CN102643318A - 一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法。采用的技术方案是：将蛹虫草子实体粉碎，过16目筛备用；取粉碎后的原料加3倍体积的70%乙醇浸泡24小时；将浸泡后的混悬液加入回流装置中，加热回流2～4小时，过滤；滤液用正丁醇萃取2～5次；将上清液60℃减压浓缩至无醇味的浸膏；浸膏经硅胶柱洗脱，流动相为按体积比，乙酸乙酯：95%乙醇为5:3，回收洗脱液，TLC跟踪检测；将回收的洗脱液，再次减压蒸馏浓缩为接收洗脱液体积的1/5；浓缩后的洗脱液在室温下结晶。本发明可减少有机溶剂用量，减少分离步骤，提高提取率，降低毒性，可以使蛹虫草中虫草素富集，生产成本低，虫草素纯度高。

Description

一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法
技术领域
本发明属于药用真菌提取领域，具体地涉及一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法。
背景技术
虫草素（cordycepin,3′-脱氧腺苷）是蛹虫草中主要活性成分之一，是一种具有较高药用价值的核苷类物质。近几年来发现虫草素具有抗菌、消炎、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用，无论是医疗康复还是保健养生，虫草素有巨大的潜在市场和现实市场。目前虫草素纯品在国际市场上价格昂贵，约为1000美元/g。人工培育蛹虫草技术已经非常成熟，其子实体价格低廉，子实体中虫草素含量高达7‰，因此开展虫草素分离纯化工艺具有很好的商业价值。
目前，虫草素的分离方法有离子交换树脂、大孔吸附树脂、氧化铝柱层析、活性炭吸附法等。其中离子交换树脂吸附法需要用酸碱处理，后续处理比较复杂，其他提取方法提取率低，分离纯化选择性差，难以进行工业化生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种可减少有机溶剂用量，减少分离步骤，提高提取率，降低毒性的一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法。通过本发明的方法可以使蛹虫草中虫草素富集，生产成本低，虫草素纯度高。
本发明采用的技术方案是：一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法，步骤如下：
1）将蛹虫草子实体粉碎，过16目筛备用；
2）取粉碎后的原料加3倍体积的70%乙醇浸泡24小时；
3）将浸泡后的混悬液加入回流装置中，加热回流2～4小时，过滤；
4）滤液用正丁醇萃取2～5次，取上清液；
5）上清液60℃减压浓缩至无醇味的浸膏；
6）将浸膏经硅胶柱洗脱，流动相为按体积比，乙酸乙酯：95%乙醇为5:3，回收洗脱液，TLC跟踪检测；优选，硅胶柱的柱高为柱直径的10-15倍；
7）将回收的洗脱液，再次减压蒸馏浓缩为接收洗脱液体积的1/5；
8）浓缩后的洗脱液在室温下结晶。
本发明的有益效果是：（1）设备投资少。本发明不需要复杂的提取、分离纯化设备，整个提取、分离纯化过程可在简单的容器和层析柱内完成即可，成本低廉。（2）原料来源丰富，以蛹虫草子实体为原料，成本低廉。（3）分离步骤采用柱层析分离富集虫草素，分离效果较好，纯化出的虫草素纯度较高，高达98%。（4）毒性较低。硅胶柱色谱作为一种分离的方法，根据物质在硅胶上的吸附力不同，通过吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，对不同极性化合物能进行有效地分离。但是目前硅胶柱色谱中，流动相一般采用氯仿、乙酸乙酯、异丙醇和水，有机溶剂使用量增高，配比复杂，不利于流动相的回收利用，成本增加，而且氯仿为高毒物质，不利于食品安全，本发明克服以上不足采用乙酸乙酯和95%乙醇作为流动相，成本低廉，降低毒性。
附图说明
图1虫草素标准品高效液相色检测图。
图2图1得到的色谱峰的结果。
图3实施例1得到的虫草素洗脱液高效液相色检测图。
图4图3得到的色谱峰的结果。
