CN113278540B - 一种蜡样芽孢杆菌菌株yn917及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株,命名YN917,于2020年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M2020655。该菌株可用于治疗和预防稻瘟病,对稻瘟病具有良好的防效,保护和治疗作用兼具,还可促进水稻生长,可作为潜在的生物防治剂和水稻栽培的生物接种剂加工开发,具有良好的应用前景。

Description

一种蜡样芽孢杆菌菌株YN917及其应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域,更具体地,涉及一种蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)菌株YN917及其在治疗和预防水稻稻瘟病菌上的应用和其对水稻促生上的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一。稻瘟病(病菌为Magnaportheoryzae,其无性世代为Pyicularia oryzae)是水稻最严重的真菌性病害之一,该病根据其发病部位和发病时期不同可以分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。该病已成为水稻持续高产稳产的严重障碍。目前,防治稻瘟病的主要措施是培育抗稻瘟病品种、生态调控和化学防治。抗病品种的选育已被证明是防治稻瘟病最有效、经济和环保的策略,但抗病品种选育周期长、稻瘟病菌的遗传背景复杂,生理小种的变异易导致抗病性丧失等限制。因此,在抗病品种不能满足生产需要的情况下,生产上主要通过使用化学杀菌剂的手段防止稻瘟病,如三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺、稻瘟酰胺、异稻瘟净、稻瘟净等;生物产品化学有效成分或活体微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。但由于用药不合理,给生态安全带来潜在的不利影响,潜在的病原菌抗药性风险及对生态环境和人类健康的危害不容忽视。
生物防治即利用有益微生物活体或代谢产物杀灭或者降低病原微生物的数量以控制植物病害发生和危害。从植物病害的可持续控制来考虑,生物防治是一类绿色安全有效的防治措施。
然而,生物防治领域中常会遇到拮抗微生物在田间自然条件下定殖力差、对病害防治效果不稳定等问题。大量的研究也表明,室内筛选出的拮抗微生物在温室中对病原菌有较强的抑制作用,而在大田防治中效果不理想,这可能是由于一方面菌株不适应大田生态环境而不能很好的定殖到植物的根围,另一方面与大田土壤中复杂的微生物种类与拮抗菌株之间出现相互作用,导致拮抗微生物防效降低,因此,选择筛选生物菌株的田间适应能力强或高效代谢产物应用于大田病害防治是解决上述问题的重要途径。
发明内容
基于此,针对现有技术中存在的上述技术问题,本发明的目的之一在于提供一种对生态环境和人体健康友好的对稻瘟病具有拮抗作用的防病促生菌。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株,命名为YN917,已于2020年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉,武汉大学,邮编430072,保藏编号:CCTCCNO:M2020655。
本发明的目的之二在于提供含有上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917和/或菌株YN917的代谢产物的菌剂。
本发明的目的之三在于提供上述菌剂的制备方法,该制备方法包括如下步骤:将所述菌株YN917在LB固体培养基平板上活化后,取菌饼接入LB液体培养基中,28℃、180r/min条件在摇床中震荡至少24h。
在一些实施方式中,所述LB固体培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,pH7.0,蒸馏水配制。
本发明的目的之四在于提供上述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在预防稻瘟病中的应用。
本发明的目的之五在于提供上述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在治疗稻瘟病中的应用。
本发明的目的之六在于提供上述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在促进水稻生长的应用。
本发明的目的之七在于提供上述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在制备生物防治剂和/或生物肥料接种剂上的应用。
本发明的目的之八在于提供上述的菌剂或由上述制备方法制成的菌剂在预防稻瘟病中的应用。
本发明的目的之九在于提供上述的菌剂或由上述制备方法制成的菌剂在治疗稻瘟病中的应用。
本发明的目的之十在于提供上述的菌剂或由上述制备方法制成的菌剂在促生水稻生长的应用。
本发明的目的之十一在于提供上述的菌剂或由上述制备方法制成的菌剂在制备生物防治剂和/或生物肥料接种剂上的应用。
相较于现有技术,本发明的有益效果如下:
本发明提供的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917,可用于预防和治疗稻瘟病,而且预防和治疗效果效果显著;对稻瘟病具有良好的防效,保护和治疗作用兼具;该菌株或该菌株的代谢产物制成的菌剂同时可预防和治疗稻瘟病。将该菌株或菌剂用于治疗和预防稻瘟病,可避免化学防治对环境和稻米安全存在潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险,而且对环境友好无污染。
另外,该菌株和包括该菌株或其代谢产物的菌剂还可促进水稻生长,经本发明提供的菌株或菌剂处理后的水稻或水稻种子,株高、茎基宽、鲜重、干重和根系活力均显著提高。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917及包含该菌株或菌株的代谢产物的菌剂,均可作为潜在的生物防治剂和水稻栽培的生物肥料接种剂加工开发,具有良好的应用前景。
附图说明
图1中的a和b均为本发明具体实施例的蜡样芽孢杆菌菌株YN917扫描电镜下菌体形态;
图2为本发明的蜡样芽孢杆菌菌株YN917在体外能产生防病促生长因子的能力鉴定;其中,A为菌株YN917具有产生吲哚-3-乙酸的能力,B为菌株YN917具有产生铁载体的能力,C为菌株YN917具有解有机磷能力,D为菌株YN917具有产淀粉酶能力,E为菌株YN917具有产蛋白酶能力,F为菌株YN917具有产纤维素酶能力,G为菌株YN917具有产β-1,3-葡聚糖酶的能力;
图3为本发明蜡样芽孢杆菌菌株YN917对稻瘟病菌分生孢子发芽率的影响;
图4为采用针刺离体接种法接种,在用蜡样芽孢杆菌菌株YN917预防和治疗液滴处理后的5天后,其对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的发病率及病变直径生长抑制效果;其中,A为CK,仅接种稻瘟病菌,B为接种稻瘟病菌前24h喷施三环唑;C为稻瘟病菌接种稻瘟病菌前24h喷施含菌株YN917的菌剂;D为接种稻瘟病菌后24h喷施三环唑;F为接种稻瘟病菌后24h喷施含菌株YN917的菌剂。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
实施例1蜡样芽孢杆菌菌株YN917的分离获得
从湖南省桃江县大栗港镇牌形上村(N28°31′49.02″,E111°54′24.86″)感染稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株,采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出1株拮抗菌菌株,该菌株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)抑制率达72.63%±1.30%。
在LB固体培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,pH7.0,蒸馏水配制)平板上培养该菌株,对其菌落形态进行观察,对其菌体的扫描电镜图观察,其菌体菌落形态如图1所示,菌落较大,质地较软,表面粗糙,形态不规则,稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色),长时间培养后,菌落表面呈毛玻璃状;菌体细胞呈杆状,末端略方,大小为(1.0~1.5)μm×(3.0~5.0)μm。该菌株的生理生化特性如下:能使淀粉水解、明胶液化,接触酶试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验反应为阳性,石蕊牛奶试验为胨化反应,能利用D-半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇、鼠李糖、果糖、蔗糖、山梨糖,但不能产生H2S,V.P试验、吲哚试验、苯丙氨酸脱氨酶试验反应为阴性,不能利用木糖。
通过菌株菌落形态并结合菌株的生理生化、微生物学检测结果,以及16S rRNA测序结果(该菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示),最终确定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),命名为YN917,并于2020年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M2020655。
通过纸片扩散法测定菌株YN917对各抗生素的敏感性,通过不同平板测定了菌株YN917产吲哚-3-乙酸、铁载体、淀粉酶、蛋白酶、维生素酶和β-1,3-葡聚糖酶等防病促生因子的能力,并检测了其溶磷、解钾以及固氮的能力,测定结果如图2所示。测定结果显示,该菌株YN917能在体外产生吲哚-3-乙酸(图2-A)和铁载体(图2-B)等促生长因子,具有解有机磷(图2-C)的能力,不具有解无机磷、解钾以及固氮能力,该菌株也能产生分解酶,如淀粉酶(图2-D)、蛋白酶(图2-E)、纤维素酶(图2-F)、β-1,3-葡聚糖酶(图2-G)。此外,该菌株表现出一定的抗药性和耐盐性(5%NaCl)。
此外,采用平板对峙培养法发现该菌株YN917对多种病原指示菌具有抑制效果,例如稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、德氏疫霉菌(Phytophthora drechsleri)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、香樟炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea Pers.)、柑橘拟茎点霉菌(Phomopsis citri)生长的抑菌率分别为72.63%、54.47%、52.38%、36.24%、34.39%、28.52%、24.65%、23.81%、22.74%、14.07%、13.97%、12.17%。
实施例2蜡样芽孢杆菌菌株YN917防病促生作用
菌株YN917在LB固体培养基平板上活化后,用打孔器获取直径5mm的菌饼2个接入装有150mLLB液体培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5g/L,pH 7.0,蒸馏水配制)的250mL三角瓶中,28℃、180r/min条件在摇床中振荡培养24h,获得蜡样芽孢杆菌菌株YN917代谢产物。
将1mL蜡样芽孢杆菌菌株YN917与1mL稻瘟病菌分生孢子液加入灭菌的离心管中混匀,以无菌水代替菌株YN917培养液为对照,28℃黑暗培养,每隔2h镜检观察孢子萌发情况,实验重复3次。结果表明,菌株YN917对稻瘟病菌孢子的萌发具有抑制作用。
以易感稻瘟病的丽江新团水稻叶片为试材,在水稻五叶一心期研究了菌株YN917对稻瘟病的离体防治能力,将稻瘟病菌在番茄燕麦琼脂(番茄汁150mL/L,燕麦片30g/L,CaCO3 0.6 g/L,,琼脂20g/L,蒸馏水配制,pH 6.5)平板上培养10天作用产生孢子,然后用无菌水冲洗平板,调整至2×105分生孢子/mL,从水稻植株上切下约7cm长的新鲜叶片。为了保持新鲜,水稻离体叶片保存在含有0.1%的6-苄基氨基嘌呤的无菌水中。采用针刺离体接种法进行实验,用消毒针尖轻刺水稻叶片,直到叶片出现凹痕,但没有刺穿。接种前(或接种后)24h,在伤口处加入5μL的孢子悬液,并在斑点处分别加入5μL菌株YN917悬浮液、LB培养液、无菌水(阴性对照)、20%三环唑可湿性粉剂(750倍稀释液,阳性对照)。在25℃下培养水稻离体叶片,在接种后5d测定病斑。菌株YN917对稻瘟病菌分生孢子发芽率的影响如图3所示。
以易感稻瘟病的湘早籼24和湘晚籼12号为试材,在水稻三叶期研究了菌株YN917对稻瘟病的盆栽防治能力。采用喷雾接种法进行实验。本研究涉及了3个处理:(1)对照组,仅稻瘟病菌孢子悬浮液;(2)预防组(-24h),将菌株YN917悬浮液10mL均匀地喷在植株叶片上,然后在叶片上保湿1d后再喷上稻瘟病菌孢子悬浮液;(3)治疗组(+24),先将稻瘟病菌孢子悬浮液喷洒在水稻叶片表面,保湿1d,再均匀喷洒10mL的菌株YN917悬浮液。用水或LB培养液处理的幼苗为阴性对照,用20%三环唑可湿性粉剂(WP)750倍稀释液或40%稻瘟灵可湿性粉剂500倍稀释液处理的幼苗为杀菌剂对照组。每处理重复3次,这些处理置于25-32℃温室条件下生长,光周期为12h,温相对湿度范围为85%~100%。
以水稻品种湘晚籼12号为试材,研究了菌株YN917对水稻种子萌发的促进作用。用75%酒精对50粒水稻种子进行表面灭菌,然后将种子浸泡在20mL无菌蒸馏水中2d。发芽后,在每个苗盆内(20cm×15cm×10cm)随机种的100颗水稻种子,置于栽培温室内。每10d用50mL蜡样芽孢杆菌菌株YN917发酵液浇灌一次,以LB培养液和水作为阴性对照。每组处理一式三份。盆栽在温室条件下生长,光周期12h,温度在25-32℃之间,幼苗每天浇水,整个试验期间不施肥。在水稻30天龄时,将水稻幼苗从土壤中连根拔起,除去附着的根系上的泥土,从每个处理中随机抽取50株幼苗,测量株高、根长、茎围、鲜重和根系活性。
蜡样芽孢杆菌菌株YN917防病促生效果如表1-4所示,其中,表1为蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻稻瘟病离体防治效果;表2-1和2-2分别为蜡样芽孢杆菌菌株YN917对湘早籼24号和湘晚籼12号水稻稻瘟病盆栽防治效果;表3为蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻种子的促生效果;表4为蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻植株的促生效果。
表1蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻稻瘟病的离体拮抗效果
Figure GDA0003598291170000081
表2-1蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻稻瘟病的盆栽防治效果(湘早籼24号)
Figure GDA0003598291170000082
表2-2蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻稻瘟病的盆栽防治效果(湘晚籼12号)
Figure GDA0003598291170000083
表3蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻种子的促生效果
Figure GDA0003598291170000091
表4蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻植株的促生效果
Figure GDA0003598291170000092
注:以上数据均为3次重复结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 一种蜡样芽孢杆菌菌株YN917及其应用
<130> 2021
<160> 1
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<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
aaaagaaagt ggcggcgtgc ctatacatgc agtcgagcga atggattaag agcttgctct 60
tatgaagtta gcggcggacc ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccata agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat aacattttga accgcatggt tcgaaattga 180
aaggcggctt cggctgtcac ttatggatgg acccgcgtcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
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aaccgtggag ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc 660
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agttaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa 900
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cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
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ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca aagagctgca agaccgcgag gtggagctaa 1260
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tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccgcgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt ggggtaacct tttggagcca 1440
gccgcctaag gtgacagagt atggcc 1466

Claims (8)

1.一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株,命名YN917,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M2020655,保藏日期:2020年10月29日。
2.一种含权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917的菌剂。
3.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在预防和/或治疗稻瘟病中的应用。
4.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在促进水稻生长的应用。
5.权利要求2所述的菌剂在预防和/或治疗稻瘟病中的应用。
6.权利要求2所述的菌剂在促生水稻生长的应用。
7.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株YN917在制备生物防治剂和/或生物肥料接种剂上的应用。
8.权利要求2所述的菌剂在制备生物防治剂和/或生物肥料接种剂上的应用。
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