DE60023846T2 - Ein verfahren zur bekämpfung pilzlicher pathogene und dafür brauchbare mittel - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung eines biologischen Schutzmittels, bestehend aus dem Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder einer Mutante oder einem Derivat hiervon, oder einer Mutante oder einem Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624), um das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit pilzlicher Pflanzenpathogene, die ansonsten Pflanzen oder Pflanzenteile infizieren oder anderweitig befallen, zu hemmen, zu verlangsamen oder anderweitig zu kontrollieren. Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auf ein isoliertes biologisches Schutzmittel für die Behandlung einer pilzlichen Infektion in einer Pflanze und auf eine pflanzenschützende Zusammensetzung, die dieses biologische Schutzmittel in Kombination mit einem phytopathologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Benetzungsmittel umfasst.
  • ALLGEMEIN
  • Die bibliographischen Details der Veröffentlichungen, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, sind am Ende der Beschreibung gesammelt.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff „abgeleitet von" so verstanden werden, dass er angibt, dass eine spezifizierte Einheit aus einer bestimmten Quelle erhalten werden kann, wenngleich nicht notwendigerweise direkt aus dieser Quelle.
  • Im Verlauf dieses Textes, wenn es der Zusammenhang nicht anders erfordert, wird der Begriff „umfassen" oder Variationen hiervon, wie etwa „umfasst" oder „umfassend" so zu verstehen sein, dass die Einbeziehung eines genannten Schritts oder Elements oder einer Anzahl oder Gruppe von Schritten oder Elementen oder Einheiten damit impliziert ist, nicht jedoch ein Ausschluss irgendwelcher anderer Schritte oder Elemente oder Anzahlen oder Gruppen von Elementen oder Einheiten.
  • Fachleute werden erkennen, dass die hier beschriebene Erfindung weiteren als den hier spezifisch beschriebenen Variationen und Modifikationen zugänglich ist. Es versteht sich, dass die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung schließt außerdem alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen ein, die in dieser Beschreibung einzeln oder in der Gruppe angegeben oder in Bezug genommen sind, sowie sämtliche Kombinationen von zwei oder mehr solcher Schritte oder Merkmale.
  • Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Schutzumfang nicht durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen begrenzt, die nur dem Zweck der beispielhaften Darstellung dienen sollen. Funktionell gleichwertige Produkte, Zusammensetzungen und Verfahren liegen eindeutig im Schutzbereich der Erfindung, wie hier beschrieben.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Pathogene Infektionen, insbesondere Pilzinfektionen von Tieren (einschließlich Menschen und landwirtschaftlichen Nutztieren und Haustieren) und von Pflanzen (insbesondere landwirtschaftlich bedeutenden Pflanzen) verursachen signifikante Verluste bei der weltweiten Produktionskapazität.
  • Echte Pilz-Pathogene können in wenigstens drei Hauptklassen eingeteilt werden: die Phycomyceten, die Ascomyceten und die Basidiomyceten.
  • Viele Pilzpathogene erzeugen eine Vielzahl von Krankheiten in Pflanzen, wobei verschiedene Spezies von Pilzen dazu neigen, in bestimmte Spezies und bestimmte Gewebe von Pflanzen einzuwandern. Die Schäden an Nutzpflanzen durch Pilzinfektion beziffern sich jährlich auf viele Millionen Dollar an verlorenen Profiten. Die Basidiomyceten sind von besonderer Wichtigkeit in der Landwirtschaft; sie beinhalten Rostpilze, wie z.B. Puccinia spp., Cronartium ribicola und Gymnosporangium juniperi-virginianae; und Brandpilze, wie z.B. Ustilago spp., der unter anderem Mais und Hafer befällt und jährlich bis zu 30% Verlust verursacht.
  • Zusätzlich ist die „Schwarzbeinigkeit" bzw. „Take-all disease" die durch Infektion von Weizenpflanzen mit dem Pilzpathogen Gaeumannomyces graminis Var. tritici (allgemein bekannt als Erreger der Schwarzbeinigkeit oder „Take all"-Pilz) verursacht wird, die bedeutendste Wurzelerkrankung von Weizen weltweit und führt derzeit zu 10% Verlust bei der jährlichen Weizenernte in Australien (Murray und Brown, 1987). Andere wichtige Pilzerkrankungen bei Pflanzen beinhalten die Krongalle bei der Luzernenkrankheit, die durch Physoderma alfalfae verursacht wird; die Bitterfäule bei der Apfelerkrankung, verursacht von Glomerella cingulata; Apfelrost, verursacht von Gymnosporangium juniperi-virginianae; Apfelschort, verursacht von Venturia inaequalis; Bananenwelke, verursacht durch Fusarium oxysporum f. cubense; Flugbrand bei Gerste, verursacht von Ustilago nuda Rostr.; frühe und späte Blattfleckenkrankheit bei Sellerie, verursacht von Septoria apiicola; Sellerieschorf, verursacht von Fusarium oxysporum f. apii Snyder Hansen; Mutterkorn bei Getreidepflanzen und Gräsern, verursacht durch Claviceps purpurea; Schwarzrost, verursacht von Puccinia spp., insbesondere P. graminis; späte Knollenfäule der Kartoffel, verursacht von Phytophthera infestans; und Zitrus-Wurzelfäule, verursacht von Armillaria mellea. Diese Liste ist jedoch nicht erschöpfend.
  • Verfahren für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von Pilz- und Bakterieninfektionen bei Pflanzen beinhalten allgemein die Applikation von Anti-Pilz-Chemikalien und antibakteriellen Chemikalien; die Verwendung biologischer Schutzmittel und, in jüngerer Zeit, die genetische Erzeugung von Nutzpflanzen zur Expression von Krankheitstoleranz- oder Krankheitsresistenz-Genen hierin.
  • Fungizide und fungistatische chemische Verbindungen:
  • Antipilz-Chemikalien unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung und sind dafür konzipiert, um das pilzliche Pathogen entweder zu vertilgen, z.B. dadurch, dass es gegen die Pilzsporen wirkt, oder alternativ, indem es die Pilzsporen an der Keimung hindert, sobald diese ihren Wirt infiziert haben. Jedoch fallen die meisten Chemikalien nicht ausschließlich in eine einzige Kategorie. Beispielsweise ist elementarer Schwefel dafür verwendet worden, um Apfelernten gegen Apfelschorf zu schützen, jedoch wirkt dieselbe Chemikalie vernichtend, wenn sie gegen einen Rostpilz verwendet wird.
  • Eine breite Vielfalt von Pyridinverbindungen und Derivaten hiervon mit variierender und oftmals multipler Wirkungsweise wird in Agrochemikalien und Pharmazeutika gegen pilzliche Pathogene verwendet, wie z.B. 3-(2-Methylpiperidino)propyl-3,4-dichlorbenzoat; Cephalosporin C; Cephapirin-Natrium; Pyrithion-Zink (d.h. 2-Mercaptopyridin-N-oxid); und 2-Sulfanylamidopyridin.
  • Fungizide in der Landwirtschaft und die Arten ihrer Anwendung werden detailliert in Übersichtsartikeln von Gennaro et al. (1990) und Kirk-Othmer (1980) dargestellt. Diese Verbindungen gehören allgemein zur Klasse der Polysulfide; Schwermetall-Fungizide; sowie der organischen Fungizide, wie z.B. die Chinone (insbesondere Chloranil und Dichlon), organische Schwefel-enthaltende Verbindungen (insbesondere die Dithiocarbamate), Imidazoline und Guanine (insbesondere Heptadecyl-2-imidazolinium-Acetat und Dodecylguanidium-Acetat), Trichlormethylthiocarboximide [insbesondere N-(Trichlormethylthio)-4-cyclohexen-1,2-dicarboximid (Captan) und N-(Trichlormethylthio)-phthalimid (Folpet)], die chlorierten und/oder nitrierten Benzolderivate [insbesondere 2,3,5,6-Tetrachlornitrobenzol; Pentachlornitrobenzol (PCNB); 1,3,5-Trichlor-2,4,6-trinitrobenzol; 1,2,4-Trichlor-3,5-dinitrobenzol; Hexachlorbenzol; 2,6-Dichlor-4-Nitroanilin (Dichloran); 1,4-Dichlor-2,5-dimethoxybenzol und Tetrachlorisophthalonitril (Chlorothalonil)]. Verschiedene andere Verbindungen mit systemischer Antipilz-Aktivität bei landwirtschaftlichen Verwendungen (d.h. systemische Fungizide) beinhalten die Oxathiine (insbesondere Carboxin); Benzimidazole [insbesondere Methyl-2-benzimidazolylcarbamat (MBC)]; Pyrimidine (insbesondere 5-Butyl-2-dimethylamino-6-methyl-4(1H)-pyrimidinon (Dimethirimol); das 2-Ethylaminoanalogon Ethirimol; und α-(2,4-Dichlorphenyl)-α-phenyl-5- pyrimidinmethanol (Triarimol)]. Die Antibiotika, einschließlich Cycloheximid, Bastocidin S, Kasugamycin und die Polyoxine werden ebenfalls in ausgedehntem Maße verwendet.
  • In den meisten Fällen ist die Wirkungsweise bekannter landwirtschaftlicher Antipilz-Verbindungen unzuverlässig, und bei Antipilz-Verbindungen, die wirksam gegen Pilzpathogene des Menschen sind, ist es so, dass viele Verbindungen den Stoffwechsel der Pilzzellmembran verändern. Beispielsweise inhibieren Triarimol und verwandte Verbindungen Schritte der Sterol-Biosynthese. Demgegenüber ist Carboxin dafür bekannt, dass es die mitochondriale Atmung blockiert, indem es die Succinat-Dehydrogenase inhibiert, während die Benzimidazole Zellstrukturen aufbrechen, wie etwa diejenigen, die für die Mitose benötigt werden.
  • Biologische Antipilz-Schutzmittel:
  • Biologische Kontrolle bzw. biologischer Schutz beziehen sich auf die Einführung lebender Organismen, wie z.B. Bakterien, Pilze und Insekten, um Pflanzenpathogene zu kontrollieren. Drei Eigenschaften machen biologische Schutzmittel zu einer erstrebenswerten Option bei dem Schutz von Pflanzen vor Pilzpathogenen. Zum ersten sind biologische Schutzmittel im allgemeinen natürliche Produkte, sodass es weniger wahrscheinlich als bei synthetischen Chemikalien ist, dass sie einen schädlichen Effekt auf die Umwelt haben. Zum zweiten sind biologische Schutzmittel im Vergleich zu synthetischen Chemikalien relativ preiswert. Drittens stellen biologische Schutzmittel eine unerschöpfliche Quelle für Schutzmittel dar, da Mikroorganismen in Kultur gehalten und schnell und preiswert vermehrt werden können.
  • Biologische Schutzmittel wirken entweder dadurch, dass sie die Stelle der Infektion eines Pathogens besetzen und mit dem Pathogen um Nährstoffe konkurrieren, die aus der Pflanze stammen, oder alternativ produzieren die biologischen Schutzmittel fungizide und/oder fungistatische Verbindungen, die das Pilzpathogen spezifisch attackieren. Es sind bedeutende Faktoren identifiziert worden, die für die biologische Kontrolle bedeutsam sind (wie etwa die Besiedelung, antibiotische Wirkung, die Siderophoren-Produktion, etc), jedoch variiert der Einfluss dieser Faktoren mit den Umweltbedingungen, sodass es schwer ist, den biologischen Schutzmitteln einen universell gültigen Wirkungsmechanismus zuzuordnen (Weller 1988). Das universelle Merkmal aller biologischen Schutzmittel ist ihre Fähigkeit, sich schnell in den von dem pathogenen Agens infizierten Zellen und Geweben zu vermehren, und eine Verbindung zu diesen herzustellen, ein Prozess, der als Kolonisierung (Besiedelung) bezeichnet wird (Suslow, 1982). Tatsächlich hat Weller (1988) drei Faktoren als verantwortlich für die unterdrückende Natur verschiedener Bakterien gegen Pilze identifiziert: die Besiedelung der Wurzel, die Produktion von Fungiziden und/oder fungistatischen Verbindungen, einschließlich Antibiotika, HCN (Fravel, 1988) oder Wasserstoffperoxid (Wu et al, 1995; US-Patent Nr. 5,516,671) unter anderem, und die Produktion fluoreszierender Siderophoren oder von Hochaffinitäts- Eisentransportmitteln. In diesem Zusammenhang legt das unterschiedliche Besiedelungs-Wirtsspektrum, das von den Biokontroll-Bakterien gezeigt wird (Weller, 1988) nahe, dass es eine gewisse Wirtsspezifität bei der Besiedelung gibt, und dass eine Anzahl von Faktoren beteiligt ist. Wie dem Fachmann bekannt sein wird, gibt es auch Wirtsspezifität bei der Wirkung von Fungiziden, und dies könnte erklären, warum einige Stämme gegen bestimmte Pathogene ineffektiv sind (Schroth und Hancock, 1981). Des weiteren wirken nicht alle biologischen Schutzmittel dadurch, dass sie Fungizide oder fungistatische Verbindungen produzieren (Kraus und Loper, 1992).
  • Es gibt eine große Anzahl von Systemen, bei denen die biologische Kontrolle effektiv ist (Weller, 1988). Im allgemeinen haben biologische Schutzmittel gezeigt, dass sie unter kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus und bei einer großen Zahl von Fällen im Feld einen günstigen Effekt auf die Pflanze besitzen (Baker und Cook, 1974). Es gibt derzeit zahlreiche biologische Schutzmittel, die von Bauern zur Krankheitskontrolle verwendet werden (Schroth und Hancock, 1981), was zeigt, dass dieser Ansatz wirksam und lebensfähig als Verfahren für die Kontrolle von Pflanzenkrankheiten im Feld ist.
  • So ist beispielsweise die Sclerotinia-Fäule, die durch die Pilze Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor und Sclerotinia trifoliorum verursacht wird, eine der zerstörerischsten Krankheiten bei Pflanzen und betrifft über 380 Zierpflanzen (z.B. Aster, Begonie, Nelke, Chrysantheme, Fuchsie, Gerbera, Lupine, Pelargonie und Petunie), Feldpflanzen (z.B. Luzerne, Raps, Trockenbohne, Hanf, Linse, Raps-Ölsaaten, Erdnuss, Kartoffel, roten Klee, Färberdistel, Sojabohne, Sonnenblume, Süßklee und Tabak), Gemüse und Fruchtpflanzen (z.B. Artischocke, Spargel, Avocado, Bohne, Broccoli, Kohl, Karotte, Sellerie, Kichererbse, Chicoree, Gurke, Aubergine, Endivie, Fenchel, Kiwi, Porree, Kopfsalat, Petersilie, Erbse, Pfeffer (Chili, roten Pfeffer oder Süßpfeffer), Brechbohne, Tomate, Wassermelone, Knoblauch und Zwiebel) und Kräuter (z.B. Koriander, Schnittlauch, Dill, Fenchel und Winterkresse). Ein biologisches Pflanzenschutzmittel, das als Wirkstoff lebensfähige Sporen des Bodenpilzes Coniothyrium minitans enthält, ist jüngst entwickelt worden und besitzt spezifische antagonistische Wirkungen gegen die Überlebensstrukturen (Dauermycelien) dieser pilzlichen Pathogene. Nach der Applikation und Einarbeitung in den Boden keimt C. minitans aus und greift die Dauermycelien (verbleibende Überlebensstrukturen) der Pathogene im Boden an, wodurch ein Wiederauftreten der Erkrankung im Boden reduziert wird.
