CN108709949A - 一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法 - Google Patents

一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种发酵虫草菌粉Cs‑4中药饮片的检测方法，具体为采用高效液相色谱法同时检测饮片内容物中的胞苷、鸟苷和腺苷总含量。检测步骤包括：制备供试品溶液、对照品溶液，然后分别注入液相色谱仪进行检测。供试品溶液的制备采用的是加入木瓜蛋白酶和水，静置、超声处理，过滤后续滤液再过微孔滤膜即得。色谱条件包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为水‑甲醇或者0.03‑0.05％SDS水溶液‑甲醇，梯度洗脱。本发明方法供试品中核苷类物质的提取率高，分析得到的各组分峰形好，分离度好。本法操作简单，精密度高、回收率高，稳定性和重复性好。

Description

一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法。
背景技术
发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片是由发酵虫草菌粉(Cs-4)填充而得，具有补肾保肺，秘精益气功能。用于慢性支气管炎，高血脂症，阳痿、遗精、早泄、性欲减退、妇女月经不调、腰酸腹痛、白带清稀等性功能低下症，腰膝酸软、畏寒肢冷、头晕眼花、耳鸣等老年虚症及晚期血吸血病肝硬化。
甘露醇、核苷类、麦角甾醇、虫草多糖、氨基酸等被认为是发酵虫草菌粉的活性成分，因此，收载入中国药典的金水宝片、金水宝胶囊和百令胶囊，以及收载入卫生部药品标准的至灵胶囊、宁心宝胶囊和心肝宝胶囊，均以腺苷或腺苷和甘露醇为含量测定的指标。但是，药典和药品标准中的含量测定指标并不能代表虫草菌粉中的核苷总含量。
雷宁等人研究了采用RP-HPLC测定天然虫草与人工虫草中核苷类成分的含量，其测定的核苷类是指腺嘌呤、腺苷和虫草素，流动相使用的是乙腈和水。虫草属核苷类成分的分析方法除HPLC外，还有毛细管电泳法和薄层色谱扫描法，但是HPLC法用于核苷类成分定量分析具备灵敏度高、分离速度快和分离效率高的特点。
现有的核苷类测定方法，大多使用乙腈-水、水-甲醇-甲酸、磷酸二氢钾-甲醇为流动相；供试品溶液的制备是使用乙醇提取或者水煮的方法提取，总体来说，存在工艺复杂，灵敏度不够的问题。单一的超声波提取制备供试品溶液会出现浑浊现象，稀释后进样会导致色谱柱堵塞。专门针对发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片中的胞苷、鸟苷和腺苷总含量的检测方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法，尤其是同时测定胞苷、鸟苷和腺苷总含量的方法，为发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的质量控制提供依据。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法，Cs-4中药饮片的内容物为发酵虫草菌粉，所述检测方法为高效液相色谱法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物，加入木瓜蛋白酶，加水并定容，静置，超声处理，过滤，取续滤液过微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定胞苷、鸟苷及腺苷对照品，加水溶解并定容，得对照品溶液；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算胞苷(C9H13N3O5)、鸟苷(C10H13N5O5)和腺苷(C10H13N5O4)的总量；其中，色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中的A相为水或十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱。
样品中加入木瓜蛋白酶和水后静置，部分核苷类物质溶解到水里，再进行超声后，核苷类物质的提取率明显提高，检测得到的胞苷、鸟苷和腺苷总含量更接近发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的实际含量，能更准确地反应产品质量。
优选地，S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.2-0.3g，以饮片内容物重量的0.5-1.0％加入木瓜蛋白酶，加水并定容至50mL，静置，超声处理20-40min，过滤，取续滤液过微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；S2.对照品溶液的制备：制得的对照品溶液中每1mL各含胞苷、鸟苷和腺苷10-50ug；S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液5-20μL，色谱条件包括：色谱柱长15-25cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm，柱温15-30℃，检测波长为260nm。
优选地，步骤S3中流动相的流速为0.5-1.0mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000或5000。
优选地，步骤S1中静置时间为20-50min。
优选地，步骤S1中所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
优选地，步骤S3中梯度洗脱的流动相梯度比例为：0～10minA相与B相的比例为100:0，10～20minA相与B相的比例为100→85：0→15，20～30minA相与B相的比例为85→40：15→60，30～45minA相与B相的比例为40:60。
优选地，步骤S1中超声处理的温度为30-45℃。
优选地，以重量体积g/mL计，步骤S3中的十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为0.03-0.05％。以十二烷基硫酸钠为流动相，检测结果更准确，分离度更好，峰形对称，保留时间更短。
