JPS5942657B2 - ゴボウジュ−スよりアニオン性高分子電解物質を分離精製する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ゴボウジユース中よりアニオン性高分子電解
質物質を分離精製する方法に関する。

該アニオン性高分子電解質物質は突然変異原性を有５
する物質の突然変異性を阻害する活性を有する有用な物
質である。Ｎ−ブチルーＮアセトキシメチルニトロソア
ミン、ゾルピン酸と亜硝酸との反応生成物２−アミノア
ントラセン、エチジウムブロマイド、トリフ１０ トフ
アンやオルニチン等のアミノ酸の加熱分解産物などが突
然変異原性物質であることは知られている。

従来自然界にもサルノコシカケ、ヒラタケ、シイタケ等
制ガン効果があるといわれているものが１５いくつかあ
り、このほかにも未知の制ガン作用を有するものがある
と考えられる。

最近、発ガン性物質の殆んどは突然変異原性を示すこと
や、突然変異原性物質はガン原性物質である可能性が強
いこともよく知られている。特に生活に身近なＡＦ２０
−２並びに焼肉や焼魚等のコゲ成分中に存在するＴにｐ
−Ｐ−１（３−アミノー１、４−ジメチルー５Ｈ−ピリ
ド〔４、３−ｂ〕−インドール）等が変異原性を示し、
動物に発ガン性を誘発する物質であることが報告されて
いる。２５最近、ゴボウジユースを遠心分離して得られ
た上清が、前記アミノ酸分解産物の突然変異原性を阻害
することが、報告されているがその阻害活性は低く、満
足し得るものではない。

本発明者等は、ゴボウジユース中に存在する突３０然変
異性阻害活性を有する物質を高純度で精製分離する方法
を開発すべく鋭意研究した結果、本発明に到達したもの
である。

本発明方法により得られた分離精製物は、本発明者の研
究によれは、マンガンイオンにより失活し、陰イオン交
換樹脂に３５吸着するが陽イオン交換樹脂に吸着せずか
つ２８０ｎｍに最大吸収波長を有するアニオン性高分子
電解質物質であることが明らかにされ、しかも多くの突
然変異原性物質を阻害しかつ阻害活性の高い突然変異性
阻害活性を有することが明らかにされた。すなわち、本
発明は、ゴボウジユースを遠心分離及び／又は超遠心分
離し、生成した上清にリン酸緩衝液を混合し、この混合
液に無機酸の水溶性アルカリ金属塩又（まアンモニウム
塩を添加して塩析し次いで遠心分離し、分離した沈殿物
をリン酸緩衝液に溶解し、この癖液を水又はリン酸緩衝
液で透析し、生成した透析液を限外Ｆ過に付し、そして
生成した濃縮液を取出すか或（１その濃縮液を凍結乾燥
することを特徴とする、マンガンイオンにより失活し、
陰イオン交換樹脂に吸着するが陽イオン交換樹脂に吸着
せず、かつ２８０ｎｍに極大吸収波長を有するアニオン
性高分子電解質物質を分離精製する方法である。

本発明によれば、ゴボウジユースはゴボウを水洗し次い
でジユーザーにかけてジユーズとする方法で製造するこ
とができる。

以下本発明方法の工程を順を追つて説明する。ゴボウジ
ユースの遠心分離（は通常７．０００〜１５．０００Ｘ
Ｇで３０〜６０分間行うことが好ましくまた超遠心分離
（１１０万〜２０万×Ｇで１〜２時間行なうことが好ま
しい。

ゴボウジユースの遠心分離及び／又は超遠心分離により
生成した上清に（はリン酸緩衝液が混合される。その量
は、通常上清を基準として１／２０〜１／１００容量の
範囲内である。リン酸緩衝液としては、通常濃度が１〜
２モル、ＰＨが６。５〜７．０のものが用いられる。

無磯酸の水溶性アルカリ金属塩又（はアンモニウム塩と
しては、例えば炭酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸
テトリウム、リン酸カリウム等が好ましく用いられる。

