CN102321127A

CN102321127A - 一种从女贞子中制备红景天苷的新方法

Info

Publication number: CN102321127A
Application number: CN201110186084A
Authority: CN
Inventors: 石任兵; 姜艳艳; 李娟�
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明公开了一种自女贞子中分离制备红景天苷的新方法。女贞子药材采用乙醇加热回流提取得到提取液，提取液减压回收至无醇味，离心，上清液加碱水解后，加酸调至中性，通过大孔吸附树脂初步分离，采用硅胶柱色谱法分离得到红景天苷粗品，粗品采用溶剂法或柱色谱法纯化得到红景天苷白色针状结晶。经高效液相色谱法测定其纯度均大于98％。

Description

一种从女贞子中制备红景天苷的新方法

技术领域

本发明属医药技术领域，并涉及在碱转化基础上，从中药材女贞子中分离高纯度红景天苷的方法。

背景技术

红景天苷，英文名salidroside，化学名“对羟基苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷”。分子式为：C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.30。

结构式：

红景天苷具有抗疲劳、抗衰老、抗氧化、抗炎镇痛的作用；对心血管、中枢神经、肝肾具有保护作用；还有抗肿瘤、防辐射、清除自由基、免疫调节作用等，是一种有广泛应用前景的药物。目前制备红景天苷的主要方法有从红景天属植物红景天中提取分离和化学合成的方法。但红景天属于高原植物，获取困难，价格昂贵；化学合成得率低，副产物多。从木犀科女贞属植物女贞子中制备高纯度红景天苷的方法，少有报道。仅见：发明专利(1)(刘东锋，张翼.一种从女贞子中提取纯化红景天苷的方法[P].中国专利，20101011 17 83.2)、(2)(石任兵，周文娟，田恒康，等.一种从女贞子中制备高纯度红景天苷的方法[P].中国专利，200810098011.2)。而女贞子中红景天苷的含量很低仅为0.02％～0.2％(李曼玲，徐丹，仝会娟，等.红景天苷的含量测定.中国实验方剂学杂志，2010，16(2)：14-16)。迄今，未见涉及通过转化使女贞子中红景天苷含量大幅度提高的基础上，再进行制备高纯度红景天苷的方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于碱转化从女贞子中制备高纯度红景天苷的方法。

本发明的技术方案为：以女贞子为原料，经粉碎后，采用一定浓度的乙醇提取，所得提取物经回收溶剂、浓缩至无醇味后，经一定量的水分散离心。离心后上清液，加碱水解后加酸中和，所得上样液，经过HPD-100大孔吸附树脂柱，采用水、一定浓度的乙醇洗脱；洗脱产物经两次硅胶柱层析，甲醇丙酮重结晶或SephadexLH-20、ODS-A等纯化，得高纯度的红景天苷。

本发明的技术方案通过下述步骤实现：

步骤1：以女贞子为原料，粉碎后，采用40-80％乙醇回流提取2-4次，提取液减压回收至无醇味，离心，取上清液；

步骤2：取步骤1中上清液，加入药材重量10-50倍量的无机碱回流水解0.5-4.5小时，水解液加HCl调pH值至中性，得上样液；

步骤3：取步骤2中上样液，通过大孔吸附树脂吸附结束后，先用水洗脱，水的用量按体积比计算为树脂体积的2-6倍，继而以10％-50％乙醇洗脱，乙醇用量按体积比计算为树脂体积的3-8倍，收集洗脱液，蒸干，真空干燥，得洗脱物；

步骤4：取步骤3中洗脱物，加50-200体积份甲醇溶解，拌入20-500重量份硅胶，挥尽溶剂，得到拌样硅胶；上样于径高比1∶3-1∶8的硅胶层析柱中，洗脱物重量与硅胶体积比为2-6mg/ml，上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为3～5个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为3～5个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1～3个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每30-80ml收集一份，TLC检识，合并含红景天苷部分，减压回收溶剂，得到红景天苷粗品；

步骤5：取步骤4中红景天苷粗品，加30-100体积份甲醇溶解，拌入20-250重量份空白硅胶拌样，挥尽溶剂，上样于径高比1∶10-1∶30的硅胶层析柱中，红景天苷粗品上样量与硅胶体积比5-15mg/ml，上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为2～4个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为2～4个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1～3个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每20-50ml收集一份，采用TLC检识，合并含红景天苷部分，减压回收溶剂，加溶剂重结晶，或残渣用水溶解，通过Sephadex LH-20或ODS柱色谱纯化，先用水洗脱2～3柱体积，再用10％甲醇洗脱2～3柱体积，收集10％甲醇洗脱物，静置，析出白色针状结晶，得到纯度大于98％的红景天苷。

所述的碱转化中涉及的碱包括NaOH、NaHCO₃、Na₂CO₃、KOH。优选为NaOH。

所述的大孔树脂包括D101、HPD-100、AB-8、NKA-9等大孔吸附树脂，优选为HPD-100型大孔树脂。

用于大孔树脂洗脱的溶液为水、以及一定浓度的乙醇。优选洗脱顺序为纯水洗脱除杂后，10％乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱部分，经浓缩，即得。

所述的柱层析硅胶为300～400目。

综上所述，本发明存在的创新点及优点如下：

(a)采用从女贞子中分离红景天苷，大大缓解了资源不足的压力；

(b)首次通过碱转化的方法，使红景天苷的转化率高达250％；

(c)所采用的原料便宜，所用溶剂可回收再利用，节省成本；

(d)分离纯化方法简单，产品得率高。

说明书附图

图1：红景天苷纯度检测HPLC色谱图。

实验例1红景天苷纯度检测方法

Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2996Photodiode Array Detector检测器，Empower Pro软件系统；SARTORIUS-BS 124S型电子分析天平(德国赛多利斯股份有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈(Fisher公司，色谱纯)，蒸馏水(屈臣氏)。

色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm，依利特)；流动相：乙腈∶水(20∶80)，1.0ml/min等度洗脱；DAD检测；检测波长：224nm；柱温：30℃。

实验例2药效试验

1.药品与试剂

受试药：红景天苷，经检测纯度为99.0％，临用前用生理盐水配置。

阳性对照药：安宫牛黄丸，北京同仁堂科技股份有限公司提供。

红四氮唑(TTC)，为淡黄色粉末，北京化学试剂公司产品，批号030227。

2.动物

SD大鼠，雄性，体重260-280g，由北京维通利华实验动物中心提供，合格证号为：SCXK(京)2009-2010

3.方法与结果

1)分组及给药

将大鼠随机分为六组，即假手术对照组、模型组、红景天苷100mg/kg、安宫牛黄丸450mg生药/kg组(相当人用量的9倍)，每组12～13只。灌胃给药，一日一次，给药三次后一小时造模，造模后再给药一次，假手术对照组、MCAT模型组给予等量的饮用水(1ml/100g体重)。

2)造模方法

大鼠麻醉后，将其仰卧固定。分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，插入一端加热成光滑球形并涂了多聚赖氨酸的尼龙线(直径为0.25mm，距球端18mm处作标记)，插入深度为18mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留约1cm，缝合皮肤，用电热毯维持大鼠的体温。2小时后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注，造模完成。假手术只结扎CCA与ECA。

3)脑梗塞范围的测定方法

模型大鼠缺血2小时，再灌注22h，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在-20℃冰箱冷冻10min，在冰盘上冠状切成6片，迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC 1.5ml，1M K₂HP0₄ 0.1ml，其余加蒸馏水至刻度)，37℃避光温孵1h，取出后置于10％甲醛液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量百分比作为脑梗塞范围。结果见表1。

表1红景天苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑保护作用

注：各组与模型组相比，*P＜0.05。

结果显示，术后24h，模型组大鼠脑组织梗塞灶可达全脑重量的17.8％，清脑宣窍滴丸180、90mg/kg组、安宫牛黄丸450mg/kg组的大鼠梗塞程度明显减轻，与模型组相比具有显著差异(P＜0.01，P＜0.05)。即红景天苷具有显著的脑保护作用。

实施例1

女贞子药材粗粉用75％乙醇10倍量体积，回流提取3次，每次1小时，提取液浓缩至无醇味，用10倍于生药量的水分散，再以4000转/分钟的速度离心30分钟，离心后弃去沉淀补足体积，即为上清液。

