DE112004002508B4 - Der neue Bacillus Amyloliquefaciens KTGB202 und Verfahren zur Eindämmung von Pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung von selbigem - Google Patents

Der neue Bacillus Amyloliquefaciens KTGB202 und Verfahren zur Eindämmung von Pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung von selbigem Download PDF

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Abstract

Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 (Zugangsnummer: KCTC 10564BP) mit einer antifungalen Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze und einer inhibitorischen Wirkung gegen Pflanzenvirus-Infektion.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 und ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung von selbigem.
  • Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein mikrobiologisches Pestizid, enthaltend das Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterium, welches billig und sicher ist und zur gleichen Zeit einen exzellenten Eindämmungseffekt gegen echten Mehltau, Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Phytophthora sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Alternaria sp., Magnaporthe grisea, Puccinia recondita, Corticium sasaki, Candida sp. und dergleichen aufweist, wie auch ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung des KTGB0202-Bakteriums.
  • Stand der Technik
  • Derzeit werden chemisch synthetisierte agrikulturelle Chemikalien hauptsächlich verwendet, um die Entwicklung von Pflanzenpathogenen einzudämmen bzw. zu inhibieren.
  • Jedoch sind solche Agrochemikalien limitiert in ihrer Anwendung, da sie zur Zerstörung des natürlichen Ökosystems führen und sie eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit aufweisen, chemische Vergiftung, Karzinogese, Missbildung und verschiedene Erkrankungen des menschlichen Körpers aufgrund von verbleibender Toxizität zu verursachen.
  • Aus diesem Grund werden nun Untersuchungen für die Entwicklung von wenig toxischen, ökofreundlichen biologischen Agrochemikalien aktiv vorangetrieben.
  • Die koreanische Patent-Registrationsnummer 10-0257452 (mit dem Titel "ein Bacillus subtilis A405-Stamm, erzeugend ein antibakterielles Peptid mit Pflanzenerkrankungseindämmungs-Aktivität sowie ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenerkrankungen unter Verwendung selbigen) offenbart einen Bacillus subtilis A405-Stamm (KFCC-11024), erzeugend ein antibakterielles Peptid mit Pflanzenerkrankungseindämmungs-Aktivität, sowie ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenerkrankungen, charakterisiert durch Verbreiten einer mikrobiologischen Formulierung enthaltend diesen Stamm auf das Ackergebiet, welches behandelt werden soll.
  • Mittlerweile ist der echte Mehltau eine der hauptsächlichen Pflanzenerkrankungen, welche sich weiterentwickeln und große Schäden für Früchte, beispielsweise Erdbeeren, Gurken und dergleichen erzeugen, welche die hauptsächlichen Einkommensquellen in der Landwirtschaft sind. Insbesondere erscheinen in jüngster Zeit Pilze, resistent gegen existierende Agrochemikalien, so häufig, dass Eindämmungen der Pflanzenerkrankungen nur durch chemische Behandlungsverfahren Grenzen in ihren Auswirkungen setzen.
  • Folglich wurden in einem Versuch, den echten Mehltau einzudämmen unter Verwendung von Biopestiziden, Verfahren unter Verwendung von natürlichen Substanzen, Mikroorganismen und dergleichen vorgeschlagen.
  • Die koreanische veröffentlichte Patentpublikationsnummer 2002-0072813 (mit dem Titel "Neuer Bacillus sp. CMB26-Stamm, Herstellung eines Lipopeptids unter Verwendung des CMB26-Stamms und Germicid von fungalen Pflanzenpathogenen, enthaltend CMB26-Stamm und/oder Lipopeptid") offenbart einen neuen Mikroorganismus, Bacillus sp. CMB26 (KFCC-11289), charakterisiert durch das Erzeugen von Lipopeptid mit der hohen Aktivität, die Sporen und Mycelen von Schimmelpilzen unschädlich zu machen sowie einen antifungalen Wirkstoff gegen Pflanzenschimmelpilze wie z. B. echten Mehltau, Mycosphaerella melonis, Botryosphaeria dothidea, Fusarium oxysporum, Collectotrichum gloeosporum, Botrytis cinerea, Phytophthora root rot oder Rhizoctonia solani.