無機酸の水溶性アルカリ金属塩又はアンモニウム塩は上
清とリン酸緩衝液との上記混合物を基準として、好まし
く（ま３０〜８０重量％の量で用いられる。

遠心分離により分離した沈殿物を溶解するために使用す
るリン酸緩衝液の量は、通常沈殿物の重量を基準として
５〜１０倍量である。

得られた溶液は水又はリン酸緩衝液で、通常の透析操洋
により透析される３、生成した透析液の限外済過に使用
し得るフイルタ一としては、ＰＭ−３０，ＸＭ−５０，
ＸＭ一１００，ＸＭ−３００（アミコン社製）等を挙げ
ることができる。

これらのうちＸＭ−３００（１特に好ましく用いられる
。本発明の方法によれば、本発明方法の目的物は最終画
分の限外淵過濃縮液としてあるい（まそれを次いで凍結
乾燥した凍結乾燥粉末として得られる。

本発明の目的物（ま、何れも同様の安定性を有しかつ同
様の良好な突然変異性阻害効果を発揮する。液状の製剤
製品には限外沢過濃縮液や凍結乾燥粉末の水溶液が用い
られまた粉末状の製品や顆粒状、錠剤等の成型製品に（
は凍結乾燥粉末が用いられる。凍結乾燥粉末（は何れの
形態の製品にも適用しやすくより好ましい。本発明の方
法によつて得られる目的物は、本発明者の研究によれば
、熱に対し著しく安定で、マンガンイオンにより失活す
るアニオン性高分子電解質物質であることが明らかにさ
れ、またこの物質は突然変異性阻害活性高くしかも種々
の突然変異原性物質に対してその突然変異性を顕著に阻
害し得る広いスペタトルを持つことが明らかにされた。

以下、実施例によつて本発明を更に詳細に説明する。

実施例 １ （１）ゴボウ（２．５００９）を水洗後、ジユーザ（東
芝ＪＣ−５４０Ａ）により破砕し、約１７００ｍ１のゴ
ボウジユースを得た。

このジユーズ１４００ｍ１を９０００×Ｇで３０分間遠
心分離し、褐色の透明な上清１１００ｍ１を得た。

この上清に１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＨ６．８）を１／２
０量（容量）を混合した。

この混合物１１００ｍ１にその重量に対して８０（：Ｆ
ｔ）量の硫安を添加して塩析を行なつた。この塩析混合
物を９０００×Ｇで１．５分間遠心分離し、沈殿物８０
９を得た。この沈殿物２０９を５０ｍＭリン酸緩衝液（
ＰＨ６．８）に溶解した（全量２００ｍ００この溶液を
４℃において前記の緩衝液にて透析し、透析液２３２ｍ
１を得た。

次にこの透析液の２３２ｍ１をメンブランフイルタ一Ｘ
Ｍ−３００（アミコン社製）を用いて限外淵過して濃縮
した。

１／３量に濃縮後この濃縮液に５０ｍＭリン酸緩衝液を
加えて全量を２００ｍｌとして、再び限外淵過により濃
縮し、上清７０ｍｌを得た。

得られた７０ｍｌの限外済過濃縮液を凍結乾燥器（セン
トラル科学社製、ＦＤＸ−１−５４）を用いて−５４゜
Ｃで、２４時間、凍結乾燥を行ない、乾燥紛末４５０ｍ
ｌを得た。

（２）上記乾燥紛末について下記の実験を行つた。

ａ）上記乾燥紛末を水に溶解し１２η／ｍｌの水溶液（
以下最終画分という）を準備した。この最終画分を用い
、突然変異性阻害活性を調べた。突然変異性阻害活性は
次のようにして求めた。

ジメチルスルフオキシドＯ．０２ｍｌに突然変異原性物
質を溶解し、これに最終画分０．５ｍｌを加え３７℃３
０分間反応させた。その後該反応系中を無菌化するため
、１００℃にて１０分間加熱処理した。加熱処理後、ソ
フトアガー（０．６（ｆｆ）Ｄｉｆｃｏ−Ａｇａｒ）３
ｍ７を加えさらにサルモネラＴＡ９８（ヒスチジン要求
性）の菌液０．１Ｔ！１ｌを加えて、後記の選択用寒天
培地へ流し、３７℃で２日間培養し、ヒスチジン非要求
性の復帰変異コロニー数を数えた。対照として、最終画
分０．５ｍｌの代りにリン酸緩衝液を０．５ｍｌを用い
る他（ま上記と全く同様の手順を行なつた。

