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Anti-mutagener Faktor, Verfahren zu seiner
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Gewinnung und Arzneimittel
Die Erfindung betrifft
einen anti-mutagenen Faktor, ein Verfahren zur Gewinnung des Faktors aus Kohisaft,
sowie ein Arznei' mittel, das diesen anti-mutagenen Faktor enthält.
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Bekanntlich sind N-Butyl-N-acetoxymethyinitrosamine, Reaktionsprodukte
der Sorbinsäure mit salpetriger Säure, das 2-Aminoanthracen, das Athidiumbromid,
sowie Pyrolysate von Aminosäuren wie Tryptophan oder Ornithin, mutagen oder carcinogen
wirkende Substanzen.
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Erfindungsgemäß wurde überraschend gefunden, daß Kohl säfte einen
Faktor enthalten, der die mutagene Aktivität dieser genannten mutagenen Substanzen,
wie beispielsweise Tryptophanpyrolysate, ganz beträchtlich inhibiert. Dieser Faktor
kann in im wesentlichen reinen Zustand durch Fraktionieren von Kohlsaft isoliert
werden.
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Die Erfindung schafft somit einen neuen, anti-mutagenen Faktor, gekennzeichnet
durch a) ein Molekulargewicht von ungefähr 48 000, bestimmt durch Elektrophorese
an Natrium-dodecylsulfatgel; I b) die folgende Aminosäurezusammensetzung, ausgedrückt
in Mol prozent Asp 13,22; Thr 8,43; Ser 3,05; Glu 6,38; Pro 6,56; Gly 7,22; AIa
9,89; Cy& 1,73; Val 5,77; Met 1,29; Ileu 3,44; Leu 11,64; Tyr 1,31; Phe 5,36;
Lys 2,59; His 1,07; Arg 7,40; c) Absorptionen bei 250 und 404 nm (Soret-Bande),
wobei sich die Soret-Bande bei Behandlung des Faktors mit Natriumhydrogensulfit
nach 436,5 nm verschiebt.
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Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Gewinnung des anti-mutagenen
Faktors. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man: a) Wohl saft zur
Entfernung von Gewebeteilchen zentrifugiert; b) die erhaltene überstehende Flüssigkeit
ultrazentrifugiert; c) die erhaltene überstehende Flüssigkeit mit einer Anionenaustau-
Anionenaustauscher-Zel 1 ul ose in Berührung bringt; d) die durchgegangene Fraktion
auf eine Säule mit einer Kationen austausch er-Zell ul ose aufgi bt; e) die adsorbierten
Substanzen mit einem wässerigen Eluiermittel, das KCl oder NaCl enthält, eluiert;
f) aus dem Eluat die den anti-mutagenen Faktor enthaltende Fraktion, welche bei
einer niedrigeren Konzentration an KCl oder NaCl eluiert wird, abtrennt; g) den
Faktor auf ein Molekularsieb aufbringt; und h) den Faktor abtrennt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die überstehende
Flüssigkeit aus der Stufe b) vor Durchführung der Stufe c) einer Dialyse oder Gelfiltration
unterworfen werden, um kleinere Moleküle zu entfernen. Die Dialyse kann beispielsweise
gegen 50 mM HEPES (chemische Bezeichnung: N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure)
oder gegen 50 mM Phosphatpuffer unter Verwendung von Cellophanmembranen, durch-
4 geführt werden. Wenn man bei der Gelfiltration Molekularsiebe gebraucht, so wählt
man solche, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 1000
absorbieren können.
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Es ist auch bevorzugt, die Fraktion aus Stufe f) zu ultrafiltrieren.
Es ist ferner bevorzugt, sämtliche Reaktionsstufen bei einer Temperatur unterhalb
5 oc durchzuführen.
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Zu Beispielen für die Anionenaustauscher-Zellulose, die man in Stufe
c) einsetzen kann, gehören DEAE-Zellulose, TEAE-Zellulose und AE-Zellulose. Beispiele
für die Kationenaustauscher-Zellulose zur Verwendung in Stufe d) sind CMC, P-Zellulose
und PPM-Zellulose. Zu Beispielen für Molekularsiebe, die in Stufe g) eingesetzt
werden können, gehören Sephacryl S-200, Sephadex G-75 und Biogel P-30. Zu Beispielen
für die Filtermembranen,die zur Ultrafiltration eingesetzt werden können, gehören
UM-10, UM-20Et, PM-30 und andere Membranen, durch die Moleküle mit einem Mole-!
kulargewicht von weniger als 30 000 hindurchtreten können.
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Der erfindungsgemäß gewinnbare anti-mutagene Faktor zeigt charakteristische
Absorptionen bei 280 nm und bei 404 nm. Der Faktor ist stabil gegen Erhitzen, wird
jedoch durch Einwirkung eines proteolytischen Enzyms desaktiviert. Es handelt sich
um ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48 000, bestimmt durch die
Natrium-dodecyl sul fatgel (SDS-Gel)-Elektrophorese.
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Die Aminosäurezusammensetzung des erfindungsgemäßen, anti-mutagenen
Faktors ist, ausgedrückt in Mol prozent, wie folgt: Asp 13,22; Thr 8,43; Ser 3,05;
Glu 6,38; Pro 6,56; Gly 7,22; Ala 9,89; Cys 1,73; Val 5,77; Met 1,29; Ileu 3,44;
Leu 11,64; Tyr 1,31; Phe 5,36; Lys 2,59; His 1,07; Arg 7,40.
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Das Das nachfolgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der
vorliegenden Erfindung.
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Beispiel Man wäscht 2000 9 Kohlblätter mit Wasser und behandelt in
einem; Entsafter bei OOC, um den Kohlsaft zu erhalten. Der Saft wird 30 Minuten
lang bei 4°C mit 9000 G zentrifugiert, um Gewebeteilchen, wie Chloroplasten oder
Mitochondrien, zu entfernen.
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Die überstehende Flüssigkeit wird dann 2 Stunden bei 40C mit 2 x 105
G ultrazentrifugiert, um feinere Teilchen, wie Mikrosomen oder Ribosomen, zu entfernen.
Die erhaltene Flüssigkeit (528 ml) wird gegen 50 mM HEPES-Puffer (pH 6,8) durch
eine Cellophanmembran dialysiert, um Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger
als ungefähr 1000 zu entfernen. Die Dialyse lösung wird zweimal ersetzt.
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Man bringt das erhaltene Dialysat auf eine Säule mit DEAE-Zellulose
(4 cm x 37 cm) mit einer FHeßrate von 122 ml/Stunde auf. Die Säule wird bei 40C
mit 50 mM HEPES-Puffer (pH 6,8), der KCl in einer Menge enthält, die stufenweise
von 0 bis 500 mM ansteigt, eluiert. Sämtliche Fraktionen (15 ml pro Röhrchen} werden
auf ihre A280-Absorption untersucht. Ferner wer- 1 den die anti-mutanenen Eigenschaften
anhand der nachstehend beschriebenen Methode bestimmt. Flan stellt fest, daß sich
anti-l mutagene Aktivität nur in der Fraktion befindet, die nicht auf DEAE-Zellulose
absorbiert war, d.h. bei einer KCl-Konzentratio von 0. Die Elutionskurve ist in
Figur 1 dargestellt.
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Dann gibt man die vorstehende Fraktion (1100 ml) auf eine Säule mit
CMC (2,5 cm x 8 cm) in einer Fließrate von 69 ml/Stun de auf. Man eluiert die Säule
bei 4°C mit 50 mM HEPES-Puffer (pH 6,8), der KCl in einer Menge enthält, die kontinuierlich
in einem Gradienten von 0 bis 500 mM ansteigt.
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Man sammelt das Eluat in aliquoten Anteilen zu 3 ml pro Röhrchen Jede
der Fraktionen wird auf ihre A280-Absorption und
die zuvor genannten
anti-mutagenen Eigenschaften getestet.
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Man findet die anti-mutagene Aktivität in den Fraktionen, die einen
Absorptionspeak bei einer KCl-Konzentration von 0,05 M aufweisen. Die Eluierungskurve
ist in Figur 2 dargestellt. Auf diese Weise werden sieben aliquote Anteile (21 ml)
der Fraktionen mit anti-mutagener Aktivität aufgetrennt.
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Man vereinigt diese Fraktionen und ultrafiltriert sie durch ein UM-10-Filter,
um die Fraktionen auf 2,0 ml zu konzentrieren. Dann gibt man das Konzentrat auf
eine Säule mit Sephacryl S-200 (1 cm x 92 cm) auf. Die Säule wird dann mit 50 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) bei einer Temperatur von 4 0C eluiert.
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Man sammelt das Eluat in aliquoten Anteilen zu jeweils 40 Tropfen
pro Röhrchen. Jede Fraktion wird auf ihre A280-Absorption und die wie zuvor beschriebene
anti-mutagene Eigenschaft untersucht.
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Man findet die anti-mutagene Aktivität in der zweiten Fraktion des
Eluats.
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Um den jeweiligen Reinigungsgrad des Faktors bei jeder Stufe des vorliegenden
Verfahrens festzustellen, werden die Verhältnisse der anti-mutagenen Aktivität des
Proteingehalts verglichen. Durch den Vergleich ergibt sich, daß die Aktivität durch
die C3lC-Säulenchromatographie bzw. die Behandlung mit Sephacryl um ungefähr 200-mal
bzw. ungefähr 450-mal größer ist als beim anfänglichen Kohisaft.
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I Der so isolierte anti-mutagene Faktor ist gegenüber Erhitzen relativ
stabil. Man verliert beispielsweise bei 90-minütinem t Erhitzen auf 1000 C nur 50
c der Aktivität. Durch Einwirkung eines proteolytischen Enzyms geht die Wirksamkeit
vollständig verloren. Das Molekulargewicht der Substanz wird durch SDS-Gelelektrophorese
bestimmt und beträgt ungefähr 48 000. Der Faktor weist eine charakteristische Absorption
bei 404 nm in Form einer Soret-Bande auf, die charakteristisch für Hämoproteine
ist.
Diese Bande erfährt eine Verschiebung auf 436,5 nm, wenn der Faktor mit Natriumhydrogensulfit
behandelt wird. Dieses Phänomen zeigt die Umwandlung des Hämoproteins aus der oxydiert
3+ 2+ ten Form (Fe ) in die reduzierte Form (Fe ) an. Aus den vorstehenden Angaben
wird geschlossen, daß es sich beim Faktor um ein Hämoprotein handelt.
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Anti-mutagene Wirksamkeit: Man hony 10 µg Tryptophanpyrolysat in
0,02 ml DMSO zu 0,5 ml der zu untersuchenden Fraktion. Die Mischung wird 30 Minuten
bei 0 37°C inkubiert und dann 0 37 C inkubiert und dann 10 Minuten auf 100 C erhitzt,
um den verbliebenen anti-mutagenen Faktor zu desaktivieren. Zur Mischung gibt man
3 ml Weichagar (0,5 % Difco Agar) und 0,1 ml einer Suspension von Salmonella TA
98 (histidinfrei, His ).
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Diese Mischung und 0,3 ml einer S-9-Mischung, welche Lebermikrosomen
einer mit PCB behandelten SD-Rattenleber enthält und die nachstehend beschriebene
Zusammensetzung aufweist, werden auf ein Agarmedium gegossen, das die nachfolgend
bebeschriebene Zusammensetzung besitzt. Anschließend inkubiert man 2 Tage bei 370C.
Die Kolonien der Revertanten (ohne Histidin-+ bedarf, His+) werden gezählt. Die
anti-mutagene Aktivität kann bestimmt werden, inden man die Zahl der Kolonien der
Revertanten mit der Kontrolle vergleicht, die zwischen 300 und 400 pro Schale liegt.
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Zusammensetzung der S-9-Mischung: Lebermikrosomen 3,0 ml 0,25 M Na2HP04
4,0 ml 0,16 M MgCl2 0,5 ml 0,66 M KCl 0,5 ml 0,05 M G-6-P 1,0 ml 0,04 M NADP 1,0
ml
Zusammensetzung des Agarmediums: MM (X 20) 50 ml 40 %-ige Glucose
10 ml Nährbrühe 0,8 %-ig (Difco) 10 ml Biotin (100#/ml) 1 ml Agar 15 g aqua dest.
930 ml Zusammensetzung von MM (X 20): (NH4)2S04 2,0 % KH2P°4 20,0 % MgS04 . 7H20
0,2 % Natriumcitrat 1,0 % pH 7,0 mit KOH
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