CN102599005A - 辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法 - Google Patents

Abstract

辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，是为了解决目前为提高北虫草的虫草素含量，所采用的通过向培养基中添加一定数量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技术问题而设计的。该方法通过辐射、诱变和筛选实现培育目标菌株的目的。目标菌株yccGy1016是通过对出发菌株ycc-01进行特点参数的辐射处理和对变异菌落的筛选纯化，以及对产生虫草素指标的科学检测和栽培稳定性的评价，最后获得该专利所提及的高产虫草素北虫草新菌株的生产方法。经检测菌株ycc Gy 1016产生虫草素能力是出发菌株ycc-01的3.8倍。这一成果对于人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。

Description

辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法

技术领域

本发明涉及一种食用菌种源的生产方法，尤其涉及一种辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法。属于食用菌药用菌遗传育种领域。

背景技术

冬虫夏草【Cordyceps sinensis】是我国传统的名贵药材，分布于西藏、青海、四川、甘肃、云南等地，具有特殊的药理作用和治疗功效。也是药食调补佳品。其中虫草素是最独特而重要的药物成分。

近年来由于人类活动范围的扩大，生态环境的恶化，导致野生冬虫夏草持续减少，价格也持续飙升。到2010年优质虫草已经销售到16万元/公斤(干)。为解决冬虫夏草资源紧缺问题，人们很早就开始关注蛹虫草，从1986年起，人们把野生蛹虫草采集回来，通过组织分离获得菌种，20多年里，蛹虫草栽培获得重大技术突破。目前它已经成为冬虫夏草的最佳替代品。全世界已知虫草类有350余种，我国目前有62种，但最为昂贵的只有冬虫夏草和蛹虫草。

北虫草即蛹虫草【Cordycepsmilitaris(L.)Link】、又称之北冬虫夏草，它是虫草属中两个模式种之一。2007年我国正式将北虫草列为新资源食品。它被认为是目前唯一能替代冬虫夏草的虫草属真菌。北虫草在世界上广泛分布，它能够寄生在多种鳞翅目昆虫的幼虫及其蛹体上，在我国各地分布较广，主要分布剥蚀丘陵地带、海拔50-400米之间、气候属于北温带、半湿润大陆性气候、每年只有林区在郁闭、避风的地段才能有北虫草集中发生，而传统的冬虫夏草主产于我国青海、云贵高原的横断山区及祁连山等海拔4500-5000米以上的高原灌丛或草甸地带、寄生在冻土层中的蝙蝠蛾幼虫体上，遗憾的是对于这种名贵中药材至今未能实现有效的子实体人工培养及规模化生产，但是国内外对已经成为诱发虫草子实体的种类研究认为，北虫草食用和药用价值可与传统的冬虫夏草媲美，它不仅在药效成分种类上与传统冬虫夏草相近外，而且是在已报道的350余种虫草菌中唯一能大量形成虫草素的种，因此它与传统冬虫夏草一样，能滋补人体，而且能有效地抑制肿瘤和病毒，并具有多种药理功能，是传统冬虫夏草的最理想代用品，但野生的北冬虫夏草与传统的冬虫夏草一样，在自然界中稀少，价格昂贵，因此，人工培育具有自然形态的北冬虫夏草子实体，意义重大，经济效益显著！

虫草素是虫草属药用真菌中独有的药物成分，是一种核苷类抗生素，具有较好的抗病毒功能；能抑制枯草杆菌，鸟结核杆菌和艾氏腹水癌细胞，并对KB细胞培养和Hep#2细胞有毒性作用，可影响mRNA的形成以至蛋白质的合成，这一机制与虫草素抗肿瘤有关，1997年美国已将虫草素用于一期临床试验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌，抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性。经检测人工栽培的北虫草富含虫草素，其含量高于冬虫夏草。

目前北虫草的人工栽培技术已经相当成熟，但在如何提高北虫草内在品质方面尚有大量工作需要去做，其中如何提高北虫草内虫草素含量就是一个重要课题。资料显示，目前科技工作者在提高虫草素方面主要是通过向培养基中添加一定数量的蛋白源，但这种做法提高幅度有限，从2008年起，我们主要通过培育北虫草新品种来提高虫草素含量，具体做法就是对现有虫草种源进行辐射育种，再通过液相色谱检测法筛选虫草素产率高的新菌株。本专利所提及的高产虫草素北虫草新菌株ycc Gy 1016的生产方法就是在上述背景下选育而成。批量多次重复的栽培结果表明，在相同栽培培养基和管理条件下，采用ycc Gy 1016和ycc-01两个不同品种进行栽培，所获得的虫草干品中虫草素含量差异明显，与种源本身产生虫草素能力成正相关。

