CN105815338B - 一种用于人参种子及土壤处理的生物农药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于人参种子及土壤处理的生物农药及其制备方法，属于植物病害生物防治领域。由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉65‑75份，助剂8‑12份，稳定剂1.5‑2.5份，紫外保护剂0.05‑0.15份，载体10‑25份。本发明对于多种人参苗期病害和根部病害的病原菌具有强烈的抗生作用，不仅有助于提高人参种苗的抗性，而且有效降低化学农药施用量，降低人参中化学农药残留。本发明在生产中未用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，不产生溶剂中毒，不造成对人类健康的危害，对环境无污染，绿色环保。

Description

一种用于人参种子及土壤处理的生物农药及其制备方法

技术领域

本发明属于植物病害生物防治领域，具体涉及一种人参种子、种栽及土壤处理的生物农药及其制备方法。

背景技术

人参(Panax ginseng)自2012年被卫生部批准为新资源食品，消费量和市场需求量急剧增加。人参种植对土壤和环境条件要求高，极易受到各种病原菌侵染。面临的主要问题是：在人参种植过程中，其苗期和根部极易发生病害，例如人参猝倒病、人参立枯病和人参锈腐病等，长期大量使用化学农药已导致病原菌产生抗药性、人参中化学农药残留超标、生产优质人参困难。因此，研究和制备生物农药以减少化学农药的施用，增加优质参的产出比，对促进人参产业的可持续发展具有重要意义。微生物产品极其适用于种子、种栽处理和土壤处理。这些微生物产品能通过接触起效，控制种传病害和土传病害，可在植物根系及根围部位定殖，产生各类抗生物质，提高作物的抗逆性，促进植物生长。

发明内容

本发明提供一种用于人参种子种栽及土壤处理的生物农药及其制备方法，目的是有效地防治人参苗期病害和根部土传病害。利用人参植株土壤中的有益微生物，解淀粉芽孢杆菌制成生物农药具有多种生物学功能，如对人参的促生作用、诱导植物抗病性和对病原菌的抗生作用。利用这些机制，以菌治菌，从而达到防治病害并促进植物生长的作用，不仅对人参苗期病害和根部病害起到预防作用，利于提高优质人参产出比，而且能够减少对环境污染，具备极佳的生态效益。

本发明采取的技术方案是：是由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉65-75份，助剂8-12份，稳定剂1.5-2.5份，紫外保护剂0.05-0.15份，载体10-25份。

本发明所述解淀粉芽孢杆菌冻干粉是通过以下方法制备的：

(1)、将保藏编号为CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；

(2)、将所述种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，所述种子罐的培养条件为：通气比1:0.9～1.1，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.015～0.020MPa， 培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液；

(3)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-75～-85℃超低温冰箱预冻2.5～3.5h，然后在-55～-65℃，真空度为95～105Pa，冻干20～30h后在0～45℃进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉。

本发明所述载体为高岭土6000目。

本发明所述助剂包括分散剂和润湿剂。

本发明所述分散剂为木质素磺酸钙，所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，且所述木质素磺酸钙与所述十二烷基苯磺酸钠的重量比为9:1～9.5:0.5。

本发明所述稳定剂为碳酸钙。

本发明人参种子种栽及土壤处理的生物农药的制备方法，包括将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于200目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0～45℃。

一种人参种子种栽及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用。

本发明应用的解淀粉芽孢杆菌是来源于人参主产区人参根围土壤，属于有益微生物。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂，用于人参种子、种栽及土壤处理，对于多种人参苗期病害和根部病害的病原菌具有强烈的抗生作用，例如造成病原菌细胞畸形，产生大量泡状物，破坏细胞壁，引起细胞内含物外溢；或造成菌丝体扭曲，原生质凝集，生长点膨大，细胞壁断裂，菌丝体崩溃等效果。并且，解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂对人参生长具有明显促生作用，例如施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤，小区产量比对照增产42.35％；人参平均全株重比对照增产74.38％。该生物农药的应用还可增强人参苗期对病害的抗性，不仅有助于提高人参种苗的抗性，而且有效降低化学农药施用量，降低人参中化学农药残留。本发明在生产中未用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，不产生溶剂中毒，不造成对人类健康的危害，对环境无污染，绿色环保。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌FS6对人参苗期病害和根部病害病原菌的抗生作用，第1纵列图表示不同的人参苗期病害和根部病害病原菌与解淀粉芽孢杆菌FS6对峙培养，培养皿中部接种病原菌菌饼，其左边的滤纸片上滴加的是无菌水作为对照，其右边的滤纸片上滴加的是FS6菌悬液；第2纵列图表示挑取与解淀粉芽孢杆菌FS6菌悬液接触的病原菌生长菌丝前端的显微照片；第3纵列图表示挑取与无菌水接触的对照病原菌生长菌 丝前端的显微照片；

图2为解淀粉芽孢杆菌FS6冻干粉母粉加入载体高岭土后对人参根部病害病原菌的抑制作用；A：人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)与加入高岭土后的解淀粉芽孢杆菌FS6配成制剂的对峙培养结果；B：人参锈腐病菌培养菌落；C：人参疫霉菌(Phytophthora cactorum)与加入高岭土后的解淀粉芽孢杆菌FS6配成制剂的对峙培养结果；D：人参疫霉菌培养菌落；备注：图A和B中滤纸片a：FS6冻干粉母粉+高岭土4000目；滤纸片b：FS6冻干粉母粉+高岭土6000目；滤纸片CK1：解淀粉芽孢杆菌FS6冻干粉母粉；滤纸片CK2：高岭土4000目；

图3为解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参的促生作用。A：2015年年初施用1次解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂后的新出土3年人参；B：当年未施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的新出土3年人参作为对照。

具体实施方式

本发明使用的解淀粉芽孢杆菌FS6，保藏号为CGMCC No.9538，于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编：100101；分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

实施例1

是由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉65份，助剂8份，稳定剂1.5份，紫外保护剂0.05份，载体10份；

所述解淀粉芽孢杆菌冻干粉是通过以下方法制备的：

(1)、将保藏编号为CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；

(2)、将所述种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，所述种子罐的培养条件为：通气比1:0.9，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.015MPa，培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液；

(3)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-75℃超低温冰箱预冻2.5h，然后在-55℃，真空度为95Pa，冻干20h后在0℃进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉。

所述载体为高岭土6000目；

所述助剂包括分散剂和润湿剂；

所述分散剂为木质素磺酸钙，所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，且所述木质素磺酸钙与所述十二烷基苯磺酸钠的重量比为9:1；

所述稳定剂为碳酸钙；

用于人参种子及土壤处理的生物农药的制备方法，包括将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于200目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0℃。

一种用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用。

实施例2

是由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉70份，助剂10份，稳定剂2.0份，紫外保护剂0.10份，载体17.5份；

所述解淀粉芽孢杆菌冻干粉是通过以下方法制备的：

(1)、将保藏编号为CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；

(2)、将所述种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，所述种子罐的培养条件为：通气比1:1.0，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.018MPa，培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液；

(3)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-80℃超低温冰箱预冻3.0h，然后在-60℃，真空度为100Pa，冻干25h后在22.5℃进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉；

所述载体为高岭土6000目；

所述助剂包括分散剂和润湿剂；

所述分散剂为木质素磺酸钙，所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，且所述木质素磺酸钙与所述十二烷基苯磺酸钠的重量比为9.2:0.8；

所述稳定剂为碳酸钙；

用于人参种子及土壤处理的生物农药的制备方法，包括将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于200目的粉剂，整个制备过程中温度保持在22.5℃；

一种用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用。

实施例3

是由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉75份，助剂12份，稳定剂2.5份，紫外保护剂0.15份，载体25份；

所述解淀粉芽孢杆菌冻干粉是通过以下方法制备的：

(1)、将保藏编号为CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；

(2)、将所述种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，所述种子罐的培养条件为：通气比1:1.1，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.020MPa，培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液；

(3)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-85℃超低温冰箱预冻3.5h，然后在-65℃，真空度为105Pa，冻干30h后在45℃进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉；

所述载体为高岭土6000目；

所述助剂包括分散剂和润湿剂；

所述分散剂为木质素磺酸钙，所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，且所述木质素磺酸钙与所述十二烷基苯磺酸钠的重量比为9.5:0.5；

所述稳定剂为碳酸钙；

用于人参种子及土壤处理的生物农药的制备方法，其特征在于，将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于200目的粉剂，整个制备过程中温度保持在45℃。

一种用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用。

下边通过具体实验例来对本发明作进一步说明。

实验例1解淀粉芽孢杆菌FS6对人参根部病害及苗期病害病原菌的抗生作用

采用平板对峙法对解淀粉芽孢杆菌FS6进行室内抑菌活性测定实验。用打孔器打取人参主要苗期病害及根部病害靶标菌(人参立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人参疫霉菌(Phytophthora cactorum)、人参灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人参根腐病菌(Fusarium solani)、人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans))直径为8mm的菌饼接入PDA培养皿中央，每皿一片，在距平板中心2.4cm处在靶标菌两侧或四周放置直径为8mm的无菌滤纸片。用移液枪吸取10μl解淀粉芽孢杆菌FS6菌悬液(4.5×10¹⁰CFU/ml)于滤纸片上，与病原菌进行对峙培养，以吸取10μl无菌水于滤纸片上作为空白对照，或以单独培养靶标菌为对照，每个处理设3个重复，25℃培养4d后，挑取与解淀粉芽孢杆菌FS6菌悬液接触的生长菌丝前端置于光学显微镜下拍照，并观察其抗生作用，测量对不同病原菌的抑菌带宽度，并计算抑菌率。

结果显示解淀粉芽孢杆菌FS6对上述病害的病原菌均具有不同程度的抑制作用(表1)，且如表1所示，抑菌率均达50％以上。解淀粉芽孢杆菌FS6对于多种人参苗期病害(人参立枯病、人参疫病、人参灰霉病)和根部病害(人参根腐病和人参锈腐病)的病原菌具有强烈的抗生作用，造成病原菌细胞畸形，产生大量泡状物，破坏细胞壁，引起细胞内含物外溢；或造成菌丝体扭曲，原生质凝集，生长点膨大，细胞壁断裂，菌丝体崩溃(图1)。

表1解淀粉芽孢杆菌FS6对人参根部病菌及苗期病害病菌的室内抑制作用

实验例2解淀粉芽孢杆菌冻干粉的制备

(1)、将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于灭菌的液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液。种子液培养用液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

(2)、将种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，种子罐的培养条件为：通气比1:0.9～1.1，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.015～0.020MPa，培养时间36～48h，培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液。种子罐培养液配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.0～7.0。

(3)、菌悬液中加入5％的甘油冷冻保护剂后，放置于-75～-85℃超低温冰箱预冻2.5～3.5h；然后在-55～-65℃，真空度为95～105Pa，冻干20～30h，然后控制温度于0～45℃，在气流粉碎机中进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉，冻干粉中含菌量≥10¹⁰CFU/g(100亿CFU/g)。

实验例3解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的制备及优化

3.1载体的筛选

选择膨润土(400目)、滑石粉(1250目)、高岭土(2000目)、高岭土(4000目)、高岭土(6000目)、硅藻土(400目)、白炭黑、凹凸棒粉(200目)、沸石粉(200目)、海泡石粉(100目)、轻质碳酸钙(1250目)、轻质碳酸钙(2500目)不同材料做载体，与解淀粉芽孢杆菌冻干粉混合，检测其湿润性、重量悬浮率和pH值。将载体按照5％的比例分别加入100mL的LB液体培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7)混匀，灭菌后接入1mL解淀粉芽孢杆菌FS6种子液，28℃，180r/min条件下振荡培养24h。以不加载体作为对照，每处理重复3次，采用平板菌落计数法测定含不同载体的培养液的芽孢含量，鉴定载体与解淀粉芽孢杆菌FS6的生物相容性。并结合平板对峙法(如实验例1所述方法)检测对人参根部病菌和苗期病菌的抑菌效果，且比较各载体制剂的悬浮率、润湿时间和成本等方面因素，选择最优载体。

解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液的最适初始pH值是6～7，因此，在选择载体时应首选pH在此范围的载体。如表2所示高岭土4000目及6000目的pH分别为6.67和6.65，于是首先测定含高岭土4000目及6000目的FS6培养液芽孢含量，结果显示活芽孢含量均达1.0×10¹⁰CFU/ml以上，表明高岭土与FS6具备较高的生物相容性(表3)。通过采用平板对峙法，如图2所示混有高岭土4000目及6000目的FS6分别与人参锈腐病菌及人参疫霉病菌对峙培养，滴加混有高岭土的解淀粉芽孢杆菌FS6冻干粉母粉悬液的滤纸片(图2滤纸片a和b)与只加入FS6冻干粉母粉悬液的滤纸片(图2滤纸片CK1)均对病原菌具有抗生作用，且对人参锈腐病菌抑菌宽度均达7mm以上(表3)，表明高岭土4000目及6000目的加入不影响解淀粉芽孢杆菌FS6的抑菌效果。由于高岭土6000目的悬浮率66.5％大于悬浮率为64.74％的高岭土4000目，并且高岭土6000目的润湿时间29s比高岭土4000目44s短(表2)，因此选择高岭土6000目为解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的载体。

表2解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂载体润湿时间、悬浮率及pH值的测定

表3高岭土与解淀粉芽孢杆菌FS6生物相容性检测及其对人参锈腐菌抑菌效果

3.2助剂筛选及复配助剂配比确定

首先测定助剂与解淀粉芽孢杆菌FS6的生物相容性(参考实施例3.1所述方法)，将供试的助剂用蒸馏水配置成10.00g/L、1.00g/L的母液，取1mL、2.5mL和5mL母液分别加入到49mL、47.5mL和45mL的50℃左右的含有相同浓度的FS6的LB液体培养基中，采用平板菌落计数法，涂板36h后测定含不同助剂的培养液的芽孢含量，每处理重复3次，选取与FS6菌株有较高生物相容性的助剂，并确定其最佳浓度。将助剂与解淀粉芽孢杆菌冻干粉混合，测定制剂的润湿时间，比较各制剂悬浮率的差异，采用平板对峙法检测对人参常见根部和苗期病害病原菌的抑制效果。

通过生物相容性试验结果表明，如表4、表5所示：待测的助剂、稳定剂、保护剂最佳使用浓度是木质素磺酸钠为0.05g/L、木质素磺酸钙为0.1g/L、聚乙二醇8000PEG为0.05g/L、羧甲基纤维素钠CMC-Na为0.1g/L、吐温80为0.1g/L、十二烷基苯磺酸钠DBS为0.02g/L、碳酸钙为0.05g/L、K₂HPO₄为0.1g/L、糊精为0.1g/L。十二烷基硫酸钠SDS与解淀粉芽孢杆菌FS6的生物相容性低，因此排除在外。

表4解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂助剂与FS6菌株的生物相容性检测

表5解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂助剂使用的最佳浓度

检测不同助剂对制剂pH、润湿时间、悬浮率的影响。结果如表6所示：木质素磺酸钙作为分散剂，润湿时间最短仅为19秒，悬浮率最高，达到76.72％，但是pH值偏酸，为了保证制剂的pH值偏中性，选择悬浮率达到70％以上的十二烷基苯磺酸钠作为润湿剂。

表6解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂助剂的润湿时间、pH值及悬浮率的测定

从助剂中筛选出悬浮率较高，润湿性较好的十二烷基苯磺酸钠作为润湿剂。润湿剂十二烷基苯磺酸钠与分散剂木质素磺酸钙按0.1:9.9、0.5:9.5、0.8:9.2、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的质量比经粉碎，混合均匀，制成可湿性粉剂，测定其悬浮率、润湿时间，选出复配助剂的最佳质量配比。

结果如表7所示：当木质素磺酸钙与十二烷基苯磺酸钠的比值为9:1～9.5:0.5时，pH值约为7，悬浮率最低达到70.11％，润湿时间最长为56秒，符合可湿性粉剂悬浮率70％以上，润湿时间<90秒的国家标准。因此，选择木质素磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠为解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的分散剂和润湿剂，比值为9:1～9.5:0.5。

表7解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的助剂筛选及助剂配比确定

备注：助剂配比即十二烷基苯磺酸钠与木质素磺酸钙的比值。

3.3稳定剂的筛选

将解淀粉芽孢杆菌冻干粉母粉与筛选出的载体、湿润剂及分散剂分别与待选稳定剂(2％)混合均匀加工成可湿性粉剂，以不加稳定剂的制剂为对照。进行热贮(54±2)℃，14d后测定活芽孢含量。每处理重复3次，采用平板对峙法检测对人参常见根部和苗期病害病原菌的抑制效果。

稳定剂在制剂中的作用是能在较长的时间稳定制剂的理化性质，在室温下放置长时间，仍能保持制剂对病原菌具有稳定的抑制效果。结果如表8所示，添加碳酸钙和羧甲基纤维素钠作为稳定剂，在54℃的环境下放置15d后，对人参病原菌的抑制效果最佳。并且它与解淀粉芽孢杆菌FS6生物相容性测定结果，如表4所示：碳酸钙与FS6的生物相容性高于羧甲基纤维素钠。因此，选择碳酸钙作为解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的稳定剂。

表8解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂稳定剂的筛选

3.4保护剂的筛选

当将未加保护剂的生防制剂直接用到大田中，受紫外线的影响，微生物制剂的防治效果会大大降低。紫外保护剂可将阳光中大部分紫外辐射吸收，达到保护制剂的效果。将筛选出的载体、解淀粉芽孢杆菌冻干粉母粉、润湿剂及分散剂分别与待选保护 剂(0.1％)加工成可湿性粉剂，以不加保护剂为对照，稀释后涂布在平板上，每个处理重复3次，在距离紫外灯(20W)40cm处照射12、24h后，采用平板对峙法检测对人参常见病菌的抑菌效果。

选择糊精与抗坏血酸VC两种紫外保护剂进行检测，结果如表9与表10所示以抗坏血酸VC作为保护剂，紫外线照射12小时和24小时之后，对人参立枯病菌、人参菌核病菌、人参疫霉病菌、人参锈腐病菌、人参灰霉病菌及人参根腐病菌六种病原菌的抑制效果好，因此选择抗坏血酸VC为解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的保护剂。

表9解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂保护剂的筛选(12小时)

表10解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂保护剂的筛选(24小时)

实验例4解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂质量测定

将制备的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂溶解于无菌水中，进行梯度稀释，利用滴液法检测可湿性粉剂中有效成分含量。对成品的各指标进行测定，悬浮率测定参考GB/T14825-2006，润湿时间测定参考GB/T5451-2001，细度测定参考GB/T16150-1995， pH值测定参考GB/T1601-1993，水分测定参考GB/T1600-2001。根据中华人民共和国可湿性粉剂各项指标国家标准测定，所制备的解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的各项指标均符合农药可湿性粉剂的质量要求。以下仅以第2种配方制备的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂为例进行说明。其中，实施例2中配方制备的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂结果显示解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂菌体在25℃的条件下，芽孢含量≥1×10¹⁰CFU/ml，pH值7.01，水分含量2％，润湿时间40.6s，悬浮率74.94％，99％通过325目筛，各指标均符合农药可湿性粉剂的质量要求。

实验例5解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂在人参种子及土壤处理中的应用及合理施用

以实施例2中配方制备的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(解淀粉芽孢杆菌冻干粉70份，木质素磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠10份、碳酸钙2份、抗坏血酸VC 0.1份，6000目的高岭土17.5份，其中木质素磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠的质量比为9.2：0.8)为例进行解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂在人参种子及土壤处理中的应用。

(一)、解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂对人参的促生作用

根据自然发病区域，选择地势平坦的地块，进行田间试验。若为种子处理，每个小区种植人参种子重量一致，为200g；若为种栽处理，每个小区种植人参种栽数量一致，重量为270g，田间试验每个小区面积为1m²，小区排列为随机区组排列，每个试验设3次重复。供试药剂：解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂、咯菌腈(瑞士先正达有限公司)、枯草芽孢杆菌(河北省保定市科绿丰生化科技有限公司)、噻·咯·精霜灵(瑞士先正达有限公司)。将解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂稀释不同倍数设置不同处理(具体见附表11～17备注说明)，每组处理的对照均使用等量清水。试验地点：吉林省白山市抚松县松江河镇人参种植基地。试验品种：2年生大马牙。施药时间：2015年4月28日，种子、种栽和土壤处理，施药1次。出苗率调查时间：2015年6月12日；秧苗素质调查时间：2015年7月2日；苗期病害和根部病害调查时间：2015年7月2日；测产时间：2015年9月28日。调查种子出苗率、保苗率、发病率及防效的计算公式如下：

解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽出苗率及保苗率的影响见表11，处理2-④、3-①、3-②、3-⑤、4-④的平均出苗率在5％水平差异不显著，均达到80％以上；其中处理3-①和3-②即施用2g/m²和3g/m²处理种栽与处理4-④施用噻·咯·精霜灵处理土壤的人参种栽保苗率均达到100％。因此，使用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂与使用化学农药的保苗效果达到一致，而施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂3g/m²时的出苗率比使用化学农药略高，并且在人参中无农药残留。

表11解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽出苗率及保苗率的影响

备注：P值<0.01,为5％显著水平

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤：2-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤。2-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理土壤。

(2)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽：3-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-④：用160μL/m²咯菌腈处理种栽。3-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种栽。

(3)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种栽：4-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用320μL/m²咯菌腈处理种栽。4-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种栽。

(4)、CK：施用等量清水对照。

解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽产量的影响见表12，结果显示：以10颗人参的平均产量，可见处理2-③、3-①、3-②、3-③、3-④、3-⑤、4-①、4-②、4-③、4-④、4-⑤在5％水平差异不显著。从小区总产量，可知处理3-①施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽、3-②施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽、3-⑤施用2g/m²枯草芽孢杆菌处理种栽、4-①施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽、4-②施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽、4-③施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽、4-④用噻·咯·精霜灵处理土壤，用咯菌腈处理种栽、4-⑤施用2g/m²枯草芽孢杆菌分别处理土壤和种栽的产量均在500g以上，其中4-①处理施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽，小区产量最高，达到551.51克，比对照增产42.35％。

表12解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽产量的影响

备注：P值<0.01,为5％显著水平

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤：2-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤。2-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理土壤。

(2)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽：3-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-④：用160μL/m²咯菌腈处理种栽。3-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种栽。

(3)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种栽：4-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用320μL/m²咯菌腈处理种栽。4-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种栽。

(4)、CK：施用等量清水对照。

解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽秧苗素质的影响见表13，结果显示：经过人参根长、茎粗、株高、根重、全株重五方面测试，处理3-③、4-①和4-④的效果好，且在5％水平差异不显著。其中，处理3-③施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽后，人参平均根重最高，达到7.22g，比对照增产118.79％；处理4-①施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽，人参平均全株重最高，达到14.02g，比对照增产74.38％。

表13解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂对人参种栽秧苗素质的影响

备注：P值<0.01,为5％显著水平

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤：2-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤。2-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤。2-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理土壤。

(2)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽：3-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种栽。3-④：用160μL/m²咯菌腈处理种栽。3-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种栽。

(3)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种栽：4-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种栽。4-④：用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用320μL/m²咯菌腈处理种栽。4-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种栽。

(4)、CK：施用等量清水对照。

解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理人参种子对人参产量影响见表14，结果显示：处理5-②施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子的小区产量最高，达到57.04g，比对照增产63.3％。解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子对人参秧苗素质的影响见表15，结果显示：测试人参平均根长、株高、茎粗、根重、全株重，处理5-②在5％水平上与其他处理差异显著，处理效果最佳，人参平均全株重最高，达到0.275g，比对照增产72.96％。因此，施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子对人参有明显促生作用。

表14解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子对人参产量的影响

备注：P值<0.01,为5％显著水平

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种子：1-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-④用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用160μL/m²咯菌腈处理种子1-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种子。

(2)施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子：5-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-④：用160μL/m²咯菌腈处理种子。5-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种子。

(3)、CK：施用等量清水对照。

表15解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子对人参秧苗素质的影响

备注：P值<0.01,为5％显著水平

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种子：1-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-④用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用160μL/m²咯菌腈处理种子1-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种子。

(2)施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子：5-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-④：用160μL/m²咯菌腈处理种子。5-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种子。

(3)、CK：施用等量清水对照。

(二)、解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂对人参病害的预防及其诱导植物抗病性作用

解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子及土壤对人参苗期病害和根部病害的防治效果，以防治人参立枯病为例进行具体说明。处理1-②施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子防效最高，达到68.63％，发病率仅为2.12％，(表 16)。

综合以上结果表明施用2～3g/m²解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂处理种子、种栽及土壤可充分发挥解淀粉芽孢杆菌对人参生长的促生作用及对病原菌有效防治的抗生作用。

表16解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子和土壤对人参苗期病害的防效

备注：P值<0.01，为5％显著

(1)、施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理土壤及种子：1-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂分别处理土壤和种子。1-④用320μL/m²噻·咯·精霜灵处理土壤，用160μL/m²咯菌腈处理种子1-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)分别处理土壤和种子。

(2)施用解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子：5-①：施用2g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-②：施用3g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-③：施用4g/m²解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂处理种子。5-④：用160μL/m²咯菌腈处理种子。5-⑤：施用2g/m²枯草芽孢杆菌(10亿CFU/g)处理种子。

(3)、CK：施用等量清水对照。

(三)、解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂防治人参根部土传病害和苗期病害的合理施用综合实验例5(一)和(二)的实施案例，总结解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂预防人参病害的合理施用技术如表17。可应用以下技术进行合理施用：

种子处理方法：将人参种子放入解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的悬液中充分搅拌，使种子和药液充分接触，提高浸种效果。在浸种时，必须保证药液面高出种子，以免种子吸水膨胀后露出药液外影响浸种效果。浸种2小时后直接播到苗床土壤中，用药浓度为100～150g/kg种子(若按小区面积算即2～3g/m²)。

种栽处理方法：将人参种栽放入解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂的悬液中充分浸泡，使种栽和药液充分接触，提高浸泡效果。浸泡30分钟后直接种植到土壤中，用药浓度为7.4～11.1g/kg种栽(若按小区面积算即2～3g/m²)。

土壤处理方法：将解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂与土壤进行混合拌匀，再均匀撒到小区土壤中；或者将解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂配置成合适浓度的药液，进行近地面土壤浇灌，用药浓度为2～3g/m²。

表17解淀粉芽孢杆菌FS6可湿性粉剂田间合理施用方法

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用，其特征在于：所述生物农药是由如下重量份的原料制成的：解淀粉芽孢杆菌冻干粉65-75份，助剂8-12份，稳定剂1.5-2.5份，紫外保护剂0.05-0.15份，载体10-25份；其中：

所述解淀粉芽孢杆菌为保藏编号CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6；

所述助剂包括分散剂和润湿剂；所述分散剂为木质素磺酸钙，所述润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，且所述木质素磺酸钙与所述十二烷基苯磺酸钠的重量比为9:1～9.5:0.5；

所述稳定剂为碳酸钙；

所述载体为高岭土6000目；

所述人参苗期病害为人参立枯病、人参疫霉病和人参灰霉病；

所述人参根部土传病害为人参根腐病和人参锈腐病。

2.根据权利要求1所述的一种用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌冻干粉是通过以下方法制备的：

(1)、将保藏编号为CGMCC No.9538的解淀粉芽孢杆菌FS6接种于液体培养基中，于28℃条件下在摇床中180r/min振荡培养24h，制得种子液；

(2)、将所述种子液以体积百分数为6％的接种量接种于种子罐中，所述种子罐的培养条件为：通气比1:0.9～1.1，搅拌转速180r/min，温度28℃，罐压0.015～0.020MPa，培养至活菌含量为4.5×10¹⁰CFU/ml，制备得到菌悬液；

(3)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-75～-85℃超低温冰箱预冻2.5～3.5h，然后在-55～-65℃，真空度为95～105Pa，冻干20～30h后在0～45℃进行粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌冻干粉。

3.如权利要求1-2任一项所述的用于人参种子及土壤处理的生物农药在防治人参苗期病害和人参根部土传病害中的应用，其特征在于，将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于200目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0～45℃。