CN101918034A - 用于诊断和治疗癌症的taz/wwtr1 - Google Patents

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Abstract

我们提供了用于治疗、预防或减轻癌症的抗TAZ剂。我们进一步提供了用于检测个体中的乳腺癌或个体对乳腺癌的易感性的试剂盒，其包含用于检测个体或自他或她采集的样品中的TAZ表达的手段，以及检测癌细胞的方法，该方法包括检测所述细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。

Description

用于诊断和治疗癌症的TAZ/WWTR1
发明领域
本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医学领域。具体地，它涉及疾病(特别是乳腺癌)的治疗和诊断，以及用于此类用途的组合物。
发明背景
TAZ(又称为WWTR1)是具有PDZ结合基序的14-3-3结合蛋白。已知TAZ/WWTR1调控间充质干细胞分化。
TAZ/WWTR1是首先由Kanai等(2000)克隆的。Kanai显示了TAZ RNA在人肾中进行最高度的表达，接着是心脏、胎盘和肺。在除胸腺和外周血白细胞外的所有测试组织中检测出表达。对小鼠组织的Northern印迹分析显示了转录物在肾、肺、肝、和心脏中中以最高水平表达，而且睾丸中也有。Western印迹分析揭示了TAZ在数种上皮和成纤维细胞细胞系中的表达，但不在Jurkat T细胞中表达。
间充质干细胞是能分化成数种独特谱系的多能细胞类型。两种关键转录因子，即RUNX2(OMIM参照600211)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG；OMIM参照601487)分别驱动间充质干细胞分化成成骨细胞或脂肪细胞。Hong等(2005)发现了TAZ/WWTR1在抑制PPARG依赖性基因转录的同时共激活RUNX2依赖性基因转录。
通过在模式细胞系即小鼠胚胎成纤维细胞和培养的原代间充质干细胞中及在体内在斑马鱼中调控Taz表达，Hong等(2005)观察到成骨性对生脂性潜能的改变。Hong等(2005)推断TAZ发挥调控间充质干细胞分化的分子变阻器的功能。
Murakami(2005)显示了，TAZ充当有力的TBX5共激活物，其在物理上与TBX5和组蛋白乙酰转移酶(HAT)蛋白联合，而且介导TBX5依赖性基因激活。Murakami(2005)提示，TAZ在心脏和肢发育过程中在控制TBX5依赖性基因的控制中发挥重要的作用。
Hossain(2007)显示了，WWTR1对于肾纤毛的完整性是至关重要的，而且它在小鼠中的缺乏导致肾囊肿的形成。Hossain(2007)推断Wwtr1可能代表人类多囊性肾病的候选基因。
在西方世界和亚洲的发达国家，乳腺癌是女性中癌症相关死亡的第二位主要原因(Polyak，2001)。乳腺癌位于新加坡女性癌症目录的头名，其中每年诊断700-800例新病例(Singapore Cancer Registry Report，2000)。在美国，每年180,000名女性被诊断为乳腺癌的新病例(Polyak，2001)。尽管有更好的诊断和例行的筛选，但1/4左右的病例仍会死于她们的疾病。
因而，需要改良的乳腺癌检测和治疗。
发明概述
依照本发明的第一方面，我们提供了供治疗、预防或减轻癌症用的抗TAZ剂。
所述抗TAZ剂可以能够下调以GenBank登录号NP_056287所显示的TAZ序列或与该序列具有至少90％序列同一性的序列的表达、量或活性的任意组合。
所述癌症可以包括乳腺癌。所述癌症可以包括侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。所述抗TAZ剂可以通过RNA干扰(诸如通过包含小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA))来下调TAZ。
所述抗TAZ剂可以包含shRNA 1(有义寡核苷酸序列5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、shRNA 650(有义寡核苷酸序列5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或shRNA 652(有义寡核苷酸序列5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。
所述抗TAZ剂可以包括抗TAZ抗体，诸如选自下组：针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体、家兔抗TAZ抗体(产品目录编号2149S，CellSignaling Technology，Danvers，MA，USA)、家兔多克隆抗TAZ抗体(产品目录编号NB110-58359SS，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、小鼠单克隆抗TAZ[1B10](产品目录编号H00006901-M12，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、家兔抗人TAZ多克隆抗体(产品目录编号LS-B94，LifeSpan Biosciences，Inc.，Seattle，WA，USA)或p-TAZ(Ser 89)-R(产品目录编号sc-17610-R，SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。
依照本发明的第二方面，提供了包含shRNA 650(有义寡核苷酸序列5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)、shRNA 652(有义寡核苷酸序列5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)、5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’、5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’、或其互补物的核酸，或能够与任何此类序列特异性杂交的核酸。
依照本发明的第三方面，我们提供了一种针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体，任选地，其与包含YAP序列(GenBank登录号：NP_006097)或与该序列具有至少90％序列同一性的序列诸如GST-YAP组合。
作为本发明的第四方面，提供了一种MCF10A-TAZ、MCF7-KD-1、MCF7-KD-650、MCF7-KD-652或Hs578T-KD-652细胞或细胞系，例如作为癌症诸如侵入性乳腺癌的模型使用。
依照本发明的第五方面，我们提供了一种用于检测个体中的乳腺癌或个体对乳腺癌的易感性的试剂盒，其包含用于检测所述个体或自他或她采集的样品中的TAZ表达的手段。
所述用于检测的手段可以选自下组：TAZ多核苷酸或其片段；与TAZ核酸或其片段互补的核苷酸序列；TAZ多肽或其片段，或者抗TAZ抗体，例如包括针对TAZ氨基酸160-229的抗体，和任选地，使用指令。所述试剂盒可以进一步包含依照本发明第一方面的抗TAZ剂。所述试剂盒可以进一步包含用于治疗、预防或减轻乳腺癌的治疗药物，诸如包含他莫昔芬(Tamoxifen)或赫赛汀(Herceptin)。
在第六方面，本发明提供了一种检测癌细胞的方法，该方法包括检测所述细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。可以比较所述TAZ表达与已知为非癌性的对照细胞中TAZ的表达、量或活性。
所述方法可以包括检测所述细胞中TAZ表达、量或活性的上调。所述方法可以包括检测TAZ核酸，诸如依靠包含如下核酸的至少一部分的探针，所述核酸具有以GenBank登录号NM_015472显示的序列或与此序列具有至少90％序列同一性的序列。所述方法可以包括检测TAZ多肽。可以依靠上文所列的抗TAZ抗体来检测TAZ多肽。
