のみに阻害劾果を示す反面、 代謝を経ずして突然変異性を発 現する酸化染料の一部（ 2 -ニ ト 口パラフエ二レンジ了ミ ン、 4 -ニ ト ロォ ルソフエ二レンジ了ミ ン等） には阻害効果を示さ ¾いの.に対し、 本発明の当 該画分は、 前記何れの突然変異原性物質に対しても、 第 3表の如き顕著な阻 害効杲を発現し、 その作用効果の特異性は著しい。
(6) 活性画分の耐熱性
次に、 本発明の最終画分の耐熱性について調べた。 即ち、 本発明の最終画 分（凍結乾燥粉末の水溶液） を 1 0 0 C 1 5分間還流冷却下に加熱処理した ものと、 加熱処理をし い該最終画分（水溶液）の、 各 5 0 0 m£を第 4表に 示す濃度の各突然変異原性^質と混合し 3 で 3 0分間反応せしめた。
次に前述 (5)と同様に阻害効果試験を行った。 その結杲を第 4表に示す。
第 4表 プレート当 の突然変異原 最終画分
性物質の濃度（ ^ ?/プレ
—ト） ( 5 0 0 プレー ト 5¾
2 —二 ト ロ 一ノ、フ 加熱処理 し 8 8.6
フエ二レンジ了 ミ 2 0 0
ン 加熱処理有 8 6.1
2一了ミ ノ了ン ト 加熱処理 ¾し 9 6.8
ラセン 4
加熱処理有 9 5.5 ェチジゥムブロマ 加熱処理なし 9 5.5
ィ ト"
加熱処理有 9 3.5
Trp- P - 0.2 加熱処理る'し 9 6.8 加熱処理有 9 6.2
Trp- P - 2 0.2 加熱処理 し 9 5.8 加熱処理有 9 6.0
その結果、 本発明の最終画分は加熱しても安定で且つ失活せず、 しかも良 好 阻害効果を発現することが確認された。 ' (7) 活性画分の蛋白質分解酵素に対する安定性 又、 本発明の最終画分（凍結乾燥粉末の水溶液）の蛋白分解薛素に対する 安定性について調べた。 即ち、 蛋白分解薛素として D ase 1 ( を分解する酵素） RNase ( ^ Aを分解する酵素）並びに/ oT zse (各種蛋白質を分解する酵素、 ΟΓΛΡΪ
W1P 科研製品） を用い且つ本発明の最終画分に対して、 最終濃度が 2 Q μ ? /m& になる様に調製し、 3 7 C 3 0分間反応させた。 次に、 この反応物の各 5 0 0 を第 5表に示す濃度、 各突然変異原性物 質と混合し、 そして3 で 3 0分間反応せしめた。 反応後、 前述 )と同様 に阻害効杲試験を行った。 一 その結杲を第 5表に示す。 5
木
突然変異原性物質 突然変異阻害率（ ° )
A B C D
2 —'二 ト ロ一ハ フ 2 0 0 8 6.6 8 4.7 8 3.9 8 7.0
フエ二レンジ了 ミ
ン
2一了ミノ了ン ト 9 6.3 9 4. 9 3.2 9 6.7
ラセン ェチジゥムフロマ 0 9 5. 9 3. 9 2.0 9 5.
ィ K
Ττφ-Ρ - 0.2 9 6.7 9 4.6 9 3.7 9 7.
Ττ -Ρ一 2 0.2 9 5.2 9 7.3 9 1.8 9 5.6
* ：最終画分で処理した突然変異原性物質を用いた場合 B ： DNase 1で処理した最終画分によって処理された突然変異原性物質 を用いた場合
C ： RNaseで処理した最終画分によって処理された突然変異原性物質を 用いた場合
C PI D ： Pr cmct s eで処理した最終画分によって処理された突然変異原性物質 を用いた場合
その結果、 本発明の最終画分は蛋白質分解酵素に対しても極めて安定で且 っ失活せず、 しかも良好な阻害効杲を発現することが確認された。
(8) 活性画分の多価金属イオン又は蛋白質変性剤に対する安定性 更に、 本発明の最終画分の各種多価金属イオン又は蛋白変性剤に対する安 定性について調べた。
即ち、 塩化マグネシウム、 塩化マンガン、 塩化カルシウムのそれぞれを、 本発明の最終画分（凍結乾燥粉末の水溶液） に対して得られる溶液中の濃度 (最終濃度）が 1 0 になる様に混合溶解し、 又蛋白質変性剤である^ の場合は 2. 5 Mとし、 同様に蛋白質変性剤である ( ドデシルべ ンゼンスルフォン酸ナト リ ウム ） の場合は 0. 1 に る様にそれぞれ混合溶 解した。 これらの各溶液を 3 7 °Cで 3 0分間処理した。
その後、 それらの反応混合物 5 0 0 ί を第 6表に示す濃度の各突然変異 原性物質と混合し、 そして 3 7 C 3 0分間反応した。 反応後前述 (5)と同様に 阻害効果試験を行った。
その結果を第 6表に示す。 第 6表
氺
突然変異原性物質 ： ^ )
μ ^ /プレート A Mg++ Ca-H- ΕΠΓΑ SDS
2 一二 ト ロ ーノ ラ
フエ二レンジ了ミ 2 0 0 8 2.8 8 4.9 1 2.0 8 0.3 8 4.0 8 2.3
ン
2 ーァミ ノ —アン 4 9 5.2 9 4.1 8.5 9 0.1 9 2.0 9 45
ト ラセン ェチシゥムブロマ 9 3.8 9 2.1 0.2 9 41 9 3.2 9 3.5
ィ ト、、
Trv -P-l 0. 2 9 5.3 9 6.7 9.8 9 3.0 9 2.3 9 6.0 Trp-P-2 0. 2 9 6.2 9 5.1 8.7 9 40 9 5.7 9 3.2
*注）
A：最終画分で処理した突然変異原性物質を用いた場合
M g + . +：塩化マグネシウムで処理した最終画分によって処理された突然変 異原性物質を用いた場合 M n + +：塩化マンガンで処理した最終画分によって処理された突然変異原 性物質を用いた場合 C a + + ：塩化カルシウムで処理した最終画分によって処理された突然変異 原性物質を用いた場合 E D T A： ^ Γ Aで処理した最終画分によって処理された突然変異原性物 質を用いた場合
S D S ： で^理した最終画分によって処理された突然変異原性物質
VvIPO- を用いた場合
その結果、 本発明の最終画分は蛋白変性剤や、 塩化マグネシウム、 塩化力 ルシゥムに対しては極めて安定ではあるが、 塩化マンガンによって、 突然変 異性の阻害活性を大きく低下されるという特異性を具備することが確認され た。 - 以上、 要するに本発明の最終画分は、 前述の諸結果から明らか ように、 強 ァニ才ン性基を有し、 且つ 2 8 0 w 〜 3 0 0 の範囲に吸収波長の ピークを有する高分子電解質であ ]9、 そして、 マンガンイオンによ]?阻害活 性を大きく低下されるが蛋白質分解剤によっては阻害活';生が実質的に低下さ れず、 熱に著しく安定で多くの突然変異原性物質特に代謝 しに突然変異性 を発現する突然変異原性物質の突然変異性を阻害する、 阻害活性の高い、 突 然変異性阻害物質である。
- Ο

Claims

請 求 の 範 囲
1. ゴボウに含有される水溶性物質であって、 陰イオン交換セルローズに 吸着されるが陽イ オン交換セルローズに吸着されず且つ2 8 0 m~ 3 0 0 n の範園に吸収波長のピークを有する、 突然変異性の阻害活性を有する、 ゴボウから取得される活性画分。
2. 該突然変異性の阻害活性が約 1 0 0 Cで 1 5分間の熱処理によって実 質的に低下しない請求の範囲第 1項に記載の該活牲画分。
3. 該突然変異性の阻害活性が蛋白質分解酵素による処理によって実質的 に低下しない請求の範囲第 1項に記載の該活性画分。
4. 該突然変異性の阻害活性がマンガンイオンによ]?大きく低下する請求 の範囲第 1項に記載の該活性画分。
5. 該突然変異性が生体内における代謝を受けずに突然変異性を発現する 突然変異原性物質による請求の範囲第 1項〜第 4項の ずれかの記載による 活性画分。
6. 突然変異原性物質が 2 -ニ ト ロ - : p -フエ二レンジァ ミ ン又は 4 - ニ トロ - 0 -フエ二レンジ了 ミ ンである請求の範囲第 5項に記载の活性画分。
7. ゴボウに含有される水溶性物質であって、 陰イオン交換セルローズに 吸着されるが陽イオン交換樹脂に吸着されず且つ 2 8 0 w 〜 3 0 0 ?t の 範囲に吸収波長のピークを有する、 突然変異性の阻害活性を有する、 ゴボウ から取得される活性画分を、 必要によ]?薬学的に許容され得る担体又は了ジ ュ， ントとー鍺に含有して成る、 突然変異原性物質の突然変異性を阻害する
U ?。 .. ための薬学的組成物。
8. 突然穸異 性物質によ 突然変異を誘発される恐れのある動物に対し、 ゴボウに含有される水溶性物質であって、 陰イオン交換セルローズに吸着さ れるが、 陽イオン交換樹脂に吸着されず且つ 2 8 0 7i 〜 3 0 0 Ti の範囲 に吸収波長のピークを有する、 突然変異性の阻害活性を有する、 ゴボウから 取得される活性画分の薬学的 有効量を、 必要によ])薬学的に許容され得る 担体又はアジュバン トと一緒に投与することを特徵とする、 該動物に突然変 異が生じるのを予防する方法。
9. ( ) ゴボウジュースを遠心分離することによ ]9、 夾雑物を除去する.、 (ろ） 得られた上清にリ ン酸緩衝液を混合し、 この混合物に水溶性の無 機酸のアル力リ金属塩又はアンモニゥム塩を添加して塩析し、 その 後沈殿を分取する、
(c) その沈殿をリ ン酸緩衝液に溶解した後、 その溶液を透析する、
( ) 透析液を限外泸過して濃縮液を取出すか、 Yたはその濃縮液を凍. 結乾燥によ])粉末化する、
各工程を含むことを特徵とする、 陰イオン交換セルローズに吸着するが陽ィ オン交換セルローズに吸着せず、 2 8 0 % m〜 3 0 0 % の範囲に吸収波長 のピークを有し、 且つその突然変異の阻害活性がマンガンイオンによ])大き く低下するが、 1 0 0 Cで 1 5分間の加熱処理および蛋白分解酵素による処 理によって実質的に低下しない、 該突然変異性阻害因子を分難し且つ精製す
1 0. リ ン酸緩衝液が、 ゴボウジュースを遠心分離して夾雑物を除ました 後の上清に対して 1 2 0〜 1 1 0 0容量混合される、 請求の範囲第 9項 に記載の方法。
1 1. 水溶性の無機酸のアンモニゥム塩が、 硫酸アンモユウムである請求 の範囲第 7項記載の方法。
1 2. 水溶性の無機酸のアル力 リ金属塩又はアンモニゥム塩が上清とリ ン 酸緩衝液の混合物の重量に対して、 約 3 0〜 8 0重量 添加される請求の範 囲第 9項記載の方法。
1 3. 塩析後分取した沈殿が、 その重量 1 ^当 5〜 1 0 の割合のリン 酸緩衝液に溶解される請求の範囲第 9項記載の方法。
1 4. 透析が、 リ ン酸緩衝液によって行なわれる請求の範囲第 9項記載の
1 5. 透析液が、 限外 過によ その1 Λ 1 容量にるるまで濃縮され る請求の範囲第 9項記載の方法。
V； , ••i. O
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