CN103131655B - 解淀粉芽孢杆菌k-8及其菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）K-8及其菌剂。所述菌株的保藏编号为CGMCCNO.6486。所述菌剂是以上述菌株为活性成分。将菌株培养得到液态菌剂，在其中加入载体或载体与助剂的混合物后可得到固态菌剂。本发明菌株及其菌剂能有效防治青枯病、枯萎病、角斑病、纹枯病、稻曲病、软腐病、腐烂病、溃疡病、根腐病等病害。该菌剂制备方法简单、操作方便，适合工业化生产，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物农药领域，更具体地说是涉及到一株防治植物病害的解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8及其培养和菌剂制备。
背景技术
近年来，农业生产中，作物的青枯病、角斑病、溃疡病、软腐病、枯萎病、纹枯病和腐烂病等病害发病严重，针对这些病害，目前的农药在安全、有效、残留方面，都存在一定的问题。
随着人们对环境保护和食品安全要求的提高，微生物农药受到广泛重视。但是，现有技术中的微生物农药，抑菌谱范围较小，抑菌效果不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，能同时抑制多种作物病原菌，如番茄青枯病病原菌、黄瓜角斑病病原菌、猕猴桃溃疡病病原菌、大白菜软腐病病原菌等细菌性病害以及西瓜枯萎病病原菌、水稻纹枯病病原菌和苹果腐烂病病原菌等真菌性病害。
本发明的另一目的是提供一种以解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8为活性成分的菌剂，该菌剂能够抑制多种病原菌，对环境友好，高效安全。
本发明的再一目的是提供上述菌剂的制备方法，该方法简单易行，成本低。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，其保藏号为CGMCC NO. 6486。
以解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8为活性成分的菌剂。
所述菌剂为液态或固态。
所述液态菌剂中解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的含量为1×107 ~1×1011cfu/mL。
所述固态菌剂中解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的含量为1×106 ~1×1012cfu/g。
所述固态菌剂还含吸附基质，所述吸附基质为载体或载体和助剂的混合物；所述载体选自高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑中的一种或两种以上的混合物；所述助剂选自十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或两种以上的混合物。
一种制备所述液态菌剂的方法，将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种于培养基中，在28℃-32℃条件下培养24h-72h，得到液态菌剂。
所述培养基中含有20-200g/L碳源，10-150g/L氮源，0.1-10g/L无机盐；所述碳源为葡萄糖、淀粉、碎米粉和糖蜜中的一种或两种的混合物；所述氮源为花生饼粉、大豆粉、酵母粉、蛋白粉和蚕蛹粉中的一种或两种的混合物；所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙中的一种或两种的混合物。
一种所述固态菌剂的方法，将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种于培养基中，在28℃-32℃条件下培养24h-72h，得到液态菌剂；在液态菌剂中加入吸附基质，干燥后即得固态菌剂或者将液态菌剂过滤、干燥后，加入吸附基质，混匀后粉碎即得固态菌剂。
一种所述菌剂在防治青枯病、角斑病、溃疡病、软腐病、枯萎病、稻曲病、纹枯病和腐烂病方面的应用。
有益效果：
本发明解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，能够同时抑制多种作物病原菌：番茄青枯病病原菌、黄瓜角斑病病原菌、猕猴桃溃疡病病原菌、大白菜软腐病病原菌等细菌性病害以及西瓜枯萎病病原菌、水稻纹枯病病原菌和苹果腐烂病等真菌性病原菌。由于解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8是从江苏省盐城市滨海县八滩盐碱地发病植株及周围土壤中筛选，所以该菌株可以耐盐碱，可以用于防治盐碱地作物感染的病原菌。
本发明以解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8为活性成分的菌剂，能够抑制多种病原菌，对环境友好的，高效安全，尤其是可以用于盐碱地作物上病原菌的防治。其中固态菌剂还具有货架期长的特点。
本发明菌剂的制备方法简单易行，成本低，对环境友好。
具体实施方式
实施例1 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的筛选和鉴定
本实施例介绍了解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的分离、筛选和鉴定。
1. 分离、筛选病原菌的拮抗菌