所述方法可以包括检测一种或多种选自下组的蛋白质的表达：IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1、FBN2AXL、ITGB2、CRIM1和Alcam。
所述方法可以进一步包括组织学分级，例如使用Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(Nottingham分级系统(NGS))来进行。
一种测定细胞的增殖状态或者测定细胞会变为侵入性或攻击性的可能性的方法，该方法包括检测所述细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
在本发明的第七方面，提供了一种预测患有癌症的个体的存活率的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达的调控。
依照本发明的第八方面，我们提供了一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达的调控，基于所述癌症的攻击性来选择合适的疗法。
依照本发明的第九方面，我们提供了一种测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性的方法，该方法包括比较所述疗法与通过如上文所列的方法确定的疗法。
依照本发明的第十方面，提供了一种操作癌细胞的方法，该方法包括调控所述细胞中TAZ的表达、量或活性。
所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。由于所述操作，所述癌细胞可以变为非癌性的或者所述侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。所述方法可以包括下调所述细胞中的TAZ表达、量或活性。所述方法可以包括将所述细胞暴露于能够特异性结合TAZ的siRNA或shRNA。所述shRNA可以包括上文所列的shRNA。所述方法可以包括将所述细胞暴露于抗TAZ抗体。
作为本发明的第十一方面，我们提供了一种操作细胞的方法，该方法包括下列步骤：(a)检测细胞中升高的TAZ表达、量或活性；并(b)降低所述细胞中的TAZ水平。
一种调控TAZ表达的方法，该方法包括靶向选自下组的TAZ靶位点：KD-1(5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、KD-650(5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或KD-652(5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。
依照本发明的第十二方面，我们提供了一种鉴定能够结合TAZ多肽的分子的方法，该方法包括：(a)使TAZ多肽与候选分子接触，并测定所述候选分子是否结合所述TAZ多肽；或(b)一种鉴定TAZ调控剂的方法，该方法包括使细胞与候选分子接触，并检测所述细胞中的或所述细胞的升高或降低的TAZ表达、量或活性。
依照本发明的第十三方面，我们提供了一种鉴定TAZ多肽调控剂的方法，该方法包括容许TAZ结合包括TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4的TEAD多肽，并检测候选分子的存在对此类结合的调控。
依照本发明的第十四方面，提供了一种鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法，该方法包括测定候选分子是否是TAZ1/WWTR的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂。
依照本发明的第十五方面，我们提供了TAZ或与其具有至少90％序列同一性的序列在鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法中的用途。可以将候选分子暴露于TAZ多肽或表达TAZ多肽的细胞，以便测定所述候选分子是否是其激动剂或拮抗剂。
依照本发明的第十六方面，我们提供了TAZ多核苷酸或与其具有至少90％序列同一性的序列用于鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的用途。
依照本发明的第十七方面，我们提供了一种鉴定TAZ的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括对动物施用候选分子，并测定所述动物是否展现出升高或降低的TAZ表达、量或活性。
依照本发明的第十八方面，我们提供了包含如上文所列的核酸的表达载体，诸如逆转录病毒载体。依照本发明的第十九方面，我们提供了包含如上文所列的核酸或如上文所列的表达载体的宿主细胞。依照本发明的第二十方面，我们提供了包含如上文所列的宿主细胞的非人动物。
依照本发明的第二十一方面，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括调控个体的细胞中TAZ的表达、量或活性。所述TAZ的表达、量或活性在所述个体的乳腺细胞(breast cell)中可以降低。
依照本发明的第二十二方面，我们提供了一种在个体中诊断癌症或对癌症的易感性的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
依照本发明的第二十三方面，我们提供了一种对患有癌症的个体预后的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
依照本发明的第二十四方面，我们提供了一种测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法，该方法包括检测所述个体的肿瘤细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
依照本发明的第二十五方面，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来对所述个体施用合适的疗法。所述癌症可以包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。可以通过评估肿瘤大小和/或淋巴结阶段，任选地与其它风险因素一起或组合来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。可以通过评估所述肿瘤的雌激素受体(ER)状态来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。
依照本发明的第二十六方面，我们提供了供在个体中治疗、预防或减轻癌症(例如乳腺癌)的方法中使用的TAZ。
依照本发明的第二十七方面，我们提供了通过如上文所列的方法或用途鉴定的，TAZ多肽的分子、激动剂或拮抗剂。
依照本发明的第二十八方面，我们提供了供在治疗、预防或减轻癌症中使用的分子，其能够调控诸如下调TAZ的表达。
附图简述
图1A和图1B：TAZ在高侵入性乳腺癌细胞中优先过表达。
图1A：通过使用还与YAP良好地起反应的抗TAZ抗体(上部小图)或抗YAP抗体(下部小图)进行的Western印迹来分析自11种乳腺癌细胞系衍生的溶胞物。使用如由抗肌动蛋白抗体检测的肌动蛋白水平作为加载对照。
图1B：在三项独立实验中量化TAZ和YAP的表达水平，并以相对于肌动蛋白的任意单位呈现平均值。
图2A、图2B和图2C：TAZ促进MCF10A细胞的迁移和侵入。
图2A：通过Western印迹来评估用表达EGFP(第1道)、TAZ(第2道)或Flag-TAZ(第3道)的逆转录病毒转导的MCF10A细胞中的TAZ水平。评估Hs578T(第4道)和BT-549(第5道)细胞中的TAZ水平作为比较。
图2B：表达EGFP的MCF10A细胞(左侧小图)和表达TAZ的MCF10A细胞(右侧小图)的伤口愈合迁移测定法。使在时间0、14小时和24小时时由迁移细胞进行的伤口愈合成像。表达TAZ的MCF10A细胞比表达EGFP的MCF10A细胞具有更为能动和纺锤状成纤维细胞样的外观，而且迁移得更快。
