CN108990586A - 注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，属于植物病害技术领域，具体步骤为：取0.5 g携带云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织用液氮研磨成粉末，再加入PBS缓冲液研磨，所得匀浆离心待注射；在植株叶片上扎孔注射；注射接种半个月后，进行症状观察以及RT‑PCR检测，即可获得感染4种云南烟草丛顶病病原物的活体样本。本发明能高效的将云南烟草丛顶病4种病原物同时接种在健康植株上，突破通过摩擦接种不能把云南烟草丛顶病4种病原物均接种在健康植株上的技术屏障，避免了利用蚜虫传毒必须从活体植株获毒的限制以及因蚜虫传毒效率差异而引起试验误差的缺陷，丰富了接种所需带毒植物组织的保存方式。
Description
技术领域
本发明属于植物病害技术领域，具体地说，涉及一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法。
背景技术
烟草丛顶病(Tobacco bushy top disease，TBTD)于1957年在津巴布韦北部的春克旺里烟区首次发生，此后爆发流行并造成很大损失。1993年在云南保山、大理等地大面积爆发流行。鉴于致病病原物的差别，在云南发现的TBTD称为云南烟草丛顶病(Yunnantobacco bushy top disease，YTBTD)，至今，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉溪、红河、普洱、文山、西双版纳及怒江等州市也有YTBTD零星发生。
YTBTD由幽影病毒属的烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus，TBTV)、烟草丛顶病毒卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA，TBTV-SatRNA)、黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus，TVDV)以及烟草扭脉病毒相关RNA(tobacco vein distorting virus-associated RNA，TVDVaRNA)等4种病原物复合侵染引起。
目前的研究结果表明，自然条件下表现典型云南烟草丛顶病症状的烟株，都由上述4种病原物复合侵染引起。TBTV可通过摩擦接种传播，在辅助病毒TVDV的帮助下可通过蚜虫传播，而TVDV只能通过蚜虫传播；单一的TBTV、TBTV-SatRNA或TVDVaRNA都不能经蚜虫传播，这3种病原物都只有在TVDV的帮助下才能通过蚜虫传播。TBTV和TVDV都不能由上一代蚜虫垂直传递给下一代蚜虫，通过蚜虫接种，饲毒后的蚜虫必须于当代进行接种使用，这就需要研究者长时间活体保存患病的烟草植株，用于饲毒和传毒。然而患病的烟草表现出严重的矮化、长势差且幼苗期患病的植株极易致死，因而造成患病材料极易丧失或在温室中容易出现交叉污染，这使得对YTBTD相关病原物的后续研究缺乏持续有效的毒源保障。所以，通过植物病毒学常规的摩擦接种和蚜虫传毒就相对比较局限，而且在研究样品不是新鲜叶片的情况下也很难通过蚜虫稳定的将YTBTD的4种病原物进行传毒。经过证实，YTBTD患病组织可以在-20℃至-80℃的低温状态或在玻璃干燥器脱水后干保存一定时间，但目前这一保存方法下的离体患病材料只能通过摩擦接种将TBTV和TBTV-SatRNA两种病原物接种到新的植株上，摩擦接种无法将TVDV及TVDVaRNA这两种病原物接种到新的植株，而且这一保存方法下的离体患病材料也很难通过蚜虫将TBTV、TBTV-SatRNA、TVDV和TVDVaRNA接种到新的植株，这样的情况对于后续研究极其不利。因此，探索一种新的将云南烟草丛顶病4种病原物成功接种到健康植株的方法，将对多种保存方式下活体、离体患病材料中云南烟草丛顶病4种病原物的高效、便捷传播和接种、病原物间的互作关系以及其它患病毒病植株中病原物的传播和接种等研究提供重要的参考意义。
发明内容
为了克服背景技术中存在的不足，本发明提出了一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，能高效的将云南烟草丛顶病4种病原物同时接种在健康植株上，突破通过摩擦接种不能把云南烟草丛顶病4种病原物均接种在健康植株上的技术屏障，避免了利用蚜虫传毒必须从活体植株获毒的限制以及因蚜虫传毒效率差异而引起试验误差的缺陷，丰富了接种所需带毒植物组织的保存方式。
