CN105132336B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用，其中该解淀粉芽孢杆菌的拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为HC200，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10371。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌对生防菌和病原菌具有选择性拮抗作用，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、烟草疫霉菌、青枯雷尔氏菌具有强抑制作用，与绿色木霉H06配合具有良好协同拮抗病原菌作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用。
背景技术
由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)等病原菌引起的香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病、番茄青枯病等植物病害是一类毁灭性土传病害，目前对该类病害的防治还没有一种有效的化学农药，而且长期使用化学农药对环境和人类健康造成严重威胁。生物防治是一项安全，环保的防治技术，已成为研究热点。与化学防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有对环境友好、成本低、病原菌不易产生抗药性等优点,是未来病害防治的方向。尽管人们已经发现了大量拮抗细菌,但目前所分离到的细菌还远不能满足农业生产发展的要求。
解淀粉芽孢杆菌是一种芽孢杆菌，在其自身生长中可以产生一系列抗菌活性的代谢产物。在众多生防菌中解淀粉芽孢杆菌抗菌谱广，能形成芽孢，抵御热、紫外线、电磁辐射不良环境，广泛用于防治香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄青枯病等土传病害。尽管解淀粉芽孢杆菌已成为生物防治的研究热点，但是单一的生防芽孢杆菌及其制剂存在功能局限性，同时前人报道了香蕉枯萎病的发生与发病程度分别取决于土壤和根际土壤中尖孢镰刀菌数量。因此分离制备具有选择性拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌菌株，用于研制生防菌复合制剂，能够快速降低土壤中枯萎病等土传病原菌数量，对于有效控制香蕉等作物枯萎病的危害，克服单一生防菌制剂防治土传病害田间防效不稳定的局限，具有重要意义。
发明内容
本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌，解决现有技术中的解淀粉芽孢杆菌对生防菌和病原菌不具有选择性拮抗的问题。
本发明提供的一株解淀粉芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌株号为HC200，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10371。
本发明的解淀粉芽孢杆菌在制备植物杀菌剂的应用。
本发明还提供了一种杀菌剂，该杀菌剂由本发明的解淀粉芽孢杆菌制备而得，杀菌剂包括解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
本发明的杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、辣椒疫霉或青枯雷尔氏菌，植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病或番茄青枯病。
本发明还提供了复合杀菌剂，复合杀菌剂由绿色木霉H06和本发明的解淀粉芽孢杆菌制备而得。
复合杀菌剂包括本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢物的至少一种，还包括绿色木霉H06的菌体和代谢物中的至少一种。
复合杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、辣椒疫霉或青枯雷尔氏菌，植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病或番茄青枯病。
本发明的解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371在低浓度下能够有效抑制尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、烟草疫霉菌、青枯雷尔氏菌的生长，且杀菌应用范围广，对香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病、番茄青枯病、辣椒根腐病等均具有防治效果。
进一步地，由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HC200CGMCCNo.10371与绿色木霉H06混合制备而得的复合杀菌剂，对香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病、番茄青枯病的防治效果优于施用单一菌株解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂或绿色木霉H06菌剂，与绿色木霉H06具有良好的协同作用。
菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens
菌株编号：HC200
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年01月19日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10371
附图说明
图1-A为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HC200的菌落形态；
图1-B为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HC200的芽孢形态；