在江苏省盐城市滨海县八滩盐碱地，取发病植株及周围土壤进行菌株分离和培养。用PDA培养基分离真菌，用LB培养基分离细菌。一共分离得到12株真菌和35株细菌。以番茄青枯病病原菌、西瓜枯萎病病原菌、水稻纹枯病病原菌作为指示菌株，采用平板对峙培养法和抑菌圈法筛选，结果如表1所示。从表1，可以看出菌株K-8对番茄青枯病病原菌、西瓜枯萎病病原菌、水稻纹枯病病原菌的拮抗作用强。
表1. 部分菌株对病原菌的抑制效果
| 菌株编号 | 番茄青枯病病原菌 | 西瓜枯萎病病原菌 | 水稻纹枯病病原菌 |
| K-2 | — | + | + |
| K-5 | + | ++ | — |
| K-8 | ++++ | +++ | ++ |
| K-12 | +++ | — | ++ |
| K-15 | ++ | — | + |
| K-18 | — | ++ | ++ |
| K-28 | ++ | ++ | — |
| K-35 | + | — | — |
| K-43 | — | — | + |
注：（1）对番茄青枯病病菌，抑菌圈直径≤10mm的标“—”；10mm＜抑菌圈直径≤12mm的标“+”； 12mm＜抑菌圈直径≤15mm的标“++”；15mm＜抑菌圈直径≤20mm的标“+++”；抑菌圈直径＞20mm的标“++++”。
（2）对西瓜枯萎病和水稻纹枯病病原菌：抑菌带宽度≤1mm的标“—”；1mm＜抑菌带宽度≤2mm的标“+”； 2mm＜抑菌带宽度≤5mm的标“++”； 5mm＜抑菌带宽度≤10mm的标“+++”； 抑菌带宽度＞10mm的标“++++”。
2. 菌株K-8的鉴定
染色：按本领域常规方法进行革兰氏染色，发现该菌株为革兰氏阳性。
形态特征：于LB培养基上30℃培养2天，观察菌落形成及颜色；取菌体涂片，染色后用光学显微镜观察菌体形态。结果为：菌落白色或灰白色，不透明，有皱褶。菌体为直或近直的杆状，只含有一个芽孢，具运动性。
生理生化特征：参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》进行，结果见表2。
表2. 菌株K-8的生理生化特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 利用葡萄糖 | + |
| 细胞形状 | 杆状 | 利用木糖 | + |
| 形成芽孢 | + | 利用L-阿拉伯糖 | + |
| 芽孢膨大 | - | 利用甘露醇 | + |
| 芽孢圆形 | - | 利用乳糖 | + |
| 伴孢晶体 | - | 利用柠檬酸盐 | + |
| 接触酶 | + | 50℃生长 | - |
| 氧化酶 | + | pH5.7生长 | + |
| 水解明胶 | + | 7%NaCl生长 | + |
| 淀粉水解 | + | 厌氧生长 | - |
| 分解酪素 | + | VP试验 | + |
注：表中的“+”表示实验结果为阳性；“-” 表示实验结果为阴性。
根据上述生理生化特征，将其与细菌鉴定手册相比较，初步将菌株K-8鉴定为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）。
申请人委托中国科学院微生物研究所对该菌株进行了进一步的鉴定，分析了16S rRNA基因（SEQ ID NO:1）和gyrB基因（SEQ ID NO:2）。通过基因比对，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8。
该菌株已于2012年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏号为CGMCC No.6486，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens），菌株名称是K-8。
实施例2 制备含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的液态菌剂
1. 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的活化及种子液的制备
解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的活化：从解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的冷冻干燥管中，用无菌接种针挑取部分菌粉至LB摇瓶中（250mL摇瓶，LB液体培养基装液量50ml），在30℃、150r/min下培养24h后，LB培养基变浑浊。取菌液至LB固体培养基中划线培养24h-36h，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8在LB固体培养基上生长良好，菌落白色或灰白色，表面不规则，不透明。
一级种子液的制备：挑取LB固体培养基上的单菌落接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL，LB液态培养基的装液量50ml。将一级种子摇瓶在30℃、150r/min下培养24h，得到一级种子液。
二级种子液的制备：种子罐中的培养基配方（g/L）为：葡萄糖25、蔗糖25、蛋白粉10、酵母粉15、磷酸二氢钾0.5、硫酸锰0.05，溶剂为水。将一级种子液接入种子罐中，接种量为1%-5%（V/V），培养条件为：通气比1：1，搅拌转速为200r/min，培养温度30℃，罐压0.01MPa，培养时间为20h。培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1-3×108cfu/mL，此时菌体活力强。