  • Im Fall der Schwarzbeinigkeit bei Weizen ist Pseudomonas sp. identifiziert worden, das ein niedermolekulares Siderophor, manchmal mit Fluoreszenz, produziert, das befähigt ist, Eisen zu komplexieren und aktiv in die Zelle zu transportieren, um einen Eisenmangel im Boden hervorzurufen (Buyer und Leong, 1986, Leong 1986), wodurch ein Hungerzustand des Pilzpathogens im Bezug auf das aus dem Boden stammende Eisen, das für Keimung und Wachstum notwendig ist, verursacht wird. Jedoch nimmt man zur Zeit an, dass die Siderophor-Produktion nur bedeutsam für den biologischen Schutz vor der Schwarzbeinigkeit in alkalischen Böden ist, die eine niedrige Eisenkonzentration aufweisen, worin Eisen ein limitierender Nährstoff für den Pilz sein kann (Kloepper et al., 1980). Weiterhin haben Fravel (1988), Hamdan et al. (1991) und Thomashow et al. (1990) vorgeschlagen, dass der dominante, wichtige Faktor bei der Unterdrückung der Krankheit in der Produktion von fungiziden und/oder fungistatischen Verbindungen durch Pseudomonas spp. begründet liegt, insbesondere von Phenazin-1-Carbonsäure (Thomashow et al., 1993), und 2,4-Diacetylphloroglucinol, einem normalen Zwischenprodukt bei einem Pathway der Bakterien, der eine Reihe von Pilzpathogenen hemmt und in einem weiten Spektrum von Pseudomonaden zu finden ist (Keel et al., 1992; 1996). Phenazin ist als biologisches Schutzmittel gegen Schwarzbeinigkeit umfänglich untersucht worden, jedoch ist die Wirksamkeit von 2,4-Diacetylphloroglucinol gegen Schwarzbeinigkeit nur teilweise charakterisiert worden (Raaijmakers und Weller, 1998). Pseudomonas fluorescens, Stamm CHA0 ist ebenfalls ausgedehnt untersucht worden und hat gezeigt, dass es eine wirksame Menge an 2,4-Diacetylphloroglucinol für die Unterdrückung der Schwarzfäule bei Tabak und der Schwarzbeinigkeit bei Weizen produziert (Laville et al., 1992).
  • Zusätzlich hat der isolierte Pseudomonas-Stamm AN5 gezeigt, dass er insofern ein breites Wirtsspektrum besitzt, als er befähigt ist, die Wurzeln einer Anzahl von Pflanzenarten zu besiedeln und sich in Agarplatten-Tests, Topfversuchen und in Feldversuchen als wirksames biologisches Schutzmittel gegen Schwarzbeinigkeit zeigt (Nayudu et al., 1994b). Die vorliegenden Autoren stimmten mit Thomashow et al. (1993) in der Schlussfolgerung überein, dass die dominanten Effekte dieses Bakteriums offenbar eher auf der Produktion von fungiziden und/oder fungistatischen Verbindungen beruhen als auf der Produktion von Siderophoren.
  • Obwohl andere biologische Schutzmittel auf ihre Fähigkeit hin getestet wurden, die Schwarzbeinigkeit zu kontrollieren, wie z.B. die nicht-pathogenen Stämme von G. graminis var. graminis (Wong et al., 1996), bieten diese kein durchführbares Verfahren zur Bekämpfung der Schwarzbeinigkeit im großen Umfang, da derzeit keine Technologie verfügbar ist, um solche Pilze in großem Maßstab zu züchten. Die Kosten zur Herstellung eines solchen Pilzmittels und zur Anwendung desselben im Feld sind im Vergleich zu bakteriellen biologischen Schutzmitteln untragbar hoch.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Bei der Arbeit, die zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, haben die vorliegenden Erfinder versucht, ein im Bezug auf die Umwelt verträgliches Mittel für die Behandlung eines breiten Spektrums von Pilzpathogenen bei Pflanzen und Tieren zu identifizieren. Die Erfinder identifizierten die Antipilz-Komponente, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produziert wird, als Zuckersäure und haben den biochemischen und genetischen Pathway für deren Produktion bestimmt. Die Identifizierung dieses spezifischen Antipilz-Mittels und die Klonierung der genetischen Sequenzen, die für die Biosynthese des Antipilzmittels erforderlich sind, erlauben die Entwicklung von Strategien für die Kontrolle eines breiten Spektrums von Pilzpathogenen bei Pflanzen und Tieren.
  • Dem entsprechend bezieht sich ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Infektionen durch ein pilzliches Pathogen in einer Pflanze, bei dem man der Pflanze eine wirksame Menge eines biologischen Schutzmittels verabreicht, das befähigt ist, eine Zuckersäure zu produzieren, die hinreichend ist, Pilzwachstum oder Pilzreproduktion in dieser Pflanze zu hemmen oder zu verhindern, wobei das biologische Schutzmittel der Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat hiervon ist, oder eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624).
  • Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um die nach der Ernte erfolgende Lagerung eines Pflanzenprodukts zu verbessern, bei dem man darauf eine wirksame Menge eines biologischen Schutzmittels appliziert, das befähigt ist, eine Menge einer Zuckersäure zu produzieren, die hinreichend ist, Pilzwachstum oder -Reproduktion zu hemmen oder zu verhindern, wobei das biologische Schutzmittel der Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat hiervon ist, oder eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624). Dieser Aspekt der Erfindung lässt sich auf jedes Pflanzenprodukt anwenden, insbesondere auf diejenigen essbaren Produkte, die für den Verzehr durch Mensch oder Tier gedacht sind, die aufgrund von Pilzinfektion für raschen Verfall empfindlich sind, wie z.B. Obst und Gemüse, einschließlich u.a. Tomaten, Äpfel, Birnen, Citrusfrüchte, Trauben und Beeren).
  • Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein biologisches Schutzmittel für die Behandlung einer Pilzinfektion in einer Pflanze oder einem Tier bereit, wobei dieses Mittel eine isolierte Bakterienzelle umfasst, die folgende Eigenschaften besitzt:
    • (i) Sie produziert eine Zuckersäure, wenn sie in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird, die eine Aldose umfasst;
    • (ii) Sie ist in der Lage, die Infektionsstelle eines solchen Pilzes, bevorzugt die Pflanzenwurzeln, zu besiedeln; und
    • (iii) Sie besitzt die biologischen Schutzeigenschaften des Pseudomonas-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624). Bevorzugt umfasst das biologische Schutzmittel den Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder ein Derivat hiervon. Bevorzugt besitzt das Derivat im Vergleich zum Pseudomonas-Stamm AN5rif eine gesteigerte Fähigkeit, eine Zuckersäure zu produzieren, wenn es in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird, die eine Aldose beinhaltet, und/oder eine im Vergleich zum Pseudomonas-Stamm AN5rif gesteigerte Befähigung, die Wurzeln einer Pflanze zu besiedeln.
  • Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt eine pflanzenschützende Zusammensetzung für die Behandlung einer Pilzinfektion einer Pflanze bereit, wobei diese Zusammensetzung eine wirksame Menge eines im vorstehenden Absatz beschriebenen biologischen Schutzmittels in Kombination mit einem phytopathologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Benetzungsmittel umfasst.
  • Ein fünfter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um eine Zuckersäure zu produzieren, umfassend das Inkubieren einer Bakterienzelle mit den biologischen Schutzeigenschaften des Pseudomonas-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) in Gegenwart einer Aldose für eine Zeit und unter Bedingungen, die hinreichend sind, damit eine PQQ-abhängige Oxidation der Aldose zur Zuckersäure erfolgen kann.
  • Das biologische Schutzmittel und Zusammensetzungen, die dieses umfassen, wie hier beschrieben, können durch jedes für Fachleute bekannte Mittel hierzu hergestellt werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Kopie einer photographischen Darstellung eines Dünnschicht-Chromatogramms (TLC) eines Agar-Overlay-Tests, der die biologische Aktivität der gegen die Schwarzbeinigkeit gerichteten Verbindung aus dem Rohextrakt des Pseudomonas-Stammes AN5 zeigt. Tafel A zeigt eine TLC, die unter Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt wurde, das 10% (Gewicht/Volumen) an Methanol in Chloroform umfasst. Tafel B zeigt eine TLC, die unter Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt wurde, das 30% (Gewicht/Volumen) an Methanol in Chloroform umfasst. Tafel C zeigt eine TLC, die unter Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt wurde, das 50% (Gewicht/Volumen) an Methanol in Chloroform umfasst. Der Pilzerreger der Schwarzbeinigkeit (Take all-Pilz) wurde auf der Oberseite der TLC-Platte in einem Kartoffel-Dextrose-Overlay-Agar angeimpft und hat die Möglichkeit, gut zu wachsen. Eine Hemmzone, angezeigt durch den Pfeil, entspricht der Position eines Antipilz-Mittels des Pseudomonas-Stammes AN5 gegen Schwarzbeinigkeit. Dieses Antipilz-Mittel befindet sich am Ausgangspunkt und zeigt in Gegenwart keines der getesteten Lösungsmittel eine Wanderbewegung.
  • 2A ist eine Kopie einer photographischen Darstellung von Kieselgel 60 F254-TLC-Platten unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Volumen/Volumen)] umfasst, und zeigt die Auftrennung von Verbindungen in Rohextrakten des Pseudomonas-Stammes AN5 (Tafel a) und des mutanten Stammes AN5-MN1 (Tafel b). Diese Daten zeigen im Vergleich zu dem Pseudomonas-Stamm AN5 Unterschiede bei den einfachen Zuckern an, die von dem mutanten Stamm AN5-MN1 produziert werden.
  • 2B ist eine Kopie einer photographischen Darstellung der TLC-Platten aus 2A in einem Agar-Overlay-Test, der die biologische Aktivität einer Verbindung anzeigt, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 (Tafel a) produziert wird, nicht jedoch von dem mutanten Stamm AN5-MN1 (Tafel b), mit Wirkung gegen den Take all-Pilz, wie durch den Pfeil angezeigt wird (Hemmzone). Die Lösungsmittelbedingungen sind dieselben, wie in 2A dargestellt.
  • 3A ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer Kieselgel 60 F254-TLC-Platte unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Volumen/Volumen)] umfasst, wobei Siliziumdioxidsäulen-Fraktionen des Pseudomonas-Stammes AN5 dargestellt sind. Die Nummerierung unten an jeder Spur zeigt die Nummer der Fraktion an, die aus der Siliziumdioxidsäule gesammelt wurde; und C zeigt einen Rohextrakt des Pseudomonas-Stammes AN5, der als Ausgangsmaterial für die Siliziumdioxidsäule verwendet wurde.
  • 3B ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer PDA-Platte, die mit Take-all-Pilz angeimpft wurde und die biologische Aktivität der Siliziumdioxidsäulenfraktionen 17 bis 20 zeigt, die in 3A gegen den Take-all-Pilz gezeigt sind. Die Nummerierung entspricht der Nummer der Siliziumdioxidsäulenfraktion. Die Zone, die klar wird, zeigt eine Hemmung des Pilzwachstums an, im Vergleich zu den weißen Bereichen, auf denen der Pilz wächst. Die Daten zeigen an, dass die Fraktionen 17 bis 20 gegen den Take-all-Pilz aktiv sind, und dass die Fraktionen 19 und 20 die höchste Aktivität enthalten.
  • 4 ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer PDA-Platte in einem Agar-Overlay-Bioassay, die die Aktivität gegen den Take-all-Pilz bei den Siliziumdioxidsäulenfraktionen 17 bis 20 bei dem Pseudomonas-Stamm AN5 zeigt, und zwar nach ihrer erneuten Chromatographie durch TLC, wie in der Legende zu 3A beschrieben. Die aktiven Fraktionen wurden in vier Proben (auf Basis ihrer Rf-Werte) mit der Nummerierung 1–4 eluiert. Nur die Fraktion 3 (Rf-Wert 0,75) zeigte Aktivität gegen den Take-all-Pilz, wie durch die Hemmzone zu sehen.
  • 5A ist eine Kopie einer graphischen Darstellung eines 1H-NMR-Spektrums der aktiven Fraktion, die mittels Siliziumdioxidsäule und TLC gereinigt worden war, wie in den Legenden zu den 3A und 4 angezeigt. Die Nummerierung auf der X-Achse zeigt die ppm an.
  • 5B ist eine Kopie einer graphischen Darstellung eines 13C-NMR-Spektrums der aktiven Fraktion, die mittels Siliziumdioxidsäule und TLC gereinigt worden war, wie in den Legenden zu den 3A und 4 angezeigt. Die Nummerierung auf der X-Achse zeigt die ppm an.
  • 5C ist eine Kopie einer graphischen Darstellung der Massenspektrumsdaten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule gereinigt wurde, wie dies in der Legende zu den 3A und 4 dargestellt ist. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min). Der Pfeil zeigt die Position von Gluconolacton an.
  • 5D ist eine Kopie einer graphischen Darstellung der Massenspektrumsdaten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule gereinigt wurde, wie dies in der Legende zu 4 dargestellt ist. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min). Der Pfeil zeigt die Position von Gluconsäure an.
  • 6A ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer PDA-Platte, die mit dem Pseudomonas-Stamm AN5 angeimpft ist, und die die biologische Aktivität verschiedener Mengen an reiner Gluconsäure (Sigma Chemical Company Pty. Ltd) gegen Schwarzbeinigkeit unter Verwendung eines Agar-Overlay-Bioassays zeigt. Die Nummerierung zeigt die Menge an verwendeter Zuckersäure wie folgt an: (1) 25 mg; (2) 15 mg; (3) 12,5 mg; und (4) 7,5 mg. Die Daten zeigen an, dass es eine positive Korrelation zwischen der Menge an verwendeter Gluconsäure und der Größe der Hemmzone (geklärte Region) gibt, wobei die Hemmzone die Aktivität gegen den Take-all-Pilz anzeigt.
  • 6B ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer PDA-Platte, die mit dem Pseudomonas-Stamm AN5 angeimpft ist, und die die biologischen Aktivitäten verschiedener gereinigter Zuckersäuren (Sigma Chemical Company Pty. Ltd) gegen den Take-all-Pilz unter Verwendung eines Agar-Overlay-Bioassays zeigt. Die Menge an verwendeter Zuckersäure betrug in jedem Fall 12,5 mg. Die Nummerierung zeigt die verwendete Zuckersäure wie folgt an: (1) Äpfelsäure; (2) Ascorbinsäure; (3) Glutarsäure; und (4) Glucuronsäure. Alle vier Zuckersäuren erzeugen starke Hemmzonen (geklärte Bereiche), was Aktivität gegen den Take-all-Pilz anzeigt.
  • 7 ist eine Schwarz-Weiß-Kopie einer Farbphotodarstellung von Bakterienplatten mit King's B-Medium und mit Animpfung mit dem Pseudomonas-Stamm AN5 (Tafel a) oder mit Pseudomonas fluorescens Pf-5 (Tafel b). Die Daten zeigen über das dunklere Erscheinungsbild dieser Platte (die bei der originalen farbigen Platte eine rote Farbe besitzt) im Vergleich mit dem weißeren Erscheinungsbild der Platte auf Tafel a an, dass Pseudomonas fluorescens Pf-5 2,4-Diacetylphloroglucinol produziert. Im Gegensatz dazu produziert der Pseudomonas-Stamm AN5 bei diesem Test keine detektierbaren Niveaus an 2,4-Diacetylphloroglucinol. Die originale farbphotographische Darstellung ist auf Anfrage erhältlich.
  • 8 ist eine Kopie einer graphischen Darstellung des 1H NMR-Spektrums von Phenazin-1-carbonsäure. Die Nummerierung auf der X-Achse zeigt die ppm an.
  • 9A ist eine Kopie einer graphischen Darstellung der 1H NMR eines Rohextrakts von Pseudomonas fluorescens Pf-5 aus Malz-Agar. Die Nummerierung auf der X-Achse zeigt die ppm an.
  • 9B ist eine Kopie einer graphischen Darstellung der 1H NMR eines Rohextrakts des Pseudomonas-Stammes AN5 aus Malz-Agar. Die Nummerierung auf der X-Achse zeigt die ppm an.
  • 10A ist eine Schwarz-Weiß-Kopie einer farbfotographischen Darstellung von drei PDA-Platten, die mit dem Pseudomonas sp.-Stamm AN5 (Tafeln a und b) oder mit dem mutanten Stamm AN5-MN1 (Tafel c) angeimpft wurden. Bei den Tafeln b und c war der Indikatorfarbstoff Bromcresol-Violett zu dem Wachstumsmedium hinzugegeben worden, und die gelbe Farbe auf Tafel b der originalen photographischen Darstellung (dunkler graue Farbe gegenüber einem hellgrauen Hintergrund in der Schwarz-Weiß-Kopie) zeigt die Ansäuerung des Mediums durch den Pseudomonas-Stamm AN5 an. In Tafel c zeigt die violette Farbe der originalen photographischen Darstellung (sehr dunkelgraue Farbe gegenüber einem heller grauen Hintergrund in der Schwarzweiß-Kopie) die Alkalisierung des Mediums durch den Pseudomonas-Stamm AN5-MN1 an. Die originale farbfotographische Darstellung ist auf Anfrage erhältlich.
  • 10B ist eine Schwarz-Weiß-Kopie einer farbfotographischen Darstellung einer PDA-Platte, die den Indikatorfarbstoff Bromcresol-Violett enthält und mit dem Take-all-Pilz angeimpft wurde. In der Originalphotographie zeigt sich der Take-all-Pilz als schwarze zentrale Zone, die von einer gelben Wachstumszone umgeben ist und es gibt eine violette Zone um den Take all-Pilz, was darauf hin deutet, dass er Verbindungen abgibt, die den pH des Mediums erhöhen. Bei der Schwarz-Weiß-Kopie zeigt sich der Take-all-Pilz als schwarze zentrale Zone, umgeben von einer hellgrauen Zone, und die violette Zone um den Take-all-Pilz ist als dunkler graue Zone zu den Rändern der Platte hin zu sehen. Die originale farbfotographische Darstellung ist auf Anfrage erhältlich.
  • 11A ist eine Kopie einer graphischen Darstellung von Massenspektrum-Daten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 mit Wirkung gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule, wie in der Legende von 3A angezeigt, gereinigt wurde. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung an. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min) an. Der Pfeil zeigt die Position von Galactonolacton an.
  • 11B ist eine Kopie einer graphischen Darstellung von Massenspektrum-Daten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 mit Wirkung gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule, wie in der Legende von 3A angezeigt, gereinigt wurde. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung an. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min) an. Der Pfeil zeigt die Position von Galactonsäure an.
  • 12A ist eine Kopie der graphischen Darstellung von Massenspektrum-Daten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 mit Wirkung gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule, wie in der Legende von 3A angezeigt, gereinigt wurde. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Mannose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung an. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min) an. Der Pfeil zeigt die Position von Mannono-1,4-Lacton an.
  • 12B ist eine Kopie der graphischen Darstellung von Massenspektrum-Daten der aktiven Fraktion des Pseudomonas-Stammes AN5 mit Wirkung gegen den Take all-Pilz, die über eine Siliziumdioxidsäule, wie in der Legende von 3A angezeigt, gereinigt wurde. Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde mit Mannose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Obere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion von Masse/Ladung an. Untere Tafel: Die Daten zeigen ein überreiches Vorkommen jedes Fragments als Funktion der Elutionszeit (min) an. Der Pfeil zeigt die Position von Mannonsäure an.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Pilzinfektion in einer Pflanze und zur Steigerung der nach der Ernte erfolgenden Lagerung von Pflanzenprodukten, bei dem man bei der Pflanze oder dem Pflanzenprodukt eine wirksame Menge eines biologischen Schutzmittels appliziert, das befähigt ist, eine Zuckersäure zu produzieren, die hinreichend ist, Pilzwachstum oder -Reproduktion zu hemmen oder zu verhindern, wobei das biologische Schutzmittel der Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat hiervon ist, oder eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624).
  • Mit „pilzlich" ist gemeint „im Zusammenhang mit jedem Pilz oder jeder Hefe, der/die befähigt ist, eine Pflanze in einer Weise zu infizieren, bei der dadurch die Produktivität oder Gesundheit dieser Pflanze reduziert wird oder hierdurch Krankheit, Kränklichkeit oder Tod ausgelöst werden". Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Begriff „Pilz" weiterhin alle echten Pilze oder Hefen, die Pflanzen oder Pflanzenteile infizieren.
  • Die vorliegende Erfindung ist von eindeutigem Nutzen bei der Verzögerung oder Verhinderung des Verderbens von Lebensmitteln aufgrund der Infektion durch pilzliche Pathogene, insbesondere im Falle von Pflanzenprodukten (z.B. Früchten und Gemüsen), wobei hier die Zuckersäure oder eine Zusammensetzung, die selbige umfasst, direkt auf das Produkt aufgesprüht werden kann, um pilzliches Wachstum unter Standardbedingungen der Lagerung teilweise oder vollständig zu hemmen und dadurch die auf die Ernte folgende Haltbarkeit der Produkte zu verbessern.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer Infektion mit einem pilzlichen Pathogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Alternaria spp., Armillaria mellea, Arthrobotrys oligosporus, Boletus granulatus, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Claviceps purpurea, Cronartium ribicola, Epicoccum purpurescens, Fomes annosus, Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Glomerella cingulata, Gymnosporangium juniperi-virginianae, Monilinia fructicola, Physoderma alfalfae, Phytopthera infestans, Polyporus sulphureus, Puccinia spp., Septoria apiicola, Ustilago spp., Venturia inaequalis und Verticillium dahliae.
  • Bevorzugter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Infektion durch ein Pilzpathogen von monokotylen Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C. purpurea, G. graminis var. tritici, Puccinia spp. und Ustilago spp.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion einer Pflanze durch das pilzliche Pathogen Gaeumannomyces graminis var tritici bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an Pseudomonas sp. Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder einer Mutante oder einem Derivat hiervon, oder einer Mutante oder einem Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften von Pseudomonas sp. Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) für eine Zeitspanne und unter Bedingungen, die hinreichend sind, um das Wachstum oder die Reproduktion des Pilzes zu hemmen oder zu verhindern. Die Pflanze, auf die diese Ausführungsform der Erfindung abzielt, kann ein beliebiger der natürlichen Wirte von G. graminis sein, bevorzugt eine Weizenpflanze oder eine eng verwandte Art oder Vorläuferart von Weizen, z.B. unter anderem Triticum aestivum, T. tauschii oder Hordeum vulgare.
  • Wie hier verwendet, ist der Begriff „Zuckersäure" so zu verstehen, dass er sich auf ein Carbonsäurederivat eines beliebigen Monosaccharids, Disaccharids oder Polysaccharids bezieht, das von dem biologischen Schutzmittel produziert wird, egal, ob dieses Carbonsäurederivat nun in anionischer Form oder als Salz vorliegt oder nicht oder weitere, daran angebrachte Substituentengruppen enthält, wie z.B. ein oder mehrere Phosphoratome oder Phosphor enthaltende Gruppierungen. Der Begriff „Zuckersäure" umfasst weiterhin jedes Monocarbonsäure-, Dicarbonsäure- oder Tricarbonsäure-Derivat einer Aldose, das von dem biologischen Schutzmittel produziert wird.
  • Bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich, ist die von dem biologischen Schutzmittel produzierte Zuckersäure keine Keto-Säure. Zusätzlich, soweit verträglich, ist es besonders bevorzugt, wenn die von dem biologischen Schutzmittel produzierte Zuckersäure nicht in der Lactonform vorliegt.
  • Bevorzugt sind die von dem biologischen Schutzmittel produzierten Zuckersäuren Aldon-, Aldar-, oder Uronsäuren. Fachleute werden wissen, dass Aldonsäuren natürlich hergestellt werden können, indem man eine Aldose am aldehydischen Kohlenstoffatom oxidiert. Im Gegensatz dazu werden die Aldarsäuren hergestellt, indem man sowohl am aldehydischen Kohlenstoffatom als auch an dem Kohlenstoffatom oxidiert, das die erstrangige Hydroxylgruppe trägt, während bei den Uronsäuren nur das Kohlenstoffatom oxidiert wird, das die erstrangige Hydroxylgruppe trägt. Bevorzugt ist die Zuckersäure, die von dem biologischen Schutzmittel produziert wird, ein Derivat von D-Glucose, insbesondere die Aldonsäure Gluconsäure, und/oder die Aldarsäure Glucarsäure, und/oder die Uronsäure Glucuronsäure. Optional kann das biologische Schutzmittel auch Zuckersäurederivate von D-Galactose produzieren, insbesondere Galactonsäure und/oder Galactarsäure und/oder Galacturonsäure, oder Zuckersäurederivate von D-Mannose, insbesondere Mannonsäure und/oder Mannonarsäure und/oder Mannonuronsäure. Alternativ produziert das biologische Schutzmittel eine Zuckersäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Apfelsäure und Ascorbinsäure.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines biologischen Schutzmittels, das Gluconsäure und/oder Mannonsäure und/oder Galacturonsäure produziert, und insbesondere Gluconsäure.
  • Mit „wirksame Menge" einer Zuckersäure ist eine Menge gemeint, die wirksam ist, das Wachstum und/oder die Reproduktion des pilzlichen Pathogens zu verhindern oder, alternativ, das pilzliche Pathogen abzutöten, ohne dabei an der Gesundheit oder Lebensfähigkeit der Pflanze, der die Zuckersäure verabreicht wird, signifikante nachteilige Effekte zu verursachen. Die wirksame Menge des verabreichten biologischen Schutzmittels wird in Abhängigkeit von der Natur des Pilzpathogens und der durch die Verabreichung produzierten Zuckersäure abhängen.
  • Fachleute werden in der Lage sein, mittels empirischer Standardansätze eine wirksame Menge des zu verabreichenden biologischen Schutzmittels zu bestimmen, wobei die einzige Erfordernis die Verfügbarkeit eines geeigneten Bioassays für das pilzliche Pathogen ist. Solche Verfahren werden Fachleuten wohlbekannt sein, oder sie werden hier beschrieben. Im allgemeinen ist es nicht essentiell für die Durchführung eines Bioassays, der das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit eines pilzlichen Pathogens testet, dass er Wirtszellen beinhaltet, die der Pilz normalerweise infiziert, vorausgesetzt, dass geeignete in vitro-Kulturbedingungen etabliert wurden, die das Wachstum des pilzlichen Pathogens erlauben. Wenn kein derartiger Assay verfügbar ist, so können Bioassays unter Verwendung geeigneter Pflanzenwirte oder isolierter Zellen oder Gewebe durchgeführt werden, die als Nährstoffquelle für das pilzliche Pathogen fungieren.
  • In diesem Zusammenhang haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass der Agar-Pfropfen-Test, der von Poplawsky et al. (1988) beschrieben wurde, besonders nützlich ist, um das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit eines breiten Spektrums von Pilzpathogenen von Pflanzen zu bestimmen, einschließlich Alternaria spp., A. mellea, A. oligosporus, B. granulatus, B. cinerea, E. purpurescens, F. annosus, G. graminis var tritici, M. fructicola, P. sulphureus und V. dahliae.
  • Um die Wirksamkeit eines jeden spezifischen biologischen Schutzmittels, das eine Zuckersäure produziert, bei der Kontrolle eines Pilzpathogens zu bestimmen, werden verschiedene Dosierungen einer Zuckersäure, die von dem biologischen Schutzmittel produziert wird, auf ihre Fähigkeit getestet, pilzliches Wachstum zu verlangsamen oder zu hemmen oder, alternativ, das pilzliche Pathogen abzutöten, wobei dies im Vergleich mit der Wirksamkeit einer oder mehrerer als Negativ- und/oder Positivkontrolle dienender Verbindungen erfolgt. Geeignete Negativkontrollen beinhalten die Verwendung eines geeigneten Wachstumsmediums, das als Ersatz für die Zuckersäure den korrespondierenden Aldosezucker oder das korrespondierende Lacton enthält, oder alternativ ein Fehlen der Testverbindungen im Wachstumsmedium. Eine geeignete Positivkontrolle beinhaltet die Verwendung eines geeigneten Wachstumsmediums mit Gluconsäure bei einer Konzentration, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum des getesteten pilzlichen Pathogens hemmt, oder von der bekannt ist, dass sie das getestete pilzliche Pathogen abtötet.
  • Sobald die Parameter festgelegt wurden, innerhalb derer eine bestimmte Zuckersäure, die von dem biologischen Schutzmittel produziert wird, pilzliches Wachstum und/oder Reproduktion hemmen wird, ist es für das zu testende biologische Schutzmittel bevorzugt, dass man weiterhin sicherstellt, dass es keine nachteiligen Wirkungen erzeugen oder schwere Kontraindikationen bei dem Wirt haben wird.
  • Das biologische Schutzmittel wird im Falle therapeutischer Behandlungen im allgemeinen an der Stelle der Infektion verabreicht. Alternativ, im Falle prophylaktischer Behandlungen, wird das biologische Schutzmittel im allgemeinen an einer wahrscheinlichen Infektionsstelle verabreicht werden, oder zumindest in einer Form, die für den Transport zu einer wahrscheinlichen Infektionsstelle geeignet ist.
  • Das biologische Schutzmittel produziert die Zuckersäure, wenn es in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird, die eine Aldose umfasst. Solche biologischen Schutzmittel können aus natürlichen Quellen isoliert werden (wie z.B. der Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosyntheseeigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif), oder sie können aus einer beliebigen oder mehreren Mutanten oder Derivaten eines natürlich vorkommenden Organismus bestehen (z.B. einer Mutante oder einem Derivat des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif oder einer Mutante oder einem Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 mit den Zuckersäurebiosyntheseeigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif), und zwar einschließlich eines gentechnisch veränderten Organismus, wobei die einzige Erfordernis darin besteht, dass das biologische Schutzmittel die biologischen Kontrolleigenschaften des Pseudomonas sp.-Stammes AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) besitzt, dazu befähigt ist, die Gewebe oder Zellen zu besiedeln, die normalerweise von dem Pilzpathogen infiziert werden und dazu befähigt ist, eine gegen Pilze wirksame Menge einer Zuckersäure zu produzieren. Bevorzugt ist das biologische Schutzmittel des weiteren beschränkt im Hinblick auf die Zelltypen, die es im Wirt besiedeln kann, wie z.B. eine nicht-pathogene Form des jeweiligen Pathogens.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht das biologische Schutzmittel aus einem nicht-pathogenen Bakterium.
  • Es ist bevorzugt, dass das biologische Schutzmittel aus einem nicht-pathogenen Stamm eines Bakteriums besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Frankia sp., und Pseudomonas sp. Im Fall von Agrobacterium sp. sollte der Stamm idealer Weise ein Stamm sein, der keine schädigende Krongallen-Erkrankung hervorruft oder keine Phytohormone, wie z.B. Auxine, Gibberelline oder Zytokine auf Niveaus produziert, die dazu befähigt sind, atypische Entwicklungsmuster bei der Pflanze zu induzieren. Stämme, die für die Verwendung zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten z.B. Derivate des A. tumefaciens-Stammes LBA4404, Derivate des A. tumefaciens-Stammes AGL1 und den Pseudomonas-Stamm AN5 und Derivate hiervon.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht das biologische Schutzmittel aus einem Isolat von Pseudomonas, beispielhaft vertreten durch den Pseudomonas-Stamm AN5rif oder eine Mutante oder ein Derivat hiervon oder eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5. Für diese Stämme ist durch die vorliegenden Erfinder gezeigt worden, dass sie von besonderem Nutzen beim Schutz von Pflanzen gegen den Take-all-Pilz G. graminis var tritici sind, und zwar bedingt durch ihre Fähigkeit, die Wurzel-Rhizosphäre einer Weizenpflanze oder eines anderen Wirts von G. graminis var tritici zu besiedeln und eine Zuckersäure zu produzieren, wenn sie in Gegenwart eines Aldosesubstrats kultiviert werden.
  • Bei Anwendung auf ein biologisches Schutzmittel, das in seinem nativen Zustand eine Zuckersäure produziert, wie z.B. eine Mutante oder ein Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5, ist die hier erfolgende Bezugnahme auf „Mutanten" und „Derivate" so zu verstehen, dass sie diejenigen Mutanten mit einer verbesserten Besiedelungseigenschaft und/oder einer gesteigerten Kapazität zur Zuckersäurebiosynthese und/oder einer gesteigerten Sekretion von Zuckersäure im Vergleich mit dem natürlich vorkommenden Isolat bezeichnet, wobei dies beliebige auxotrophe Mutanten, Replikationsmutanten und rekombinante Stämme einschließt, die durch Einsetzen von zusätzlichem genetischen Material erzeugt wurden, wie z.B. extrachromosomalen Plasmiden oder integrierter DNA oder transponierbaren genetischen Elementen. Wie hier verwendet, ist der Begriff „Sekretion" so zu verstehen, dass er sowohl aktiven Transport als auch Diffusionsprozesse einschließt, die in der extrazellulären Position der von einer Zelle produzierten Zuckersäure resultieren.
  • Bei Anwendung auf Bakterien, die nicht die Befähigung besitzen, in ihrem nativen Zustand Zuckersäuren zu produzieren und/oder zu sekretieren, wie z.B. A. tumefaciens, sind die Begriffe „Mutante" und „Derivat" so zu verstehen, dass sie das natürliche Isolat meinen, das der Mutagenese unterzogen wurde und/oder genetisch umgestaltet wurde, um so die Zuckersäure zu produzieren und/oder zu sekretieren, wenn eine Anzucht auf einem geeigneten Aldose-Substrat erfolgt. Dies kann z.B. dadurch erfolgen, dass man einen Organismus genetisch umgestaltet oder mutiert, um ein Pyrrolochinolin-Chinon-abhängiges (PQQ-abhängiges) Zuckeroxidase-Enzym zu exprimieren.
  • Bei Anwendung auf Bakterien, die nicht die Fähigkeit besitzen, die gleichen Zellen wie das Pilzpathogen zu besiedeln, sind die Begriffe „Mutante" und „Derivat" so zu verstehen, dass sie das natürliche Isolat meinen, das der Mutagenese unterzogen wurde und/oder genetisch umgestaltet wurde, um so die Fähigkeit zu erlangen, die gleichen Zellen oder Gewebe zu besiedeln wie diejenigen, die von dem Pilzpathogen infiziert werden.
  • Besonders nützliche Mutanten und Derivate beinhalten weiterhin diejenigen Organismen mit veränderten Zellmembran- oder Zellwandkomponenten. Gemäß dieser Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein gegen Rifampicin resistentes Derivat des Pseudomonas-Stammes AN5 bereit, das hier im Folgenden als Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) bezeichnet wird, und das eine höhere Antipilz-Aktivität gegen G. graminis var. tritici aufweist als das natürlich vorkommende Isolat, der Pseudomonas-Stamm AN5.
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5 rif ist bei den Australian Government Analytical Laboratories (AGAL), 1 Suakin street Pymble 2073, New South Wales, Australien, am 28. Januar 2000 gemäß den Vorgaben des Budapest-Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt worden und bekam die AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624 zugeteilt.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden der Pseudomonas-Stamm AN5 oder der Pseudomonas-Stamm AN5rif für die Verwendung als biologische Schutzmittel zur Durchführung der vorliegenden Erfindung weiter verbessert, indem man zusätzliche Kopien der genetischen Sequenzen einführt, die, wenn sie exprimiert werden, den Organismus zur Produktion von Zuckersäuren befähigen. Derartige Verbesserungen können, unter anderem durch für Fachleute bekannte Prozeduren, mittels Standard-Transformations/Transfektions-Prozeduren für Bakterien oder durch Transposon-Mutagenese, erzeugt werden.
  • Mittel zur Produktion von Mutanten werden Fachleuten wohlbekannt sein; sie beinhalten u.a. die Verwendung chemischer und physikalischer Mutagene, sowie Transposon-Mutagenese. Besonders bevorzugte chemische Mutagene beinhalten EMS und Methansulfonsäure-Ethylester.
  • Wie Fachleuten bekannt sein wird, führt EMS im allgemeinen Punktmutationen in einer zufälligen, nicht zielgerichteten Weise in das Genom einer Zelle ein, sodass die Anzahl an Punktmutationen, die in ein Genom eingeführt wird, proportional zur verwendeten Konzentration des Mutagens ist. Dementsprechend werden zur Identifizierung einer bestimmten Mutation im allgemeinen große Zellpopulationen mit EMS behandelt, und die Auswirkung der Mutation wird dann in den mutierten Zellen durchgetestet, oder, gebräuchlicher, in den Nachkommenzellen hiervon. Verfahren zur Applikation und Verwendung chemischer Mutagene, wie etwa von EMS, sind Fachleuten wohlbekannt.
  • Bevorzugte physikalische Mutagene beinhalten die Bestrahlung von Zellen, insbesondere die Ultraviolett- und Gamma-Bestrahlung von Zellen, um Punktmutationen in ein oder mehrere Gene einzuführen, die im Genom der Zelle vorliegen, oder, alternativ, um chromosomale Deletionen im Genom zu erzeugen. Verfahren zur Applikation und Verwendung derartiger Mutagene sind Fachleuten wohlbekannt.
  • Insertionsmutagenese kann erreicht werden, indem man ein DNA-Molekül, das Gene für die Biosynthese von Zuckersäuren codiert, in einer exprimierbaren Form in ein oder mehrere Gene einführt, die im Genom einer Zelle vorhanden sind, sodass die Befähigung der Zelle, eine Aldose zur Zuckersäure umzusetzen, gesteigert wird. Alternativ kann ein Nukleinsäuremolekül in die Zelle eingeführt werden, das zur Inaktivierung eines negativen Regulators eines Gens, das zur Biosynthese einer Zuckersäure benötigt wird, befähigt ist.
  • Bevorzugte DNA-Moleküle zum Einführen von Genen in Zellen, insbesondere Bakterien- oder Pflanzenzellen, beinhalten Transposon-Moleküle und T-DNA-Moleküle. Die Verwendung von Transposons hat den Vorteil, einen Marker für die Klonierung von genetischem Material bereitzustellen, das befähigt ist, Moleküle zu codieren, die dafür benötigt werden, die Umsetzung einer Kohlenstoffquelle zu einer korrespondierenden Zuckersäure zu katalysieren oder anderweitig zu erleichtern. Es sind zahlreiche Transposons für die Verwendung in bakteriellen und pflanzlichen Systemen bekannt, einschließlich Tn10 (bakteriell), Tn5 (bakteriell), Spm (Pflanze), Ac/Ds (Pflanze) und DSG (Pflanze), und ihre Verwendung ist gut beschrieben.
  • Verfahren für die Herstellung geeigneter biologischer Schutzmittel sind hier beschrieben.
  • Die hier beschriebenen biologischen Schutzmittel, einschließlich Mutanten und Derivaten, sind von Nutzen für die Herstellung von Zusammensetzungen für die Behandlung von Pilzinfektionen bei Pflanzen und Tieren, und die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf alle derartigen Anwendungen. Beispielsweise können die Organismen bei der Fermentation oder unter anderen Kulturbedingungen verwendet werden, um die Zuckersäure herzustellen, die dann unter Verwendung konventioneller Extraktions- und/oder Reinigungsprozeduren aus den Zellen extrahiert werden kann, oder alternativ kann eine Sekretion in das Wachstumsmedium erfolgen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine pflanzenschützende Zusammensetzung für die Behandlung einer Pilzinfektion einer Pflanze bereit, umfassend eine wirksame Menge des biologischen Schutzmittels in Kombination mit einem phytopathologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Benetzungsmittel.
  • Das Benetzungsmittel kann jedwede Verbindung sein, die befähigt ist, die epidermale Schicht und/oder die wächserne Schicht eines Pflanzengewebes zu durchdringen, wie etwa, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein nicht-ionisches Detergens.
  • Bevorzugt umfasst die pflanzenschützende Zusammensetzung ein biologisches Schutzmittel, das die Zuckersäure in Gegenwart des geeigneten Aldosesubstrats mittels der Expression eines darin befindlichen PQQ-abhängigen Zuckeroxidase-Enzyms produziert. Zusätzlich kann die pflanzenschützende Zusammensetzung in Form eines Sprays, einer Emulsion oder eines trockenen Pulvers vorliegen.
  • Obwohl es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung auf irgendeine Theorie oder Wirkungsweise zu beschränken, wird vorgeschlagen, dass der Pseudomonas-Stamm AN5 oder ein Derivat hiervon, insbesondere der Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder ein anderer Organismus, der die hier beschriebene, für Zucker-Oxidase codierende Nukleotidsequenz trägt (optional mit der hier vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenz des PQQ-Biosynthesegens), eine Aldose, wie etwa D-Glucose, am aldehydischen Kohlenstoffatom oxidiert, um die korrespondierende Zuckersäure zu bilden, wobei der erste Schritt bei dieser Umsetzung von der Glucoseoxidase-(GOD)-Aktivität der PQQ-abhängigen Zuckeroxidase katalysiert wird, woran die Bildung eines Lactons beteiligt ist, und wobei der zweite Schritt bei dieser Umsetzung durch die Lactonase-Aktivität der PQQ-abhängigen Zucker-Oxidase katalysiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Beispiele und Zeichnungen weiter beschrieben. Die Beispiele, die die Wirksamkeit des Pseudomonas-Stammes AN5 bei der Kontrolle einer Pilzinfektion in Pflanzen oder die Produktion von Zuckersäuren durch den Pseudomonas-Stamm AN5 beschreiben, sind nur für veranschaulichende Zwecke oder Vergleichszwecke einbezogen und befinden sich nicht im Bereich der beanspruchten Materie.
  • BEISPIEL 1
  • Verwendung des Pseudomonas-Stammes AN5 als biologisches Schutzmittel gegen G. graminis var tritici (Schwarzbeinigkeit)
  • In klein angelegten Feldversuchen waren die Erfinder in der Lage, die Weizenausbeuten an verschiedenen Trockenland-Versuchsstellen in New South Wales, Australien, durch die Applikation des Pseudomonas-Stammes AN5 konsistent zu steigern, und zwar um 12% bis 36% (p < 0,05) (siehe Tabelle 1). Tabelle 1
    Figure 00210001
    • n.t.
    nicht getestet
    • ^ nicht signifikant
    • * signifikant, mit p < 0,01
  • Nachfolgend hat die Harden District Rural Services (HRS)-Gruppe groß angelegte Versuche unter Verwendung des Pseudomonas-Stammes AN5 in Acre-Anpflanzungen an Versuchsstellen in Harden, New South Wales, Australien, etabliert. Vor dem Beginn des Versuchs gab es an dieser Stelle Schwarzbeinigkeit in signifikantem Maße. Nach der biologischen Schutzbehandlung unter Verwendung des Pseudomonas-Stammes AN5, zeigt die behandelte Anpflanzung bei Überwachung über die Wachstumssaison von Weizen eine Unterdrückung der Erkrankung um 30% bis 40%, wie dies anhand des Ausmaßes der Ausbildung weißer Köpfe und einer optischen Überprüfung der Symptome an den Wurzeln bestimmt wurde. Zusätzlich zeigte eine Bestimmung des Ertrags der Weizenpflanzen unter Verwendung eines bioinformatischen, Satelliten-basierten Global Positioning Systems (GPS) zur genauen Ortung der abgeernteten Nutzpflanze und eines NIH-Bildanalysators an, dass es aufgrund des biologischen Schutzes, der von dem Pseudomonas-Stamm AN5 verliehen wurde, eine 20%ige Steigerung des Weizenertrags gab.
  • Bei biologischen Schutzprotokollen ist das Überleben der Bakterien des Pseudomonas-Stammes AN5 an den Wurzeln der Pflanze und im Boden einer der wichtigsten Faktoren für einen wirksamen Schutz durch biologische Kontrolle. Ein typisches Überlebensmuster von Bakterien des Pseudomonas-Stammes AN5 an Weizenwurzeln über eine Saison besteht darin, dass diese zahlenmäßig abnehmen. Die Geschwindigkeit der Abnahme des Pseudomonas-Stammes AN5 hängt mit dem Feuchtigkeitsgehalt im Boden zusammen. Bei verschiedenen Bodentypen und an verschiedenen Feldstellen nehmen die Zahlen für den Pseudomonas-Stamm AN5, die im Boden vorhanden sind, über eine Reihe von Saisonzeiten ab. Zu Beginn der Saison bauen sich hohe Bakterienanzahlen auf (etwa 106–107 pro Gramm Weizenwurzel) wobei die Zahlen zum trockeneren Ende der Saison hin abfallen. In sehr trockenen Jahren wird ein viel dramatischerer Abfall bei der Anzahl der Bakterien an den Weizenwurzeln beobachtet, und dies korreliert gut mit dem Verlust an Schutz durch biologische Kontrolle.
  • BEISPIEL 2
  • Biologische Kontrolle von Botrytis fabae (Schokoladenflecken-Pilz) unter Verwendung des Pseudomonas-Stammes AN5
  • Die Schokoladenflecken-Krankheit (verursachendes Agens: Botrytis fabae) ist eine wichtige Erkrankung von Fababohnen. Derzeit werden während der Wachstumssaison mehrere Male Fungizide appliziert.
  • Wir haben gezeigt, dass der Pseudomonas-Stamm AN5 wirksam gegen die Schokoladenfleckenkrankheit der Fababohne ist, und in der Lage ist, das Wachstum von B. fabae bei in vitro durchgeführten Bioassays zu unterdrücken.
  • Im Gewächshaus waren die vorliegenden Erfinder in der Lage, Schokoladenflecken zu induzieren, indem sie den Pilz B. fabae auf die Pflanze aufsprühten. Die Symptome der Erkrankung waren innerhalb weniger Tage nach dem Aufsprühen zu beobachten. Es wurde eine Skala entworfen, um die Schwere der Krankheitssymptome zu erfassen, und, unter Verwendung dieser Skala, wurde für Pflanzen, die entweder vor oder nach der Beimpfung mit B. fabae mit biologischen Kontrollbakterien eingesprüht worden waren, die den Pseudomonas-Stamm AN5 umfassen, gezeigt, dass sie im Verhältnis zu den unbehandelten Pflanzen um bis zu 90% reduzierte Symptome aufwiesen. Die vorliegenden Erfinder haben ferner gezeigt, dass ein bis zu 95% Schutz gegen die Schokoladenflecken-Krankheit erhalten werden kann, wenn man mit dem Pseudomonas-Stamm AN5 animpft.
  • Wir haben weiterhin gezeigt, dass Zuckersäuren, wie etwa Gluconsäure, das Wachstum und/oder die Reproduktion des Pilzes B. fabae in in vitro durchgeführten Bioassays supprimieren können. Dementsprechend liegt es im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren transgene Fababohnenpflanzen herzustellen, die Zuckersäuren produzieren, um die Toleranz der Fababohnen gegenüber B. fabae zu steigern.
  • BEISPIEL 3
  • Die Identifizierung einer Antipilz-Verbindung in Pseudomonas sp., die aktiv ist gegen G. graminis var tritici (Schwarzbeinigkeit)
  • Mikrobiologische und molekularbiologische Verfahren
  • Es wurden Standardverfahren verwendet, wie von Nayudu und Hollaway (1981), Nayudu und Rolfe (1987), Nayudu et al. (1994a) und Nayudu et al (1994b) beschrieben.
  • Bakterienstämme
  • Die Pseudomonas-Stämme, die als AN5, Pf5 und AN5 rif bezeichnet werden, besitzen Anti-Pilzaktivität gegen Schwarzbeinigkeit (Take all-Pilz) und wurden bei sämtlichen Versuchen verwendet, sofern nicht anders angegeben. Die mutanten Stämme AN5-MN1 und AN5-MN2 besitzen keine signifikante Antipilzaktivität und wurden als Negativkontrollen verwendet, wenn nicht anders abgegeben.
  • Prozedur des Bioassays
  • Es wurde eine Modifikation des Agar-Pfropfen-Tests (Poplawsky et al., 1988) verwendet, um auf Bioaktivität bei den Extrakten des Pseudomonas-Stammes AN5 oder Derivat-Stämmen hiervon gegenüber dem Take-all-Pilz zu testen, wobei ein Agar overlay-Test verwendet wurde, um auf die Aktivität spezifischer Faktoren hin zu testen. Dieser Test beinhaltet das Einweichen des in Kartoffel-Dextrose (PD)-Brühe herangezogenen Take-all-Pilzes und dessen Aussaat auf einem Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Overlay. Dieser PDA-Overlay wurde auf dicke PDA-Platten gegossen. Die auf Aktivität hin zu testenden Fraktionen wurden auf die Oberseite des Overlay getupft, die Platten wurden dann getrocknet und bei 16°C für 3–5 Tage inkubiert.
  • Extraktion und Analyse der Anti-Pilz-Verbindung
  • Die Bakterien des Pseudomonas sp.-Stammes AN5 wurden in 250 ml-Kolben bei 25°C für zwei Tage kultiviert, wobei Kartoffel-Dextrose-Brühe als Wachstumsmedium verwendet wurde. Nach dieser Kulturphase wurden 150 ml Isopropanol zu 90 ml der Zellkultur hinzu gegeben, und die Lösung wurde durch Schütteln für 15 Minuten gemischt, wonach die Zellen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 5.000 rpm gesammelt wurden. Der Überstand wurde abgenommen und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 40°C eingedampft. Der eingedampfte Rohansatz wurde in 100 ml Ethanol (3 × 30 ml) gelöst. Zu der in Ethanol unlöslichen Verreibung wurden 50 ml Wasser hinzugegeben, gefolgt von 50 ml Aceton, um proteinöses Material zu präzipitieren.
  • Die resultierende Suspension wurde zentrifugiert, und eine Gesamtheit von 0,02 ml, abgenommen von dem Überstand, ebenso wie von der ethanolischen Lösung, wurde mittels einer Mikropipette (Gilson Pipette) auf eine Kieselgel G F254 TLC-Platte (Aszalos et al., 1968) appliziert. Es wurde eine Dünnschichtchromatographie mit dem Rohextrakt durchgeführt, wobei verschiedene Lösungsmittelsysteme verwendet wurden:
    • 1. Methanol;
    • 2. Methanol:Chloroform [1:9 (Vol./Vol.)];
    • 3. Chloroform;
    • 4. Pyridin:Wasser [1:1 (Vol./Vol.)];
    • 5. Pyridin:Wasser:Ethanol [1:1:1 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 6. Pyridin:Wasser:Ethanol [1:1:3 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 7. 2-Propanol:Wasser [17:3 (Vol./Vol.)];
    • 8. 2-Propanol:Wasser [4:1 (Vol./Vol.)];
    • 9. 2-Propanol:Wasser [7:3 (Vol./Vol.)];
    • 10. Aceton:Wasser [9:1 (Vol./Vol.)];
    • 11. Aceton:n-Butanol:Essigsäure:Wasser [8:0,5:0,5:1 (Vol./Vol./Vol./Vol.)];
    • 12. n-Propanol:Wasser [7:1 (Vol./Vol.)];
    • 13. n-Propanol:Wasser [7:1,5 (Vol./Vol.)];
    • 14. n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:1:4 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 15. n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 16. n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5,5:2:2,5 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 17. Methylacetat:2-Propanol:Wasser [18:1:1 (Vol./Vol./Vol.)];
    • 18. 2-Propanol:Ethylacetat:Wasser [1:1:2 (Vol./Vol./Vol.)] und
    • 19. 2-Propanol:Ethylacetat:Wasser [6:1:3 (Vol./Vol./Vol.)].
  • Die große Anzahl an Lösungsmittelsystemen wurde für Versuche verwendet, um die Auflösung der aktiven Anti-Pilz-Verbindung des Pseudomonas sp.-Stammes AN5 auf den Siliziumdioxid-TLC-Platten zu verbessern.
  • Um zu bestimmen, ob irgendeine bestimmte Verbindung auf den TLC-Platten Anti-Pilz-Aktivität besitzt, wurde der oben beschriebene Bioassay modifiziert, sodass der PDA-Overlay, der mit dem Take-all-Pilz beimpft war, auf die TLC-Platten gegossen und für eine Woche bei 16°C inkubiert wurde. Die aktiven Fraktionen wurden durch das Erscheinen geklärter Zonen auf den Platten in einem lichtundurchlässigen Hintergrund des kultivierten Pilzes identifiziert.
  • Bei der Verwendung dieses Bioassays wanderte die Verbindung im Pseudomonas-Stamm AN5 mit Antipilz-Aktivität gegen den Take-all-Pilz nicht vom Ausgangspunkt weg, wenn die Lösungsmittelsysteme mit Methanol, Methanol:Chloroform [1:9 (Vol/Vol.)] oder Chloroform verwendet wurden. Die biologische Aktivität wurde auf den TLC-Platten getestet, und ebenso nach dem Abkratzen von Banden und Extrahieren der Verbindungen von den Platten auf PDA-Platten. Insbesondere gab es eine Klärungszone an den Ausgangspunkten dieser TLC-Platten sowie ebenso auf den PDA-Platten mit derselben aktiven Fraktion (1).
  • Unter Verwendung von TLC in Verbindung mit diesem Bioassay wurde für die bioaktive, gegen Pilze wirksame Verbindung aus dem Pseudomonas-Stamm AN5 gezeigt, dass diese einen Rf-Wert von etwa 0,7 besitzt, wenn ein Lösungsmittelsystem mit Pyridin:Wasser:Ethanol [1:1:1 (Vol./Vol./Vol.)] oder Pyridin:Wasser:Ethanol [1:1:3 (Vol./Vol./Vol.)] verwendet wurde, jedoch war die Auflösung der Verbindung bei diesem System ebenfalls schwach.
  • Kieselgel-Reversphasen-Dünnschichtchromatographie (SGRPTLC) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems mit Acetonitril:Methanol:Wasser war nicht befähigt, eine bessere Auflösung zu erzielen als diese TLC-Lösungsmittelsysteme.
  • Wir testeten nachfolgend Lösungsmittelsysteme, die üblicherweise bei der Auftrennung von Kohlenhydraten angewandt werden, insbesondere organische Lösungsmittel binärer oder ternärer Zusammensetzung. Wasser ist ein unverzichtbarer Bestandteil solcher Lösungsmittelsysteme, da wasserfreie Lösungsmittel oder Lösungsmittel mit geringem Wassergehalt diffuse Flecken erzeugen, wie diese für Rohextrakte von AN5 und Mutanten hiervon erhalten wurden (Ghebregzabher et al., 1976).
  • Von der großen Anzahl oben aufgelisteter Lösungsmittelsysteme war nur ein System, n-Propanol:Ethylacetat:Wasser, erfolgreich bei der Auflösung des Antipilz-Bestandteils des Pseudomonas-Stammes AN5 bei TLC-Prozeduren, wobei optimale Ergebnisse erhalten wurden, wenn man n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Vol./Vol./Vol.)] verwendete. Die Daten sind in 2 dargestellt. Dieses Lösungsmittelsystem wird normalerweise verwendet, um Hexoseamine aufzutrennen (Ghebregzabher et al., 1976; Gal, 1968). Dementsprechend deuten diese Daten darauf hin, dass die Antipilz-Verbindung des Pseudomonas-Stammes AN5 ein Kohlenhydrat-artiges Molekül sein könnte.
  • BEISPIEL 4
  • Reinigung einer Antipilz-Verbindung in Pseudomonas sp., die Aktivität gegen G. graminis var tritici (Schwarzbeinigkeit) besitzt
  • Adsorptionschromatographie auf Säulen oder auf TLC-Platten ist ein nützliches Verfahren zur Abtrennung und Reinigung einfacher Zucker, Zuckerderivate und Oligosaccharide. Diese Technik ist jedoch zeitaufwändig und resultiert aufgrund der Schwanzbildung von Banden oft in einer schlechten Auflösung. Daher folgten die Erfinder der wesentlich schnelleren Technik der „Blitz-Chromatographie", um die Verbindung zu reinigen (Still et al., 1978). Blitzchromatographie ist im wesentlichen ein von Luftdruck angetriebenes Hybrid aus Mediumdruck- und Kurzsäulen-Chromatographie.
  • Biologisch aktive Extrakte des Pseudomonas-Stammes AN5 oder der Mutanten AN5-MN1 oder AN5-MN2 wurden auf Kieselgelsäulen aufgetrennt, wobei eine SGRPTLC mit n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Vol./Vol./Vol.)] als Lösungsmittelsystem verwendet und im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Still et al., (1978) vorgegangen wurde.
  • Partiell gereinigte Extrakte (d.h. Säulenfraktionen) des Pseudomonas-Stammes AN5 oder der Mutanten AN5-MN1 oder AN5-MN2 wurden unter Verwendung des standardisierten Lösungsmittelsystems (d.h. n-Propanol:Ethylacetat:Wasser [5:2:3 (Vol./Vol./Vol.)]) auf TLC-Platten aufgetrennt, und verschiedene Banden wurden abgekratzt und extrahiert. Die extrahierten Verbindungen des Pseudomonas-Stammes AN5 wurden auf PDA-Platten auf ihre Antipilz-Aktivität hin getestet, wobei der Bioassay verwendet wurde, der im vorstehenden Beispiel beschrieben wurde. Der Bioassay wurde auch unter Verwendung der modifizierten Prozedur auf TLC-Platten durchgeführt, um die Aktivität der interessierenden Bande zu bestätigen. Die aktiven Fraktionen, die ähnliche aktive Banden auf den TLC-Platten besitzen, wurden für die weitere Analyse vereint.
  • Wie in 3A dargestellt, wurde für die bioaktiven Säulenfraktionen des Pseudomonas-Stammes AN5 auch unter Verwendung der TLC gezeigt, dass sie biologische Aktivität besitzen, wobei sie bis zu einem Punkt wanderten, der einem Rf-Wert von etwa 0,75 auf dem TLC entsprach. Im Gegensatz dazu waren die entsprechenden Kieselgelfraktionen, die aus den biologisch inaktiven Mutanten AN5-MN1 oder AN5-MN2 extrahiert wurden, inaktiv bei dem Bioassay, der auf TLC-Platten mit einer PDA-Überschichtung durchgeführt wurde, was nahelegt, dass die aktive Fraktion des Pseudomonas-Stamm-AN5-Extrakts spezifisch wirkte.
  • Jedoch nahm man nicht an, dass die aus den Extrakten des Pseudomonas-Stammes AN5 erhaltenen Kieselgel-Säulenfraktionen reine Verbindungen enthalten, da auf TLC-Platten, die diese Fraktionen enthielten, zahlreiche Banden beobachtet wurden (3A).
  • Die bioaktive Verbindung wurde weiter gereinigt, indem man vereinte aktive Fraktionen des Pseudomonas-Stammes AN5 auf einer TLC auftrennte und die Banden von Interesse ausschnitt. Die Verbindungen in diesen ausgeschnittenen Banden wurden auf ihre Aktivität gegen den Take-all-Pilz auf PDA-Platten getestet und zeigten, dass sie biologische Aktivität besitzen (4).
  • BEISPIEL 5
  • Chemische Charakterisierung einer Anti-Pilz-Verbindung in Pseudomonas sp., die gegen G. graminis var tritici (Schwarzbeinigkeit) aktiv ist, als Zuckersäure
  • Die aktiven Fraktionen mit Antipilz-Wirkung aus dem Pseudomonas-Stamm AN5 wurden mittels 1H NMR und 13C NMR weiter analysiert, und das Massenspektrum der Verbindungen wurde bestimmt, um die Struktur der biologisch aktiven Verbindung zu bestimmen.
  • Wie in 5A gezeigt, ergab die 1H NMR der aktiven Fraktion, die unter Verwendung von Kieselgel und TLC gemäß der Beschreibung im vorstehenden Beispiel gereinigt worden war, Peaks mit Resonanzen bei 5,09, 3,57, 3,69, 3,39, 3,26, 3,69 und 3,63, wobei diese Resonanzen den Protonen entsprechen, die sich an den Kohlenstoffatomen C1, C2, C3, C4, C5 und C6 befinden, was nahelegt, dass die aktive Verbindung eine Kohlenstoff-enthaltende Verbindung ist. Es wurden außerdem Peaks bei 3,99, 3,89, 3,62, 3,62, 3,68 und 3,52 beobachtet, die für C2 bis C6 von Gluconsäure charakteristisch waren.
  • Wie in 5B dargestellt, erbrachte die 13C NMR der aktiven Fraktion, die unter Verwendung von Kieselgel und TLC gemäß der Beschreibung im vorstehenden Beispiel gereinigt worden war, Peaks mit Resonanzen bei 94,67, 75,35, 74,07, 74,02, 72,23 und 63,16, die charakteristisch für die Kohlenstoffatome C1 bis C6 von α-D-Glucose sind, sowie Peaks mit Resonanzen bei 98,49, 78,53, 78,34, 76,71, 72,19 und 63,32, die charakteristisch für C1 bis C6 von β-D-Glucose sind, und Peaks mit Resonanzen bei 181,2, 76,67, 73,54, 75,16, 73,76 und 65,2, die charakteristisch für C1 bis C6 von Gluconsäure sind.
  • Wie in 5C dargestellt, deutete die Massenspektrumanalyse der aktiven Fraktionen, die aus dem Kieselgel und der TLC stammen, wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, ebenfalls darauf hin, dass D-Glucose und Gluconsäure in der aktiven Fraktion vorhanden waren.
  • Ausgehend von der Grundannahme, dass die aktive Verbindung eine Zuckersäure ist, wurden reine Gluconsäure und andere Zuckersäuren unter Verwendung des PDA-Platten- Bioassays auf ihre Bioaktivität gegen Take-all getestet. Wie in 6A gezeigt, besaß gereinigte Gluconsäure starke biologische Aktivität gegen den Take all-Pilz. Die in 6B dargestellten Daten zeigen außerdem an, dass gereinigte Apfelsäure, Ascorbinsäure, Glutarsäure und Glucuronsäure bei den getesteten Konzentrationen Aktivität gegen den Take-all-Pilz besitzen.
  • Außerdem ist die aktive Verbindung, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produziert wird, verschieden von den Antipilz-Verbindungen, die von den anderen Bakterienstämmen produziert werden. Die beiden Bakterienstämme, als Pseudomonas-Stamm AN5 und Pseudomonas-Stamm Pf5 bezeichnet, die Antipilz-Aktivität gegen den Take-all-Pilz besitzen, wurden gemäß der Prozedur von Keel et al. (1996) auf Anwesenheit von 2,4-Diacetylphloroglucinol getestet. Die Extrakte dieser zwei Bakterienstämme wurden außerdem auf Anwesenheit von Aminen, Zuckern und Carbonylbestandteilen getestet, wobei in der Technik bekannte Ninhydrin-, Silbernitrat- bzw. Dinitrophenylhydrazin-Tests verwendet wurden. Einige der Ergebnisse, die diese Unterschiede anzeigen, sind unten zusammengefasst:
  • 1. Löslichkeit und Pigmentproduktion
  • Phenazin-1-carbonsäure (PCA) ist ein pigmentiertes grünlich-gelbes Antibiotikum, das sich in Kulturen des P. fluorescens-Stammes 2-79 anreichert (Gurusiddaiah et al., 1986). PCA ist hochgradig löslich in Chloroform und Methylenchlorid und unlöslich in Wasser, Methanol und Ethylacetat. Im Gegensatz dazu ist die pilzbekämpfende Verbindung, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produziert wird, hochgradig löslich in Wasser. Darüber hinaus produziert der Pseudomonas-Stamm AN5 gefärbte Pigmente, während er im Medium wächst. In ähnlicher Weise produzieren die 2,4-Diacetylphloroglucinol erzeugenden Stämme von Pseudomonas sp. rote Pigmente, wenn sie auf Kings's B-Medium gezüchtet werden (Keel et al., 1996). Im Gegensatz dazu wurden von dem Pseudomonas-Stamm AN5 keine gefärbten Substanzen produziert, wenn dieser auf King's Medium herangezüchtet wird (7).
  • 2. Auftrennung bei der TLC
  • Das TLC-Profil für das aktive pilzbekämpfende Agens aus dem Pseudomonas-Stamm AN5 stimmte nicht mit denjenigen überein, die für bekannte Antipilzmittel beobachtet wurden. Insbesondere konnten die Zuckersäuren, für die die Eigenschaft pilzbekämpfender Aktivität ermittelt wurde, nicht auf dem TLC aufgetrennt werden, wenn man die Lösungsmittel verwendete, die benötigt werden, um zuvor identifizierte Verbindungen aufzulösen. Bei TLC-Platten aus Kieselgel und unter Verwendung von Chloroform:Methanol [19:1 (Vol./Vol.)] beispielsweise besitzt 2,4-Diacetylphloroglucinol einen Rf-Wert von 0,2, und Pyoluteorin besitzt einen Rf-Wert von 0,5 (Keel et al., 1992). Weiterhin, bei Verwendung von Reversphasen-C18-TLC mit Acetonitril:Methanol:Wasser [1:1:1 (Vol./Vol./Vol.)] als Lösungsmittelsystem, besitzt 2,4- Diacetylphloroglucinol einen Rf-Wert von 0,88, Pyoluteorin besitzt einen Rf-Wert von 0,75, und Pyronitrin besitzt einen Rf-Wert von 0,28 (Rosales et al., 1995 und Pfender et al., 1993). Im Gegensatz dazu zeigte die Zuckersäureverbindung der vorliegenden Erfindung keine Wanderung vom Ausgangspunkt weg, wenn ein Chloroform:Methanol [19:1 (Vol./Vol.)]-Lösungsmittelsystem verwendet wurde (1), und sie zeigte nur eine geringe Auflösung, wenn Acetonitril:Methanol:Wasser [1:1:1 (Vol./Vol./Vol.)] verwendet wurde.
  • 3. Protonen-NMR-Spektren
  • Bei der 1H NMR von PCA werden Protonen-Peaks nur oberhalb von 7 ppm beobachtet (Gurusiddaiah et al., 1986; 8), während in den Spektren der neuen Verbindung keine Peaks in dieser Region beobachtet wurden. Bei der Protonen-NMR von 2,4-Diacetylphloroglucinol sind zwei Peaks bei etwa 6,00 und 2,5 ppm charakteristisch für die Anbindung von Wasserstoff an die sechs Kohlenstoffprotonen bzw. an die sechs Acetyl-Protonen (Keel et al., 1992), und dies stimmte nicht überein mit den Protonen-NMR-Spektren, die für Rohextrakte des Pseudomonas-Stammes AN5 oder des Pseudomonas-Stammes Pf5 erhalten wurden (9).
  • Zusammengefasst zeigen alle diese erhaltenen chemischen Daten an, dass die gegen Pilze wirkende Verbindung des Pseudomonas-Stammes AN5 ein Kohlenhydrat ist, und insbesondere eine Zuckersäure.
  • BEISPIEL 6
  • Von Pseudomonas sp. produzierte Zuckersäuren induzieren eine pH-Änderung im Kulturmedium
  • Der Take-all-Pilz wurde auf Kartoffel-Dextrose-Platten mit dem Indikator-Farbstoff Bromcresol-Violett (0,015 g/l) herangezogen. Nach 6–7 Tagen der Kultur entwickelte sich ein violetter Ring um den Take all-Pilz, was anzeigt, dass das Medium alkalisch war (10B). Somit wachsen die Hyphen des Take-all-Pilzes und setzen Verbindungen in das Medium frei, die von alkalischer Natur sind.
  • Um zu bestimmen, ob dieser alkalisierende Effekt von Take all durch die Zuckersäure der Erfindung modifiziert wird, wurden der Elternstamm, der Pseudomonas-Stamm AN5 und die mutanten Stämme, AN5-MN1, AN5-MN2 und AN5-MN3 auf PDA ausgestrichen, das mit Bromcresol-Violett (0,015 g/l) supplementiert war. Die in 10A präsentierten Daten zeigen, dass der Pseudomonas-Stamm AN5 Medien, die mit 2% (Gew./Vol.) an Glucose supplementiert sind, ansäuert, wenn er darin inkubiert wird, wie dies anhand eines gelben Hofes auf den PDA-Platten in Gegenwart von Bromcresol-Violett detektiert wird. Im Gegensatz dazu war der mutante Stamm AN5-MN1 unfähig, diesen gelben Hof nach 3–4 Tagen zu produzieren (10A). Die Platten mit den Mutanten darauf wurden violett, was ein Anzeichen für den alkalischen Zustand ist. Das Fehlen dieses Farbwechsels wurde für alle Mutanten festgestellt. Diese Daten zeigen, dass, obwohl der Pseudomonas-Stamm AN5 den pH-Wert des PDA-Wachstumsmediums senkt, die Mutanten den pH von PDA steigern. Die Korrelation dieser Daten mit der Antipilz-Aktivität dieser Bakterienstämme unterstützt weiterhin die Schlussfolgerung, dass die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produzierte Antipilz-Verbindung von saurer Natur ist.
  • Die Effekte unterschiedlicher Konzentrationen der gereinigten Säuren auf die Wurzelkrankheit Schwarzbeinigkeit (Take all) ist in Tabelle 2 dargestellt. Die in Tabelle 2 präsentierten Daten legen nahe, dass die Ansäuerung des Mediums eine wichtige Rolle beim Schutz gegen den Take-all-Pilz spielen könnte. Insbesondere ist es so, dass, obwohl Gluconsäure Schutz vor Take all verleiht, das Natriumsalz von Gluconsäure keinen signifikanten Schutz gegen das pilzliche Pathogen verlieh.
  • BEISPIEL 7
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5 produziert verschiedene Zuckersäuren
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5, der auf Nähr-Agar, King's B-Medium oder Malz-Agar ohne Aldose-Substrat herangezüchtet wird, produziert keine signifikanten Mengen an Zuckersäure, wie durch den pH des Mediums angezeigt wird. Extrakte aus diesen Medien besitzen wenig oder keine biologische Aktivität gegen den Take all-Pilz. Außerdem produziert der Pseudomonas-Stamm AN5 auf Kartoffel-Agar (der Stärke als Hauptkohlenstoffquelle enthält) keine Zuckersäure, das Medium ist alkalisch, und es gibt keine biologische Antipilz-Schutzaktivität von Extrakten des Pseudomonas-Stammes AN5 aus Kartoffel-Agar.
  • Im Gegensatz dazu wird starke biologische Aktivität detektiert, wenn der Pseudomonas-Stamm AN5 aus Kartoffel-Dextrose-Medium extrahiert wird, das Glucose als Kohlenstoffquelle enthält. Des weiteren wird der pH dieses Mediums durch die Produktion von Gluconsäure auf natürlichem Wege sauer.
  • Wir haben gezeigt, dass es bei Zugabe einer anderen Kohlenstoffquelle zu dem mit dem Pseudomonas-Stamm AN5 angeimpften Kartoffel-Agar, wie etwa Galactose oder Mannose, zu einer Produktion von Zuckersäuren kommt. Die aus diesen Kulturen extrahierten Medien besitzen biologische Aktivität gegen den Take all-Pilz.
  • Die in den 11A und 11B präsentierten Daten zeigen, dass Galacturonsäure von Kulturen des Pseudomonas-Stammes AN5 produziert wird, wenn diese auf PD-Medium gezüchtet werden, das mit Galactose supplementiert ist.
  • Zusätzlich zeigen Daten, die in den 12A und 12B präsentiert sind, dass Mannonsäure von Kulturen des Pseudomonas-Stammes AN5 produziert wird, wenn diese auf PD-Medium gezüchtet werden, das mit Mannose supplementiert ist.
  • Jedoch sind die biologischen Aktivitäten gegen Take-all bei Mannonsäure oder Galacturonsäure nicht so stark wie bei Gluconsäure. Ausgehend von dem, was über die Effizienz der Umsetzung verschiedener Aldose-Substrate durch Aspergillus sp. bekannt ist, ist es möglich, dass Glucose lediglich effizienter in Zuckersäuren umgesetzt wird als Mannose oder Galactose.
  • BEISPIEL 8
  • Breite Antipilz-Aktivität der von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produzierten Gluconsäure
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5 wurde gegen eine Reihe von Mikroorganismen auf biologischen Schutz hin getestet, wie dies in Tabelle 3 aufgelistet ist, wobei der PDA-Platten-Bioassay verwendet wurde, um die Wirksamkeit von Gluconsäure bei der Wachstumskontrolle dieser Pathogene zu bestimmen. Das Antipilz-Mittel, das von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produziert wird, zeigte Aktivität gegen ein breites Spektrum von Pilzen, die Pflanzenpathogene, Humanpathogene und Saprophyten darstellen. Beim Test gegen Bakterien-Spezies gab es einige Gram-negative und Gram-positive Spezies, die durch das Mittel inhibiert wurden, das von dem Pseudomonas-Stamm AN5 produziert wird, jedoch war das Spezies-Spektrum des Schutzes nicht so breit wie im Falle der Pilze. Der beobachtete Bereich der Inhibition lag im Bereich vollständigen Schutzes bis zu einem nur teilweisen Schutz.
  • TABELLE 2
    Figure 00320001
  • BEISPIEL 9
  • Mutante Stämme von Pseudomonas sp., die modifizierte Aktivität gegen G. graminis var. tritici (Take-all) besitzen
  • Die Erfinder haben natürlich vorkommende Mutanten von Pseudomonas AN5-Bakterien isoliert und neue Stämme von Pseudomonas AN5-Bakterien gentechnisch hergestellt, die verschiedene Mengen an Zuckersäuren produzieren, wenn sie auf Aldose-Substraten herangezogen werden. Dies ist z.B. erreicht worden, indem man den Elternstamm auf verschiedenen Antibiotika kultiviert, durch Einführen eines in vielen Kopien vorliegenden Plasmids (multi-copy plasmid) mit zusätzlichen Antipilz-Genen in den Pseudomonas-Stamm AN5 oder durch Transposon-Mutagenese des Pseudomonas-Stammes AN5. Es sind außerdem Stämme erzeugt worden, die weniger EPS produzieren, um die Sekretion von mehr Zuckersäure in das umgebende Medium zu erleichtern. Diese Mutanten und Derivate des Pseudomonas-Stammes AN5 erzeugen größere Zonen der Klärung bei den Agarplatten-Bioassays. Diese Stämme sind auf ihre Schutzwirkung durch biologische Kontrolle gegen den Take-all-Pilz in Labor- bzw. Gewächshausstudien mit kontrollierter Umgebung getestet worden.
  • Mutanten mit reduzierter Anti-Pilz-Aktivität
  • Mutanten mit reduzierter Antipilz-Aktivität sind besonders nützlich als Negativkontrollen bei Versuchen zur Identifizierung von Antipilz-Verbindungen oder als Vektoren, in die verschiedene Antipilz-Eigenschaften, wie etwa Gene, die für Zucker-Oxidasen codieren, eingeführt werden können.
  • Eine besonders nützliche Mutante, als Pseudomonas-Stamm AN5-M1 bezeichnet, ist ein Einzeltransposon-mutanter Stamm von AN5, der die Antipilz-Aktivität verloren hat. Ein Tn5-Transposon ist in ein Gen inseriert worden, das für die Aktivität gegen den Take-all-Pilz bei dieser Mutante benötigt wird.
  • Es wurden drei Transposon-Mutanten, AN5-MN1, AN5-MN2 und AN5-MN3, isoliert, die die Biokontroll-Aktivität verloren haben, den pilzbekämpfenden Metaboliten nicht produzieren und unfähig sind, die Wurzelerkrankung der Schwarzbeinigkeit bei Weizen zu kontrollieren. Diese Mutanten sind nicht befähigt, Glucose in einem ähnlichen Pathway wie der Elternstamm, der Pseudomonas-Stamm AN5, zu nutzen. Diese Mutanten sind für ein Enzym defizient, das Glucose zur Zuckersäure umsetzt.
  • TABELLE 3 Wirtsspektrum des Schutzes, der von dem Pseudomonas-Stamm AN5 verliehen wird, der in Gegenwart von Glucose-Substrat kultiviert wird
    Figure 00340001
  • Mutanten mit reduzierter Antipilz-Aktivität
  • Mutanten mit reduzierter Antipilz-Aktivität sind besonders nützlich als Negativkontrollen bei Versuchen zur Identifizierung von Antipilz-Verbindungen oder als Vektoren, in die verschiedene Anti-Pilz-Eigenschaften, wie etwa Gene, die für Zuckeroxidasen codieren, eingeführt werden können.
  • Eine besonders nützliche Mutante, die als Pseudomonas-Stamm AN5-M1 bezeichnet wird, ist ein Einzeltransposon-mutanter Stamm von AN5, der die Antipilz-Aktivität verloren hat. Ein Tn5-Transposon ist in ein Gen inseriert worden, das für die Aktivität gegen den Take-all-Pilz bei dieser Mutante benötigt wird.
  • Es wurden drei Transposon-Mutanten, AN5-MN1, AN5-MN2 und AN5-MN3, isoliert, die die Biokontroll-Aktivität verloren haben, den pilzbekämpfenden Metaboliten nicht produzieren und unfähig sind, die Wurzelerkrankung der Schwarzbeinigkeit bei Weizen zu kontrollieren. Diese Mutanten sind nicht befähigt, Glucose in einem ähnlichen Pathway wie der Elternstamm, der Pseudomonas-Stamm AN5, zu nutzen. Diese Mutanten sind für ein Enzym defizient, das Glucose zur Zuckersäure umwandelt.
  • Es wurden zwei weitere Transposon-Mutanten, die das Tn5:uidA-Transposon tragen, über ihre Unfähigkeit, biologischen Schutz gegenüber dem Take-all-Pilz zu verleihen, identifiziert. Diese Mutanten wurden als PQQ– und SOX– bezeichnet. Wie in Beispiel 13 gezeigt, enthalten die Mutanten PQQ– und SOX– das Tn5-Element im pqqD-Gen bzw. im Zuckeroxidase-Gen des Pseudomonas sp.-Genoms.
  • Mutanten mit gesteigerter Antipilz-Aktivität
  • Ein gegenüber Spectinomycin resistenter Stamm, der als Pseudomonas-Stamm AN5 spec bezeichnet wird, wurde als natürlich vorkommende Mutante des Pseudomonas-Stammes AN5 isoliert, indem man auf Wachstum auf dem Antibiotikum Spectinomycin testete. Der Pseudomonas-Stamm AN5spec besitzt adäquate biologische Schutzeigenschaften gegenüber dem Take all-Pilz.
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5 rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) wurde als natürlich vorkommende Mutante des Pseudomonas-Stammes AN5 isoliert, indem man auf Wachstum auf dem Antibiotikum Rifampicin testete. Folglich ist der Pseudomonas-Stamm AN5rif Rifampicin-resistent. Bioassays unter Verwendung dieses Stammes zeigen, dass er überlegene biologische Schutzeigenschaften gegenüber dem Take-all-Pilz besitzt, und zwar sowohl auf PDA-Platten als auch in Topf-Versuchen, wenn man ihn mit dem Elternstamm des Pseudomonas-Stammes AN5spec vergleicht.
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5-M1 wurde modifiziert, indem man ein Cosmid einführte, das den Vektor pLAF3 mit einer darin inserierten wildtypischen Region aus dem Genom des Pseudomonas-Stammes AN5 umfasste. Das Cosmid pLAF3 liegt in Pseudomonas sp. im allgemeinen in mehreren Kopien vor, jedoch ist die Kopienzahl im Vergleich zu vielen bakteriellen Plasmiden relativ gering (10–15 Kopien pro Chromosom). Die Transformanten wurden auf Antipilz-Aktivität gegen Take-all durchgetestet.
  • Es wurde eine Transformante identifiziert, die gegen Take-all ebenso effektiv schützte wie der Elternstamm, der Pseudomonas-Stamm AN5. Jedoch besiedelt dieser modifizierte Bakterienstamm die Wurzeln von Weizen nur schwach, und es gibt sehr geringe Zahlen von Bakterien, die auf den Wurzeln vorhanden sind, wenn man dies mit der Besiedelungsfähigkeit des Elternstammes vergleicht, was darauf hindeutet, dass bei der Transformante jede einzelne Zelle, die die Wurzeln besiedelt, im Vergleich zu einer Einzelzelle des Elternstamms einen höherwertigen Schutz verleiht, wahrscheinlich dadurch, dass höhere Spiegel des Antipilzmittels auf Einzelzellbasis produziert werden. Diese Daten legen außerdem nahe, dass ein effektiverer biologischer Kontrollstamm hergestellt werden kann, wenn man die Befähigung der Einzelzelle erhöht, die Antipilz-Verbindung zu produzieren.
  • Die Erfinder haben auch eine Reihe genetisch modifizierter Stämme erzeugt, die die Wurzeln von Weizen in einer normalen Weise besiedeln und eine größere Klärungs-Zone bei Agarplatten-Bioassays zeigen.
  • Die Erfinder haben außerdem auf gentechnischem Weg eine Anzahl neuer biologischer Schutzstämme hergestellt, die höhere Mengen an Antipilzmittel produzieren, entweder durch Einführen von Multikopien-Plasmiden (z.B. Pseudomonas-Stamm AN5-M1 und Pseudomonas-Stamm AN5-P1) oder durch Erhalt einer Transposon-Mutante dieses Stammes (z.B. Pseudomonas-Stamm AN5-T5).
  • Für diese verbesserten Bioschutz-Stämme wurde in Agarplatten-Bioassays anhand der größeren Klärungszonen gezeigt, dass sie wirksamer gegen Take-all sind. Die Ergebnisse für die Pseudomonas-Stämme AN5-P1 und AN5-T5 zeigten, dass eine Steigerung der biologischen Schutzwirkung gegen den Take-all-Pilz erhalten werden kann, indem man die pilzbekämpfende Natur des Stammes erhöht, ohne dabei die Besiedelungsfähigkeit zu beeinträchtigen. Daher verbessert eine Steigerung der pilzbekämpfenden Aktivität die Fähigkeit zum Schutz durch biologische Kontrolle.
  • In Gewächshausversuchen wurde gezeigt, dass diese modifizierten Stämme signifikant besser schützen als der Elternstamm, der Pseudomonas-Stamm AN5, wie dies anhand einer Bewertung der Symptome an Weizenwurzeln bestimmt wurde. Insbesondere bestimmten wir die Inhibition des Wachstums von G. graminis in Gegenwart dieser Stämme nach dem Animpfen von Töpfen mit dem Pilz bei Hirsesaaten. Die Kontrollproben waren entweder ohne zugegebenen Pilz und zugegebenes Biokontrollbakterium oder mit Pilz ohne Biokontrollbakterium. Es wurde der Erkrankungswert für Take-all bestimmt, wobei eine Skala verwendet wurde, bei der ein numerischer Anzeigewert für den Schweregrad der Erkrankung wie folgt zugeordnet wird: Null = keine Erkrankung; 1 = Erkrankung, die gerade detektierbar ist; und 5 = maximale Erkrankung an der Krone der Pflanze. Am Ende des Versuchs wurden die Pflanzen außerdem getrocknet und gewogen, und ihre Trockengewichte wurden als Prozentanteile des Trockengewichts der Kontrollpflanzen ausgedrückt. Die in Tabelle 4 gezeigten Daten zeigen die mittleren Werte an, die über sechs Behandlungen erhalten wurden. Eine gesteigerte antibiotische Wirkung wird durch die gesteigerten Antipilz-Aktivitäten der gentechnisch erzeugten Stämme im Vergleich zum Elternstamm angezeigt.
  • Bei solchen Topfversuchen, bei denen ein Überschuss an Take-all-Pilz künstlich zu dem Topfmedium hinzugegeben wurde, stellten diese verbesserten Biokontroll-Stämme einen signifikanten Schutz gegen Take-all für viel längere Zeitspannen bereit als der Elternstamm. Die Pseudomonas-Stämme AN5-P1 und AN5-T5, die höhere Konzentrationen an Zuckersäuren produzieren, besitzen das Potential, einen größeren Schutz bereitzustellen, auch wenn sie in geringerer Anzahl auf den Weizenwurzeln vorliegen. Daher sollten diese Stämme einen verbesserten Schutz gegen Take-all erbringen, wenn sie während der trockeneren Winterwachstumsphasen in reduzierter Anzahl auf den Weizenwurzeln vorliegen.
  • BEISPIEL 10
  • Massenspektrum-Analyse von Zuckersäuren, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5rif produziert werden
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) wurde für 2 Tage bei 25°C in 100 ml steriler (autoklavierter) Pontiak-Brühe (auf Kartoffelbasis, 400 g/l) mit entweder 2% (Gewicht/Volumen) Glucose oder 4% (Gewicht/Volumen) Glucose oder 4% (Gewicht/Volumen) Galactose oder 4% (Gewicht/Volumen) Mannose als Kohlenstoffquelle kultiviert. Die Identitäten der produzierten Zuckersäuren wurden mittels Massenspektrum gemäß der Beschreibung in den vorstehenden Beispielen bestimmt.
  • Die Massenspektrum-Analyse der aktiven Fraktionen zeigte an, dass bei jeder Probe nur eine Zuckersäure produziert wird, die jeweils dem Aldonsäureprodukt des Aldosezucker-Substrats entspricht, das den unter diesen Bedingungen gezüchteten Bakterienkulturen zur Verfügung gestellt wird. Insbesondere wurde Glucose zu Gluconsäure umgesetzt (d.h. der Peak für Gluconsäure war wie in 5D), Galactose wurde zu Galactonsäure umgesetzt (der Peak für Galactonsäure war wie in 11B), und Mannose wurde zu Mannonsäure umgesetzt (der Peak für Mannonsäure war wie in 12B).
  • TABELLE 4 Vergleich der gentechnisch erzeugten Stämme
    Figure 00380001
  • BEISPIEL 11
  • Quantifizierung der Gluconsäure, die von Pseudomonas-Stamm AN5rif-Kulturen unter Verwendung von Glucose als einziger Kohlenstoffquelle produziert wird
  • 1. Quantifizierung der Zuckersäuren, die von dem Pseudomonas sp.-Stamm AN5rif produziert werden
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) wurde für 2 Tage bei 25°C in 100 ml steriler (autoklavierter) Pontiak-Brühe (auf Kartoffelbasis, 400 g/l) mit entweder 2% (Gewicht/Volumen) Glucose oder 4% (Gewicht/Volumen) Glucose oder 2% (Gewicht/Volumen) Galactose oder 4% (Gewicht/Volumen) Galactose kultiviert. Es wurde außerdem eine Negativkontroll-Lösung hergestellt, die keine zusätzlichen Aldose-Substrate enthält. Zucker wurden aus Stammlösungen zugegeben, die durch die Zugabe von Chloroform sterilisiert worden waren.
  • Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen wurde nach zwei Tagen der Kultur unter Verwendung von Standardprozeduren bestimmt. Die Zählung lebensfähiger Zellen für Kulturen mit 2% (Gewicht/Volumen) Glucose in Pontiac-Brühe betrug durchschnittlich 7,325 × 107 Zellen/ml im Vergleich zu nur 6,0 × 104 Zellen/ml für Kulturen, die auf Pontiac-Brühe ohne zugesetzten Zucker gezüchtet worden waren.
  • Die Bestimmung der pH-Werte der Kulturüberstände erfolgte nach dem Sammeln der Bakterienzellen nach zwei Tagen Kultur mittels Zentrifugation bei 6.000 rpm zum Sammeln von Bakterienzellen und Titration eines Aliquots jedes Überstandes gegen 0,001 N bis 0,01 N NaOH. Um den titrierbaren pH-Wert, der für jeden Überstand erhalten wurde, zu bestätigen, wurden gleiche Volumina an Aceton zu den verbleibenden Überständen hinzugegeben, und die Proben wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, um jeden proteinösen Bestandteil oder sämtliche Bakterienzellen zu präzipitieren. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation bei 6.000 rpm abgenommen, und die pH-Werte der Kulturüberstände wurden, wie zuvor, durch Titration bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Figure 00390001
    • ** pH-Werte in Klammern zeigen den pH der Überstände nach der Aceton-Präzipitation
  • Die Pontiak-Brühe mit 2% (Gewicht/Volumen) an Galactose produzierte bei Verwendung des Indikatorfarbstoffs Phenolphthalein eine magentafarbene (dunkelpinkfarbene) Farbe, sodass das Medium infolgedessen unter Verwendung von Natriumhydroxid-Lösung nicht titrierbar war. Andere Medien erforderten kleine Volumina an 0,001 N Natriumhydroxid, um die gleiche pinkfarbene Farbe zu ergeben, wie diejenige, die für die Pontiac-Brühe produziert wurde, die mit dem Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) in Abwesenheit von Aldose angeimpft worden war. Die durchschnittlichen Mengen an 0,001 N NaOH, die benötigt wurden, um die Zuckersäuren zu neutralisieren, die von jeweils 100 ml Kultur (n = 3) produziert wurden, war wie folgt:
    Figure 00400001
    • (**: nicht bestimmt)
  • Als feste Medien wurden Pontiac-Agar-Platten hergestellt und auf pH-Werte von 6,5, 8,5, 10,5 und 12,5 eingestellt. Bromcresol-Violett (15 mg/l) wurde zu jeder Platte hinzugegeben. Die Pontiac-Agar-Platten wurden angeimpft, indem man den Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ausstrich und für einen Tag bei 25°C inkubierte. Nach dieser Zeitspanne begannen diese Platten, die einen pH im Bereich von pH 6,5 bis pH 10,5 besaßen, gelb zu werden. Jedoch war bei den Platten mit pH 12,5 kein Farbwechsel erkennbar. Das Bakterienwachstum wurde auch durch den pH des Kulturmediums beeinflusst, und es wurde bei niedrigeren pH-Werten mehr Wachstum beobachtet, und zwar in der Reihenfolge: 6,5 = 8,5 > 10,5 > 12,5. Bei pH 12,5 war das Wachstum sehr gering.
  • Zusammengefasst ist die Titration von Bakterienkulturen aufgrund des hohen alkalischen pH-Werts der Lösung, die für das Bakterienwachstum benötigt wird, nicht das optimale Verfahren für die Quantifizierung von Zuckersäuren, bei denen die Kohlenstoffquelle eine andere als Glucose ist. Jedoch ist dieses Verfahren für die Verwendung in Verbindung mit festen Medien bevorzugt. Alternativ erfolgt die quantitative Bestimmung der Zucker unter Verwendung der Prozedur, die in folgender Literaturstelle beschrieben ist: Microbiology 143: 1595–1603, 1997.
  • 2. Assay für die Gluconsäure-Produktion durch den Pseudomonas-Stamm AN5rif
  • Der Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) wurde auf Nähr-Agar ausgestrichen, der Rifampicin (100 μg/ml) enthielt und wurde für zwei Tage bei 25°C inkubiert. Mit diesen Platten wurden Nährbrühe und Pontiac-Brühe mittels einer Bakterien-Schlaufe angeimpft. Diese Brühen wurden ebenfalls für zwei Tage bei 25°C auf einem Schüttler inkubiert. Es wurden 5 ml dieser Brühen verwendet, um 100 ml der jeweiligen Brühe anzuimpfen. Diese ließ man über Nacht für etwa 15–18 Stunden wachsen. Kleine Aliquots hiervon wurden mit einer Anzahl von Verdünnungen verwendet, um lebensfähige Zellzahlen zu erhalten. Diese Kulturen wurden bei 6000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Bakterienpellets wurden zweimal mit destilliertem autoklaviertem Wasser gewaschen, um jedwede Brühe zu entfernen, und dann in 100 ml 0,01 M Glucose-Lösung (pH 7, Glucose mit 1,8 g/l) resuspendiert. Die Bakteriensuspensionen wurden auf einem Schüttler bei 25°C inkubiert. Nach 3,5 Stunden beobachtete man diese Lösungen darauf, ob sie in Gegenwart von Bromcresol-Violett (15 mg/l) eine gelbe Farbe erzeugen. Die Überstände wurden bei –30°C eingefroren und dann lyophilisiert. Ein Aliquot des lyophilisierten Materials wurde in Wasser gelöst, und 5 ml Lösung wurden mit 0,01 N NaOH titriert. Die Quantifizierung der Zuckersäuren erfolgte wie oben beschrieben.
  • Die Daten zeigen an, dass Bakterien, die aus Pontiac-Brühe als Starter-Kultur erhalten und dann in reiner Glucose-Lösung herangezogen wurden, dazu in der Lage sind, unter diesen Bedingungen 40% des vorhandenen Glucose-Substrats in 3,5 Stunden in Gluconsäure umzusetzen. Bei der Nährbrühe als Starter-Kultur wurden in einem ähnlichen Versuch 32% des Glucose-Substrats in derselben Zeit zu Gluconsäure umgesetzt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Pontiac-Brühe ein besseres Medium für die Starter-Kultur von Bakterien bei der Gluconsäure-Erzeugung ist, wenn Glucose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird.
  • BEISPIEL 12
  • Zusammenfassung der Zuckersäure-Produktion durch verschiedene Pseudomonas-Stämme auf verschiedenen Kohlenstoff-Quellen
  • Die Mengenniveaus der Zuckersäuren, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) und den beiden Transposon-Mutanten, PQQ– und SOX–, die das Transposon Tn5:uidA im Gen pqqD bzw. Zuckeroxidase tragen (siehe Beispiel 9) produziert werden, wurden nach dem Wachstum in Pontiac-Medium mit oder ohne 2% (Gewicht/Volumen) Aldose im Kulturmedium bestimmt. Die Daten sind in Tabelle 5 dargestellt.
  • TABELLE 5
    Figure 00410001
  • Die Daten stimmen damit überein, dass Glucose die bevorzugte Kohlenstoffquelle für den Pseudomonas-Stamm AN5 und Derivate hiervon ist, um Zuckersäuren aus Aldosesubstraten zu produzieren.
  • BEISPIEL 13
  • Produktion wirksamer Mengen pilzbekämpfender Zuckersäuren in situ an Weizenwurzeln durch den Pseudomonas-Stamm AN5
  • Weizensäaten wurden mit verschiedenen Biokontroll-Bakterien behandelt und in sterilen Magenta-Glas-Assays in Vermiculit herangezogen. Wir sammelten das Wurzel-Exsudat von Weizenwurzeln, die mit diesen verschiedenen Biokontrollstämmen angeimpft worden waren. Diese beinhalteten den Elternstamm (d.h. den Pseudomonas-Stamm AN5), den Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) und verschiedene Mutanten, einschließlich der Mutanten PQQ– und SOX–. Das Exsudat wurde durch Gefriertrocknung konzentriert und dann in Wasser resuspendiert. Nur die Pseudomonas-Stämme AN5 und AN5rif zeigten bei Bioassays gegen das Take-all-Pathogen eine starke biologische Aktivität. Die Extrakte der restlichen mutanten Stämme oder von unbehandeltem Weizen zeigten keine biologische Aktivität. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Zuckersäure, die von dem Pseudomonas-Stamm AN5 oder dem Pseudomonas-Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM/00/09624) auf Weizenwurzeln produziert wird, das Take-all-Pathogen auf Weizenwurzeln supprimiert.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001

Claims (27)

  1. Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer Pilzinfektion in einer Pflanze, welches das Verabreichen eines biologischen Schutzmittels, das in der Lage ist, eine Zuckersäure zu erzeugen, in einer wirksamen Menge, die ausreichend ist, um Pilzwachstum oder -vermehrung in der Pflanze zu hemmen oder zu verhindern, an die Pflanze umfaßt, wobei das biologische Schutzmittel Pseudomonas sp. Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat davon ist oder eine Mutante oder ein Derivat von Pseudomonas Stamm AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften von Pseudomonas sp. Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pilzpathogen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Alternaria spp., Armillaria mellea, Arthrobotrys oligosporus, Boletus granulatus, Botritis fabae, Botritis cinerea, Candida albicans, Claviceps purpurea, Cronartium ribicola, Epicoccum purpurescens, Epidermophyton floccosum, Fomes annosus, Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Glomerella cingulata, Gymnosporangium juniperi-virginianae, Microsporum canis, Monilinia fructicola, Physoderma alfalfae, Phytopthera infestans, Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur), Polyporus sulphureus, Puccinia spp., Saccharomyces cerevisiae, Septoria apiicola, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Ustilago spp., Venturia inaequalis und Verticillium dahliae.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pilzpathogen G. graminis (Take-All-Pilz) ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pilzpathogen Botrytis fabae ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zuckersäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mannonsäure, Gluconsäure und Galakturonsäure.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zuckersäure Gluconsäure ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das biologische Schutzmittel Pseudomonas Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ist.
  8. Verfahren zur Verbesserung der Lagerfähigkeit eines Produkts aus einer Pflanze nach der Ernte, welches das Aufbringen eines biologischen Schutzmittels, das in der Lage ist, eine Zuckersäure zu erzeugen, in einer wirksamen Menge, die ausreichend ist, um Pilzwachstum oder -vermehrung zu hemmen oder zu verhindern, auf das Produkt umfaßt, wobei das biologische Schutzmittel Pseudomonas sp. Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder eine Mutante oder ein Derivat davon ist oder eine Mutante oder ein Derivat von Pseudomonas Stamm AN5 mit den Zuckersäurebiosynthese-Eigenschaften von Pseudomonas sp. Stamm AN5rif(AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zuckersäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mannonsäure, Gluconsäure und Galakturonsäure.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zuckersäure Gluconsäure ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das biologische Schutzmittel Pseudomonas Stamm AN5 rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ist.
  12. Isoliertes biologisches Schutzmittel für die Behandlung einer Pilzinfektion in einer Pflanze, wobei das Mittel eine Bakterienzelle mit den folgenden Eigenschaften umfaßt: (i) sie erzeugt eine Zuckersäure, wenn sie in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle, die eine Aldose umfaßt, kultiviert wird, (ii) sie ist in der Lage, die Infektionsstelle des Pilzes, vorzugsweise Pflanzenwurzeln, zu besiedeln und (iii) sie weist die biologischen Schutzeigenschaften von Pseudomonas Stamm AN5 rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) auf.
  13. Biologisches Schutzmittel nach Anspruch 12, welches Pseudomonas Stamm AN5rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) oder ein Derivat davon umfaßt.
  14. Biologisches Schutzmittel nach Anspruch 13, wobei das Derivat im Vergleich zu Pseudomonas Stamm AN5rif verbesserte Fähigkeiten hat, eine Zuckersäure zu erzeugen, wenn es in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle, die eine Aldose umfaßt, kultiviert wird.
  15. Biologisches Schutzmittel nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Derivat im Vergleich zu Pseudomonas Stamm AN5rif verbesserte Fähigkeiten hat, die Rhizosphäre einer Pflanze zu besiedeln.
  16. Pflanzenschutzzusammensetzung zur Behandlung einer Pilzinfektion in einer Pflanze, welche das biologische Schutzmittel nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Kombination mit einem phytopathologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Benetzungsmittel umfaßt.
  17. Pflanzenschutzzusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Benetzungsmittel ein nicht-ionisches Detergens ist.
  18. Pflanzenschutzzusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Pilzinfektion eine Infektion ist, die durch ein Pilzpathogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alternaria spp., A. mellea, A. oligosporus, B. granulatus, B. cinerea, Botritis fabae, C. purpurea, C. ribicola, E. purpurescens, F. annosus, F. oxysporum, G. graminis var. tritici, G. cingulata, G. juniperi-virginianae, M. fructicola, P. alfalfae, P. infestans, P. sulphureus, Puccinia spp., S. apiicola, Ustilago spp., V. inaequalis und V. dahliae, und noch bevorzugter durch ein Pilzpathogen monokotyledoner Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C. purpurea, G. graminis var tritici, Puccinia spp. und Ustilago spp., ausgelöst wird.
  19. Pflanzenschutzzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Pilzpathogen G. graminis (Take-All-Pilz) ist.
  20. Pflanzenschutzzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Pilzpathogen Botrytis fabae ist.
  21. Verfahren zum Herstellen einer Zuckersäure, welches das Inkubieren einer Bakterienzelle, die die Schutzeigenschaften von Pseudomonas Stamm AN5 rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) hat, in Gegenwart von Aldose für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit eine PQQ-abhängige Oxidation der Aldose zu Zuckersäure stattfindet, umfaßt.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Bakterienstamm Pseudomonas Stamm AN5 rif (AGAL-Hinterlegungsnummer NM 00/09624) ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Aldose aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Glucose, Mannose und Galactose.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Aldose Glucose ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die Kulturbedingungen das Wachstum auf Kartoffeldextrosemedien oder Pontiac-Medium, welches Aldosesubstrat enthält, umfassen.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Aldosesubstrat in einer Menge von etwa 2% (w/v) bis etwa 4% (w/v) im Kulturmedium enthalten ist.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die Kulturbedingungen das Wachstum auf Kartoffeldextrosemedien oder Pontiac-Medium, gefolgt von Inkubation in einer konzentrierten Lösung von Aldosesubstrat umfassen.
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