CN113234638B - 一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1(Bacillus amyloliquefaciens Bam1)，其保藏编号为CGMCC No.21633。本发明还公开了所述的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1的应用。本发明的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1具有良好的抑菌活性，对镉具有良好的耐受性，在含镉的土壤中具有良好的定殖能力，可以在含镉类轻度污染地块中正常发挥防治植物病害及促进植物生长的功能。

Description

一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于农用生物制剂技术领域，具体地说，是关于一种高耐农田污染重金属--镉的生防解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

随着社会工业化程度的提高，我国农田受重金属污染情况日益严重。镉是我国农田首要污染重金属。目前我国受镉污染的耕地面积约达140万公顷。在这面积辽阔的镉污染的耕地中，绝大多数耕地仍处于轻度污染状态(约占85.71％)，而在该类地块上种植的作物中所含镉的含量不存在明显对人体危害的风险，仍符合我国食品卫生标准；鉴于我国耕地紧张的现状，占地辽阔的镉轻度污染耕地仍是我国重要农业生产资源。在该类地块中，由于镉的超标存在对植物造成一定程度的免疫损伤，使植物更容易受到病原菌的侵染而发生病害。但是化学农药也是带来农田重金属污染的源头之一，所以在该类地块中植物病害防治的最佳选择是对环境友好的微生物农药。生防菌在施用小生境中能够良好地定殖及繁殖是微生物农药发挥防治作用的首要条件。因此在镉轻度污染地块中，含有良好镉耐受性(抗性)生防菌的微生物农药才能更好的发挥防治植物病害的作用。而我国已登记的微生物农药的生防菌大多数都没有良好的重金属耐受性，难以在该类地块中正常发挥防治植物病害的作用。

因此亟待开发适用于该类地块的新型高耐镉微生物农药。

发明内容

本发明从黄瓜植株根际中分离得到一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1(Bacillus amyloliquefaciens Bam1)，在对其功能进行研究的过程中发现，该菌具有良好的抑菌活性，对镉具有良好的耐受性，在含镉的土壤中具有良好的定殖能力，可以在含镉类地块中正常发挥防治植物病害的功能。因此，本发明的第一个目的是提供一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1。本发明的第二个目的是提供所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备微生物农药、抑菌剂等中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1(Bacillusamyloliquefaciens Bam1)，所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1的保藏编号为CGMCCNo.21633。

根据本发明，所述高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1包括如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示gryB基因、gryA基因、cadA基因、czrA基因、czcD基因。

作为本发明的第二个方面，一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备微生物农药中的应用。

作为本发明的第三个方面，一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在防治植物病原真菌和/或植物病原细菌中的应用。

根据本发明，所述的植物病原真菌包括香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、小麦枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苦瓜黑霉病菌、黄瓜黑霉病菌、烟草赤星病菌、番茄早疫病菌、黄萎病菌；所述植物病原细菌包括番茄青枯病菌和黄瓜细菌性角斑病菌。

作为本发明的第四个方面，一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备用于抑制植物病原真菌或植物病原细菌的活性的微生物抑菌剂中的应用。

根据本发明，所述植物病原真菌包括香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、小麦枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苦瓜黑霉病菌、黄瓜黑霉病菌、烟草赤星病菌、番茄早疫病菌、黄萎病菌；所述植物病原细菌包括番茄青枯病菌和黄瓜细菌性角斑病菌。

作为本发明的第五个方面，一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备用于促进植物生长的微生物促进剂中的应用。

根据本发明，所述植物为黄瓜、番茄、白菜等。

作为本发明的第六个方面，一种微生物抑菌剂，以上述所述的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1的菌液或菌粉为活性成分。

本发明的有益效果：本发明的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1具有良好的抑菌活性，对镉具有良好的耐受性(抗性)，在含镉的土壤中具有良好的定殖能力，可以在含镉类轻度污染地块中正常发挥防治植物病害及促进植物生长的功能。

附图说明

图1为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1对多种重要病原菌的抑菌活性。

图2为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1与对照市售生防解淀粉芽孢杆菌菌株对镉(Cd)的耐受性评估结果，其中，***表示在LB培养基中，镉对两组处理的抑菌圈在p＜0.001水平差异显著，n＝3。

图3为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1与对照市售生防解淀粉芽孢杆菌菌株在含镉(Cd)土壤中的定殖情况。

图4为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1对黄瓜苗的促生长作用，其中，***表示黄瓜苗处理30天后，高度在p＜0.001水平差异显著，n＝3。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

1、本发明的菌种

本发明的解淀粉芽孢杆菌Bam1(Bacillus amyloliquefaciens Bam1)分离自黄瓜植株根际，已于2021年1月15日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，保藏号为：CGMCCNo.21633，保藏地址为中国北京。解淀粉芽孢杆菌Bam1已用第三代测序仪PacBio RS II进行全基因组测序，其几个主要特征基因(gryB、gryA、cadA、czrA、czcD)的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

2、本发明的培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1L；固体培养基另添加琼脂粉15g。

实施例1解淀粉芽孢杆菌Bam1抑菌活性的评估

用点接法评估了本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株对所测实的12种重要植物病原真菌和2种重要植物病原细菌的抑菌活性，结果见图1。

对病原真菌抑菌活性的测定操作过程为：将活化后的病原真菌，切取直径为6mm的菌饼，放置在PDA平板上；随后用接种针沾取活化后的解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株单菌落，并将沾取的解淀粉芽孢杆菌Bam1均匀点接3-4个点在病原真菌菌饼周围，25℃培养7天左右测量抑菌带宽度，抑菌带越宽表明解淀粉芽孢杆菌Bam1对病原真菌的抑菌效果越好。

对病原细菌抑菌活性的测定操作过程为：将活化的病原细菌用LB液体培养至OD₆₀₀≈0.4，取200μL与4ml 50℃左右的LB熔融固体培养基混匀后平铺在预先制备好的水琼脂平板上，待含菌的LB凝固后，用接种针均匀的点接活化后的解淀粉芽孢杆菌Bam1在含病原细菌的LB平板上，28℃培养24h测量抑菌圈的直径，直径越大表示解淀粉芽孢杆菌Bam1对病原细菌的抑菌效果越好。

经以上方法的评估结果显示，解淀粉芽孢杆菌Bam1对其中的9种植物病原真菌(香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、小麦枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苦瓜黑霉病菌、黄瓜黑霉病菌、烟草赤星病菌、番茄早疫病菌、黄萎病菌)和2种植物病原细菌(番茄青枯病菌、黄瓜细菌性角斑病菌)有较好的抑菌活性。

实施例2解淀粉芽孢杆菌Bam1对镉耐受性的评估

用平板扩散法对一株市售生防解淀粉芽孢杆菌(对照)和本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株对农田重要污染重金属镉的耐受性进行了评估。

具体操作过程为：挑取解淀粉芽孢杆菌Bam1或市售解淀粉芽孢杆菌在LB液体培养基中培养至的OD₆₀₀≈1.0，取200μL解淀粉芽孢杆菌Bam1或市售解淀粉芽孢杆菌培养液与4ml 50℃左右的LB熔融半固体培养基混匀后平铺在预先制备好的LB固体平板上，待含菌的LB凝固后，在平板中央放置一个直径为6mm的纸碟，在纸碟上滴加10μL浓度为10mM的镉Cl₂，37℃培养12-24h测定抑菌圈直径，抑菌圈直径越小，表示测试菌对镉的耐受性(抗性)越强。结果如图2所示。

从图2可以看出，镉对解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株的抑菌圈明显小于对照的市售解淀粉芽孢杆菌菌株，即解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株对镉的耐受性明显优于对照的市售解淀粉芽孢杆菌菌株。

实施例3解淀粉芽孢杆菌Bam1在含镉土壤中的定殖能力评估

将镉Cl₂溶液与灭菌土壤混合，使土壤中镉离子的含量达到10mM。分别接种本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株和市售解淀粉芽孢杆菌菌株(对照)到含镉浓度为10mM的土壤中，使初始活菌含量达到约1×10⁷CFU/g土，随后定期观察两个菌株在含镉土壤中的定殖能力。结果如图3所示。

从图3中可以看出，市售解淀粉芽孢杆菌菌株在含镉浓度为10mM的土壤中难以生存，而解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株可以在该土壤中良好定殖。这也进一步证明解淀粉芽孢杆菌Bam1菌株对镉的耐受性明显优于对照的市售解淀粉芽孢杆菌菌株。

实施例4解淀粉芽孢杆菌Bam1对黄瓜苗的促生长作用

解淀粉芽孢杆菌Bam1除可以防治植物病害外，还可以促进植物的生长。

将解淀粉芽孢杆菌Bam1的发酵培养液(活菌含量达到1.0×10¹⁰CFU/mL)对黄瓜苗(约10cm高)进行灌根(约20ml/苗，30株苗/处理，以清水为对照)，处理30天后发现解淀粉芽孢杆菌Bam1对黄瓜苗有明显的促生长作用，结果如图4所示。

结果显示，Bam1处理后黄瓜苗的高度比对照(清水)高10cm左右，差异达到极显著水平。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 211074

<141> 2021-06-16

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1923

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctatgg aacagcagca aaatagttat gatgagaatc agatacaggt attagaaggt 60

ttggaagctg ttcgaaagag accggggatg tacatcggat caactaacag caaaggcctt 120

caccatttgg tatgggaaat cgtcgacaac agtattgacg aagccctggc cggttattgt 180

acagatatta acatcgagat tgaaaaagat aacagcatta ccgttaaaga caacgggcgc 240

ggaattccgg tcggtatcca agagaaaatg ggccgtcctg cggttgaagt catcatgacc 300

gttcttcacg caggcggaaa atttgacgga agcggatata aagtatccgg cggtcttcac 360

ggtgttgggg cgtctgtcgt aaacgcctta tcgaccactc ttgacgttac ggttcatcgt 420

gacgggaaaa tccattatca ggcgtatgaa cgcggtgtac cggtggccga tcttgaagtg 480

atcggtgaca ctgataagac cggaacgatt acgcacttcg ttcccgatcc ggaaattttc 540

aaagaaacaa ccgtatacga ctatgatctg ctttcaaacc gtgtccgaga attggccttc 600

ctgacaaagg gcgtcaacat cacgattgaa gacaaacgtg aaggacaaga acggaaaaac 660

gagtaccact acgaaggcgg aatcaaaagc tacgttgagt acttaaaccg ttccaaagaa 720

gtcattcatg aagagccgat ttatatcgaa ggcgagaaag acggcataac ggttgaagtt 780

gcattgcaat acaacgacag ctatacaagc aacatttatt ctttcacgaa taacatcaac 840

acatacgaag gcggcacgca cgaagccgga tttaaaaccg gtttgacccg tgtcataaac 900

gactatgcaa gaagaaaagg gattttcaaa gaaaatgatc cgaatctgag cggtgatgat 960

gtgagagaag ggctgactgc catcatttca attaagcacc ctgatccgca attcgaaggg 1020

cagacgaaaa cgaagctcgg caactctgaa gcgagaacga ttactgatac gctgttttct 1080

tccgcactgg aaacattcct tcttgaaaat ccggactcag cccgtaaaat cgttgaaaag 1140

ggcttaatgg ccgcaagagc gcggatggcg gcgaaaaaag cgcgggaatt gacccggcgt 1200

aaaagcgcac ttgagatttc caatttgccg ggtaaactgg cggactgttc ttctaaagat 1260

ccgagcattt ccgagctgta tatcgtagag ggtgactctg cgggcggatc agcgaaacag 1320

ggacgggacc gtcatttcca agccattctg ccgctgcggg gtaagattct gaacgttgag 1380

aaagcaagac ttgataagat tctctcaaac aatgaggtca gatcaatgat tacggctctc 1440

gggacaggaa tcggagaaga ctttaatctt gaaaaagcgc gttatcataa agtggttatc 1500

atgacggatg ccgatgttga cggcgcccac atcagaacgc ttttattaac gttcttctac 1560

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aaagtgcagc agggaaaacg ggtggaatac gcttataacg ataagcagct tgatgagctt 1680

ttaaaagagc ttccgcaatc acccaagccc ggcctccagc gttataaagg tctcggggaa 1740

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gtcaatcttg aagatgcgat ggacgctgac gagacttttg aaatgctgat gggtgacaaa 1860

gtagaaccgc gcagaaactt catagaagca aacgccagat acgtgaaaaa ccttgatatt 1920

taa 1923

<210> 2

<211> 2460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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tacatgcttg ttgacggaca cggcaacttc ggttcggtag acggcgactc agcggctgcg 360

atgcgttata cagaagcgag aatgtcaaaa atcgcaatgg aaattctgcg tgacattacg 420

aaagacacga ttgactatca agacaactat gacggttcag aaagagaacc agccgtcatg 480

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atcatcatcg gaacgaagaa cggtttgctg atccgtttcc cggaagaaga tgtaagacaa 2040

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<210> 3

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tattataaaa gagatgaaga agcgataaag gcgatggccg attattttca gcgcgaaatg 300

tag 303

<210> 4

<211> 2112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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aaaatagaaa acggcgtaaa agccattgaa ggcatagacg gttgtgctgt caattttgcg 120

gcaagcacca tcacggtttc ggccgggggc aaagacgaac agtggatgaa agacgaagtt 180

gcgaaaaagg taaagtccat tgatcctcat gtgaacgtcc gttcaaagca tgaagacaaa 240

cccggcgggg atgaataccg caaaaagctg cagctgatgt tagtaaggct tgcggcgggc 300

gccgttttgg gcataatcgc ttatttcgcg cacgcgggga ccgtccttga gtttttgctc 360

ttttttgctt cgtatttgat catcggcggc gatatcgtag ccagagcggg aaaaaatatt 420

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ctgagcggtt catcaatggt tgatacatcc gctttaacgg gtgaatccgt gccgagaaaa 780

gcggagccgg ggcaagatgt aatggccgga tttatgaacc agaacggcgt gcttcatatt 840

gaaaccgcta aaggatatga agactcggcc gtatcaaaaa tattggatct ggtcgaaaat 900

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ccggccgttg tgattgttgc ggtgcttctc gcctttttgc cgccgcttct cgtaccgtca 1020

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gcactagtcg tctccattcc gcttggtttt ttcggcggta tcggtgccgc gtcaaaagcg 1140

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catccgattg ctgcatccat ccgtgaggct tacaataaac cgcttgcggc tcaggaaatt 1380

gaagaatatg aagaaatacc cggacacggt attcgggtga aaaccggcag atcaaccatt 1440

ttggccggaa atcaaaaact gatggaaaaa gaacaaatcg ctttcggcac agctgaaaac 1500

aagggaaccg tcgtctatgt tgccgtcgat gggcaatatg cgggggcaat cgtgatcgct 1560

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ggtattgatg acgtgtatac agagctattg ccgggtgaca aagtagaccg cgtcgaagaa 1740

ctcgaagcgg cgctttcacc gaatgaaaaa ttgatgtttg tcggtgacgg gataaatgat 1800

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<210> 5

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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gaagcaatca aacgtttctc tcatccgccc gaggtagcaa caacgggcat gcttatcatt 360

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ccattggcca gtgtcattgt ggctgttctt gtcctaagga gcggttataa cgtgacgaaa 600

gatgccattc acgtattaat ggaaggaact ccagaaaata ttgatgttac tgacatcatt 660

catacaattg aagagacaga gggcattcaa aacattcatg atttacacat atggtctatc 720

acaagcggat tgaatgctct ttcctgccac gctgttgttg atgatcagct gactatttca 780

gaaagtgaac gtattttacg caaaattgaa catgagcttg agcacaaagg cattacgcat 840

gtaacgattc aaatggaaac agccgcgcat aatcacgaca atgcgattct ttgtcaggcc 900

aaaagtgagc agacggacgg ccaccatcat cattaa 936

Claims (9)

1.一种高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1(Bacillus amyloliquefaciens Bam1)，其特征在于，所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1的保藏编号为CGMCC No.21633，且所述菌株包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的gryB基因、gryA基因、cadA基因、czrA基因和czcD基因。

2.一种如权利要求1所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备微生物农药中的应用。

3.一种如权利要求1所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在防治植物病原真菌和/或植物病原细菌中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物病原真菌包括香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、小麦枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苦瓜黑霉病菌、黄瓜黑霉病菌、烟草赤星病菌、番茄早疫病菌、黄萎病菌；所述植物病原细菌包括番茄青枯病菌和黄瓜细菌性角斑病菌。

5.一种如权利要求1所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备用于抑制植物病原真菌或植物病原细菌的活性的微生物抑菌剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌包括香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、小麦枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苦瓜黑霉病菌、黄瓜黑霉病菌、烟草赤星病菌、番茄早疫病菌、黄萎病菌；所述植物病原细菌包括番茄青枯病菌和黄瓜细菌性角斑病菌。

7.一种如权利要求1所述的高耐镉的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1在制备用于促进植物生长的微生物促进剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜、番茄、白菜。

9.一种微生物抑菌剂，以权利要求1所述的生防解淀粉芽孢杆菌Bam1的菌液或菌粉为活性成分。

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