上清液加入加碱量为生药量：NaOH(g∶g)为10∶1的NaOH，加热回流提取2小时，转化液加HCl调至中性。即为上样液。

所得上样液稀释至0.05g/mL(相当于生药材)后，上样于(相当于生药克数)与树脂体积比为1∶2的HPD-100型大孔树脂，树脂径高比为1∶11，进行动态吸附，吸附流速为3BV/h。上样后以4BV的水洗脱，水洗脱流速为2BV/h，然后以5BV10％乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，真空干燥。

取上述样品，加50体积份甲醇溶解，拌入100重量份硅胶，挥尽溶剂，得到拌样硅胶；上样于径高比1∶5的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比3mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为4个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为4个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为2个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每50ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品1。

取红景天苷粗品1，加30体积份甲醇溶解，拌入50重量份空白硅胶拌样，挥尽溶剂，上样于径高比1∶20的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比7mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为3个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为3个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为2个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每45ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品2。

取红景天苷粗品2，用水溶解，通过Sephadex LH-20纯化，先用水洗脱3柱体积，再用10％甲醇洗脱3柱体积，收集10％甲醇洗脱物，静置，析出白色针状结晶，得到含量为99.1％的红景天苷纯品。

在整个制备过程中，红景天苷的转化率(相当于药材中)为257.50％。成功得实现了通过碱转化提高红景天苷含量的目的，同时制备工艺简单，成本低。

实施例2

女贞子药材粗粉用80％乙醇10倍量体积，回流提取2次，每次1小时，提取液浓缩至无醇味，用10倍于生药量的水分散，再以4000转/分钟的速度离心30分钟，离心后弃去沉淀补足体积，即为上清液。

上清液加入加碱量为生药量：NaOH(g∶g)为12∶1的NaOH，加热回流提取1.5小时，转化液加HCl调至中性。即为上样液。

所得上样液稀释至0.1g/mL(相当于生药材)后，上样于(相当于生药克数)与树脂体积比为1∶1.5的HPD-100型大孔树脂，树脂径高比为1∶14，进行动态吸附，吸附流速为3BV/h。上样后以3BV的水洗脱，水洗脱流速为2BV/h，然后以6BV10％乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，真空干燥。

取上述样品，加50体积份甲醇溶解，拌入100重量份硅胶，挥尽溶剂，得到拌样硅胶；上样于径高比1∶6的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比3mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为3个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为3个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每50ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品1。

取红景天苷粗品1，加30体积份甲醇溶解，拌入50重量份空白硅胶拌样，挥尽溶剂，上样于径高比1∶25的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比7mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为3个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为3个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为2个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每40ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品2。

取红景天苷粗品2，用甲醇重结晶，得到含量为99.1％的红景天苷纯品。

在整个制备过程中，红景天苷的转化率(相当于药材中)为248.60％。成功得实现了通过碱转化提高红景天苷含量的目的，同时制备工艺简单，成本低。

实施例3

女贞子药材粗粉用50％乙醇15倍量体积，回流提取3次，每次1小时，提取液浓缩至无醇味，用10倍于生药量的水分散，再以4000转/分钟的速度离心30分钟，离心后弃去沉淀补足体积，即为上清液。

上清液加入加碱量为生药量：NaOH(g∶g)为8∶1的NaOH，加热回流提取2.5小时，转化液加HCl调至中性。即为上样液。

所得上样液稀释至0.067g/mL(相当于生药材)后，上样于(相当于生药克数)与树脂体积比为1∶2.5的HPD-100型大孔树脂，树脂径高比为1∶8，进行动态吸附，吸附流速为3BV/h。上样后以4BV的水洗脱，水洗脱流速为4BV/h，然后以5BV10％乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，真空干燥。

取上述样品，加60体积份甲醇溶解，拌入120重量份硅胶，挥尽溶剂，得到拌样硅胶；上样于径高比1∶4的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比3mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为4个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为4个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每50ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品1。

取红景天苷粗品1，加50体积份甲醇溶解，拌入100重量份空白硅胶拌样，挥尽溶剂，上样于径高比1∶25的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比7mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为2个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为2个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每30ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)技术进行检测，收集含红景天苷部分。得到红景天苷粗品2。