发明内容：

本发明为了解决目前为提高北虫草的虫草素含量，所采用的通过向培养基中添加一定数量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技术问题，提供一种辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为：ycc Gy 1016；具体生产方法是通过下述步骤实现的：

1)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

2)ycc-01培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

3)按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.1-0.5毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy-500Gy，距离30cm，照射2-300s，照射后在20℃暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2-4天，然后根据菌落生长形态进行菌落筛选；

5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；

6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为：葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；

7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；

8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为：ycc Gy 1016新菌株。

本发明的特点及有益效果：ycc Gy 1016菌株与出发菌株ycc-01相比，在出草方面形态正常，产量性状在0.05水平比较差异不显著，虫草素产率在0.05水平比较，差异达到显著水平。经检测菌株ycc Gy 1016产生虫草素能力是出发菌株ycc-01的3.8倍。这一成果对于人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。

具体结果：ycc Gy 1016菌株生物转化率为5.62克(干)/45克小麦，出发菌株ycc-01生物转化率为5.68克(干)/45克小麦；ycc Gy 1016菌株虫草素产率481.6毫克/公斤，ycc-01菌株虫草素产率126.3毫克/公斤。

附图说明：

图1yccGy1016和YCC-01菌种转代次数对子实体产量的影响曲线图

图2虫草素标准曲线图

图3转代次数对yccGy1016和YCC-01菌种虫草素含量曲线图

具体实施方式：

辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为：ycc Gy 1016；具体生产方法是通过下述步骤实现的：

1)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

2)ycc-01培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

3)按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.1-0.5毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy-500Gy，距离30cm，照射2-300s，照射后在20℃暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2-4天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；

5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；

6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为：葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；

7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；

8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为：ycc Gy 1016新菌株。

其中：所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性。

1)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL配方按常规繁育生产用液体菌种。

2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，1.05公斤/平方厘米压力灭菌60分钟，冷却接种。

3)菌瓶先放于20℃避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85％，每天通风3次。

4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。

实施例1

本专利申请保护的是一株能够提高虫草素含量的北虫草新品种的生产方法。该品种是通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为：ycc Gy1016。

具体实现步骤是：

首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

将ycc-01利用如下培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释2500倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.3毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy，距离30cm，照射300s，照射后在20℃暗培养7天，然后转入光照培养，光照强度4000勒克斯，培养时间4天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；

进行菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；

将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为：葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；其虫草素测定方法：采用高效液相色谱法。

经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源。

对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为：ycc Gy 1016新菌株。

所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性。

1)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL配方按常规繁育生产用液体菌种。

2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，1.05公斤/平方厘米压力灭菌60分钟，冷却接种。

3)菌瓶先放于20℃避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85％，每天通风3次。

4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。

经检测ycc Gy 1016菌株与出发菌株ycc-01相比，在出草方面形态正常，产量性状在0.05水平比较差异不显著，虫草素产率在0.05水平比较，差异达到显著水平。具体结果：ycc Gy 1016菌株生物转化率为5.62克(干)/45克小麦，出发菌株ycc-01生物转化率为5.68克(干)/45克小麦；ycc Gy 1016菌株虫草素产率481.6毫克/公斤，ycc-01菌株虫草素产率126.3毫克/公斤。

实施例2

辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

将ycc-01利用如下培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.3毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

辐射源选择低剂量铯137，剂量500Gy，距离30cm，照射2s，照射后在20℃暗培养6天，然后转入光照培养，光照强度5000勒克斯，培养时间3天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；

其他同实施例1

实施例3

辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，首先选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

将ycc-01利用如下培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

再按常规方法制备加富PDA培养基，取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.3毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

辐射源选择低剂量铯137，剂量200Gy，距离30cm，照射200s，照射后在20℃暗培养5天，然后转入光照培养，光照强度6000勒克斯，培养时间2天，选择菌落生长正常，菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落，挑取保存；

其他同实施例1。

下面的实验是对北虫草诱变菌株yccGy1016遗传稳定性及产生虫草素能力的评价：

实验一：北虫草诱变菌株ycc Gy 1016遗传稳定性评价

1.1遗传稳定性试验

由于诱变菌株在连续继代培养时的性状常常不稳定，所以要对钴60辐射诱变处理后得到的菌株进行遗传稳定性试验。将诱变菌株yccGy1016和对照原始菌株YCC-01一起在PDA斜面上连续转接10代，每代均进行栽培试验，结果见表1、表2。

菌株代号	菌丝形态	转色天数	出草时间	生物转化率(干)	虫草素产率
						yccGy1016	菌丝平贴不徒长	2	35	5.62克/45克	481.6毫克/公斤
YCC-01	菌丝平贴不徒长	2	33	5.68克/45克	126.3毫克/公斤

