CN105380994A - 马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，包括以下步骤：马钱子子实体磨成粉末状后用乙醇浸泡或回流提取，滤液蒸干用甲醇-水溶液溶解；进行一维液相色谱分离，采用C18色谱柱，A相水、B相甲醇二元液相，洗脱方式为B相25％等度洗脱10min、B相35％等度洗脱20min、B相100％等度洗脱10min，收集15.5-19.5min洗脱液，蒸干再用甲醇-水溶液溶解；二维液相色谱分离，采用C18色谱柱，A相水、B相甲醇二元液相，洗脱方式为B相32％等度洗脱30-40min，收集20-31min洗脱液，蒸干得抗肿瘤活性组分。该方法分离出强活性抗肿瘤活性组分，可用于制备抗肿瘤药物中。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品加工技术领域，具体涉及一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，以及该活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的，它是指细胞在致癌因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。2008年，WHO发布的数据显示，中国已经成为世界第二大癌症高发国，中国每年新增220万名癌症患者，约占全球癌症病人总数的20％，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成为主要的健康杀手。研究如何消灭癌症、让癌症病人能生活地更好，是医药领域中的研究重点，因此寻找高效、低毒、选择性强的有临床应用价值的理想的新型抗肿瘤药物是一项长期而艰巨的任务，从中药里寻找抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物开发的重要方向与希望所在。
马钱子为马钱科植物马钱Strychosrux-vomicaL.的成熟种子，主产于印度、泰国和我国云南等地，具有消肿散结、通络止痛之功效，擅于消瘀除积、通窍利络、畅旺血行。
肿瘤是阴毒之邪瘀结于内，马钱子为辛温大毒之品，善入经络，有攻坚蚀疮、破瘀散结、消肿止痛之功，多用于攻毒祛邪之法。千百年来，马钱子一直作为“以毒攻毒"治疗恶性肿瘤的常用药物，研究表明，马钱子对胃癌、食管癌、大肠癌效果显著。故本研究对马钱子的抗肝癌、肺癌活性成分进行一定的研究。
马钱子具有多种与抗肿瘤作用相关的活性物质，有些活性物质如番木鳖碱、马钱子碱的药理作用已研究得比较深入；而其中一些生物碱如番木鳖碱氮氧化物、依卡精、克鲁勃林、奴弗新的研究则较少。马钱子活性物质未能最大程度地得到开发与利用，所以研究具有抗肿瘤作用的新的活性物质，不断开拓现有活性物质的新的生理活性和药理作用具有重要意义，能为进一步研究和开发马钱子在医药方面的应用提供理论基础和产业化背景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有背景，提供一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法以生物活性实验指导下，马钱子抗癌活性组分分离提取为基础，经乙醇浸提后再用制备液相色谱技术活性导向分离出强活性抗肿瘤活性组分。
本发明所采用的技术方案为：
一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙醇浸泡或者回流提取，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，用甲醇体积分数为50-70％的甲醇-水二元混合溶剂溶解，得到固含量50-200mg/mL的提取液；
(2)对得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为二元混合液相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为50-200mL/针；流动相流速为100-1000mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式为B相浓度25％等度洗脱10min、B相浓度35％等度洗脱20min、B相浓度100％等度洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集15.5-19.5min洗脱液，旋转蒸发至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇体积分数为50-70％的甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至固含量为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为二元混合液相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为500-2000μL/针；流动相流速为10-30mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式为B相浓度32％等度洗脱30-40min；根据紫外吸收光谱收集20-31min洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，得本发明抗肿瘤活性组分。
所述步骤(1)中回流提取可重复进行1-3次，每次1-2h。
所述步骤(1)、(3)中甲醇-水二元混合溶剂含0.1％(质量百分比)乙酸。
所述步骤(2)、(4)中二元混合液相的A相含0.1％(质量百分比)乙酸。
所述步骤(2)中C18色谱柱具体为反相C18轴向加压色谱柱 使用时柱温为室温或25-40℃。
所述步骤(4)中C18色谱柱具体为华谱C18色谱柱使用时柱温为室温或25-40℃。
本发明进一步提供上述提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分在制备抗肺癌药物中的应用。该马钱子抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
本发明还进一步提供上述提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物中的应用。该马钱子抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
本发明选用二维高效液相色谱技术从天然产物马钱子子实体中提取抗肿瘤活性组分，通过合理选择色谱柱、溶解液、流动相等，结合对流速、洗脱方式、收集区段等工艺条件的摸索，使得整个分离纯化方法切实可行，操作简便，制备周期短，仪器自动化程度高，试剂耗费量小，常温常压下就可进行，制备量大，重复性高，得到的物质组分批次之间一致性高，可操作性好，可控度高，可直接运用于工业生产。
本发明得到的抗肿瘤活性组分性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该化合物对肺癌A549细胞和肝癌Hep-g2细胞具有强抑制作用，即体外实验抗肿瘤作用明显，具有良好的抗癌药物开发潜力，可用于研发制备抗肿瘤药物中，为抗癌天然药物的开发提供了新的原料来源和理论依据。