取红景天苷粗品2，用水溶解，通过ODS柱色谱纯化，先用水洗脱2柱体积，再用10％甲醇洗脱3柱体积，收集10％甲醇洗脱物，静置，析出白色针状结晶，得到含量为99.1％的红景天苷纯品。

在整个制备过程中，红景天苷的转化率(相当于药材中)为250.60％。成功得实现了通过碱转化提高红景天苷含量的目的，同时制备工艺简单，成本低。

Claims

1.一种从女贞子中制备红景天苷的方法，其特征是通过下述步骤实现：

步骤1：以女贞子为原料，粉碎后，采用40-80％乙醇回流提取2-4次，提取液减压回收至无醇味，离心，取上清液：

步骤5：取步骤4中红景天苷粗品，加30-100体积份甲醇溶解，拌入20-250重量份空白硅胶拌样，挥尽溶剂，上样于径高比1∶10-1∶30的硅胶层析柱中，红景天苷粗品上样量与硅胶体积比5-15mg/ml，上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为2～4个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为2～4个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为1～3个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每20-50ml收集一份，采用TLC检识，合并含红景天苷部分，减压回收溶剂，加溶剂重结晶，或残渣用水溶解，通过Sephadex LH-20或ODS柱色谱纯化，先用水洗脱2～3柱体积，再用10％甲醇洗脱2～4柱体积，收集10％甲醇洗脱物，静置，析出白色针状结晶，得到纯度大于98％的红景天苷。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1中采用10倍量75％乙醇进行回流提取3次，每次1小时。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2中碱为NaOH、NaHCO3、Na₂CO3、KOH，优选为NaOH。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3中的大孔吸附树脂为D101、AB-8、NKA-9，优选为HPD-100型大孔吸附树脂。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4和步骤5中硅胶柱层析用的硅胶为300-400目。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤5中重结晶的溶剂为单一或混合溶剂，优选为甲醇和丙酮。

7.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于该方法为：

女贞子药材粗粉用75％乙醇10倍量体积，回流提取3次，每次1小时，提取液浓缩至无醇味，用10倍于生药量的水分散，再以4000转/分钟的速度离心30分钟，离心后弃去沉淀补足体积，即为上清液；

上清液加入NaOH水解2小时，加碱量为生药量的20倍，水解转化液加HCl调至中性，即为上样液；所得上样液稀释至浓0.05g原药材/mL，上样于HPD-100型大孔树脂，生药量与树脂体积比为1∶2，树脂径高比为1∶11，进行动态吸附，吸附流速为3BV/h，上样后以4BV的水洗脱，水洗脱流速为2BV/h，然后以5BV10％乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集20％乙醇洗脱液，蒸干，真空干燥，得洗脱物，加50体积份甲醇溶解，拌入100重量份硅胶，挥尽溶剂，得到拌样硅胶，上样于径高比1∶5的硅胶层析柱中，按上样量与硅胶体积比3mg/ml上样，上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为4个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为4个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为2个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每50ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱检测，合并含红景天苷部分，回收溶剂，得到红景天苷粗品；

取红景天苷粗品，加30体积份甲醇溶解，拌入50重量份空白硅胶拌样。上样于径高比1∶20的硅胶层析柱中，上样量与硅胶体积比为7mg/ml。上样后先以石油醚∶乙酸乙酯1∶1混合溶剂洗脱除去杂质，所用混合溶剂体积为3个柱体积，继而采用石油醚∶乙酸乙酯1∶7混合溶剂洗脱，洗脱体积为3个柱体积，再用乙酸乙酯洗脱，洗脱体积为2个柱体积，最后采用甲醇洗脱，洗脱体积为1个柱体积，分份收集，每45ml收集一份，洗脱流份用薄层色谱检测，收集含红景天苷部分，得到含量大于85％的红景天苷粗品；Sephadex LH-20纯化，先用水洗脱3个柱体积，再用10％甲醇洗脱3个柱体积，收集10％甲醇洗脱物，静置，析晶，得到含量为99.1％的红景天苷。