  • Jedoch gibt es, obwohl eine Vielzahl von biologischen eindämmenden Wirkstoffen, welche antifungale Aktivität in Bacillus sp. gegen Pilze wie oben beschrieben zeigen, nun offenbart wurden, keinen Bericht betreffend ein mikrobiologische Pestizid, enthaltend einen Bacillus amyloliquefaciens-Stamm, welcher einen exzellenten eindämmenden Effekt gegen Pflanzenpathogene aufweist und zur gleichen Zeit billig und sicher ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde durchgeführt, um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, auftretend im Stand der Technik, und es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 zur Verfügung zu stellen mit einem eindämmenden Effekt gegen Pflanzenpathogene.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Biopestizid zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen zur Verfügung zu stellen, einschließend echten Mehltau, welches den neuen Bacillus amylcliquefaciens KTGB0202 enthält und folglich eine breite antifungale Aktivität aufweist, exzellent in seiner Aktivitätsdauer und physikalisch und chemisch sicher ist, sowie ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung des KTGB0202-Stammes.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 sowie ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung desselben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Mikroorganismus Bacillus amylcliquefaciens KTGB0202 (Zugangsnummer: KCTC 10564BP) bereit, welche exzellent in einer eindämmenden Wirkung gegen echten Mehltau ist, auftretend in verschiedenen Früchten, ein breites Spektrum der antifungalen Aktivität gegen Pflanzenpathogene aufweist und die Tabakmosaikvirus-Infektion inhibiert.
  • Des Weiteren wird beschrieben KTGB0202-AF01, eine neue antifungal aktive Substanz, welche durch den erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 erzeugt wird.
  • Ebenso stellt die vorliegende Erfindung eine Bakterienkulturbrühe zur Verfügung, enthaltend die Bacillus amylcliquefaciens KTGB0202-Bakterien zur Verwendung bei der ökofreundlichen Eindämmung von echtem Mehltau.
  • Die Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung bilden nicht spezielle Pigmente aus und die Temperatur, geeignet für ihr Wachstum, ist 27–30°C.
  • Des Weiteren sind die erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterien grampositive, aerobe, mobile stäbchenförmige Bakterien mit einer Größe von 0,8–1,0 µm × 1 m 5–2,0 µm, welche das Katalaseenzym sekretieren (siehe 1).
  • Inzwischen sind die Ergebnisse der Analyse für die Zellfettsäuren solcher Bakterien in Tabelle 1 unten dargestellt.
  • Die Basensequenz der KTGB0202-Bakterien, bestimmt durch Gyraseuntereinheit A-Genanalyse ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
  • Der neue Bakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung wurde als Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 bezeichnet und hinterlegt unter der Zugangsnummer KCTC 10564BP am 10. Dezember 2003 bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB).
  • Ein Kultivierungsprozess zum Erhalten einer Kultur mit antifungalen Aktivitäten gegen echten Mehltau und andere Pflanzenpathogene aus den erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien kann in einem Nährstoff-Agarmedium, einem Kartoffelsucrose-Agarmedium oder einem Mueller Hinton-Agarmedium durchgeführt werden.
  • Pflanzenpathogene, welche durch diese erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien in Zaum gehalten werden können, schließen echten Mehltau, Cladosporium sp., Collectotrichum sp., Phytophthora sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Alternaria sp., Magnaporthe grisea, Puccinia recondita, Corticium sasaki und Candida sp. ein.
  • Die erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien sind stabil bei hoher Temperatur von mehr als 80°C und ihre Eindämmungsaktivität gegen echten Mehltau, wenn sie bei Raumtemperatur in Kulturlösungsbedingungen gelagert werden, hält für zumindest 6 Monate an.
  • Die erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien sind effizienter beim Eindämmen von echten Mehltau-Pilzen, einschließend Sphaerotheca fuliginea von Kürbispflanzen, S. humili von Erdbeeren, S. pannosa von Rosen, Erysiphe tabacina von Tabak, Leveillula taurica und Erysiphe cichoracearum von Solanaceae-Gemüse, Leveillula heraclei von Karotten und Blumeria graminis von Gerste.
  • Ein Pflanzenvirus, gegen welches die erfindungsgemäßen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien eine inhibitorische Aktivität gegen Infektion aufweisen, ist das Tabakmosaikvirus (TMV).
  • Darüber hinaus wird beschrieben eine antifungale aktive Substanz in Kulturlösung, welche durch den vorliegenden erfindungsgemäßen KTGB0202 erzeugt wird, durch fettlösliches Harz isoliert und aufgereinigt wird durch Silicagel-Chromatografie bzw. LH-20-Gel-Chromatografie, um dadurch eine weiße pulverartige Substanz zu erhalten. Diese antifungale Substanz wurde als "KTGB0202-AF01" bezeichnet.
  • Das 1H-NMR-Spektrum für die antifungale aktive Substanz ist in 2 gezeigt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das neue Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 mit einer eindämmenden Wirkung gegen pflanzenpathogene Pilze zur Verfügung gestellt.
  • Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Biopestizid zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen, einschließend echten Mehltau, welches die Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Mikroorganismen enthält, und folglich eine breite antifungale Aktivität aufweist, exzellent in der Aktivitätsdauer ist und physikalisch und chemisch sicher ist, wie auch ein Verfahren zum Eindämmen von pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung der KTGB0202-Mikroorganismen, zur Verfügung.
  • Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung die antifungale aktive Substanz KTGB0202-AF01, erzeugt durch die neuen KTGB0202-Mikroorganismen, zur Verfügung. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Biopestizid zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen zur Verfügung, einschließend echten Mehltau, welche die KTGB0202-AF01-Mikroorganismen enthält und folglich eine breite antifungale Aktivität aufweist mit einer exzellenten Aktivitätsdauer wie auch ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung der Mikroorganismen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein elektronenmikroskopische Fotografie, welche die erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterien zeigt.
  • 2 zeigt das 1H-NMR-Spektrum für die antifungale Substanz KTGB0202-AF01, erhalten durch Extraktion und Aufreinigung aus den erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterien.
  • Beste Ausführungsform zum Durchführen der Erfindung
  • Beispiel 1:
  • Isolierung und Identifizierung von Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien
  • Die Blätter von Eichenbäumen, welche natürlich auf den Hügeln in der Umgebung des KT&G Central Research Institute, lokalisiert in Shinsong-Dong, Yusong-Ku, Taejon, Korea wachsen, wurden gesammelt.
  • Die gesammelten Blätter wurden mit Wasser gewaschen, an Luft getrocknet, oberflächensterilisiert mit 1% Natriumhypochlorit, hinreichend mit Mörser und Pistill zerkleinert und in destilliertem Wasser verdünnt.
  • Die Verdünnung wurde auf Mueller Hinton-Agarmedium plattiert unter Verwendung des Zweischichtverfahrens und in einem Inkubator bei 27°C für zwei 2–3 Tage kultiviert. Anschließend wurde eine einzelne Bakterienkolonie rein isoliert durch mehrere Subkulturen.
  • Die Identifikation eines Stammes für das einzelne Isolat wurde durchgeführt durch morphologische Betrachtung und die Analyse der physiologischen Charakteristika, Zellfettsäuren und 16S rDNA-Basensequenzen.
  • Dieser Stamm wächst gut in Nährstoff-Agarmedium, Kartoffelsucrose-Agarmedium sowie Mueller Hinton-Agarmedium. Es bildet auch keine speziellen Pigmente aus und die Temperatur, geeignet für sein Wachstum, ist 27–30°C.
  • Darüber hinaus ist der Stamm ein grampositives, aerobes, mobiles stäbchenförmiges Bakterium mit einer Größe von 0,8–1,0 µm × 1,5–2,0 µm, welches das Katalaseenzym (siehe 1) sekretiert.
  • Die Ergebnisse der Analyse für die Zellfettsäuren sind in Tabelle 1 unten angegeben. <Tabelle 1> Die Fettsäure-Zusammensetzungsanalyse von KTGB0202-Bakterien
    Fettsäurezusammensetzung KTGB0202-Mikroorganismus
    C14:0 ISO 1,06
    C14:0 1,02
    C15:0 ISO 20,39
    C15:0 ANTEISO 43,73
    C16:0 ISO 2,95
    C16:1 w1 1c 1,35
    C16:0 7,53
    C17:0 ISO 8,00
    C17:0 ANTEISO 11,96
  • Die Basensequenz des identifizierten Stammes, bestimmt durch die Gyraseuntereinheit A-Genanalyse ist in SEQ ID Nr. 1 im beigefügten Sequenzprotokoll dargestellt.
  • Betrachtet man die oben dargelegten Ergebnisse im Kollektiv, wurde Bacillus amyloliquefaciens identifiziert und als "KTGB0202-Stamm" bezeichnet.
  • Der isolierte und identifizierte Stamm wurde hinterlegt unter der Zugangsnummer KCTC 10564BP am 10. Dezember 2003 bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), welches eine internationale Hinterlegungsstelle für Patentanmeldungen ist.
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung durch die folgenden Beispiele und Testbeispiele beschrieben werden, jedoch sind diese Beispiele nicht so konzipiert, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
  • Beispiel 2:
  • Kultur von Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Stamm
  • Der Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Stamm von Beispiel 1 wurde hergestellt.
  • Ein Mueller Hinton-Agarmedium wurde hergestellt.
  • 21 g des hergestellten Mueller Hinton-Agarmediums wurde in gut 11 destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wurde in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, jeweils zu 200 ml verteilt und in 1,5 atms bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert.
  • Die KTGB0202-Bakterien in einem plattierten Zustand wurden durch einen Platindraht aufgenommen und in das präparierte Medium verimpft. Die verimpften Bakterien wurden bei 27°C für 4 Tage unter Schütteln bei 110 rpm kultiviert.
  • Das Kulturmedium zeigte eine schwachgelbe Farbe, war viskos und wies einen pH von 6,79 auf.
  • Beispiel 3:
  • Isolierung und Aufreinigung der antifungalen Substanz KTGB0202-AF01, erzeugt durch KTGB0202-Bakterien
  • Die Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien enthaltende Kultur von Beispiel 2 wurde hergestellt.