附图说明
图1所示的是本发明马钱子抗肿瘤活性组分提取方法的一维色谱分离图；
图2所示的是本发明马钱子抗肿瘤活性组分提取方法的二维色谱分离图；
图3所示的是本发明得到的马钱子抗肿瘤活性组分抑制人肺癌A549细胞生长的细胞实时检测图，其中M-Et-4-2为目的抗肿瘤活性组分，HLXA为环磷酰胺；
图4所示的是本发明得到的马钱子抗肿瘤活性组分抑制人肝癌Hep-G2细胞生长的的细胞实时检测图，其中M-Et-4-2为目的抗肿瘤活性组分，HLXA为环磷酰胺。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
1、原料、材料：
原料马钱子子实体采摘自河北并经过鉴定；A549细胞、Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。
2、试剂：
色谱级甲醇、乙酸、乙醇购自天津市康科德科技有限公司；环磷酰胺购自天津金世制药有限公司；DMSO购自Sigma公司；F-12K培养基购自LifeTechnologiesCorporation；MEM培养基购自LifeTechnologiesCorporation。
3、仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；反相C18轴向加压色谱柱 购自江苏汉邦科技有限公司；华谱C18色谱柱购自上海华谱技术服务中心；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；细胞实时监测仪购自艾森生物(杭州)有限公司；细胞培养箱购自立德泰勀(上海)科学仪器有限公司。
实施例1：抗肿瘤活性组分的提取
以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙醇回流提取1.5h，过滤，取沉淀重复提取2次，合并所得滤液，旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取10g，溶于100mL55％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为100mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用InnovelC18150×250mm，10μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(含0.1％乙酸)、B相是甲醇，洗脱方式：B相浓度25％等度10min、B相浓度35％等度20min、B相浓度100％等度10min。采用紫外检测器，选择210nm吸收波长，制备温度为室温，进样量为150mL/针，流动相流速为600mL/min，收集15.5-19.5分钟(图1中4号峰)的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备粗品。用50％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液溶解一维制备粗品，浓度为50mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为华谱C1820×250mm，5μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(0.1％乙酸)、B相是甲醇，采用32％B相等度洗脱35分钟。采用紫外检测器，选择210nm吸收波长，制备温度为室温，进样量为2000μL/针，流动相流速为16mL/min，收集20-31分钟(图2中M-Et-4-2峰)的馏分，旋转蒸发至干，得到目的组分。
对得到的组分进行进行NMR氢谱、NMR碳谱、质谱等鉴定，结果显示M-Et-4-2组分主要含有吲哚生物碱及其他未知物。
实施例2：抗肿瘤活性组分的提取
以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙醇回流提取2h，过滤，取沉淀重复提取2次，合并所得滤液，旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取15g，溶于100mL50％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为150mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用InnovelC18150×250m，10μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(0.1％乙酸)、B相是甲醇，洗脱方式：B相浓度25％等度10min、B相浓度35％等度20min、B相浓度100％等度10min。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为180mL/针，流动相流速为600mL/min，收集15.5-19.5分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备番木鳖碱粗品。用55％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液溶解番木鳖碱粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为华谱C1820×250mm，5μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(0.1％乙酸)、B相是甲醇，采用32％B相等度35分钟洗脱。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为1000μL/针，流动相流速为16mL/min，收集20-31分钟的馏分，旋转蒸发至干，得到目的M-Et-4-2组分。
对组分进行进行NMR氢谱、NMR碳谱、质谱等鉴定，结果显示M-Et-4-2组分主要含有吲哚生物碱及其他未知物。
实施例3：抗肿瘤活性组分的提取
以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙醇浸泡2h，过滤，取沉淀重复2次，合并所得滤液，旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取5g，溶于100mL60％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为50mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用InnovelC18150×250mm，10μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(0.1％乙酸)、B相是甲醇，洗脱方式：B相浓度25％等度10min、B相浓度35％等度20min、B相浓度100％等度10min。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为100mL/针，流动相流速为600mL/min，收集15.5-19.5分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备番木鳖碱粗品。用60％的甲醇-水(0.1％乙酸)溶液溶解番木鳖碱粗品，浓度为100mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为华谱C1820×250mm，5μm，流动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水(0.1％乙酸)、B相是甲醇，采用32％B相等度35分钟洗脱。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为16mL/min，收集20-31分钟的馏分，旋转蒸发至干，得到目的M-Et-4-2组分。
对组分进行进行NMR氢谱、NMR碳谱、质谱等鉴定，结果显示M-Et-4-2组分主要含有吲哚生物碱及其他未知物。
实施例4：抑制人肺癌A549细胞生长试验
空白对照孔：不加药物；
阳性对照孔：加环磷酰胺；
实验孔：加本发明抗肿瘤活性组分M-Et-4-2。
细胞培养：
在5％C02，37℃，饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5％C02，37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2万，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物至终浓度为所需药物浓度，用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1％DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
实验结果如图3所示，结果表明：本发明提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分M-Et-4-2在25μg/ml时能达到近100％抑制人肺癌细胞A549的生长。
实施例5：抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验
空白对照孔：不加药物；
阳性对照孔：加环磷酰胺；
实验孔：加本发明抗肿瘤活性组分M-Et-4-2。
细胞培养：
在5％C02，37℃，饱和湿度下，用MEM(10％FBS、1％PS)培养基人肺癌Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。
细胞生长情况监测：
将细胞实时监测仪放入5％C02，37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4万，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物至终浓度为所需要药物浓度，用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1％DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
实验结果如图4所示，结果表明：本发明提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分M-Et-4-2在25μg/ml时能达到近100％抑制人肝癌细胞Hep-G2生长。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取和抗肿瘤试验的普通市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (7)
1.一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙醇浸泡或者回流提取，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，用甲醇体积分数为50-70％的甲醇-水二元混合溶剂溶解，得到固含量50-200mg/mL的提取液；
(2)对得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为二元混合液相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为50-200mL/针；流动相流速为100-1000mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式为B相浓度25％等度洗脱10min、B相浓度35％等度洗脱20min、B相浓度100％等度洗脱10min；根据紫外吸收光谱收集15.5-19.5min洗脱液，旋转蒸发至干，得到一维液相组分；
(3)用甲醇体积分数为50-70％的甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至固含量为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为二元混合液相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为500-2000μL/针；流动相流速为10-30mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式为B相浓度32％等度洗脱30-40min；根据紫外吸收光谱收集20-31min洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，得本发明抗肿瘤活性组分。
2.根据权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)、(3)中甲醇-水二元混合溶剂含0.1％乙酸。
3.根据权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)、(4)中二元混合液相的A相含0.1％乙酸。
4.根据权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中C18色谱柱具体为反相C18轴向加压色谱柱，使用时柱温为室温或25-40℃。
5.根据权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中C18色谱柱具体为华谱C18色谱柱，使用时柱温为室温或25-40℃。
6.权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肺癌药物中的应用。
7.权利要求1所述的马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160309 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |