CN110243989A - 虫草素的液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于虫草素检测方法技术领域，具体的涉及一种虫草素的液相色谱检测方法。通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。本发明所述的虫草素的液相色谱检测方法，检测方法简单快速，选择性好，检测灵敏度高，结果重现性好，大大节约了分析时间和成本，不需要昂贵的二极管阵列的检测器，仅需要普通的液相检测设备，易于大规模推广使用。
Description
技术领域
本发明属于虫草素检测方法技术领域，具体的涉及一种虫草素的液相色谱检测方法。
背景技术
虫草素(Cordycepin)是腺苷的类似物。1951年，德国的Cunningham等从蛹虫草的培养滤液中分离发现虫草素。虫草素在野生冬虫夏草中的含量极微，现在研究所用的虫草素一般均是从发酵的蛹虫草中提取的。目前国内天然提取(发酵)来源的纯度大于99％的虫草素已经可以商业化生产。
虫草素学名为3"脱氧腺苷，是从蛹虫草中提取出来的一种天然生物活性物质。虫草素的分子式为C10H13N5O3，相对分子质量为251.25，能溶于水，热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，虫草素为含氮配糖体的核酸衔生物，属嘌呤类生物碱。虫草素是一种核甙类新药。20世纪70年代被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用：20世纪90年代研究发现，添加腺甙脱氨酶(adenosine dea minase，ADA)抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用。虫草素能干扰基因细胞RNA和DNA的合成，抑制癌细胞等不正常细胞的分裂，并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视，虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药已经进人三期临末床。
现有技术一般使用二极管阵列的检测器，通过三维立体图谱分析样品的纯度，但是上述仪器价格昂贵，一般小型实验室没有这种配置，局限了检测利用率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种虫草素的液相色谱检测方法。该检测方法简单快速，选择性好，检测灵敏度高，大大节约了分析时间和成本，不需要昂贵的二极管阵列的检测器，仅需要普通的液相检测设备，易于大规模推广使用。
本发明所述的虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
其中：
流动相由流动相A与流动相B组成，流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为85-88:15-12。
流动相的制备方法如下：
将一定比例的甲醇和色谱用水混合，使用0.45um微孔水膜抽滤后，放入超声清洗机中超声20-30min，除气泡备用。
超声时选用AS系列超声波清洗机，高档超声，AS系列超声波清洗机生产厂家为天津奥特赛恩斯仪器有限公司。
优选的流动相A与流动相B的体积比为88:12，配制方法如下：
量取440ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的制备是将虫草素标准品溶于流动相中，超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，取上清液备用。
虫草素标准品溶液的浓度为0.0002g/ml-0.0004g/ml。
当虫草素标准品溶液的浓度为0.0004g/ml，配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，超声使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制是将虫草素供试品溶于流动相中，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，取上清液备用。
优选的供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为85-88：15-12；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为9-17分钟。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
对供试品进行定性和定量分析具体是将供试品曲线与标准品色谱曲线进行对照，根据色谱峰保留时间进行定性分析，外标峰面积法进行定量分析。
供试品虫草素含量的计算公式如下：
供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明所述的虫草素的液相色谱检测方法，检测方法简单快速，选择性好，检测灵敏度高，结果重现性好，大大节约了分析时间和成本，不需要昂贵的二极管阵列的检测器，仅需要普通的液相检测设备，易于大规模推广使用。
(2)本发明所述的虫草素的液相色谱检测方法，节约时间，适合车间大量生产过程中的检测，简单快捷，节约检测成本，只需要准确称量标准品和样品，通过峰面积计算就能测出样品的纯度，一般小型实验室都有配置这种液相色谱仪，所以使用性广，利用率高。
附图说明
图1是实施例1虫草素供试品液相色谱图；
图2是实施例2虫草素供试品液相色谱图；
图3是实施例3虫草素供试品液相色谱图；
图4是对比例1虫草素供试品液相色谱图；
图5是实施例4虫草素供试品液相色谱图；
图6是实施例5虫草素供试品液相色谱图；
图7是对比例2虫草素供试品液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相A与流动相B的体积比为88:12。
流动相的制备：
量取440ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：12；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为16.05min，峰面积为58269.12mAU*s。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图1所示，色谱峰保留时间为16.06min，峰面积为50694.139mAU*s。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
根绝供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％的计算公式，将上述数值代入计算得到供试品虫草素含量为87％。
实施例2
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相A与流动相B的体积比为88:15。
流动相的制备：
量取352ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：15；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为14.80min，峰面积为53873.51mAU*s。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图2所示，色谱峰保留时间为14.80min，峰面积为46869.958mAU*s。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
根绝供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％的计算公式，将上述数值代入计算得到供试品虫草素含量为87％。
实施例3
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相A与流动相B的体积比为88:20。
流动相的制备：
量取264ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：20；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为9.35min，峰面积为46920.601mAU*s。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图3所示，色谱峰保留时间为9.35min，峰面积为40820.923mAU*s。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
根绝供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％的计算公式，将上述数值代入计算得到供试品虫草素含量为87％。
对比例1
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相A与流动相B的体积比为50：50。
流动相的制备：
量取200ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取200ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用0.45umAS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为50：50；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为4.07min。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图4所示，无法区分色谱峰，色谱峰保留时间为4.07min。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
因此，无法计算虫草素标准品溶液含量。
实施例4
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相A与流动相B的体积比为88：12。
流动相的制备：
量取440ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用0.45um微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0100g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0100g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：12；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为15.57min，峰面积为29079.291mAU*s。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图5所示，色谱峰保留时间为15.57min，峰面积为25298.983mAU*s。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
根绝供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％的计算公式，将上述数值代入计算得到供试品虫草素含量为87％。
实施例5
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相的制备：
量取440ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0200g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：12；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为16.06min，峰面积为58269.125mAU*s。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图6所示，色谱峰保留时间为16.06min，峰面积为50694.139mAU*s。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
根绝供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％的计算公式，将上述数值代入计算得到供试品虫草素含量为87％。
对比例2
一种虫草素的液相色谱检测方法，通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
流动相的制备：
量取440ml色谱用水，倒入500ml的烧杯，再量取60ml的甲醇倒入烧杯，使用微孔水膜抽滤后倒入流动相专用的瓶子里，放进超声清洗机中超声20min除气泡备用。
标准品溶液的配制方法如下：
称取0.0300g虫草素标准品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，经0.45um的滤膜过滤，备用。
供试品溶液的配制方法如下：
称取0.0300g虫草素供试品于50ml的容量瓶中，用流动相定容到50ml，采用AS系列超声波清洗机，高档超声5min使其完全溶解，0.45um的滤膜过滤，备用。
在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为88：12；流速为1.0ml/min。
标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为15.95min，峰太高，显示不全。
供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线，如附图7所示，色谱峰保留时间为15.95min，峰太高，显示不全。
液相色谱分离测定时，跑基线20min等基线平稳后进样检测。
由于峰太高显示不全，导致峰面积的数值不准确，因为无法准确计算出虫草素含量。
实施例1-3为供试品的浓度相同，标准品浓度相同，检测环境相同，唯一的不同点在于流动相的体积比不同，实施例1的流动相体积比为88：12；实施例2的流动相体积比为88:15；实施例3的流动相体积比为88:20；通过比较可知，实施例1-3测试的结果重现性好，准确度高；对比例1所述的流动相的体积比为50:50，当超出本发明所述的流动相的比值范围时，出现的峰无法分离，重叠的情况，无法准确计算虫草素的含量。
实施例4-5为供试品的浓度相同，流动相体积比相同，检测环境相同，唯一的不同点在于标准品浓度不同，实施例4标准品浓度为0.0002g/ml，实施例5标准品浓度为0.0004g/ml，而对比例2标准品浓度为0.0006g/ml，此时，峰太高，显示不全，导致无法计算含量，因此当在本发明所述的标准品的浓度范围内时，虫草素测试结果的准确度高。
Claims (10)
1.一种虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：通过流动相的制备→标准品溶液的配制→供试品溶液的配制→在线液相色谱测定→标准曲线绘制→供试品检测→对供试品进行定性和定量分析实现供试品中虫草素含量的测定。
2.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：流动相由流动相A与流动相B组成，流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为85-88:15-12。
3.根据权利要求2所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：流动相的制备具体是将一定比例的甲醇和色谱用水混合，使用0.45um微孔水膜抽滤后，放入超声清洗机中超声20-30min，除气泡备用。
4.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：标准品溶液的配制具体是将虫草素标准品溶于流动相中，超声5min使其溶解，经0.45um的滤膜过滤，取上清液备用。
5.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：供试品溶液的配制具体是将虫草素供试品溶于流动相中，超声5min使其溶解，经0.45um的滤膜过滤，取上清液备用。
6.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：在线液相色谱检测条件为：色谱柱为ODS液相色谱柱，柱长150mm×内径4.60mm，粒径5um；柱温25-35℃；紫外检测器波长254-260nm；流动相A为色谱用水，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为85-88：15-12；流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：标准曲线绘制具体是取标准品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到虫草素的标准曲线，色谱峰保留时间为9-17min。
8.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：供试品检测具体是取供试品滤液20ul以所述液相色谱检测条件为标准，进行液相色谱分离测定，得到供试品曲线。
9.根据权利要求1所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：对供试品进行定性和定量分析具体是将供试品曲线与标准品色谱曲线进行对照，根据色谱峰保留时间进行定性分析，外标峰面积法进行定量分析。
10.根据权利要求9所述的虫草素的液相色谱检测方法，其特征在于：供试品虫草素含量＝(S样品峰面积/S标准品峰面积)*(C标准品浓度/C样品峰浓度)*100％。
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