  • Die hergestellte Kultur wurde durch eine Glassäule, gefüllt mit Diaion-HP10-Harz, geführt.
  • Die antifungale Substanz adsorbiert auf der Säule wurde mit 70% wässrigem Aceton extrahiert und konzentriert.
  • Die konzentrierte Substanz wurde in einer kleinen Menge an Chloroform (CHCl3) und Methanol (MeOH) aufgelöst und einer Silicagel-Säulenchromatografie unterzogen.
  • Während graduell die Polarität des Lösungsmittelsystems von 7:3 auf 0:1 erhöht wurde, wurde die aktive Substanz entwickelt, um eine Substanz aufzureinigen, welche die stärkste Aktivität bei einem Polaritätsbereich von 3:7 bis 1:9 zeigt.
  • Die aufgereinigte Substanz wurde konzentriert unter vermindertem Druck, aufgelöst in einer kleinen Menge an Methanol und schlussendlich aufgereinigt durch LH-20 (Sephadex LH-20)-Gelchromatografie unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels als ein sich entwickelndes Lösungsmittel.
  • Die letztlich aufgereinigte Substanz war in nicht-polaren Lösungsmitteln, wie z. B. Ethylacetat (EtoAc), Chloroform (CHCl3) und dergleichen und leicht in Methanol löslich. Sie war auch gut löslich in einer 1:1 Mischungslösung an Chloroform und Methanol und in Wasser.
  • Das 1H-NMR-Spektrum für die oben genannte aktive Substanz ist in 2 dargestellt.
  • Testbeispiel 1:
  • Messung der Veränderung in der Aktivität von KTGB0202-Bakterien während der Kultivierungszeit
  • Um die Veränderungen in den antifungalen, antiviralen und echten Mehltau eindämmenden Wirkungen während der Kultivierungszeit zu untersuchen, wurden die KTGB0202-Bakterien in Mueller Hinton-Agarmedium kultiviert bei Bedingungen von 27°C und 110 rpm, wobei gleichzeitig Proben zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden und auf ihre Aktivität gemessen wurden.
  • Die antifungale Wirkung wurde gemessen durch ein Papierscheibenverfahren auf Tomaten Cladosporium sp. und der antivirale Effekt wurde untersucht durch ein Vorbehandlungsverfahren von Xanthi-nc-Tabakblättern.
  • Um die den echten Mehltau eindämmende Wirkung zu messen, wurde ein fünffache Verdünnung auf Blätter verteilt, und zwar dreimal in 5-Tage-Intervallen und nach 7 Tagen wurden die Ergebnisse untersucht und sind in Tabelle 2 unten dargestellt. <Tabelle 2> Veränderung in der Aktivität von KTGB0202-Bakterien während der Kultivierungszeit
    Kultivierungszeit Antifungale Wirkung (mm) Antifungale Wirkung (%) Echten Mehltau eindämmende Wirkung (%) OD (660 nm) pH
    0 0 0 0 0,012 7,70
    6 0 0 0 0,063 7,65
    12 0 0 12,5 0,644 7,19
    24 Schwach 0 75,0 0,758 6,88
    48 Schwach 0 75,0 0,919 7,22
    72 12 50 75,0 0,780 6,75
    96 13 60 87,5 0,578 6,79
    120 13 67 87,5 0,471 6,62
    144 11 85 87,5 0,525 6,70
    168 11 76 100 0,468 6,72
    192 10 82 87,5 0,433 7,09
    Leitungswasser 0 0 0 - -
  • Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, waren die antifungale Wirkung und die den echten Mehltau eindämmende Wirkung sichtbar nach 24 Stunden an Kultivierung und die antivirale Wirkung war sichtbar nach 72 Stunden der Kultivierung.
  • Des Weiteren erreichte die Bakterienzahl das höchste Niveau nach 48–72 Stunden an Kultivierung.
  • Testbeispiel 2:
  • Test der inhibitorischen Wirkung gegen Tabakmosaikvirus(TMV)-Infektion mit der Veränderung in der Konzentration an KTGB0202-Bakterienkultur
  • Der KTGB0202-Stamm, enthaltend Mueller Hinton flüssiges Medium, hergestellt in Beispiel 1, wurde bei 10000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert in einen Überstand und Zellen, verdünnt in sterilisiertem destilliertem Wasser und behandelt durch Verteilen mit einer Bürste auf Xanthinc-Tabakblätter.