优选地，本发明的检测方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.25g，加入木瓜蛋白酶2.5mg，加水并定容至50mL，静置30min，30℃温度下超声处理20min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定腺苷、鸟苷及胞苷对照品各12mg，加水50mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含腺苷、鸟苷和胞苷各24ug；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL及供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm，柱温25℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为0.05％十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，流速为1.0mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于5000。
优选地，本发明的检测方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.2g，加入木瓜蛋白酶1mg，加水并定容至50mL，静置20min，45℃温度下超声处理30min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定腺苷、鸟苷及胞苷对照品各10mg，加水100mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含腺苷、鸟苷和胞苷各10ug；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL及供试品溶液15μL，分别注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱长15cm，内径为2mm，粒径为2μm，柱温15℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水，B相为甲醇，流速为0.5mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
(1)供试品溶液制备过程中，采用木瓜蛋白酶水溶液和超声相结合的方法处理饮片的内容物，大大提高了核苷类物质的提取率，含量检测结果更准确，能有效反映发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片中的胞苷、鸟苷和腺苷含量，利于质量控制。
(2)以水-甲醇或者十二烷基硫酸钠水溶液-甲醇为流动相，梯度洗脱，得到的各组分峰形好，分离度好，出峰时间合适。
(3)本发明方法能同时测定Cs-4中药饮片中的胞苷、鸟苷和腺苷的含量，该方法操作简单，精密度高，回收率高，稳定性和重复性好。
附图说明：
图1a-1c为实施例1得到的色谱图；
图2为实施例2得到的色谱图；
图3为实施例3得到的色谱图；
图4a-4c为实施例4得到的色谱图；
图5为实施例5得到的色谱图；
其中，图1a、4a为溶剂空白的液相色谱图、图1b、4b为对照品的液相色谱图、图1c、4c为供试品的液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法，采用高效液相分析方法同时检测饮片中的胞苷、鸟苷和腺苷含量。
首先，对样品，即发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的内容物中核苷类物质的提取条件进行筛选：(1)提取方法的选择：在相同条件下，比较了回流提取法、超声提取法和加木瓜蛋白酶后超声提取，发现加木瓜蛋白酶后超声提取的效率最高，故选择此法。此外，研究还发现，超声之前先静置20-50min能提高提取率。(2)提取溶剂的选择：考察了乙醇、甲醇和水作为提取溶剂时的提取效果，结果表明，各溶剂下的提取效率相近，故选择水为提取溶剂。(3)超声提取温度的选择：分别在20℃、30℃、40℃、45℃、50℃条件下进行超声处理，结果表明，30℃以下的提取率低；而50℃时，超声结束后过滤得到的滤液很浑浊，故选择30-45℃条件下进行超声处理。
在考察各种因素后，确定了供试品溶液的制备方法：精密称定饮片内容物0.2-0.3g，以饮片内容物重量的0.5-1.0％加入木瓜蛋白酶，加水并定容至50mL，静置20-50min，30-45℃温度下超声处理20-40min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称定胞苷、鸟苷及腺苷对照品，加水溶解并定容，得每1mL各含胞苷、鸟苷和腺苷10-50ug的混合对照品溶液。
检测波长的选择：实验以纯化水为溶剂，以胞苷、鸟苷和腺苷3个对照品分别配置适当浓度，进行紫外扫描，结果3个对照品的最大吸收都在250nm～300nm之间，综合考虑选择波长260nm作为实验波长。
测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算胞苷(C9H13N3O5)、鸟苷(C10H13N5O5)和腺苷(C10H13N5O4)的总量。其中，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长15-25cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm，柱温15-30℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水或浓度为0.03-0.05％的十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱，流速为0.5-1.0mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000或5000。
其中，续滤液是指：先被过滤下来的滤液称为初滤液，此时的滤液纯净度不够，弃去，把初滤液倒掉之后继续采集到的滤液，就是续滤液。
“精密称定”是指，称取重量应准确至所取重量的千分之一。比如，精密称定0.5g，有效范围为0.4501-0.5499g。本发明涉及的精密称定也是指在有效范围内称定的量。
本发明的检测方法对产品的质量控制更为有效，准确度、灵敏度、稳定性均较高。本发明的方法既可以用于发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的质量控制，又可以用于以发酵虫草菌粉Cs-4为原料的其他制剂，如片剂，颗粒剂、蜜丸、口服液等剂型的质量控制。
下面以具体的实施例来说明本检测方法。需说明的是，本发明涉及的试剂材料和设备均为市售。采用的液相色谱型号为岛津高效液相色谱仪LC20A。
实施例1