图2-A为本发明实施例三的解淀粉芽孢杆菌HC200对香蕉枯萎病菌的抑菌作用。其中7为清水对照实验、1、2、3为多菌灵药剂对照实验，4、5、6为解淀粉芽孢杆菌HC200实验；
图2-B为本发明实施例三未加入由解淀粉芽孢杆菌HC200制备而得的杀菌剂时香蕉枯萎病菌的菌丝形态；
图2-C为本发明实施例三加入由解淀粉芽孢杆菌HC200制备而得的杀菌剂后香蕉枯萎病菌的菌丝形态。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所用NA培养液：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1g/L，蛋白陈5g/L，葡萄糖10g/L，用蒸馏水定容，其pH为7.0。
本发明实施例所用LB培养液：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用蒸馏水定容。
本发明实施例所用LB培养基是在上述LB培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用PDA培养液：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，是在上述PDA培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用PDA培养基是在上述PDA培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
本发明实施例所用枯萎病菌选择性培养基参照文献(景晓辉,吴伦英,区小玲,朱利林,薛玉潇,吴琳,&黄俊生.一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基.热带作物学报.2009,(11),1671-1673.)。
本发明实施例所用青枯雷尔氏菌选择性培养基参照文献(丁传雨.生物有机肥对土传马铃薯青枯病的防控技术及机理研究[D].南京农业大学,2012.)。
土壤中枯萎病菌/青枯病菌的检测方法采用稀释涂平板法，参照文献(李阜棣，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京:中国农业出版社，1996:32-34，305-306.)。
本发明实例中涉及到的香蕉枯萎病菌(即尖孢镰刀菌)、辣椒根腐病菌(即腐皮镰刀菌)、烟草疫霉菌、番茄青枯病菌(即青枯雷尔氏菌)、枯草芽孢杆菌BSA-6、解淀粉芽孢杆菌C10-1、解淀粉芽孢杆菌BWA7和绿色木霉H06均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，可由现有技术中的常规方法获得。
枯草芽孢杆菌BSA-6的公开文献：潘江禹.枯草芽孢杆菌BSA-6防控香蕉枯萎病初步研究[D]..海南大学.2013，海南海口。
解淀粉芽孢杆菌C10-1的公开文献：曹红.香蕉枯萎病拮抗菌C10-1的鉴定及生防潜力评价[D].华中农业大学.2013，湖北武汉。
解淀粉芽孢杆菌bwa7的公开文献：薛玉箫.解淀粉芽孢杆菌bwa7在香蕉上的定殖及其生防机制的初步研究[D].海南大学.2013，海南海口。
绿色木霉H06的公开文献：黄俊生,梁昌聪,杨腊英,吴琳,王亚.一株绿色木霉菌及其应用(ZL201210323738.2)；黄俊生，梁昌聪，刘磊，张建华，郭立佳，王伟伟.一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法(ZL201310372776.1)。
实施例一：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HC200的分离及鉴定
1、解淀粉芽孢杆菌HC200的分离
从中国海南省文昌红树林淤泥土壤采集土样样本，把土壤样本风干，过筛后称取适量土样放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡30min，待土样均匀分散后，静置10min后，按梯度法稀至不同浓度，各梯度稀释液分别在80℃水浴加热20min后取一定量稀释液涂布于壳聚糖选择性培养基上，在37℃恒温下培养2-4d，挑取单菌落纯化，作为待测菌株。
解淀粉芽孢杆菌的初筛：制备约1.6×105个/mL的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，吸取3ml该孢子悬浮液涂布于自制的方形培养皿(22cm×25cm)中的PDA固体培养基上，预培养12h，用牙签均匀点待测菌接种于PDA固体培养基，并置于28℃的恒温培养箱下培养2天，观察有无抑菌带。
解淀粉芽孢杆菌复筛：取待测菌接种于PDA培养液，置于摇床37℃，150r/min，培养24h，取2mL发酵液离心(10000r/min，离心8-15min)，取上清，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。利用6mm打孔器在含有香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)的PDA固体培养基上打孔，分别加入待测菌滤液，培养2d后观察抑菌带透明度，计算抑菌带宽度、重复3次，选择抑菌带宽度最大的目标菌株，即得到了解淀粉芽孢杆菌HC200。
2、解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371的鉴定
①形态学鉴定
将纯化并分离得到的解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371菌株接种于LB培养基上，在37℃下培养8-10h，观察菌落形态。结果显示解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371菌株在LB培养基前期为圆形、乳白色、半透明、略凸起、边缘整齐，后期为近圆形、灰白色、干燥、不透明、皱褶、边缘波浪状，如图1-A。另取培养24h后的菌落，适当稀释后涂布于载玻片，革兰氏染色，置于显微镜观察。革兰氏染色显阳性，菌体短杆状，产芽孢，芽孢卵圆形，如图1-B。
②分子鉴定
解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371的16S rDNA全序列如序列1所示，全长为1513bp。
解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371已于2015年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10371。
③具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因
通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法检测发现解淀粉芽孢杆菌HC200具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因，提取解淀粉芽孢杆菌HC200DNA，参照文献报道的引物，以HC200DNA为模板扩增脂肽类功能基因，发现HC200含有脂肽类抗生素sur3、ituA、ituB、ituC、ituD、fenB、bam的生物合成相关基因。
所用引物参照文献中的方法制备：程凯.防治土传棉花黄萎病微生物有机肥研制与生物效应研究[D].南京:南京农业大学,2010；Athukorala S N P,Fernando W G D,Rashid K Y.Identification of antifungal antibiotics of Bacillus speciesisolated from different microhabitats using polymerase chain reaction andMALDI-TOF mass spectrometry[J].Canadian journal of microbiology,2009,55(9):1021-1032。
实施例二：由解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371制备杀菌剂的方法：
解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No.10371制备杀菌剂的方法：取斜面NA培养基保存的解淀粉芽孢杆菌HC200，划线至LB培养基平板，置于37℃，培养8h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑取HC200接种至装有20mL LB培养液的三角瓶(50mL)内，置于摇床上，在37℃条件下，以160rpm/min恒温振荡培养2-3h；然后在无菌条件下按照体积百分含量为1％的接种量接入装有200mL LB培养液的三角瓶(500mL)内；接种后的摇瓶在37℃条件下，以160rpm/min的转速振荡培养14h，获得解淀粉芽孢杆菌HC200发酵液，即杀菌剂。本实施例的杀菌剂含有解淀粉芽孢杆菌HC200菌体和代谢产物，在另外一个实施例中，杀菌剂为解淀粉芽孢杆菌HC200的单一代谢产物或单一菌体，也可以起到本发明的杀菌剂选择性拮抗病原菌的发明效果，杀菌剂的制备方法不限定本发明杀菌剂的保护范围。
实施例三：实施例二制备的杀菌剂对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)菌丝的抑制作用
1、在PDA培养基平板上涂布香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，在28℃预培养1d后，在平板中央和距离中央2cm处利用6mm打孔器打孔，加入20μL实施例二制备的杀菌剂，对照实验则分别加入清水和农药多菌灵来替代，观察其抑菌带，在28℃培养箱培养3d，各重复3次实验。观察其抑菌带，实验抑菌带平均宽度达17mm，与化学农药多菌灵效果相当，如图2-A。
2、取PDA培养基熔融后，加入实施例二制备的杀菌剂混合，吸取适量混合液置于载玻片，取香蕉枯萎病菌菌丝接种至载玻片上PDA培养基表面，培养12h观察。通过显微镜观察发现该杀菌剂对香蕉枯萎病菌菌丝的生长有较强的拮抗作用，菌丝顶端膨大，内容物消解，如图2-B，对照组菌丝平滑，如图2-C。表明该杀菌剂能明显抑制香蕉枯萎病菌菌丝的生长，表现为降解菌丝的作用。
3、取450μL浓度为1.5×107cfu/mL的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，分装至2mL离心管中。再往离心管加入50μL实施例二制备的杀菌剂，对照组则加入等量无菌水，分别与香蕉枯萎病菌孢子悬浮液混匀后置28℃恒温培养。每个实验重复3次，统计该杀菌剂在12h和24h对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制率。
抑制率＝(对照萌发率-实验萌发率)×100％/对照萌发率。
结果表明在12h时，该杀菌剂对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制率是83.19％，在20h时，该杀菌剂对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制率是87.75％。
实施例四：实施例二制备的杀菌剂对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)的拮抗作用
参照实施例三，在PDA平板中央接入番茄枯萎病菌，在28℃预培养1d后，在距离中央2cm处利用打孔器打孔，分别用移液枪加入20μL实施例二制备的杀菌剂和清水对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，每实验重复3次。测量其抑菌带平均宽度达16mm。
实施例五：实施例二制备的杀菌剂对甜瓜枯萎病菌(F.oxysprum f.sp.melonis)的拮抗作用
参照实施例三，在PDA平板中央接入甜瓜枯萎病菌，在28℃预培养1d后，在距离中央2cm处利用打孔器打孔，分别用移液枪加入20μL实施例二制备的杀菌剂和清水对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，每实验重复3次。测量抑菌带平均宽度达15mm。
实施例六：实施例二制备的杀菌剂对辣椒根腐病菌(Fusarium solani)的拮抗作用
参照实施例三，在PDA平板中央接入辣椒根腐病菌，在28℃预培养1d后，在距离中央2cm处利用打孔器打孔，分别用移液枪加入20μL实施例二制备的杀菌剂和清水对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，每实验重复3次。抑菌带平均宽度达14mm。
实施例七：实施例二制备的杀菌剂对烟草疫霉病菌(Phytophthora nicotianae)的拮抗作用。
参照实施例三，在PDA平板中央接入烟草疫霉病菌，在28℃预培养1d后，在距离中央2cm处利用打孔器打孔，分别用移液枪加入20μL实施例二制备的杀菌剂和清水对照，在28℃培养箱培养3d，测量抑菌带宽度，每实验重复3次。测量平均抑菌带宽度达15mm。
实施例八：实施例二制备的杀菌剂对番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的拮抗作用
参照实施例三，在LB平板涂布番茄青枯病菌，在距离中央2cm处利用打孔器打6个孔，在3个孔中分别用移液枪加入20μL实施例二制备的杀菌剂，在其余3个孔中加入等量的清水作为对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，每实验重复3次。抑菌带平均宽度达15mm。
实施例九：实施例二制备的杀菌剂对绿色木霉H06具有协同拮抗作用
枯草芽孢杆菌BSA-6菌剂、解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂、解淀粉芽孢杆菌bwa7菌剂的制备方法参考实施例二。枯草芽孢杆菌BSA-6菌剂、解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂、解淀粉芽孢杆菌bwa7菌剂为实施例二制备的HC200菌剂的对比菌剂，采用平板对峙法，分别取香蕉枯萎病菌和绿色木霉H06在PDA培养基上活化，置于28℃培养箱中培养3d后，在PDA培养基平板中央接入分别接入香蕉枯萎病菌和拮抗绿色木霉H06菌饼，在28℃预培养1d后，分别在距离香蕉枯萎病菌和拮抗绿色木霉H06菌饼2.0cm处，用打孔器依次等距离各打5个孔，分别在3个孔中各加入20μL实施例二制备的杀菌剂，在其余2个孔中各自加入等量无菌水、无菌PDA培养液作为对照，置于28℃培养箱中培养72h，统计其抑菌带宽度。
结果如表1所示，HC200菌剂对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，对H06菌剂无拮抗作用；BSA-6菌剂对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，同时对H06有较强拮抗作用；C10-1菌剂对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，同时对H06有较强拮抗作用；bwa7对香蕉枯萎病菌有强拮抗作用，对H06有较强抗作用。综上，说明HC200对香蕉枯萎病菌拮抗作用强，与木霉H06制备复合菌剂协同拮抗病原菌。
其中，-代表无抑制；+代表弱拮抗，抑菌带宽度1-5mm；++代表较强拮抗，抑菌带宽度5-10mm；+++代表强拮抗，抑菌带宽度>10mm。
表1
实例十：解淀粉芽孢杆菌HC200具有抗硫酸链霉素的活性
通过抗生素标记实验可诱导HC200具有硫酸链霉素抗性，在含有200μg/mL的LB培养基上能稳定生长、菌落形态、对香蕉枯萎病菌和绿色木霉H06具有选择性拮抗作用。且由于其具有硫酸链霉素抗性特性，可以与抗生素共同使用，以便起到抗自然界中的细菌污染的作用，有利于规模化发酵生产HC200菌株及HC200菌剂，使其在作为杀菌剂实际使用过程中能抵抗细菌的污染。这也是本发明解淀粉芽孢杆菌HC200优于现有杀菌用的生防芽孢杆菌的特性。
实施例十一：解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂、绿色木霉H06菌剂及复合杀菌剂的制备方法
解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂的制备：取斜面NA培养基保存的解淀粉芽孢杆菌HC200，划线至LB培养基平板，置于37℃，培养8h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑取解淀粉芽孢杆菌HC200接种至装有20mL LB培养液的三角瓶(50mL)内，置可控温摇床上，在37℃条件下，以160rpm/min速度，恒温振荡培养2.5h；然后在无菌条件下按照体积百分含量为1％的接种量接入装有200mL LB培养液的三角瓶内(500mL)；接种后的摇瓶在37℃条件下，以160rpm/min的转速振荡培养14h，即制得HC200菌剂。
绿色木霉H06菌剂的制备：取斜面NA培养基保存的绿色木霉H06，划线至LB培养基平板，置于28℃，培养48h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑取绿色木霉H06接种至装有20mLPDA培养液的三角瓶(50mL)内，置可控温摇床上，在28℃条件下，160rpm/min，恒温振荡培养2.5h；然后在无菌条件下按照体积百分含量为1％的接种量接入装有200mL PDA培养液的三角瓶内(500mL)；接种后的摇瓶在28℃条件下，以160rpm/min的转速振荡培养48h。
复合杀菌剂：取同体积量的解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂和H06菌剂混匀配制而成。
实施例十二：解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂和绿色木霉H06菌剂复合协同防治香蕉枯萎病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