  • Nach einem Tag der Behandlung wurde TMV verimpft und die für die Infektion inhibitorische Wirkung der KTGB0202-Bakterienkultur auf der viralen Infektion wurde untersucht, wie in Tabelle 3 unten gezeigt ist. <Tabelle 3> Inhibitorische Aktivität von KTGB0202 auf Tabakmosaikvirus-Infektion
    Getestete Substanz Inhibitorische Wirkung auf die Virusinfektion (%)
    Verdünnte Kultur 98
    Zweifach verdünnte Kultur 95
    Zehnfach verdünnte Kultur 70
    Zwanzigfach verdünnte Kultur 50
    Fünfzigfach verdünnte Kultur 20
    Leitungswasser 0
  • Wie aus Tabelle 3 zu sehen ist, war die für die Virusinfektion inhibitorische Wirkung der KTGB0202-Bakterienkultur gemäß der vorliegenden Erfindung merklich reduziert ab der zehnfachen Verdünnung.
  • Testbeispiel 3:
  • Test der antifungalen Aktivität von KTGB0202-Bakterien
  • Der KTGB0202-Stamm, hergestellt in Beispiel 1 wurde in Mueller Hinton-Agarmedium für 3–4 Tage kultiviert und in einen Agarstopfen mit einem Durchmesser von 0,6 mm eingebracht. Der
  • Agarstopfen wurde mit Testpflanzenpathogenen auf Kartoffeldextrose-Agarmedium kultiviert und anschließend auf klare Entfernung gemessen, um die antifungale Aktivität zu untersuchen. Die gemessenen Ergebnisse für die antifungale Aktivität sind in Tabelle 4 unten gezeigt. <Tabelle 4> Das antifungale Aktivitätsspektrum von KTGB0202-Bakterien
    Pathogene Pilze Antifungale Aktivität (mm)
    Cladosporium fulvum 8
    Collectotrichum gloeosporioides 6
    Botrytis cinerea 2,5
    Phytophthora capsici 10
    Rhizoctonia solani 8
    Fusarium oxysporum 5
    Alternaria solani 4
    Candida albicans 4
  • Testbeispiel 4:
  • Test des eindämmenden Effekts von KTGB0202-Bakterien gegen verschiedene Pflanzenerkrankungen
  • Die antifungale in vivo-Aktivität der KTGB0202-Bakterienkulturbrühe gegen Magnaporthe grisea, Corticium sasaki, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, Puccinia recondita und Blumeria graminis wurde getestet unter Verwendung von Jungpflanzen von verschiedenen Früchten.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten gezeigt. <Tabelle 5> Testergebnisse für eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterienkulturbrühe gegen verschiedene Pflanzenerkrankungen
    Pflanzenpathogene Pilze Eindämmender Wert (%) nach Behandlung mit zehnfach verdünnter Kultur
    Magnaporthe grisea 100
    Corticium sasaki 85
    Botrytis cinerea 71
    Phytophthora infestans 97
    Puccinia recondite 93
    Blumeria graminis 95
  • Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, wiesen die KTGB0202-Bakterien eine exzellente eindämmende Wirkung gegen verschiedene Pflanzenerkrankungen auf.
  • Testbeispiel 5:
  • Test der eindämmenden Wirkung gegen echten Mehltau auf Tabak
  • Präventive und therapeutische Wirkungen gegen echten Mehltau wurden auf Tabakpflanzen gemessen, welche in Töpfen unter Gewächshausbedingungen wuchsen.
  • Wenn der Befall von echtem Mehltauverletzungen auf Tabakpflanzen 10% oder mehr war, wurden die Tabakblätter mit der Kulturbrühe von Beispiel 2 behandelt und nach 7 Tagen der letztendlichen Ausbreitung auf Befall gemessen, um die eindämmende Wirkung der KTGB0202-Bakterien zu messen.
    • 1. Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tabak.
  • Tabakpflanzen, wachsend in einem Gewächshaus, wurden mit der Kultur von Beispiel 2 behandelt, um die Entwicklung der Erkrankung sowie die therapeutischen Effekte der Kultur zu untersuchen.
  • Die Untersuchung der thermischen Stabilität der aktiven Kulturingredienzien wurde durchgeführt nach Erhitzen auf 100°C für 30 Minuten und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 unten gezeigt. <Tabelle 6> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterien gegen echten Mehltau auf Tabak
    Getestete Substanz Befall (%) Eindämmungswert (%)
    Bakterienkultur 8,9 91,1
    Bakterienkultur (thermische Behandlung) 11,5 88,5
    Leitungswasser 100 0
  • Wie in Tabelle 6 zu sehen ist, war die eindämmende Wirkung der KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau durch einen exzellenten Wert von 91% repräsentiert. Auch der Verlust der Aktivität, verursacht durch thermale Behandlung, war nicht signifikant, was die thermische Stabilität der Bakterienkultur bei hohen Temperaturen zeigt.
    • 2. Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tabak bei verschiedenen Verdünnungskonzentrationen.
  • Die Kultur von Beispiel 2 wurde zehnfach bis hundertfach verdünnt mit sterilisiertem destilliertem Wasser und auf eine eindämmende Wirkung hin untersucht gegen den echten Mehltau auf Tabak.