色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长15cm，内径为2mm，粒径为2μm，柱温15℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水，B相为甲醇，流速为0.5mL/min，流动相梯度洗脱比例见表1，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000。
表1.流动相梯度洗脱比例
制备对照品溶液：精密称定胞苷、鸟苷及腺苷对照品各10mg，加水100mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含胞苷、鸟苷和腺苷各10ug。
线性关系考察：按照上述色谱条件，依次以2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl进样对照品溶液，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进样量X(μg)为横坐标，进行回归分析。线性考察结果见表2-4，胞苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-416.98，r＝1(或R2＝1)；鸟苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-78.695，r＝1；腺苷的线性回归方程为y＝3.0×106x+1176.1，r＝1；结果表明各组分的线性关系良好。
表2.胞苷线性试验结果
表3.鸟苷线性试验结果
表4.腺苷线性试验结果
制备供试品溶液：精密称定饮片内容物0.2g，加入木瓜蛋白酶1mg，加水并定容至50mL，静置20min，45℃温度下超声处理30min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
分别精密吸取上述对照品溶液10μL及供试品溶液15μL，分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析测定，得到的色谱图见附图1。附图1中，a图为溶剂空白的液相色谱图、图b为对照品的液相色谱图、图c为供试品的液相色谱图。供试品中胞苷、鸟苷和腺苷的保留时间分别为33.860min，59.712min，74.968min，峰形好，分离度好。
本实施例使用的样品为本公司生产的发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片，样品包装规格为3g/袋*100袋/盒，生产批次为16110514，检测结果见表5。
表5.检测结果
实施例2
色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长25cm，内径为8mm，粒径为10μm，柱温30℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水，B相为甲醇，流速为1.0mL/min，流动相梯度洗脱比例见表1，理论塔板数按腺苷峰计算不低于5000。
制备对照品溶液：精密称定胞苷、鸟苷和腺苷对照品各25mg，加水50mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含胞苷、鸟苷和腺苷各50ug。
线性关系考察：按照上述色谱条件，依次以2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl进样对照品溶液，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进样量X(μg)为横坐标，进行回归分析。胞苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-1035.74，r＝0.9997；鸟苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-895.91，r＝1；腺苷的线性回归方程为y＝3.0×105x-356412，r＝0.9998。结果表明各组分的性关系良好。
制备供试品溶液：精密称定饮片内容物0.3g，加入木瓜蛋白酶2.4mg，加水并定容至50mL，静置50min，30℃温度下超声处理20min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
分别精密吸取上述对照品溶液5μL及供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析测定，得到的色谱图见附图2。胞苷、鸟苷和腺苷的保留时间分别为16.715min，29.694min和37.366min。
本实施例使用的样品为本公司生产的发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片，样品包装规格为3g/袋*100袋/盒，生产批次为16110515，检测结果见表6。
表6.检测结果
实施例3
色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm，柱温25℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水，B相为甲醇，流速为1.0mL/min，流动相梯度洗脱比例见表1，理论塔板数按腺苷峰计算不低于5000。
制备对照品溶液：精密称定胞苷、鸟苷和腺苷对照品各12mg，加水50mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含胞苷、鸟苷和腺苷各24ug。
线性关系考察：按照上述色谱条件，依次以2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl进样对照品溶液，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进样量X(μg)为横坐标，进行回归分析。胞苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-931.46，r＝1；鸟苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-402.31，r＝0.9998；腺苷的线性回归方程为y＝3.2×105x-243716，r＝0.9997。结果表明各组分的线性关系良好。
制备供试品溶液：精密称定饮片内容物0.25g，加入木瓜蛋白酶2.5mg，加水并定容至50mL，静置30min，30℃温度下超声处理40min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