转代次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	(g/瓶)干品
												yccGy1016	5.62	5.63	5.38	6.02	5.53	5.46	5.56	5.43	6.0	5.63	5.62
YCC-01	5.9	5.7	6	5.67	5.63	5.6	5.58	5.59	5.6	5.56	5.68

表1菌株yccGy1016和YCC-01生长参数的比较

表2yccGy1016和YCC-01菌种转代次数对子实体产量的影响

参看图1，为yccGy1016和YCC-01菌种转代次数对子实体产量的影响曲线。

实验二：北虫草诱变菌株yccGy1016产生虫草素能力评价

2.1虫草素提取将样品ycc Gy 1016和YCC-01粉碎后，过40目筛(0.36mm)。

采用水提法，精密称取待测样品粉末1g，置于广口瓶中，精密加入去离子水溶液40ml，在85℃水浴环境下提取2.5h，放冷，定容，摇匀，粗滤，离心，取滤液，过微孔滤膜(0.22μm)，作为供试样品溶液。

2.2分析检测方法采用高效液相色谱法对虫草素进行分析检测。

2.2.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇(15％)-水(85％)；分析时长：10min；柱温25℃；流速：1.0ml/min；紫外检测波长260hm；进样量20μl，重复3次。

2.2.2标准品溶液的制备精密称取虫草素标准品25mg置于25ml容量瓶，以去离子水定容至刻度，配成质量浓度为1.0mg/ml标准品储备液。再用0.25μm微孔滤膜过滤后，备用。

2.2.3标准曲线的制作。

参看图2虫草素标准曲线，取虫草素标准品储备液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml分别置于10ml容量瓶中，以去离子水定容至刻度，过微孔滤膜(0.22μm)，分别进样测定，得到其峰面积，以峰面积Y对其质量浓度(ppm)进行线性回归分析。得回归方程：y＝49392x+0.3172，相关系数R＝0.9999性关系良好。

2.3实验检测结果

参看图3转代次数对yccGy1016和YCC-01菌种虫草素含量曲线。

Claims (2)

1.辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，通过低剂量铯137放射性元素辐射后筛选获得，定名为：ycc Gy 1016；具体生产方法是通过下述步骤实现的：

1)选择目前生产中广泛使用的北虫草品种ycc-01作为辐射育种的出发菌株；

2)ycc-01培养基配方：葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁2克、复合维生素100毫克及蒸馏水1000毫升，按常规方法生产液体种源；

3)按常规方法制备加富PDA培养基，其配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL；取直径10厘米培养皿同步高压灭菌，倒平板、冷却后涂布稀释1000-3000倍的含有分生孢子的液体种源菌液0.1-0.5毫升，均匀涂布于平板上，在18-25℃避光定植培养24-36小时，然后转入辐射处理；

4)辐射源选择低剂量铯137，剂量50Gy-500Gy，距离30cm，照射2-300s，照射后在20℃暗培养2-7天，然后转入光照培养，光照强度4000-6000勒克斯，培养时间2-4天，然后根据菌落生长形态进行菌落筛选；

5)菌落筛选，在宏观层面，选择菌落生长正常，边缘整齐、菌丝不徒长，菌丝转色深的菌落；在微观层面通过显微镜进行观察，选择菌丝粗细均匀、细胞核数量多、菌丝分枝适度、分生孢子着生呈念珠状态，选择符合上述要求的菌落挑取保存；

6)将挑取菌落进行编号，按常规方法扩繁母种和液体菌种，并进行栽培，对出草正常，子实体形态正常、产量高的菌落制备液体菌种，培养基配方为：葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁2克，蒸馏水1000毫升，以出发菌株ycc-01为对照，常规培养后测定菌丝体中虫草素含量和液体培养基中虫草素含量；

7)经过检测，对虫草素含量高菌落进行提纯、复壮；按常规制备液体菌种，按每瓶鲜蚕蛹10个、干小麦20克、饮用水30毫升，灭菌后接种，按常规培养，待出草后选子实体形态好的，进行组织分离获取种源；

8)对选择出的产生虫草素高的组织分离种源进行遗传稳定性评价实验，最后筛选得到一株高产虫草素的新菌株，定名为：ycc Gy 1016新菌株。

2.根据权利要求1所述的辐射育种高产虫草素的北冬虫夏草种源的生产方法，其特征在于：所述遗传稳定性评价实验，指按如下步骤程序操作，至少连续栽培3个批次，来确认种源种性的稳定性；

1)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL配方按常规繁育生产用液体菌种；

2)采用750毫升的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70毫升，1.05公斤/平方厘米压力灭菌60分钟，冷却接种；

3)菌瓶先放于20℃避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以4000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85％，每天通风3次；

4)整个生产周期60天，子实体长度控制在8-12厘米，其它按常规操作，每批采用后抽样测定产量和虫草素含量。

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