图5实施例1得到的虫草素红外谱图。
具体实施方式
实施例1  一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法
（一）步骤如下：
1)  取2000克干燥的蛹虫草子实体用中药粉碎机粉碎，过16目筛备用；
2)  粉碎后的原料加3倍体积的70%乙醇（室温）浸泡24小时；
3)  将浸泡后的混悬液加入回流装置中，加热回流，第一次为2h，放凉四层纱布过滤，之后滤渣再次加入70%乙醇，每次1h，再回流2次，合并三次的滤液；
4)  滤液用正丁醇按1:5于分液漏斗中萃取5次，取上清液；
5)  上清液60℃减压浓缩至无醇味的浸膏；
6)  经硅胶柱洗脱，硅胶型号200-300目，柱高以柱直径的10-15倍为宜，浸膏干法上样，流动相为按体积比，乙酸乙酯: 95%乙醇为5:3，回收洗脱液，每接收一定量时以虫草素标准品为对照，TLC检测，直至洗脱液无该物质为止；
7)  将回收的洗脱液，再次减压蒸馏浓缩为接收洗脱液体积的1/5；
8)  浓缩后的洗脱液在室温下结晶，即为虫草素晶体。
（二）测定
1．高效液相色法测定虫草素含量
1）试剂和材料
甲醇（色谱纯），纯净水，虫草素标准品。
2）色谱条件： Diamonsil 反相C18柱（250×4.6mm,5μm）；waters高效液相，1525泵；2478紫外可见光检测器；流动相：甲醇:水=15:85（v/v）；流速为1ml/min；260nm紫外检测波长；进样量20μl。
3）虫草素标准溶液的配制
准确秤取虫草素标准品5mg,甲醇溶解定容至10ml，配置成500mg/ml的标准储备液。再将其稀释成10、20、30、50、70/100μg/ml虫草素标准液，分别取上述溶液20μl，按色谱条件分别进样，测定峰面积。得到回归方程为y=58011.3x-58391.8相关系数r=0.9997。图1为虫草素标准品高效液相色检测图。图2为图1得到的色谱峰的结果。
4）样品测定：
取本实施例得到的虫草素，加入甲醇稀释至100ml，过0.22μm微孔滤膜，20μl进样，高效液相色检测图如图3，色谱峰的结果如图4。通过回归方程计算虫草素含量，虫草素的含量为13.3 μg/ml。采用上述方法每千克蛹虫草子实体可获得虫草素720 mg，回收率为27.4%。从虫草素峰面积占所有峰面积的比值可以看出，虫草素的纯度达到98.08%。说明采用本发明的方法获得了高纯度的虫草素。
2．自制样品红外图谱
取本实施例得到的虫草素样品，测定红外图谱，结果见图5。红外图谱数据：3319.4、3143.1、2927.6、1684.6、1614.4、1567.9、1468.3、1421.6、1395.4、1339.4、1298.1、1201.1、1172.7、967.7、843.05、719.6 cm-1。虫草素标准红外数据是：3331.3、3141.6、2922.9、1675.0、1575.7、1478.7、1420.2、1384.8、1340.5、1299.6、1208.3、1175.5、958.8、835.2、725.5cm-1。进一步证明本发明的方法获得了虫草素。

Claims (2)

1.一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法，其特征在于步骤如下：
1）将蛹虫草子实体粉碎，过16目筛备用；
2）取粉碎后的原料加3倍体积的70%乙醇浸泡24小时；
3）将浸泡后的混悬液加入回流装置中，加热回流2～4小时，过滤；
4）滤液用正丁醇萃取2～5次，取上清液；
5）上清液60℃减压浓缩至无醇味的浸膏；
6）将浸膏经硅胶柱洗脱，流动相为按体积比，乙酸乙酯: 95%乙醇为5:3，回收洗脱液，TLC跟踪检测；
7）将回收的洗脱液，再次减压蒸馏浓缩为接收洗脱液体积的1/5；
8）浓缩后的洗脱液在室温下结晶。
2.如权利要求1所述的一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法，其特征在于第6）步骤中硅胶柱的柱高为柱直径的10-15倍。
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