  • Jede der Verdünnungen wurde auf die Blätter dreimal in 5-tägigen Intervallen verteilt und nach 7 Tagen wurden die Ergebnisse untersucht und in Tabelle 7 unten dargestellt. <Tabelle 7> Testergebnisse der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterien gegen echten Mehltau auf Tabak bei verschiedenen Verdünnungskonzentrationen
    Grad der Verdünnung Befall (%) Eindämmungswert (%)
    Einfach 0 100
    Fünffach 5,0 95,5
    Zehnfach 12,5 87,5
    Zwanzigfach 25,0 75,0
    Fünfzigfach 45,7 55,0
    Hundertfach 67,5 32,0
    Leitungswasser 100 0
  • Wie aus Tabelle 7 oben ersichtlich ist, zeigte die fünfzigfach verdünnte Kultur der vorliegenden Erfindung eine eindämmende Wirkung von 55,0%, und wenn die unverdünnte Kultur eingesetzt wurde, trat echter Mehltau auf den behandelten Tabakblättern nicht auf.
    • 3. Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tabak unter Verwendung verschiedener Behandlungsverfahren.
  • Eine fünffache Verdünnung von KTGB0202-Bakterienkultur, hergestellt in Beispiel 2, wurde auf die Oberfläche, rückwärtige Oberfläche sowie beide Oberflächen von Tabakblättern dreimal in fünftägigen Intervallen aufgebracht und nach 7 Tagen wurden die Ergebnisse untersucht und sind in Tabelle 8 unten dargestellt. <Tabelle 8> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tabak gemäß Behandlungsverfahren
    Getestete Blattseite Befall (Eindämmungswert in %)
    Oberfläche Rückwärtige Oberfläche
    Oberfläche 12,5 (87,5) 50,0 (50,0)
    Rückwärtige Oberfläche 100 (0) 0 (100)
    Oberfläche/rückwärtige Oberfläche 12,5 (87,5) 0 (100)
    Leitungswasser 100 (0) 100 (0)
  • Wie in Tabelle 8 oben zu sehen ist, zeigte die KTGB0202-Bakterienkultur, wenn sie auf die eine Oberfläche von Tabakpflanzen aufgebracht wurde, eine erkrankungseindämmende Wirkung von 50% und wenn sie auf beide Oberflächen der Tabakblätter aufgebracht wurde, zeigte sich die am vollständigsten eindämmende Wirkung.
  • Testbeispiel 6:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Erdbeeren
  • Um die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Erdbeeren zu untersuchen, wurde die KTGB0202-Bakterienkultur von Beispiel 2 auf Maehyang-Erdbeeren aufgebracht, welche in der Nonsan Strawberry Experiment Station, lokalisiert in Nonsan-shi, Chungcheongnam-do, Korea wuchsen, und zwar dreimal in Intervallen von 6–7 Tagen.
  • Nach 5–7 Tagen einer jeden Behandlung wurden die Erdbeeren geerntet und auf den Befall von Blättern und den Befall von Früchten untersucht und die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 9 bzw. 10 dargestellt. <Tabelle 9> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterien gegen echten Mehltau auf Erdbeerfrüchten.
    Behandlungsmenge 7 Tage nach erstem Aufbringen 5 Tage nach zweitem Aufbringen 9 Tage nach drittem Aufbringen
    Befall (%) auf Früchten Eindämmender Wert (%) Befall (%) auf Früchten Eindämmender Wert (%) Befall (%) auf Früchten Eindämmender Wert (%)
    10-fach verdünnt 17,6 35,5 11,0 72,6 7,5 89,8
    30-fach verdünnt 13,4 50,9 17,5 56,5 9,5 87,1
    50-fach verdünnt 15,4 43,6 34,3 14,4 12,5 83,1
    Leitungswasser 27,3 - 40,2 73,8 -
    <Tabelle 10> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterien gegen echten Mehltau auf Erdbeerblättern
    Behandlungsmenge Befall (%) Eindämmende Wirkung (%)
    10-fach verdünnte Kultur 2,45 96,5
    30-fach verdünnte Kultur 13,3 80,8
    50-fach verdünnte Kultur 20,4 70,5
    Leitungswasser 69,3 -
  • Wie in den Tabellen 9 und 10 zu sehen ist, war die Erkrankungsentwicklung auf Früchten bis zu 89,8% eingedämmt und der höchste inhibitorische Effekt gegen die Erkrankungsentwicklung auf Blättern betrug 96,5%.
  • Testbeispiel 7:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Kürbis
  • Um die eindämmende Wirkung der KTGB0202-Bakterienkultur von Beispiel 2 gegen echten Mehltau auf Kürbis zu untersuchen, wurde die erfindungsgemäße Kultur auf Kürbisblättern mit diffundiertem echten Mehltau, welche in landwirtschaftlichen Zuchtbetrieben, lokalisiert in Kongju-shi, Chungcheongnam-do, Korea wuchsen, aufgebracht.
  • Die KTGB0202-Bakterienkultur wurde dreimal in Intervallen von 3–4 Tagen aufgebracht und nach 8 Tagen wurde der Befall auf den Blättern untersucht und ist in Tabelle 11 unten gezeigt. <Tabelle 11> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Kürbis
    Getestete Substanz Befall (%) Eindämmende Wirkung (%)
    10-fach verdünnte Kultur 2,5 97,4
    30-fach verdünnte Kultur 4,5 95,3
    50-fach verdünnte Kultur 10,5 89,2
    Leitungswasser 97,5 -
  • Wie aus Tabelle 11 zu sehen ist, zeigte die erfindungsgemäße Bakterienkultur eine hocheindämmende Wirkung von 89,2 bis 97,4%, selbst wenn sie auf die Kürbisblätter mit ernsthaft vorangeschrittener Erkrankung aufgebracht wurde. Dies legt nahe, dass die erfindungsgemäße Bakterienkultur nicht nur hinsichtlich präventiver Effekte, sondern auch hinsichtlich therapeutischer Effekte exzellent ist.
  • Testbeispiel 8:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Gurken
  • Die erfindungsgemäße Kultur wurde auf Gurkenblätter mit einem echten Mehltaubefall von ungefähr 10%, welche in Töpfen unter Gewächshausbedingungen wuchsen, aufgebracht und wurde auf eine erkrankungseindämmende Wirkung auf den Gurkenblättern hin untersucht.
  • Die erfindungsgemäße Kultur wurde dreimal in 1-Wochen-Intervallen aufgebracht und nach 7 Tagen wurde der Befall auf den behandelten Blättern untersucht und ist in Tabelle 12 unten dargestellt.
  • Des Weiteren wurde Trifumin® (Triflumizol) in einer 4000-fach verdünnten Konzentration eingesetzt, einer empfohlenen Konzentration für landwirtschaftliche Betriebe. <Tabelle 12> Testergebnisse betreffend den eindämmenden Effekt von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Gurken
    Getestete Substanz Befall (%) Eindämmende Wirkung (%)
    10-fach verdünnte Kultur 2,46 97,54
    30-fach verdünnte Kultur 12,6 87,40
    Trifumin® (Triflumizol) 3,41 96,59
    Grundwasser 100 -
  • Wie aus Tabelle 12 oben ersichtlich ist, zeigte die 10-fach verdünnte Kultur der vorliegenden Erfindung eine Wirkung gleichwertig derjenigen der Vergleichschemikalie Trifumin®.
  • Testbeispiel 9:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Melonen
  • Die Bakterienkultur wurde auf Melonen mit einem Befall von echtem Mehltau von ungefähr 10% unter Gewächshausbedingungen aufgebracht, und zwar dreimal in einwöchigen Intervallen und nach 7 Tagen wurden die Ergebnisse untersucht.
  • Trifumin® und Fenari® (Fenarimol) wurden in einer 4000-fach verdünnten Konzentration verwendet, einer empfohlenen Konzentration für landwirtschaftliche Betriebe.
  • Die Anzahl von Blättern mit echtem Mehltau auf Melone wurden zuvor gezählt und nach Be handlung, um die therapeutischen Wirkungen zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 unten dargestellt. <Tabelle 13> Testergebnisse der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Melone
    Getestete Substanz Anzahl der infizierten Blätter vor der Behandlung/Anzahl der infizierten Blätter nach Behandlung Therapeutische Wirkung
    10-fach verdünnte Kultur 11/0 100
    30-fach verdünnte Kultur 5/1 80
    Trifumin® (Triflumizol) 10/0 100
    Fenari® (Fenarimol) 9/6 33,4
    Leitungswasser 6/6 0
  • Wie aus Tabelle 13 ersichtlich, zeigte die KTGB0202-Bakterienkultur eine exzellente eindämmende Wirkung von 90–100% und auch einen exzellenten inhibitorischen Effekt gegen die Erkrankungsentwicklung auf frischen Blättern, was eine exzellente präventive Wirkung im Vergleich zur Vergleichschemikalie Trifumin® nahe legt.
  • Testbeispiel 10:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tomaten
  • Die KTGB0202-Bakterienkultur wurde dreimal in einwöchigen Intervallen auf die Blätter von Tomaten mit diffundierter Erkrankung aufgebracht, welche in einer Tomaten-Experimentierstation, lokalisiert in Buyeo-kun, Chungcheongnam-do, Korea wuchsen. Nach 7 Tagen wurde eine inhibitorische Wirkung gegen die Erkrankungsentwicklung auf den Blättern untersucht und die Ergebnisse sind in Tabelle 14 unten dargestellt. <Tabelle 14> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Tomaten
    Getestete Substanz Befall (%) Eindämmende Wirkung (%)
    10-fach verdünnte Kultur 4,43 95,57
    30-fach verdünnte Kultur 10,52 89,48
    Leitungswasser 100 0
  • Wie aus Tabelle 14 oben zu sehen ist, zeigte die Kultur, obwohl sie auf Tomatenblätter mit diffundierter Erkrankung aufgebracht wurde, eine exzellente therapeutische Wirkung von 89,48 bis 95,57%.
  • Testbeispiel 11:
  • Test der eindämmenden Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Rosen
  • Um die eindämmende Wirkung der erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Mehltau auf Rosen zu untersuchen, wurde die KTGB0202-Bakterienkultur auf Rosen aufgebracht, wo echter Mehltau auf Rosen (Spaerotheca pannosa) aufgetreten war.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 unten dargestellt. <Tabelle 5> Testergebnisse für die eindämmende Wirkung von KTGB0202-Bakterienkultur gegen echten Rosenmehltau
    Getestete Substanz Blattinfektion (%) Eindämmende Wirkung (%)
    40-fach verdünnte Kultur 2,3 97,9
    80-fach verdünnte Kultur 6,0 93,9
    unbehandelt 98,0 -
  • Wie aus Tabelle 15 oben zu sehen ist, zeigte die erfindungsgemäße KTGB0202-Bakterienkultur eine sehr hohe eindämmende Wirkung gegen echten Mehltau auf Rosen.
  • Testspiel 12:
  • Test der antifungalen Aktivität der antifungalen Substanz KTGB0202-AF01
  • Die antifungale Substanz von Beispiel 3 wurde hergestellt.
  • Das hergestellte KTGB0202-AF01 wurde in Methanol auf eine Konzentration von 100 ppm aufgelöst und in einer Papierscheibe mit einem Durchmesser von 8 mm eingegraben. Sie wurde dann untersucht auf wachstumsinhibitorische Wirkung gegen pflanzenpathogene Pilze und Candida albicans.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 unten dargestellt. <Tabelle 16> Testergebnisse der antifungalen Aktivität der antifungalen Substanz KTGB0202-AF01
    Pathogene Pilze Antifungale Aktivität (klare Zone, mm)
    Cladosporium fulvum 12
    Collectotrichum gloeosporioides 14
    Phytophthora capsici 9
    Botrytis cinerea 10
    Rhizoctonia solani 11
    Fusarium oxysporum 9
    Alternaria solani 13
    Candida albicans 12
  • Wie aus Tabelle 16 zu sehen ist, zeigte die antifungale Substanz KTGB0202-AF10 der vorliegenden Erfindung antifungale Aktivität.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung stellt die neuen Mikroorganismen Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Bakterien, die KTGB0202-Bakterienkulturbrühe sowie die antifungale Substanz KTGB0202-AF01, erhalten durch Extraktion und Aufreinigung aus der KTGB0202-Bakterienkultur, zur Verfügung.
  • Die erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterien werden verwendet zum Eindämmen von Mehltau, Cladosporium sp., Collectotrichum sp., Phytophthora sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Alternaria sp., Magnaporthe grisea, Puccinia recondita, Corticium sasaki, Candida sp. und dergleichen.
  • Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäßen KTGB0202-Bakterien, die KTGB0202-Bakterienkulturbrühe und die antifungale Substanz ein breites Spektrum an antifungaler Aktivität auf, sind exzellent in ihrer Aktivitätsdauer, physikalisch und chemisch sicher und können in Massen in kurzer Zeit kultiviert werden, was eine exzellente ökonomische Effizienz nahe legt.
  • Figure 00210001

Claims (5)

  1. Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 (Zugangsnummer: KCTC 10564BP) mit einer antifungalen Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze und einer inhibitorischen Wirkung gegen Pflanzenvirus-Infektion.
  2. Das Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 gemäß Anspruch 1, wobei der Pflanzenpathogene Pilz einer ist, ausgewählt aus echtem Mehltau, Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Phytophthora sp., Botrytus cinerea, Rhizoctonia solang, Fusarium sp., Alternaria sp., Magnaporthe grisea, Puccinia recondita, Corticium sasaki und Candida sp.
  3. Das Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 gemäß Anspruch 2, wobei der echte Mehltau einer ist, ausgewählt aus Sphaerotheca fuliginea von Kürbispflanzen, S. humuli von Erdbeeren, S. pannosa von Rosen, Erysiphe tabacina von Tabak, Leveillula taurica und Erysiphe cichoracearum von Solanaceae-Gemüsen, Leveillula heraclei von Karotten und Blumeria graminis von Gerste.
  4. Das Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202 von Anspruch 1, wobei das Pflanzenvirus das Tabakmosaikvirus (TMV) ist.
  5. Ein Verfahren zum Eindämmen von Pflanzenpathogenen unter Verwendung der Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202-Kulturbrühe gemäß Anspruch 1.
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