又、突然変異原性物質が代謝を受けた後（まじめて突然
変異性阻害活性を発現する、代謝活性化を必要とするも
の（例えば２−アミノアントラセン、エチジウムブロマ
イド、Ｔｒｐーｐ−１並びにＴｒｐ−ｐ−２等）につい
ての突然変異性阻害活性は、後述の如く調整して得られ
たＳ−９ｍｉｘを前記ソフトアガーへＯ．３ｍｌ追加し
て調べた。

ｓ−９ｍｌＸは次のようにして調製した。ＳＤ系ラツト
を用い、ＰＣＢにより薬物代謝酵素活性を高めた肝ホモ
ジネートを得た後、この肝ホモジネートを遠心分離処理
により肝ミクロゾーム画分（Ｓ一９）を得る。得られた
肝ミクロゾームを以下の組成からなる無磯塩を加えるこ
とによつて該Ｓ−９ｍｉｘを調製した。

ＫＯＨにてｐＨ７．０に調整 突然変異性阻害活性（Ｊ下記式で定義される突然変異阻
害率（％によつて表わされる。

ａ−ｂ 突然変異阻害率（％一？Ｘ１００ ９？ｒ 上記式中、 ａはリン酸緩衝液で処理した２−ニトロパラフエニレン
ジアミンの復帰変異コロニー数であり、ｃは最終画分で
処理した２−ニトロパラフエニレンジアミンの復帰変異
コロニー数であり、ｃ？１自然復帰変更コロニー数であ
る、 突然変異原性物質２−ニトロパラフエニレンジアミンに
対する前記最終画分の突然変異性阻害効果を第１表に示
した。

第１表 ２−ニトロパラフエニレンジアミン！こ 対する最終画分の突然変異性阻害効果 また各種の突然変異原性物質に対する前記最終画分の突
然変異性阻害効果を第２表に示した。

木 ＋はＳ−９ｍｉｘを添加したことを 示しており、 −はＳ−９ｍｉｘを添加しなかつた ことを示している。

第１表の結果は、本発明方法により得られた最終画分が
２−ニトロパラフエニレンジアミンに対して良好な突然
変異性阻害効果を有することを示している。

最近、キヤベツやプロツコリ一のジユーズ中に突然変異
性阻害物質が存在することが発見されたが、それらの物
質（は代謝活性化を必とする突然変異原性物質（エチジ
ウムプロマイド、２−アミノアンスラセン、Ｔｒｐ−ｐ
−１、Ｔｒｐ−Ｐ２）に対してのみ突然変異性阻害効果
を示し代謝活性を必要としない酸化染料の一部（２−ニ
トロパラフエニレンジアミン、２−ニトロオルソフエニ
レンジアミン等）に（は突然変異性阻害効果を示さない
が、本発明の上記最終画分（は、前記何れの突然変異原
性物質に対しても、第２表に示されている如く顕著な阻
害効果を発現し、その作用効果の特異性（ま著しい。

ｂ）次に、本発明の最終画分の耐熱性について調べた。

即ち、本発明の最終画分を１０『Ｃで１５分間還流下に
加熱処理したもの５００μｌを、第３表に示す濃度の各
突然変異原性物質と混合し３７℃３０分間反応した。以
下前述ａ）に記載したと同様にして阻害効果試験を行つ
た。

その結果を第３表に示した。なお、対照に（ま加熱処
理をしない最終画分を用いた。

その結果、本発明の最終画分は加熱しても安定で且つ失
活せず良好な突然変異性阻害効果を発現することがわか
つた。

ｃ）更に、本発明の最終画分の各種多価金属イオンに対
する安定性について調べた。

即ち、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウ
ムのそれぞれを、本発明の最終画分に対して最終濃度が
１０ｍＭになるように混合溶解し、３７℃で３０分間反
応させた。

その後、それらの反応混合物５００μｌを第４表に示す
濃度の各突然変異原性物質と混合し、そして３７℃３０
分間反応した。

反応後前記ａ）に記載したと同様にして阻害効果試験を
行つた。その結果を第４表に示した。

Ａ：最終画分で処理した突然変異原性物質Ｍｇ丑：塩化
マグネシウムと反応させた最終画分によつて処理された
突然変異原性物質を用いた場合、 丑：塩化マンガンと反応させた最終画分によつて処理さ
れた突然変異原性物質を 用いた場合、 Ｃａ丑：塩化カルシウムと反応させた最終画分によつて
処理された突然変異原性物質を用いた場合。