在海南儋州铺仔香蕉基地，准备五个各装入无香蕉枯萎病土壤的塑料花盆，进行5个实验组。实验1为空白对照实验，不施用香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，不施用HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为香蕉枯萎病菌对照，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，不施用菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL HC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，施用100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL H06菌剂，按106cfu/g土的菌量土接入土壤；实验5为复合杀菌剂实验，施入100mL香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理5d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的香蕉枯萎病菌数量比对照土壤中的香蕉枯萎病菌数量下降至少2个数量级后，移栽5片叶巴西蕉，每个实验组50株，重复3次。
以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，统计病情指数和防效：
将香蕉枯萎病发病程度统计分为以下5个标准：
0级：植株无枯黄症状。
1级：植株下部叶片出现轻微的枯黄症状，嫩叶完好，少部分根系轻微褐变，茎部出现水渍状褐变。
2级：植株下部叶片出现明显的枯黄症状，但嫩叶完好，根系出现褐变，茎部和假茎部出现水渍状褐变。
3级：整株出现枯黄症状，根系褐变腐烂，茎部和假茎部褐变连片，少数叶柄出现红褐。
4级：整株出现枯萎死亡症状，根系严重褐变腐烂。
病情指数＝(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治香蕉枯萎病效果如表2所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合杀菌剂对香蕉枯萎病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200或绿色木霉H06的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治香蕉枯萎病作用。
表2
实施例十三：解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治甜瓜枯萎病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
在海南三亚温室大棚微型小区进行，每小区面积1m*12m，分5个实验，制备106个/mL的甜瓜枯萎病病菌悬浮液，实验2、实验3、实验4、实验5按照104cfu/g土的菌量接入土壤，实验1为空白对照实验，不施甜瓜枯萎病病菌，不施HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为甜瓜枯萎病病菌对照，施用100mL甜瓜枯萎病菌悬浮液，不施菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验，施用100mL甜瓜枯萎病病菌悬浮液，取100mL HC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，施用100mL甜瓜枯萎病病菌悬浮液，取100mL H06菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验5为复合杀菌剂实验，加入100mL甜瓜枯萎病病菌悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理7d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的甜瓜枯萎病菌数量比对照土壤中的甜瓜枯萎病菌数量下降至少2个数量级后，移栽甜瓜枯萎病幼苗，每个实验50株，重复3次。
以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，将甜瓜枯萎病发病程度统计参照实施例十二，统计病情指数和防效。
解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治甜瓜枯萎病效果如表3所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200与H06混合施用对甜瓜枯萎病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200菌剂或H06菌剂的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治甜瓜枯萎病作用。
表3
实施例十四：解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治番茄枯萎病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
在海南儋州铺仔番茄基地，在塑料花盆(直径：15cm，高：25cm)中，各装入2kg无枯萎病土壤，分5个实验组，制备番茄枯萎病菌孢子悬浮液，在实验2、实验3、实验4、实验5按照104cfu/g土的菌量接入土壤，实验1为空白对照，不施番茄枯萎病菌，不施HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为番茄枯萎病菌对照，施用100mL番茄枯萎病菌孢子悬浮液，不施菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验，施用100mL番茄枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL HC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，施用100mL番茄枯萎病菌孢子悬浮液，取100mL H06菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验5为复合杀菌剂实验：接入100mL番茄枯萎病菌孢子悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理10d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的番茄枯萎病菌数量比对照土壤中的番茄枯萎病菌数量下降至少2个数量级后，移栽番茄，每个实验50株，重复3次。