图2C：通过转孔(transwell)测定法来评估表达EGFP和TAZ的MCF10A细胞的迁移(左侧小图)和侵入(右侧小图)。柱，三项独立实验的均值；工形线，SEM。
图3A、图3B和图3C：TAZ敲低在MCF7细胞中增强上皮形态学，而在Hs578T细胞中抑制细胞迁移和侵入。
图3A：通过Western印迹来评估用载体(第1道)和靶向TAZ mRNA不同位点的多种shRNA(第2道-第6道)转导的MCF7(左侧小图)和Hs578T(右侧小图)细胞中的TAZ表达水平。shRNA-652在MCF7和Hs578T细胞两者中在抑制TAZ表达方面最有力。
图3B：MCF7细胞中的TAZ敲低导致更密集压缩和紧凑的细胞片层的簇。在以低至中等密度铺板时，MCF7-KD-715细胞和MCF7-KD-652细胞两者均生长为细胞簇。然而，与MCF7-KD-715细胞(小图a)相比，MCF7-KD-652细胞(小图b)中明显增强簇的细胞密度。扫描电子显微术揭示与MCF7-KD-715细胞(小图c)相比，MCF7-KD-652细胞(小图d)中细胞间的间隔是缩短的。这导致在敲低TAZ表达时更紧密排列/压缩和紧凑的上皮外观。
图3C：Hs578T细胞中的TAZ敲低抑制细胞迁移。实施Hs578T-KD-715(左侧小图)和Hs578T-KD-652(右侧小图)细胞的伤口愈合迁移测定法。使在时间0、6小时和12小时时由迁移细胞进行的伤口愈合成像。具有TAZ敲低的Hs578T-KD-652细胞与Hs578T-KD-715细胞相比具有降低很多的迁移率，所述Hs578T-KD-715细胞与亲本和用载体转导的Hs578T细胞具有相似的迁移。D，通过转孔测定法来评估Hs578T-KD-715和Hs578T-KD-652细胞的迁移(左侧小图)和侵入(右侧小图)。柱，三项独立实验的均值；工形线，SEM。
图4A、图4B和图4C：MCF7细胞中的TAZ敲低抑制软琼脂中的贴壁不依赖性生长和裸鼠中的肿瘤发生。
图4A：评估MCF7-KD-715(上部小图)和MCF7-KD-652(下部小图)细胞的软琼脂生长，并为其拍照。
图4：以较高的放大率为MCF7-KD-715(左侧小图)和MCF7-KD-652(右侧小图)细胞在软琼脂中的活集落外观拍照。
图4C：评估MCF7-KD-715(右侧)和MCF7-KD-652(左侧)细胞在裸鼠大腿(左侧小图)或脂肪垫(右侧小图)中的肿瘤形成，并为其拍照。
图5A和图5B：TAZ在侵入性(浸润性)导管癌(IDC)中过表达。
图5A：家兔抗TAZ抗体的表征。通过在没有(左侧小图)或存在100X与TAZ抗原区对应的重组YAP片段(氨基酸206-262)的情况中使用亲和纯化的针对TAZ片段(氨基酸160-229)生成的家兔抗体进行的Western印迹来分析自指定细胞衍生的溶胞物。虽然抗体与YAP起交叉反应(左侧小图)，但是它们在存在过量的重组YAP片段的情况中特异性识别TAZ。
图5B：TAZ在侵入性导管癌(IDC)中过表达。用TAZ抗体(与100倍过量的重组YAP片段一起预温育)或作为对照的细胞角蛋白抗体对正常的乳腺组织(左侧小图)或乳腺癌组织(IDC)(右侧小图)染色。TAZ在IDC中但不在正常的乳腺组织中过表达。
图6A和图6B：自小鼠切出的肿瘤的量化。
图6A：展示自分别注射MCF-KD-715和MCF7-KD-652细胞的一对小鼠的脂肪垫切出的肿瘤。
图6B：肿瘤重量的定量。为自注射MCF-KD-715和MCF7-KD-652细胞的小鼠的脂肪垫切出的肿瘤称重，并将其呈现。工形线，SEM。
图7A、图7B和图7C：TAZ敲低细胞，即MCF7-KD-652中的小鼠TAZ(mTAZ)表达显著恢复MCF7-KD-652细胞在软琼脂中的生长。用pBABE潮霉素逆转录病毒载体(对照)或表达mTAZ的逆转录病毒载体(Flag-mTAZ)感染MCF7-KD-715和MCF7-KD-652细胞。在存在嘌呤霉素(1μg/ml)和潮霉素(500μg/ml)的情况中进行双重选择后，通过免疫印迹分析(图7A)和在软琼脂中生长2周(图7B)来分析细胞。标示TAZ、YAP和Flag-mTAZ。图7C中显示了来自三项独立实验的软琼脂测定法中的细胞集落数目定量。工形线，SEM。
图8A和图8B：通过固定化的TEAD 1-4C端区域保留TAZ和YAP。图8A和图8B显示了TAZ与转录因子(TEAD 1、2、3和4)相互作用。
图9的图显示了TAZ中对于与TEAD相互作用重要的残基的鉴定。
图10的图显示了测试TAZ突变体在细胞核中积累能力的实验结果。
图11的图显示了测试TAZ突变体在驱动贴壁不依赖性生长中的能力的实验结果。
图12的图显示了RT-PCR实验结果，显示了分泌性蛋白质和表面膜蛋白质的表达。
发明详述
除非另有指明，本发明的实践会采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力内。文献中解释了此类技术。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1-3册，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期补充；Current Protocolsin Molecular Biology，第9章、第13章、和第16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(编)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IrI Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure PartA：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I byEdward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(编)，David Lane(编)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-314-2)，1855.Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and OtherReference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。本文通过提及而收录这些通用教科书之每篇。
TAZ在治疗和诊断乳腺癌中的用途
本发明基于首次证明了TAZ在癌症中发挥作用。
具体地，我们显示了TAZ在乳腺癌细胞的迁移、侵入和肿瘤发生中发挥至关重要的作用。我们在实施例中显示了，TAZ在人乳腺癌细胞系中显著表达，在那里其表达水平一般与癌细胞的侵入性和/或攻击性相关。在高侵入性乳腺癌细胞系诸如Hs578T、BT549、MDA-MB-453和MDA-MB231中检测出高水平的TAZ。在侵入性较低的乳腺癌细胞系诸如MCF10A、BT20、MCF7、MDA-MB-453、ZR75.1和BT474中检测出较低水平的TAZ。
因而，可以使用TAZ作为标志物来检测乳腺癌，包括基底样(basal-like)、三阴性(triple negative)和BRCA1突变型癌症类型。可以使用TAZ表达的水平作为癌症的指标，特别是乳腺癌诸如转移性、攻击性或侵入性乳腺癌。还可以使用TAZ表达的水平作为此类癌症可能性的指标。因此，我们提供了诊断或检测癌症，特别是乳腺癌的方法。我们进一步提供了诊断和检测此类癌症的攻击性或侵入性或转移状态，或者这些的任意组合的方法。该方法可以包括分析蛋白质水平(例如免疫组织化学)或RNA水平(例如通过原位杂交)。下文更为详细地描述了此类诊断和检测方法。
我们显示了永生化的但不是经转化的MCF10A细胞中的TAZ过表达促进细胞增殖、细胞迁移和侵入。Hs578-t和MCF7细胞中shRNA介导的TAZ敲低抑制细胞迁移和侵入。MCF7细胞的软琼脂中贴壁依赖性生长和体内肿瘤发生受到TAZ敲低抑制。自过表达TAZ的MCF10A细胞收获的培养液促进细胞迁移。因此，TAZ的过表达引起癌性表型。
因而，我们提供了治疗或预防患有癌症的个体的方法。还可以使用将TAZ水平恢复成正常组织中的TAZ水平作为恢复乳腺细胞正常功能的手段。因此，我们提供了TAZ核酸和多肽治疗癌症(包括乳腺癌)的用途。可以使用我们的方法来治疗或预防乳腺癌或侵入性癌症诸如侵入性乳腺癌。
我们在实施例和图1中显示了TAZ在属于基底样、三阴性或BRCA1突变型类型的侵入性乳腺癌系中过表达。图1B显示了四种高侵入性癌细胞系的三种(Hs578T、BT-549、和MDA-MB-435S)展现出高水平的TAZ表达，其中MDA-MB-231细胞表达中等水平。
Neve等(2006)中显示了这四种细胞系对应于基底样或基底B癌症类型，而且代表侵入性乳腺癌细胞类型。此细胞类型又称为“侵入性细胞类型”或“基细胞类型”(BRCA1突变型又称为BRCA1阴性)。因而，可以使用TAZ作为标志物来检测侵入性细胞类型或基细胞类型乳腺癌。
不像ER+或Her2+乳腺癌，没有针对属于这三种乳腺癌类型之任一种的侵入性乳腺癌的靶向疗法。因此，我们首次公开了以靶向方式治疗侵入性细胞类型、基底样乳腺癌、三阴性乳腺癌和BRCA1突变型乳腺癌类型的方法。
我们进一步提供了TAZ在筛选针对癌症(特别是乳腺癌，更特别是侵入性乳腺癌)的药物中的用途。此类筛选可以牵涉检测候选分子的存在对TAZ和TEAD 1/2/3/4之间的结合的调控。
我们提供了一种鉴定用于治疗或预防癌症(包括乳腺癌诸如侵入性乳腺癌)的分子的方法，该方法包括鉴定TAZ活性或表达的调控剂。
我们在实施例中显示了TAZ与TEAD1、TEAD2、TEAD3和TEAD4相互作用，而且此相互作用对于TAZ的细胞核积累和癌发生是至关重要的。
因而，我们提供了一种鉴定用于治疗或预防癌症(包括乳腺癌诸如侵入性乳腺癌)的分子的方法，该方法包括检测候选分子对TAZ和TEAD1、TEAD2、TEAD3和/或TEAD4间的结合的影响。例如，可以对文库进行针对TAZ-TEAD结合的小分子抑制剂的筛选。
或者/另外，可以采用理性设计来生成TAZ-TEAD相互作用的候选抑制剂。如此，例如，可以设计来自TEAD(包括TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4)之TAZ结合区的肽。类似地，可以设计来自TAZ之TEAD结合区(包括TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4结合区)的肽。此类肽可以包括突变的TAZ位置52和53，这两者在实施例中显示为在TAZ和TEAD间的结合方面是重要的。
可以使用多种测定法来测试推定的抑制剂(或筛选中鉴定的候选抑制剂)，包括细胞核积累测定法或软琼脂测定法，这两者均记载于实施例中。
我们进一步提供了通过干扰或破坏TAZ-TEAD相互作用来治疗或预防癌症。这可以通过多种手段，例如通过对有所需要的患者导入TAZ调控剂，诸如自上文所描述的筛选或设计鉴定的分子来实现。
我们在实施例中显示了TAZ诱导或上调8种分泌性蛋白质(IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1和FBN2)及4种表面膜蛋白质(AXL、ITGB2、CRIM1、和Alcam)的表达。因此可以使用这些蛋白质之每一种作为致癌状态的标志物。因而，我们提供了癌细胞或致癌性细胞或转移性细胞的检测，该方法包括检测选自下组的多肽的表达：IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1、FBN2AXL、ITGB2、CRIM1和Alcam。我们还提供了癌症的治疗，该方法包括调控选自下组的多肽或活性：IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1、FBN2AXL、ITGB2、CRIM1和Alcam。
TAZ过表达和表达不足的细胞以及包含这些的组织、器官和生物体可以作为癌症模型使用或者在针对抗癌剂的筛选中使用。
TAZ
TAZ又称为具有PDZ结合基序的转录共激活物或WWTR1。它定位于基因图谱基因座3q24。
Kanai等(2000)通过筛选14-3-3结合蛋白(OMIM参照605066)，接着进行5’RACE自HeLa cDNA表达文库首次克隆TAZ。在HeLa细胞中，推导的蛋白质含有400个氨基酸，而且具有45kD的表观分子量。它具有在其N端中的推定14-3-3蛋白质结合基序、中心的WW域、和在其C端中的推定2链卷曲螺旋和PDZ结合基序。
TAZ与小鼠Taz蛋白共享91％的序列同一性而与YAP(OMIM参照606608)共享45％的同一性。Northern印迹分析揭示了6kb转录物在肾中的最高表达，接着是心脏、胎盘、和肺。在除胸腺和外周血白细胞外的所有测试组织中检测出表达。对小鼠组织的Northern印迹分析显示了在肾、肺、肝、和心脏中以最高水平表达的5.5kb转录物；在睾丸中检测出2.2kb转录物。Western印迹分析揭示了TAZ在数种上皮和成纤维细胞细胞系中的表达，但不在Jurkat T细胞中表达。
Kanai等(2000)表征了鼠Taz。他们发现了Taz与大鼠14-3-3的相互作用需要对特定丝氨酸残基的Taz磷酸化。磷酸化通过诱导经由与14-3-3相互作用的细胞核输出来降低Taz转录共激活。C端PDZ结合域使Taz定位于离散的细胞核聚焦点(nuclear foucus)，而且是Taz刺激的基因转录所需要的。PDZ结合域还介导Taz与Nherf2(OMIM参照606553)相互作用。
间充质干细胞是能分化成数种独特谱系的多能细胞类型。两种关键转录因子，即RUNX2(OMIM参照600211)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG；OMIM参照601487)分别驱动间充质干细胞分化成成骨细胞或脂肪细胞。Hong等(2005)发现了TAZ，即一种14-3-3结合蛋白在抑制PPARG依赖性基因转录的同时共激活RUNX2依赖性基因转录。通过在模式细胞系即小鼠胚胎成纤维细胞和培养的原代间充质干细胞中及在体内在斑马鱼中调控Taz表达，Hong等(2005)观察到成骨性对生脂性潜能的改变。Hong等(2005)推断TAZ发挥调控间充质干细胞分化的分子变阻器的功能。
Murakami等(2005)发现了，TAZ是一种有力的TBX5(OMIM参照601620)反式激活物。TAZ与TBX5联合，并通过与组蛋白乙酰转移酶p300(EP300；OMIM参照602700)和PCAF(OMIM参照602303)相互作用来刺激TBX5依赖性启动子。具有霍-奥二氏综合征(Holt-Oram syndrome，HOS；OMIM参照142900)相关截短突变的TBX5不能被TAZ刺激，但是具有HOS相关点突变的TBX5在其响应TAZ的能力方面未受损害。
通过放射杂交测定法，Kanai等(2000)将TAZ基因定位至染色体3q24。
在使用术语“TAZ”的地方，这应当理解为指任何TAZ序列，包括TAZ蛋白或TAZ核酸和其任何片段、变体同源物、衍生物、变体。
TAZ的特性和活性记载于本文件中，例如在参考文献中。
TAZ多肽
这里所描述的方法和组合物利用下文详细描述的TAZ多肽。
如本文所使用的，术语“TAZ多肽”意图指具有GenBank登录号NP_056287、NP_598545、NP_001032785、XP_871504、NP_001020040的序列。“TAZ多肽”可以包含人TAZ多肽诸如具有登录号NP_056287的序列，或者由其组成。
还包括任何、一些或所有这些多肽的其同源物变体和衍生物。例如，TAZ可以包括GenBank登录号AJ299430。
TAZ多肽可以用于多种手段，例如，对患有或者怀疑患有乳腺癌的个体施用以进行治疗。它们还可以用于生成或筛选抗TAZ剂，诸如特异性TAZ结合剂，特别是抗TAZ抗体。这些在下文更为详细地进行描述。可以检测TAZ多肽的表达以诊断或检测癌症，特别是乳腺癌。
“多肽”指任何包含两个或更多个彼此通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的肽或蛋白质。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及多卷的研究文献中。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当领会的是，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可以含有许多类型的修饰。
多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、有分支的或没有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以源自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)、和遍在蛋白化。参见例如Proteins-Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993和Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，第1页-第12页，于Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，编，Academic Press，New York，1983；Seifter等，“Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol，(1990)182：626-646和Rattan等，“Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging”，AnnNY Acad Sci(1992)663：48-62。
术语“多肽”包括本领域已知的各种合成肽变异诸如逆反(retroinverso)D肽。肽可以是抗原决定簇和/或T细胞表位。肽在体内可以是免疫原性的。肽可以能够在体内诱导中和性抗体。
如应用于TAZ的，所得的氨基酸序列可以具有一种或多种活性，诸如与TAZ多肽(例如人TAZ多肽)共同的生物学活性。例如，TAZ同源物在乳腺癌细胞中比在正常的乳腺细胞中可以具有升高的表达水平。具体地，术语“同源物”涵盖关于结构和/或功能的同一性，只要所得的氨基酸序列具有TAZ活性。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70％，诸如至少75％，诸如至少85％，诸如至少90％序列同一性。可以有至少95％，诸如至少98％序列同一性。这些术语还涵盖自作为TAZ核酸序列等位变异的氨基酸衍生的多肽。
在提及多肽诸如TAZ的“活性”或“生物学活性”时，这些术语意图指TAZ的代谢或生理学功能，包括类似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的这些活性。还包括TAZ的抗原性和免疫原性活性。此类活性的例子及测定和量化这些活性的方法是本领域已知的，并且详细记载于本文件的别处。
例如，此类活性可以包括任何下列一项或多项：结合SLC9A3R2、结合YWHA、结合14-3-3、RUNX2依赖性基因转录的共激活、TAZ反式激活TBX5等，如下文更为详细地描述的。
其它TAZ多肽
TAZ变体、同源物、衍生物和片段也在本文所描述的方法和组合物中使用。
涉及TAZ的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括自序列或向序列任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加一个(或多个)氨基酸。除非上下文另有承认，提及“TAZ”包括提及TAZ的此类变体、同源物、衍生物和片段。
如本文中所使用的，“删除”定义为核苷酸或氨基酸序列中分别缺失一个或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。如本文中所使用的，“插入”或“添加”指与天然存在的物质相比分别已经导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加的核苷酸或氨基酸序列变化。如本文中所使用的，“替代”源自于一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同核苷酸或氨基酸替换。
如本文所描述的TAZ多肽还可以具有产生沉默变化和导致功能等同氨基酸序列的氨基酸残基删除、插入或替代。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性首基(head group)、具有相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如依照下表来进行保守的替代。第二栏中同一块中的和第三栏中同一行中的氨基酸可以彼此替代：
Figure GPA00001143563600151
TAZ多肽可以进一步包含异源氨基酸序列，通常在N端或C端，诸如N端。异源序列可以包括影响胞内或胞外蛋白质靶向的序列(诸如前导序列)。异源序列还可以包括提高TAZ多肽的免疫原性和/或便于多肽的鉴定、提取和/或纯化的序列。可以使用的另一种异源序列是多氨基酸序列诸如多组氨酸，其可以是N端的。可以采用至少10个氨基酸，诸如至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列。
TAZ多肽可以处于“成熟的”蛋白质形式，或者可以是较大蛋白质诸如融合蛋白的一部分。通常有利的是包括额外氨基酸序列，其含有分泌或前导序列、前序列(pro-sequence)、有助于纯化的序列诸如多组氨酸残基、或为了重组生产过程中稳定性的额外序列。
通过使用已知技术的重组手段来有利地制备如本文所描述的TAZ多肽。然而，还可以通过使用熟练技术人员公知的技术进行的合成手段诸如固相合成来制备它们。此类多肽还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列，诸如凝血酶切割位点。融合蛋白可以是不阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。
TAZ多肽可以处于基本上分离的形式。此术语意图指自天然状态的人为改变。若“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经自其最初环境改变和/或取出。例如，在本文中采用该术语时，活的动物中天然存在的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分开的该多核苷酸、核酸或多肽是“分离的”。
然而，应当理解的是，TAZ蛋白可以与不会干扰该蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。TAZ多肽也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白质是TAZ多肽。
通过比对来自不同物种的TAZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种间是保守的(“同源区”)，及哪些区域在不同物种间有变化(“异源区”)。
因此，TAZ多肽可以包含至少对应同源区之一部分的序列。同源区在至少两个物种间显示高度的同源性。例如，使用上文所描述的测试，同源区可以在氨基酸水平显示至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的同一性。可以在治疗策略中使用包含对应于同源区的序列的肽，如下文更详细解释的。或者，TAZ肽可以包含至少对应异源区之一部分的序列。异源区在至少两个物种间显示低度的同源性。
TAZ同源物
为使用而公开的TAZ多肽包括自任何来源获得的同源序列，例如相关病毒/细菌蛋白质、细胞同源物和合成肽，以及其变体或衍生物。如此，多肽还包括那些编码来自其它物种(包括动物，诸如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或家兔)，尤其是灵长类，更尤其是人)的TAZ同源物的。更具体地，同源物包括人同源物。
在本文件的语境中，同源序列理解为包括在氨基酸水平上，例如在至少50或100、200、300、400或500个氨基酸里，与相关TAZ序列的序列至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90％相同，诸如至少95或98％相同的氨基酸序列。
具体地，同源性通常应当关于序列中那些已知对蛋白质功能至关重要的区域而非不是至关重要的相邻序列进行考虑。这在考虑来自远亲生物体的同源序列时是尤其重要的。
虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本文件的语境中同源性可以根据序列同一性来表述。
可以通过目视，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些公用的和商品化的计算机程序能在两种或更多种序列之间计算％同一性。
可以在连续的序列里计算％同一性，即比对一种序列与另一种序列，并且直接比较一种序列中的每个氨基酸与另一种序列中的相应氨基酸，每次一个残基。这称作“无缺口的”比对。通常，仅在相对较短数目的残基(例如小于50个连续氨基酸)里实施此类无缺口比对。
虽然这是非常简单而一致的方法，但是它没有考虑到例如，在其它方面相同的一对序列中，一处插入或删除会引起随后的氨基酸残基比对不成，如此在实施总体比对时潜在地导致％同源性的大大降低。因此，将大多数序列比较方法设计成产生最佳比对，其考虑到有可能的插入和删除，而不过度地对总体同源性得分进行罚分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以设法使局部同一性或相似性最大化来实现的。
然而，这些较复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口(反映两种所比较序列之间的较高关联性)的序列比对会比具有许多缺口的序列比对达到更高的得分。通常使用“仿射缺口代价”，其对缺口的存在处以相对较高的代价，而对缺口中的每个随后的残基处以较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然会产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序容许对缺口罚分进行修改。然而，可以在使用此类软件比较序列时使用缺省值。例如在使用GCG Wisconsin最佳拟合包(参见下文)时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是针对缺口的-12和针对每个延伸的-4。
因此，最大限度％同源性的计算首先要求产生考虑到缺口罚分的最佳比对。适合于实施此类比对的一种计算机程序是GCG Wisconsin最佳拟合包(University of Wisconsin，U.S.A；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research12：387)。能实施序列比较的其它软件的例子包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999同上-第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者都可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999同上，第7-58页至第7-60页)。可以使用GCG最佳拟合程序。
虽然可以根据同一性测量最终的％同源性，但是比对过程自身通常并不是基于全有或全无的成对比较。代替地，一般使用定标的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个配对比较。通常使用的此类矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的缺省矩阵。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或自定义符号比较表，若提供的话(关于进一步的详情参见用户手册)。可以使用GCG包的公共缺省值，或者在其它软件的情况中，可以使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。
一旦软件已经产生最佳比对，便有可能计算％同源性，诸如％序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分进行，并产生数值结果。
涉及氨基酸序列的术语“变体”或“衍生物”包括自序列或向序列任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加一个(或多个)氨基酸，只要所得的氨基酸序列保留与未修饰的序列基本上相同的活性，诸如至少具有与TAZ多肽相同的活性。
为了在本文所描述的方法和组合物中使用，可以修饰具有本文所公开的TAZ氨基酸序列的多肽，或其片段或同源物。通常，进行的修饰维持序列的生物学活性。可以进行氨基酸替代，例如自1、2或3至10、20或30处替代，只要经修饰序列保留未修饰序列的生物学活性。或者，可以进行修饰以便有意地使本文所述多肽的一个或多个功能域失活。氨基酸替代可以包括使用非天然存在的类似物，例如以便延长治疗性施用的多肽的血浆半衰期。
TAZ片段
本文所述方法和组合物中使用的多肽还包括上文所鉴定的任何TAZ多肽的全长序列的片段。片段可以包含至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域公知的。片段通常会包含至少6个氨基酸，诸如至少10、20、30、50或100个氨基酸。
包括如下片段，其包含来自相关TAZ氨基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315个或更多个残基，或由其组成。
我们进一步描述了包含如本文所描述的TAZ多肽的一部分的肽。如此，包括TAZ及其同源物、变体或衍生物的片段。所述肽的长度可以在2个和200个氨基酸之间，诸如在4个和40个氨基酸之间。所述肽可以衍生自如本文所公开的TAZ多肽，例如通过用合适的酶诸如胰蛋白酶进行的消化。或者，所述肽、片段等可以通过重组手段来制备，或者以合成法合成。
TAZ的片段可以包含具有登录号NP_056287的序列的TAZ片段。TAZ的片段可以包含与YAP(Sudol等，1995；GenBank登录号：NP_006097)共享低相似性或同一性的TAZ序列。例如。TAZ片段可以包含TAZ的氨基酸残基160-229，即：
n qplnhmnlhp avsstpvpqr smavsqpnlv mnhqhqqqma pstlsqqnhp tqnppaglmsmpnalttqq。
因而，可以使用此类TAZ片段来生成探针以优先检测TAZ表达，例如经由针对此类片段生成的抗体。这些抗体会特异性结合TAZ，并且在本文所公开的诊断和治疗方法中是有用的。
TAZ的其它片段可以包括如下片段，其包含TAZ的残基52或残基53，即F52或F53，或者包含在这些位置之一或两者的突变。在这点上，实施例公开了TAZ的第52位和第53位(这两者均被苯丙氨酸残基占据)在TAZ和TEAD间的结合中是重要的。还显示了它们对于TAZ的细胞核积累及其致癌潜力是重要的。因而，我们公开了包含F52突变和/或F53突变的TAZ片段。
可以以肽的形式合适地提供TAZ的此类片段，其可以作为抗TAZ肽使用。因而，我们公开了包含这些位置之任一或两者侧翼的TAZ序列的肽。所述肽可以具有任何合适的长度，诸如在TAZ序列的5至40(或更多)个残基之间。所述肽可以包含例如长5、10、15、20、25等个残基的序列，其作为lealfnsvmnpkpsswrkki 
Figure GPA00001143563600201
 sgshsrqsst dssgghpgpr lagg的亚序列而且包含在F52和F53(以粗体突出显示)之一或两者处的突变。可以突变成任何合适的残基，诸如丙氨酸。
可以经由多种手段，诸如通过使用膜移位序列(包括例如HIV-1反式激活蛋白(Tat)、果蝇(Drosophila)触角同源域蛋白(Antp-HD)、单纯疱疹-1病毒VP22蛋白(HSV-VP22)、基于信号序列的肽、转运和两亲性模型肽等的全部序列或亚序列)将肽导入细胞、组织、器官或个体中。这些详细记载于WO2002/007752。