为了实现上述目的，本发明提出如下的技术方案：
注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，具体步骤为：
1)传毒材料的准备：携带云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织作为传毒材料；
2)传毒材料的处理：取0.5g植物组织于灭过菌的研钵内，通过液氮冷冻研磨成粉末，加入PBS缓冲液2mL以完全浸润粉末，然后进行研磨溶解，溶解后的匀浆以中速离心获得上清接种液；
3)注射接种：将步骤2)所得到的上清接种液，用注射器吸取后在植株叶片上扎孔注射；
4)注射接种半个月后，对接种植株进行症状观察，并通过RT-PCR技术检测云南烟草丛顶病病原物，即可获得感染4种云南烟草丛顶病病原物的活体样本。
步骤1)中所述的植物组织为新鲜样品、冷冻样品、干保存样品中的一种。
进一步地，步骤2)中，PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.4，其制备方法为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值，最后加蒸馏水定容至1L，高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存。
进一步地，步骤2)中，中速离心的转速为8000rpm，温度为4℃，离心时间为3min。
进一步地，步骤3)中，每株植物选择至少2片叶片，每片叶片注射2个孔，每个孔注射量为0.1mL。
本发明的有益效果：本发明方法能高效的将云南烟草丛顶病4种病原物同时接种在健康植株上，突破通过摩擦接种不能把云南烟草丛顶病4种病原物均接种在健康植株上的技术屏障，避免了利用蚜虫传毒必须从活体植株获毒的限制以及因蚜虫传毒效率差异而引起试验误差的缺陷，丰富了接种所需带毒植物组织的保存方式，为云南烟草丛顶病病原物的长期保存及蚜虫传播特性等研究提供更多宝贵的材料及理论依据。
附图说明
图1为本发明不同样品获得的烟株对照图。
图中：A为烟草K326健康植株对照；
B为通过该发明专利以云南烟草丛顶病新鲜植株叶片为样品注射后出现矮缩丛顶病症的烟草K326植株；
C为通过该发明专利以云南烟草丛顶病在-80℃下冷冻保存植株叶片为样品注射后出现矮缩丛顶病症的烟草K326植株；
D为通过该发明专利以云南烟草丛顶病干保存植株叶片为样品注射后出现矮缩丛顶病症的烟草K326植株。
具体实施方式
实施例1
一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，具体步骤为：
将含有云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织(新鲜样品)称取0.5g于灭过菌的研钵内，通过液氮冷冻研磨成粉末后立即加入2mL冰上预冷的PBS缓冲液研磨混匀，取研磨液于2mL灭菌离心管内，在4℃以中速(8000rpm)离心3min获得上清接种液，将上清接种液转移至新的2mL灭菌离心管内放在冰上待后续使用。每株健康植株于苗期长到4片真叶后，选择基部的2片真叶进行接种，用注射器针头在叶片上相隔2cm对称于主脉扎2个孔，注射时用手指垫于叶片正面小孔处，用拔除针头部分的注射器吸取上清接种液，对准叶片背面的小孔轻轻压紧后进行注射，每个小孔的注射量均为0.1mL。将注射后的植株至于20℃的黑暗环境下放置8h，再置于玻璃温室的防虫网箱内，待半个月后观察症状并利用RT-PCR技术检测植株是否成功接种云南烟草丛顶病4种病原物。
实施例2
一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，具体步骤为：
将含有云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织(冷冻样品存放于-20℃至-80℃的低温状态)称取0.5g于灭过菌的研钵内，通过液氮冷冻研磨成粉末后立即加入2mL冰上预冷的PBS缓冲液研磨混匀，取研磨液于2mL灭菌离心管内，在4℃以中速(8000rpm)离心3min获得上清接种液，将上清接种液转移至新的2mL灭菌离心管内放在冰上待后续使用。每株健康植株于苗期长到4片真叶后，选择基部的2片真叶进行接种，用注射器针头在叶片上相隔2cm对称于主脉扎2个孔，注射时用手指垫于叶片正面小孔处，用拔除针头部分的注射器吸取上清接种液，对准叶片背面的小孔轻轻压紧后进行注射，每个小孔的注射量均为0.1mL。将注射后的植株至于20℃的黑暗环境下放置8h，再置于玻璃温室的防虫网箱内，待半个月后观察症状并利用RT-PCR技术检测植株是否成功接种云南烟草丛顶病4种病原物。
实施例3
一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，具体步骤为：
将含有云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织(干保存样品经玻璃干燥器脱水)称取0.5g于灭过菌的研钵内，通过液氮冷冻研磨成粉末后立即加入2mL冰上预冷的PBS缓冲液研磨混匀，置于冰上30min后，取研磨液于2mL灭菌离心管内，在4℃以中速(8000rpm)离心3min获得上清接种液，将上清接种液转移至新的2mL灭菌离心管内放在冰上待后续使用。每株健康植株于苗期长到4片真叶后，选择基部的2片真叶进行接种，用注射器针头在叶片上相隔2cm对称于主脉扎2个孔，注射时用手指垫于叶片正面小孔处，用拔除针头部分的注射器吸取上清接种液，对准叶片背面的小孔轻轻压紧后进行注射，每个小孔的注射量均为0.1mL。将注射后的植株至于20℃的黑暗环境下放置8h，再置于玻璃温室的防虫网箱内，待半个月后观察症状并利用RT-PCR技术检测植株是否成功接种云南烟草丛顶病4种病原物。
实验分析
本发明涉及的含有云南烟草丛顶病4种病原物的植物材料，具体是指感染了云南烟草丛顶病寄主植物的新鲜样品、冷冻样品或干保存样品，所述寄主植物经过多年验证包括了多种植物，将云南烟草丛顶病4种病原物的寄主植物烟草、蚕豆、番茄、辣椒等采用本发明方法注射接种后观察植株发病情况，待出现发病症状(植株矮缩丛顶、顶端优势丧失、叶片褪绿黄化、侧枝丛生和节间缩短等)后，取样提取核酸进行RT-PCR检测，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳的结果，判断目标条带是否为云南烟草丛顶病4种病原物的扩增条带。
根据云南烟草丛顶病病原物序列设计引物：
备注：F指正义链引物；R指反义链引物。
试验分组如下：
处理组1：使用注射接种方法以新鲜的云南烟草丛顶病植株叶片作为材料，选取15株健康苗期植株进行注射接种；
处理组2：使用注射接种方法以-80℃冰箱冷冻保存的云南烟草丛顶病植株叶片作为材料，选取15株健康苗期植株进行注射接种；
处理组3：使用注射接种方法以干保存的云南烟草丛顶病植株叶片作为材料，选取15株健康苗期植株进行注射接种；
对照组1：选取云南烟草丛顶病新鲜植株叶片对15株烟苗进行汁液摩擦接种；
对照组2：将不带毒蚜虫放置于云南烟草丛顶病植株叶片上获毒24h，选取15株健康苗期植株以每株3头蚜虫传毒24h后移除蚜虫。
提取感病植株核酸的步骤如下：
第一步：取0.05-0.1g植物组织用1mL TRIpure充分研磨；
第二步：研磨后室温放置5min。4℃，12000rpm离心10min；
第三步：取上清于另一离心管中，加入200μL氯仿，用力摇晃15s，30℃放置2-3min。4℃，12000rpm离心15min；
第四步：底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的水相。将上层水相转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入500μL异丙醇于上层水相，颠倒混匀7次，30℃放置10min。4℃，12000rpm离心10min；
第五步：去上清，沉淀加入1mL预冷的75％乙醇，洗涤沉淀。4℃，12000rpm离心10min；
第六步：去上清，于室温下自然干燥10min，用100μL的ddH2O充分溶解后作为RNA模板，于-20℃保存备用。
采用RT-PCR检测确定植物组织是否携带云南烟草丛顶病病原物，在PCR管中加入以下试剂，反应体系为10μL。反转录扩增体系为：RNA模板1μL，下游引物(10μM)0.5μL，ddH2O4μL，70℃保温10min后迅速在冰上急冷3min；离心数秒使模板、引物变性溶液聚于管底，在上述的PCR管中加入5×M-MLV Buffer 2μL，dNTP Mixture(2.5mM)2μL，M-MLV反转录酶0.5μL，42℃保温1h；70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。PCR扩增体系为cDNA模板2μL，TaKaRa rTaq(5U/μL)酶0.25μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5mM)4μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，ddH2O 36.75μL，反应体系为50μL。PCR反应循环如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环扩增35次；最后72℃延伸10min。