将以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，计算病情指数和防病效果：
番茄枯萎病发病程度统计参照实施例十二。
解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治番茄枯萎病效果如表4所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂与H06菌剂混合施用具有对番茄枯萎病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200菌剂或H06菌剂的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治番茄枯萎病作用。
表4
实施例十五、解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂和绿色木霉H06菌剂复合协同防治香草兰枯萎病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
在海南万宁香草兰苗圃微型小区进行，每小区面积2m*12m，分5个实验，制备香草兰枯萎病病菌悬浮液(106个/mL)，在实验2、实验3、实验4、实验5按照104cfu/g土的菌量接入土壤，实验1为空白对照，不施香草兰枯萎病菌，不施HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为香草兰枯萎病菌对照，施用100mL香草兰枯萎病病菌悬浮液，不施杀菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验：100mL香草兰枯萎病菌悬浮液，取100mL HC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，100mL香草兰枯萎病菌悬浮液，取100mLH06菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验5为复合杀菌剂实验，接入100mL香草兰枯萎病病菌悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上土壤处理5d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的香草兰枯萎病菌数量比对照土壤中的香草兰枯萎病菌数量下降至少2个数量级后，移栽香草兰幼苗，每个实验50株，重复3次。
以上实验植物常规水肥管理，待对照出现发病症状后，统计病情指数和防病效果。香草兰枯萎病发病程度统计参照实施例十二。
解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治香草兰枯萎病效果如表5所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂与H06菌剂混合施用具有对香草兰枯萎病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200菌剂或H06菌剂的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治香草兰枯萎病作用。
表5
实施例十六、解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂和绿色木霉H06菌剂复合协同防治辣椒根腐病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
取海南儋州铺仔辣椒种植地无根腐病土壤。在塑料花盆(直径：15cm，高：25cm)中，装入2kg土壤，分5个实验，制备辣椒根腐病菌悬浮液(106个/mL)，在实验2、实验3、实验4、实验5按照104cfu/g土接入土壤，实验1为空白对照，不施辣椒根腐病菌，不施HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为辣椒根腐病菌对照，施入100mL辣椒根腐病菌悬浮液，不施菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验，施入100mL辣椒根腐病菌悬浮液，取100mLHC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，100mL辣椒根腐病菌悬浮液，取100mL H06菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤，实验5为复合杀菌剂实验：接入100mL辣椒根腐病菌悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理7d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经枯萎病菌选择性培养基检测，待菌剂土壤中的辣椒根腐病菌数量比对照土壤中的辣椒根腐病菌数量下降至少2个数量级后，移栽辣椒幼苗，每个实验50株，重复3次。
以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照实验出现发病症状后，调查病情指数和防病效果。辣椒根腐病病程度统计分为以下5个标准：
0级：植株根系、茎部和叶片均无病害；
1级：根系和茎基部有少量病斑，占根系和茎部总面积的0-20％；
2级：根系和茎基部病斑较多，占根系和茎部总面积的20-50％
3级：根系和茎基部病斑较多且较大，占根系和茎部总面积的50-75％
4级：根系坏死，植株地上部分萎蔫或死亡。
病情指数＝(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治辣椒根腐病效果如表6所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂与H06菌剂混合施用对辣椒根腐病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200菌剂或H06菌剂的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治辣椒根腐病作用。
表6
实施例十七、解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06复合协同防治番茄青枯病
本实施例选用的HC200菌剂、H06菌剂和复合杀菌剂分别由实施例十一的方法制备而得。
在海南儋州铺仔番茄种植地，在塑料花盆(直径：cm，高：25cm)中装入2kg无番茄青枯病菌土壤，分5个实验组，制备106个/mL的番茄青枯病菌悬浮液，在实验2、实验3、实验4、实验5按照104cfu/g土接入土壤，实验1为空白对照：不施番茄青枯病菌，不施HC200菌剂和H06菌剂，施用100mL清水；实验2为番茄青枯病菌对照，施用100mL番茄青枯病菌悬浮液，不施菌剂，施用100mL清水；实验3为HC200菌剂实验，施用100mL番茄青枯病菌悬浮液，取100mLHC200菌剂，按106cfu/g土的菌量接入土壤；实验4为H06菌剂实验，100mL番茄青枯病菌悬浮液，取100mL H06菌剂，按106cfu/g的土菌量接入土壤；实验5为复合杀菌剂实验：接入100mL番茄青枯病菌悬浮液，取50mL HC200菌剂和50mL H06菌剂混匀后，按106cfu/g土的菌量接入土壤。以上实验土壤处理8d，取各处理土样采用稀释平板计数法，经青枯病菌选择性培养基检测，待菌剂处理土壤中的番茄青枯病菌数量比对照土壤中的番茄青枯病菌数量下降至少2个数量级后，移栽5片叶番茄幼苗，每个实验50株，重复3次。
将以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待对照出现发病症状后，取各实验香蕉根际土壤适量，经梯度稀释涂布镰刀菌选择性培养基计数，统计病情指数和防治效果：
将番茄青枯病病情程度统计分为以下5个标准：
0级：植株叶片无症状；
1级：植株叶片萎蔫1％-20％；
2级：植株叶片萎蔫20％-50％；
3级：植株叶片叶片萎蔫>50％，未死亡和未全株萎蔫；
4级：植株死亡。
病情指数＝(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)
防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％
解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂和绿色木霉H06菌剂复合协同防治番茄青枯病病效果如表7所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。解淀粉芽孢杆菌HC200菌剂与H06菌剂混合施用对番茄青枯病具有很好的防病效果，优于单一施用HC200菌剂或H06菌剂的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌HC200和绿色木霉H06具有较强的协同防治番茄青枯病作用。
表7
实施例十八：解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂和绿色木霉H06菌剂复合协同防治香蕉枯萎病
使用解淀粉芽孢杆菌C10-1取代解淀粉芽孢杆菌HC200，参照实施例十一制备解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂和复合杀菌剂1，参照实施例十二，分别使用解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂和复合菌剂1进行防治香蕉枯萎病实验，实验结果如表8所示，病情指数越低，防治效果越高，说明其杀菌效果越好。单一施用解淀粉芽孢杆菌C10-1菌剂或H06菌剂有较好的防病效果，优于混合施用复合菌剂1(C10-1菌剂与H06菌剂)的防病效果，说明解淀粉芽孢杆菌C10-1和绿色木霉H06不具有协同防治香蕉枯萎病作用。
表8
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (8)
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的拉丁名为Bacillusamyloliquefaciens，菌株号为HC200，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.10371。
2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌在制备植物杀菌剂的应用。
3.杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
4.根据权利要求3所述的杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的菌体或发酵液。
5.权利要求3或4所述的杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，所述病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌或青枯雷尔氏菌，所述植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病或番茄青枯病。
6.复合杀菌剂，其特征在于：所述复合杀菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和绿色木霉H06。
7.根据权利要求6所述的复合杀菌剂，其特征在于：所述复合杀菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的菌体或发酵液，还包括绿色木霉H06的菌体或发酵液。
8.权利要求6或7所述的复合杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，所述病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌或青枯雷尔氏菌，所述植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病或番茄青枯病。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |