CN100430715C - 烟草丛顶病毒检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种烟草丛顶病毒检测方法，属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒核苷酸序列设计特异性引物TB2F/TB2R，提取总RNA后采用RT-PCR的方法，直接检测烟草丛顶病毒。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测烟草丛顶病毒。

Description

烟草丛顶病毒检测方法
技术领域：
本发明涉及一种直接、快速、灵敏的检测烟草丛顶病毒(TBTV)的方法，属植物保护领域。
背景技术：
烟草丛顶病是近年来在全世界一些烟区频繁爆发的一种毁灭性烟草病害，病害由烟草丛顶病毒(TBTV)和烟草扭脉病毒(TVDV)复合侵染引起。烟草丛顶病症状表现为叶片出现斑驳，随后产生淡褐色坏死斑，新生叶片逐渐变小变圆并褪绿或黄化，植株矮缩。烟草丛顶病毒是烟草丛顶病症状表现的主要因子，烟草丛顶病毒侵染烟草植株后有一周左右的潜育期，因此烟草丛顶病毒的准确检测，对烟草丛顶病的防治起到十分关键的作用。
常用的检测病毒的方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。目前未有烟草丛顶病毒的指示植物报道，无法用指示植物检测烟草丛顶病毒。烟草丛顶病毒是幽影病毒属的暂定成员，该属的病毒均不形成通常的病毒粒体，因此无法用在电镜下观察到病毒粒体，电镜技术无法用于检测烟草丛顶病毒。烟草丛顶病毒不编码外壳蛋白，无法制备抗血清，所以不能利用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测。目前应用最为广泛的检测烟草丛顶病的方法是利用总核酸提取法检测与烟草丛顶病相关的小分子RNA，该方法只能间接检测植株体内是否存在烟草丛顶病毒，不能直接对烟草丛顶病毒进行检测。
发明内容：
本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种直接、快速、灵敏、特异的检测烟草丛顶病毒的方法。
本发明的具体步骤是：
1、引物设计：
根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下：
TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′
TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′
2、总RNA提取：
(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；
(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(3)12,000rpm离心10min；
(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(5)12,000rpm离心10min；
(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3、RT-PCR扩增
(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；
(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl2 3μL，浓度为20μmol/L的引物TB2R、TB2F各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min，共31-39次循环，最后72℃延伸10min；
4、电泳检测：
取5μL PCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带。
其中：所述的退火温度52-58℃，也可以是52-54℃；所述的循环数31-39次，也可以是36-39次；所述的琼脂糖凝胶浓度0.8％-1.5％，也可以是1.1％-1.4％。
本发明的有益效果是根据烟草丛顶病毒核苷酸序列设计的特异性引物TB2F/TB2R，提取总RNA后采用RT-PCR的方法，直接、方便、特异、灵敏检测烟草丛顶病毒。克服了烟草丛顶病毒不能用指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术进行检测，总核酸检测法不能直接检测烟草丛顶病毒的缺点。
说明书附图：
图1是烟草丛顶病毒的电泳检测图。
具体实施方式：
实例一：
以已知的只感染烟草丛顶病毒的烟株和只感染烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计
根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下：
TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′
TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′
2、总RNA提取：
(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；
(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(3)12,000rpm离心10min；
(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(5)12,000rpm离心10min；
(6)弃上清，沉淀用1mL70％乙醇洗涤，干燥10min；
(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3、RT-PCR扩增
(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；
(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl2 3μL，浓度为20μmol/L的引物TB2R、TB2F各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、52℃退火1min、72℃延伸2min，共31次循环，最后72℃延伸10min；
4、电泳检测：
取5μL PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，感染烟草扭脉病毒的烟株和健康烟株中均没有扩增条带。
实例二：
以已知的只感染烟草丛顶病毒的烟株和只感染烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计
根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下：
TB2R  5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′
TB2F  5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′
2、总RNA提取：
(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；
(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(3)12,000rpm离心10min；
(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(5)12,000rpm离心10min；
(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(7)沉淀用40μ L DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3、RT-PCR扩增
(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；
(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl2 3μL，浓度为20μmol/L的引物TB2R、TB2F各1μL，eDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共39次循环，最后72℃延伸10min；
4、电泳检测：
取5μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，感染烟草扭脉病毒的烟株和健康烟株中均没有扩增条带。
实例三：
以已知的只感染烟草丛顶病毒的烟株和只感染烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计
根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下：
TB2R  5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′
TB2F  5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′
2、总RNA提取：
(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；
(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
(3)12,000rpm离心10min；
(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
(5)12,000rpm离心10min；
(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3、RT-PCR扩增
(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；
(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl2 3μL，浓度为20μmol/L的引物TB2R、TB2F各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、56℃退火1min、72℃延伸2min，共36次循环，最后72℃延伸10min；
4、电泳检测：
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，感染烟草扭脉病毒的烟株和健康烟株中均没有扩增条带。

Claims (4)

1、一种烟草丛顶病毒检测方法，它包括以下步骤：
(1)引物设计
设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下：
TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′
TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′
(2)总RNA提取：
①称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；
②在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；
③12,000rpm离心10min；
④上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；
⑤12,000rpm离心10min；
⑥弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；
⑦沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
(3)RT-PCR扩增
①反转录合成cDNA：
取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入以下试剂：
Figure C2005100487240002C1
轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；
②PCR扩增：
在PCR管中加入以下试剂：
Figure C2005100487240003C1
轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min，共31-39次循环，最后72℃延伸10min；
(4)电泳检测：
取5μL PCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带。
2、根据权利要求1所述的烟草丛顶病毒检测方法，其特征在于PCR扩增中的退火温度为52-54℃。
3.根据权利要求1所述的烟草丛顶病毒检测方法，其特征在于PCR扩增中的循环数为36-39次。
4.根据权利要求1所述的烟草丛顶病毒检测方法，其特征在于电泳检测时所用的琼脂糖凝胶浓度为1.1％-1.4％。
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