在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1.0％的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中按照每100mL加入5μL Gold View染色剂混匀。反应结束后取全部产物用1％琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中电泳35min，然后于凝胶成像仪观察拍照。根据每对引物扩增片段大小观察注射接种植株中TBTV、TVDVaRNA、TBTV-SatRNA和TVDV的检测结果，判断发病植株中具体感染TBTV、TVDVaRNA、TBTV-SatRNA和TVDV病原物的种类。
按照本发明方法，传毒材料以栽培烟草K326品种为例，接种/传毒半个月后采集叶片经RT-PCR检测TVDV、TVDVaRNA、TBTV、TBTV-SatRNA四种病原物均同时检出的检出率见下表：
对照组1经RT-PCR检测，发现摩擦接种的植株仅能成功接种TBTV和TBTV-SatRNA这2种病原物，2种病原物的检出率均为66.7％。该方法无法将云南烟草丛顶病4种病原物均接种到健康烟株上，故4种病原物同时检出率不予标注。
云南烟草丛顶病的传播主要通过蚜虫从活体感病烟株上获毒后才能传毒到健康烟株上，对照组2经RT-PCR检测，发现传毒后的植株中云南烟草丛顶病4种病原物同时检出的检出率为73.3％。本发明的注射接种方法对于新鲜毒源材料的传毒能与蚜虫传毒达到一致水平。但相比之下，蚜虫传毒有必须从活体植株获毒的限制，以及会因蚜虫传毒效率的差异而引起试验误差，传毒与接种所用毒源保存方式较为局限。
虽然本发明中冷冻保存毒源材料会随着保存时间的增长导致病毒粒体的降解进而降低传毒效率，但一个月至两年内的保存材料也能达到平均66.7％的传毒效率。干保存样品待样品干燥处理后，能达到平均46.7％的传毒效率。本发明同时针对其他烟草品种、蚕豆、番茄、辣椒的新鲜样品进行验证，通过注射接种同时获得云南烟草丛顶病4种病原物的检出率平均值达到了71.2％，说明本发明针对云南烟草丛顶病的多种寄主植物均能有效实施。本发明方法能高效的将云南烟草丛顶病4种病原物同时接种在健康植株上，突破通过摩擦接种不能把云南烟草丛顶病4种病原物均接种在健康植株上的技术屏障，避免了利用蚜虫传毒必须从活体植株获毒的限制以及因蚜虫传毒效率差异而引起试验误差的缺陷，丰富了接种所需带毒植物组织的保存方式，为云南烟草丛顶病病原物的长期保存及蚜虫传播特性等研究提供更多宝贵的材料及理论依据。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，其特征在于：具体步骤为：
1）传毒材料的准备：携带云南烟草丛顶病4种病原物的植物组织作为传毒材料；
2）传毒材料的处理：取0.5 g植物组织于灭过菌的研钵内，通过液氮冷冻研磨成粉末，加入PBS缓冲液2 mL以完全浸润粉末，然后进行研磨溶解，溶解后的匀浆以中速离心获得上清接种液；
3）注射接种：将步骤2）所得到的上清接种液，用注射器吸取后在植株叶片上扎孔注射；
4）注射接种半个月后，对接种植株进行症状观察，并通过RT-PCR技术检测云南烟草丛顶病病原物，即可获得感染4种云南烟草丛顶病病原物的活体样本。
2.根据权利要求1所述的一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，其特征在于：步骤2）中，PBS缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH为7.4。
3.根据权利要求1所述的一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，其特征在于：步骤2）中，中速离心的转速为8000 rpm，温度为4℃，离心时间为3 min。
4.根据权利要求1所述的一种注射接种获得感染云南烟草丛顶病4种病原物病株的方法，其特征在于：步骤3）中，每株植物选择至少2片叶片，每片叶片注射2个孔，每个孔注射量为0.1 mL。
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