分别精密吸取上述对照品溶液10μL及供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析测定，得到的色谱图见附图3。胞苷、鸟苷和腺苷的保留时间分别为17.855min，30.427min和37.836min。
本实施例使用的样品为本公司生产的发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片，样品包装规格为3g/袋*100袋/盒，生产批次为16110516，检测结果见表7。
表7.检测结果
实施例4
色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm，柱温25℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为0.05％十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，流速为1.0mL/min，流动相梯度洗脱比例见表1，理论塔板数按腺苷峰计算不低于5000。
制备对照品溶液：精密称定胞苷、鸟苷和腺苷对照品各12mg，加水50mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含胞苷、鸟苷和腺苷各24ug。
线性关系考察：按照上述色谱条件，依次以2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl进样对照品溶液，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进样量X(μg)为横坐标，进行回归分析。线性考察结果见表8-10，胞苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-858.98，r＝1(或R2＝1)；鸟苷的线性回归方程为y＝2.0×106x-395.18，r＝1；腺苷的线性回归方程为y＝371628x-224496，r＝1；结果表明各组分的线性关系良好。
表8.胞苷线性试验结果
表9.鸟苷线性试验结果
表10.腺苷线性试验结果
制备供试品溶液：精密称定饮片内容物0.25g，加入木瓜蛋白酶2.5mg，加水并定容至50mL，静置30min，30℃温度下超声处理20min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
分别精密吸取上述对照品溶液10μL及供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析测定，得到的色谱图见附图4。附图4中，a图为溶剂空白的液相色谱图、图b为对照品的液相色谱图、图c为供试品的液相色谱图。供试品中胞苷、鸟苷和腺苷的保留时间分别为14.447min，28.092min和36.030min；分离度好，杂峰少，峰形对称。
本实施例使用的样品为本公司生产的发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片，样品包装规格为3g/袋*100袋/盒，生产批次为16110516，检测结果见表11。
表11.检测结果
实施例5
本实施例与实施例4的区别仅在于检测条件中的流动相中的A相为0.03％十二烷基硫酸钠水溶液，按照与实施例4相同的方法进行检测同一批样品，得到的色谱图见附图5，胞苷、鸟苷和腺苷的保留时间分别为14.881min，27.382min和35.757min。检测结果见表12，从检测结果数据可以看到，0.03％十二烷基硫酸钠水溶液作为A相流动相同样适用。
表12.检测结果
对比例1(供试品制备过程采用简单的超声提取法)
本对比例与实施例1的区别仅在于：供试品的制备方法为精密称定饮片内容物0.2g，加水定容至50mL，超声处理30min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液。
其余同实施例1，同一批样品，检测得到的胞苷、鸟苷和腺苷总含量为0.356％，远低于实施例1，说明供试品制备过程中，核苷提取率低。
实施例6
精密度实验
在实施例3的色谱条件下，以实施例3制备的供试品溶液进样6次(进样量为20μL)，按峰面积分别计算胞苷、鸟苷和腺苷RSD％，分别为0.05％、0.05％、0.05％，均小于3％，说明精密度良好。精密度测试得到的数据结果见表13。
胞苷峰面积 鸟苷峰面积 腺苷峰面积
1 719826 599688 866850
2 719276 593024 867718
3 719576 593623 867662
4 719861 594291 867529
5 720100 593668 867670
6 720082 592658 867996
RSD％ 0.05％ 0.05％ 0.05％
表13.精密度实验结果
实施例7
稳定性实验
按照实施例3的方法制备1份供试品溶液，在实施例3的色谱条件下，分别按0h、2h、4h、8h、16h、24h六个时间点进样(进样量20μL)，测定，按峰面积分别计算胞苷、鸟苷和腺苷RSD％，分别为1.7％、1.9％、2.0％。结果表明供试品溶液在24小时内，胞苷、鸟苷、腺苷峰面积RSD％均小于3％，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。稳定性实验的测定结果见表14。
表14.稳定性实验结果
实施例8重复性实验
按实施例3供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，在实施例3的色谱条件下，每份进样两次，进样量为20μL，计算样品的含量及含量的RSD％，胞苷、鸟苷、腺苷含量RSD％分别为0.74％、0.71％、1.2％，均小于3％，说明重复性良好。重复性实验的测定结果见表15-17。
表15.胞苷重复性实试验结果
表16.鸟苷重复性实试验结果
表17.腺苷重复性实试验结果
实施例9
回收率实验
精密称取已知含量的同一批号样品(供试品)6份，每份0.25g，分别加入相当于样品含量100％对照品，按实施例3中供试品的制备方法处理，按实施例3的色谱条件进样20μl，测定，计算各成分的回收率。结果见下表18-20。结果表明，回收率均在92％-105％之间，且RSD％≤3％，表明回收率良好，测定方法适合本品的含量测定。
表18.胞苷回收率试验结果
表19.鸟苷回收率试验结果
表20.腺苷回收率试验结果
实施例10
实施例4检测方法的验证(精密度、重复性和回收率)
在实施例4的色谱条件下，以实施例4制备的供试品溶液进样6次(进样量为20μL)，按峰面积分别计算胞苷、鸟苷和腺苷RSD％，分别为0.03％、0.03％、0.03％，均小于3％，说明精密度良好。
按实施例4供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，在实施例4的色谱条件下，每份进样两次，进样量为20μL，计算样品的含量及含量的RSD％，胞苷、鸟苷、腺苷含量RSD％分别为0.70％、0.68％、1.1％，均小于3％，说明重复性良好。