2. 发酵制备含有解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的液态菌剂
发酵培养基配方（g/L）为：葡萄糖50、淀粉50、蛋白粉10、酵母粉20、磷酸二氢钾0.5、硫酸锰0.05，溶剂为水。
将发酵培养基置于发酵罐中，灭菌。
将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的二级种子液，按照接种量为1%-5%（V/V）接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1：1、搅拌转速为150r/min、罐压0.01MPa、培养温度30℃、培养时间为48h，得到液态菌剂1。液态菌剂1中的活菌含量为30×108cfu/mL。
在发酵罐培养结束时，保证液态菌剂中的活菌含量为5-100×108cfu/mL的前提下，可以对发酵培养基和发酵培养条件进行调整。
发酵培养基中，碳源含量为20-200g/L，可以是葡萄糖、蔗糖、大米粉、糖蜜、淀粉、糊精、甘油、高粱中的一种或两种的混合物；氮源含量为10-150g/L，可以是蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、酵母粉、玉米浆中的一种或两种的混合物；无机盐含量为0.1-10g/L,可以是氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。发酵培养基也可以选用LB培养基或牛肉浸汁培养基。
LB培养基配方（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，溶剂为水。
牛肉浸汁培养基配方（g/L）：蛋白胨5，牛肉膏30，NaCl 5，溶剂为水，pH7.0-7.2。
在发酵罐培养过程中，发酵培养条件可以灵活调节，例如通气比为1：0.5～2、搅拌转速为50～300r/min、培养温度为28℃-32℃、培养时间为24h～72h、罐压0.01～0.1MPa。
实施例3 制备含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的固态菌剂
向实施例1制得的液态菌剂1（活菌含量为30×108cfu/mL）中加入高岭土，液态菌剂与高岭土的重量比为100:25。将该液固混合物搅拌30 分钟后静置60 分钟，利用输料泵将料液输入离心式喷雾塔中干燥后，得到的固态菌剂1。离心式喷雾塔中的干燥条件为：进风口温度为200℃，出风口温度为85℃。固态菌剂1中水含量为4%（W/W），活菌含量为60×108cfu/g。
干燥条件要满足：进风温度不高于250℃，出风口温度不高于100℃。
固态菌剂要满足：水含量不高于5%（W/W），活菌含量为1×106～1×1012cfu/g。
液态菌剂也可以用板框浓缩过滤、再真空干燥后制备固态菌剂。
取液态菌剂1，加入其重量5%的硫酸铵水溶液，再加入液态菌剂重量3％的碳酸钙、1％的珍珠岩助滤，搅拌30 分钟后静置60 分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。其中，硫酸铵、碳酸钙和珍珠岩都是助滤剂。
过滤条件为：过滤温度为40℃，过滤压力4kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在30％（W/W）。
将板框过滤后得到的滤饼在80℃条件下进行真空干燥，得到水含量为4％（W/W），活菌含量为120×108cfu/g的固形物。
在所述固形物中，加入固形物重量4倍的高岭土，再加入固形物重量25%的十二烷基苯磺酸钠，混合均匀后粉碎即可得固态菌剂2。固态菌剂2中，活菌含量为22×108cfu/g。
实施例4 含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的液态菌剂对植物病原菌的抑制作用
利用打孔法测定解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8对细菌性病原菌的抑制作用：
（1） 将细菌性病原菌在LB固体平板上活化后，收集菌体配成1×108cfu/mL—1×109cfu/mL的菌悬液，然后吸取0.1mL的病原菌菌悬液均匀涂布在LB固体平板上。待用。
（2） 在涂布了病原菌菌悬液的平板上用直径为10mm打孔器均匀的打三个孔，每个孔里加入0.2mL实施例1制备的液态菌剂1。30℃恒温培养48h后测量抑菌圈的直径。
利用平板对峙培养测定法测定解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8对真菌性病原菌的抑制作用：
（1） 制备若干个PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）平板，待用。
（2） 真菌性病原菌在PDA平板上接种后，（28±1）℃培养至菌丝覆盖整个平板，待用。
（3） 将无菌滤纸片（d=5mm）放入液态菌剂1中充分吸附后，取出置于无菌PDA平板中晾干，待用。
（4） 用打孔器将在PDA平板上培养好的真菌菌落打成d=5mm的菌块，放置于空白PDA平板的一边，在相对应的另一边放入吸附了液态菌剂1的滤纸片，对照只接种病原菌不接种K-8，置于恒温箱中（28±1）℃下培养4天，测定抑菌带宽度（病原菌生长边缘至K-8菌落边缘之间的最短距离）。结果如下表3。
表3 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8对病原菌的抑制作用
由该表数据可知，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8对番茄青枯病病原菌、黄瓜角斑病病原菌、猕猴桃溃疡病病原菌、大白菜软腐病病原菌等细菌性病害以及西瓜枯萎病病原菌、水稻纹枯病病原菌、苹果腐烂病病原菌等真菌性病害具有良好的抑制作用，具有开发成防治植物病害的菌剂的潜力。
实施例5 含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的固态菌剂在田间对植物病害的防治作用
利用实施例3中制备的含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的固态菌剂1和2，在江苏、安徽、江西、山东、陕西等地，分别对烟草青枯病、番茄青枯病、白菜软腐病、西瓜枯萎病、黄瓜角斑病、水稻稻曲病、水稻纹枯病、猕猴桃溃疡病、苹果腐烂病等病害的作物，进行了初步的田间药效实验。
对于根部病害（如烟草青枯病、番茄青枯病、白菜软腐病、西瓜枯萎病等），将固态菌剂1稀释500-1000倍后采用灌根的方法进行防治（在移栽时和发病初期用药），总用药量600克/亩。观察并统计作物的发病率或病指。灌根产生的具体效果见表4。其中空白是指作物不采取任何防治措施。
对于叶部病害（如黄瓜角斑病、水稻稻曲病、水稻纹枯病等），将固态菌剂2稀释500倍-800倍，采用喷雾的方法进行防治。在发病初期开始用药，每隔7天使用一次，共3-5次。观察并统计作物的发病率或病指。喷雾达到的效果见表4。其中空白是指作物不采取任何防治措施。
表4 固态菌剂在田间对植物病害的防治效果
由表4可知：含解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的固态菌剂对青枯病、软腐病、枯萎病、角斑病、稻曲病、纹枯病、溃疡病、腐烂病等具有较好的防治效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏苏滨生物农化有限公司
<120> 解淀粉芽孢杆菌K-8及其菌剂
<130> 20130306
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8
<400> 1
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gactgg 1206
Claims (10)
1.解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8，其保藏号为CGMCC NO. 6486。
2.以解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8为活性成分的菌剂，所述解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的保藏号为CGMCC NO. 6486。
3.根据权利要求2所述菌剂，其特征在于：所述菌剂为液态或固态。
4.根据权利要求3所述菌剂，其特征在于：所述液态菌剂中解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的含量为1×107 ~1×1011cfu/mL。
5.根据权利要求3所述菌剂，其特征在于：所述固态菌剂中解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8的含量为1×106 ~1×1012cfu/g。
6.根据权利要求5所述菌剂，其特征在于：所述固态菌剂还含吸附基质，所述吸附基质为载体或载体和助剂的混合物；所述载体选自高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑中的一种或两种以上的混合物；所述助剂选自十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或两种以上的混合物。
7.一种制备权利要求4所述菌剂的方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种于培养基中，在28℃-32℃条件下培养24h-72h，得到液态菌剂。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于所述培养基中含有20-200g/L碳源，10-150g/L氮源，0.1-10g/L无机盐；所述碳源为葡萄糖、淀粉、碎米粉和糖蜜中的一种或两种的混合物；所述氮源为花生饼粉、大豆粉、酵母粉、蛋白粉和蚕蛹粉中的一种或两种的混合物；所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙中的一种或两种的混合物。
9.一种制备权利要求5或6所述菌剂的方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）K-8接种于培养基中，在28℃-32℃条件下培养24h-72h，得到液态菌剂；在液态菌剂中加入吸附基质，干燥后即得固态菌剂或者将液态菌剂过滤、干燥后，加入吸附基质，混匀后粉碎即得固态菌剂。
10.一种权利要求2-6之一所述菌剂在防治烟草青枯病、番茄青枯病、黄瓜角斑病、猕猴桃溃疡病、白菜软腐病、西瓜枯萎病、水稻稻曲病、水稻纹枯病和苹果腐烂病方面的应用。
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