上記結果は、本発明の最終画分｛は塩化マグネシウムお
よび塩化カルシウムに対しては極めて安定ではあるが、
塩化マンガンによつては、突然変異性阻害活性が失活さ
れるという特異性を具備することを示している。

ｄ）本発明の最終画分の陰イオン交換樹脂及び陽イオン
交換樹脂に対する吸着性を調べて高分子電解質性（イオ
ン化性基）の有無を検討した。

最終画分２７ｍ１をＤＥＡＥ−セルローズカラムクロマ
トに送入した。

その条件（１カラムサイズ２．５×１２？、溶出速度３
６ａ／Ｈｒｌ溶出量は１０ｍ１／試１験管とした。また
、溶出緩衝液は５０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した５０
ｍＭの塩化カリウム〜２Ｍの塩化カリウムの範囲内で溶
出を行つた。その結果、ＤＥＡＥ−セルローズカラムに
吸着・せずに溶出した画分は検出されなかつた。

一方、本発明の最終画分７ｍ１をＣＭ−セルローズカラ
ムクロマトに送入した。その条件（はカラムサイズ２．
５×７ＣＴＩＬ１溶出速度（は４０ｍ１／Ｈｒ溶出量は
５．８ｍ１／試１験管とした。また溶出緩衝液は５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液に溶解した５０ｍＭの塩化カリウム〜０
．１Ｍの塩化カリウムの範囲内で溶出を行つた。その結
果、当該画分はＣＭ−セルローズカラムに吸着せず、全
て溶出した。

その溶出曲゛線（ま添付図面第１図の通りである。尚、
溶出した画分について前記阻害効果試験を行つた結果、
突然変異阻害率（１、８８％を示した。この値は第２表
の最終画分の量が５０？２／プレートの突然変異阻害率
の値（８７．４％）とほぼ一致した。この変異阻害率の
結果からも本発明の最終画分は強いアニオン性基を具備
した高分子電解質であることが明らかとなつた。

本発明の最終画分（１紫外部吸収を調べた結果２８０ｎ
ｍに極大吸収波長を有していることが確認された。

本発明の最終画分は、前述の諸結果から明らかなように
、強いアニオン性基を有し、マンガンイオンにより失活
し且つ２８０ｎｍに極大吸収波長を有する、アニオン性
高分子電解質物質である。

この物質（１、熱に著しく安定で多くの突然変異原性物
質の突然変異性を阻害し且つ阻害活性の高い、突然変異
性阻害物質である。

【図面の簡単な説明】

図面第１図はＣＭ−セルロースカラムクロマトグラフイ
一における溶出曲線図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ゴボウジユースを遠心分離及び／又は超遠心分離し
   、生成した上清にリン酸緩衝液を混合し、この混合液に
   無機酸の水溶性アルカリ金属塩又はアンモニウム塩を添
   加して塩析し次いで遠心分離し、分離した沈殿物をリン
   酸緩衝液に溶解し、この溶液を水又はリン酸緩衝液で透
   析し、生成した透析液を限外濾過に付し、そして生成し
   た濃縮液を取出すか或はその濃縮液を凍結乾燥すること
   を特徴とするマンガンイオンにより失活し、陰イオン交
   換樹脂に吸着するが陽イオン交換樹脂に吸着せず、かつ
   ２８０ｎｍに極大吸収波長を有するアニオン性高分子電
   解質物質を分離精製する方法。 ２ ゴボウジユースを遠心分離及び／又は超遠心分離し
   て生成した上清に対して、リン酸緩衝液を１／２０〜１
   ／１００容量混合する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３ 無機酸の水溶性アルカリ金属塩又はアンモニウム塩
   が、硫酸アンモニウム、炭酸カリウム、硫酸ナトリウム
   又はリン酸カリウムである特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ４ 遠心分離により分離した沈殿物を、その重量の５〜
   １０倍量のリン酸緩衝液に溶解する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。