精密称取已知含量的同一批号样品(供试品)6份，每份0.25g，分别加入相当于样品含量100％对照品，按实施例4中供试品的制备方法处理，按实施例4的色谱条件进样20μl，测定，计算各成分的回收率。结果表明，回收率均在92％-105％之间，且RSD％≤3％，表明回收率良好，测定方法适合本品的含量测定。
从以上检测方法和结果可以看到，本发明建立的发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法精密度高、重复性好，回收率高，供试品的稳定性好，而且操作简单，非常适合用于该类产品的质量控制。不同批次发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片中的胞苷、鸟苷和腺苷总含量稳定且高，很适合作为质量控制的指标。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种发酵虫草菌粉Cs-4中药饮片的检测方法，Cs-4中药饮片的内容物为发酵虫草菌粉，其特征在于，所述检测方法为高效液相色谱法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物，加入木瓜蛋白酶，加水并定容，静置，超声处理，过滤，取续滤液过微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定胞苷、鸟苷及腺苷对照品，加水溶解并定容，得对照品溶液；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算胞苷C9H13N3O5、鸟苷C10H13N5O5和腺苷C10H13N5O4的总量；其中，色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中的A相为水或十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.2-0.3g，以饮片内容物重量的0.5-1.0％加入木瓜蛋白酶，加水并定容至50mL，静置，超声处理20-40min，过滤，取续滤液过微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：制得的对照品溶液中每1mL各含胞苷、鸟苷和腺苷10-50ug；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液5-20μL，色谱条件包括：色谱柱长15-25cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm，柱温15-30℃，检测波长为260nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中流动相的流速为0.5-1.0mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000或5000。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中静置时间为20-50min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中梯度洗脱的流动相梯度比例为：0～10minA相与B相的比例为100:0，10～20minA相与B相的比例为100→85：0→15，20～30minA相与B相的比例为85→40：15→60，30～45minA相与B相的比例为40:60。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中超声处理的温度为30-45℃。
8.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，以重量体积g/mL计，步骤S3中的十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为0.03-0.05％。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.25g，加入木瓜蛋白酶2.5mg，加水并定容至50mL，静置30min，30℃温度下超声处理20min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定腺苷、鸟苷及胞苷对照品各12mg，加水50mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含腺苷、鸟苷和胞苷各24ug；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL及供试品溶液20μL，分别注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm，柱温25℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为0.05％十二烷基硫酸钠水溶液，B相为甲醇，流速为1.0mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于5000。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，
S1.供试品溶液的制备：精密称定饮片内容物0.2g，加入木瓜蛋白酶1mg，加水并定容至50mL，静置20min，45℃温度下超声处理30min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，经微孔滤膜过滤后的滤液作为供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：精密称定腺苷、鸟苷及胞苷对照品各10mg，加水100mL溶解制成储备液，分别取5mL储备液至50mL容量瓶中，加水定容，即得每1mL对照品溶液中含腺苷、鸟苷和胞苷各10ug；
S3.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL及供试品溶液15μL，分别注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱长15cm，内径为2mm，粒径为2μm，柱温15℃，检测波长为260nm，流动相中的A相为水，B相为甲醇，流速为0.5mL/min，理论塔板数按腺苷峰计算不低于3000。
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