可以通过重组手段来制备TAZ及其片段、同源物、变体和衍生物。然而，它们也可以通过使用熟练技术人员公知的技术进行的合成手段诸如固相合成来制备。所述蛋白质还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列。融合蛋白可以是不会阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物来获得蛋白质。
本文所公开的TAZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以处于基本上分离的形式。应当理解的是，此类多肽可以与不会干扰该蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。TAZ变体、同源物、片段或衍生物也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白质是蛋白质。
可以用显示标记物(revealing label)标记本文所公开的TAZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物。所述显示标记物可以是容许检测出多肽等的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素(例如125I)、酶、抗体、多核苷酸和接头(诸如生物素)。可以在诊断规程诸如免疫测定法中使用经过标记的多肽以测定样品中的多肽量。也可以在血清学或细胞介导的免疫测定法中使用多肽或经过标记的多肽以使用标准方案来检测动物和人中针对所述多肽的免疫反应性。
也可以将本文所公开的TAZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物(任选经过标记的)固定至固相，例如免疫测定孔或浸渍片(dipstick)的表面。可以将此类经过标记的和/或固定化的多肽与合适的试剂、对照、指令等一起在合适的容器中包装入试剂盒中。此类多肽和试剂盒可以在通过免疫测定法检测针对多肽或其等位或物种变体的抗体的方法中使用。
免疫测定方法是本领域公知的，并且一般会包括：(a)提供包含下述表位的多肽，该表位可被针对所述蛋白质的抗体结合；(b)在容许抗体-抗原复合物形成的条件下将生物学样品与所述多肽一起温育；并(c)测定是否形成包含所述多肽的抗体-抗原复合物。
可以在体外或体内细胞培养系统中使用本文所公开的TAZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物以研究它们相应的基因及其同源物在细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可以将截短的或经修饰的多肽导入细胞中以破坏细胞中发生的正常功能。可以通过自重组表达载体原位表达多肽来将多肽导入细胞中(参见下文)。任选地，表达载体携带诱导型启动子，以便控制多肽的表达。
合适的宿主细胞诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞的使用提供此类翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，其可能是对重组表达产物赋予最佳生物学活性所需要的。可以在测定系统中使用其中表达本文所公开的TAZ多肽、变体、同源物、片段和衍生物的此类细胞培养系统，以鉴定干扰或增强多肽在细胞中的功能的候选物质。
TEAD多肽
TEAD1(又称为TEA域家族成员1)具有NM_021961.4或NP_068780.1的GenBank登录号。
TEAD2(又称为TEA域家族成员2)具有NM_003598.1或NP_003589.1的GenBank登录号。
TEAD3(又称为TEA域家族成员3)具有NM_003214.3或NP_003205.2的GenBank登录号。
TEAD4(又称为TEA域家族成员4)具有多种同等型(isoform)。TEAD4同等型1具有登录号NM_003213.2或NP_003204.2。TEAD4同等型2具有登录号NM_201441.1或NP_958849.1。TEAD4同等型3具有登录号NM_201443.1或NP_958851.1。
TAZ核酸
本文所描述的方法和组合物可以采用TAZ多核苷酸、TAZ核苷酸和TAZ核酸，以及这些中任一种的变体、同源物、衍生物和片段，作为用于检测TAZ表达水平的手段。另外，我们公开了对于本文所描述的诊断方法有用的特定TAZ片段。TAZ核酸还可以用于所描述的治疗或预防方法。
术语“TAZ多核苷酸”、“TAZ核苷酸”和“TAZ核酸”可以互换使用，并且应当理解为明确包括cDNA和基因组TAZ序列两者。这些术语还意图包括能够编码TAZ多肽和/或其片段、衍生物、同源物或变体的核酸序列。
在提及TAZ核酸时，这应当理解为提及TAZ核酸家族的任何成员。特别感兴趣的是选自下组的TAZ核酸：NM_015472、NM_133784、NM_001037696、XM_866411和NM_001024869。
还包括如下文“其它TAZ核酸序列”所列的任何一种或多种核酸序列。
例如，TAZ核酸可以包含具有GenBank登录号NM_015472的人TAZ序列。
TAZ核酸可以用于多种手段，例如，对患有或者怀疑患有乳腺癌的个体施用以进行治疗。可以检测TAZ核酸的表达以诊断或检测癌症，特别是乳腺癌。也可以使用TAZ核酸来表达或生成TAZ多肽。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、及作为单链区和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或者，更通常的是双链或单链区和双链区的混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA和具有出于稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基诸如肌苷。已经对DNA和RNA进行多种修饰；如此，“多核苷酸”涵盖多核苷酸的以化学方式、酶促方式或代谢方式修饰的形式，如通常在自然界中找到的，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA化学形式。“多核苷酸”还涵盖相对较短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
熟练技术人员应当理解的是，许多核苷酸序列可以由于遗传密码的简并性而编码相同多肽。
如本文中所使用的，术语“核苷酸序列”指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的DNA或RNA，其可以是双链的或单链的，无论表示有义链还是反义链或其组合。可以通过使用重组DNA技术(例如重组DNA)来制备术语核苷酸序列。
术语“核苷酸序列”可以指DNA。
其它核酸
我们还提供了如下的核酸，其是TAZ核酸的片段、同源物、变体或衍生物。涉及TAZ核酸的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括自或向TAZ核苷酸序列的序列任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加一个(或多个)核酸。除非上下文另有承认，提及“TAZ”和“TAZ”包括提及TAZ的此类变体、同源物、衍生物和片段。
所得的核苷酸序列可以编码具有任何一种或多种TAZ活性的多肽。术语“同源物”可以意图涵盖关于结构和/或功能的同一性，使得所得的核苷酸序列编码具有TAZ活性的多肽。例如，TAZ的同源物等在乳腺癌细胞中比在正常的乳腺细胞中可以具有降低的表达水平。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70％，至少75％，至少85％或至少90％序列同一性。与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_015472的TAZ序列)可以有至少95％，诸如至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖所述序列的等位变异。
变体、衍生物和同源物
TAZ核酸变体、片段、衍生物和同源物可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。它们还可以是如下的多核苷酸，所述多核苷酸在其内包括合成的或经修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链、在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本文件的目的，应当理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以实施此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
若多核苷酸是双链的，则本文所描述的方法和组合物涵盖双链体的两条链，或是个别地或是组合地。若多核苷酸是单链的，则应当理解的是，还包括该多核苷酸的互补序列。
涉及核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括自序列或向序列任意替代、变异、修饰、替换、删除、或添加一个(或多个)核酸。所述变体、同源物或衍生物可以编码具有生物学活性的多肽。TAZ的此类片段、同源物、变体和衍生物可以包含受到调控的活性，如上文所列的。
如上文所指明的，关于序列同一性，“同源物”与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_015472的TAZ序列)可以具有至少5％同一性、至少10％同一性、至少15％同一性、至少20％同一性、至少25％同一性、至少30％同一性、至少35％同一性、至少40％同一性、至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性。
可以有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。可以如上文所描述的那样进行核苷酸同一性比较。可以使用的序列比较程序是上文所描述的GCG Wisconsin最佳拟合程序。缺省评分矩阵具有如下的匹配值：针对每个相同核苷酸的10和针对每个错配的-9。缺省缺口产生罚分是-50，而缺省缺口延伸罚分是针对每个核苷酸的-3。
杂交
我们进一步描述了能够与本文中呈现的任何序列，或其任何变体、片段或衍生物，或与上文任一种的互补物选择性杂交的核苷酸序列。核苷酸序列的长度可以是至少15个核苷酸，诸如至少20、30、40或50个核苷酸。
如本文中所使用的，术语“杂交”应当包括“核酸链经由碱基配对而与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应技术中所实施的扩增过程。
能够与本文中呈现的核苷酸序列，或与其互补物选择性杂交的多核苷酸可以与本文中呈现的相应核苷酸序列(例如具有GenBank登录号NM_015472的TAZ序列)至少40％同源、至少45％同源、至少50％同源、至少55％同源、至少60％同源、至少65％同源、至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、或至少95％同源。一般而言，此类多核苷酸可以在至少20个，诸如至少25个或30个，例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域里与相应的核苷酸序列至少70％、至少80或90％或至少95％或98％同源。
术语“可选择性杂交的”指在如下条件下使用作为探针使用的多核苷酸，在所述条件下发现靶多核苷酸以显著高于背景的水平与探针杂交。可能发生背景杂交，这是由于在例如所筛选的cDNA或基因组DNA文库中存在其它多核苷酸。在此事件中，背景暗示通过探针与文库的非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号水平，其是用靶DNA观察到的特异性相互作用的强度的不到1/10，诸如不到1/100。例如，可以通过用例如32P或33P放射性标记探针或者用非放射性探针(例如荧光染料、生物素或洋地黄毒苷)测量相互作用的强度。
杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所教导的，并且赋予限定的“严格性”，如下文所解释的。
最大限度的严格性通常于约Tm-5℃(探针的Tm下5℃)发生；高严格性在Tm下约5℃至10℃发生；中等严格性在Tm下约10℃至20℃发生；而低严格性在Tm下约20℃至25℃发生。如本领域技术人员应当理解的，可以使用最大限度的严格性杂交来鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而可以使用中等(或低)严格性杂交来鉴定或检测相似的或相关的多核苷酸序列。
我们提供了可以能够在严格条件(例如65℃和0.1xSSC(1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0))下与TAZ核酸、片段、变体、同源物或衍生物杂交的核苷酸序列。
同源物、变体和衍生物的生成
可以以许多方式获得与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_015472的人TAZ序列)不是100％相同但是也包括在内的多核苷酸，以及TAZ的同源物、变体和衍生物。可以通过例如探查自一系列个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库来获得所述序列的其它变体。例如，可以自其它个体或其它物种鉴定TAZ同源物。可以如下生成别的重组TAZ核酸和多肽，即鉴定同源物中的相应位置，并合成或生成所述分子，如本文件中别处描述的。
另外，可以获得TAZ的其它病毒/细菌、或细胞同源物，特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中找到的细胞同源物，并且一般而言，此类同源物及其片段会能够与人TAZ选择性杂交。可以使用此类同源物来设计非人TAZ核酸、片段、变体和同源物。可以通过本领域已知的手段来实施诱变以产生别的变化(variety)。
可以如下获得TAZ同源物的序列，即探查自其它动物物种制备的cDNA文库或来自其它动物物种的基因组DNA文库，并在中等至高严格性条件下用包含TAZ核酸、片段、变体和同源物之任一种的或TAZ的其它片段的整个或部分的探针探查此类文库。
类似的考虑适用于获得本文所公开的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和品系/物种同源物，所述简并PCR会使用设计用于靶向变体和同源物内如下序列的引物，所述序列编码TAZ核酸序列内保守氨基酸序列。可以通过例如比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来实施序列比对。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物会含有一个或多个简并位置，并且会在如下的严格条件使用，所述严格条件低于那些用于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列的严格条件。熟练技术人员应当领会的是，来自远亲生物体的序列之间的总体核苷酸同源性有可能是非常低的，并且如此在这些情况中简并PCR可以是选择的方法，而不是用经过标记的TAZ序列片段筛选文库。
另外，可以通过使用搜索算法诸如BLAST程序套件搜索核苷酸和/或蛋白质数据库来鉴定同源序列。
或者，可以通过对已表征序列(例如TAZ核酸、或其变体、同源物、衍生物或片段)的定点诱变来获得此类多核苷酸。这在如下情况中可以是有用的，即例如序列需要沉默密码子变化来针对表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱。其它序列变化可能是想要的，以便引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能。
可以使用本文所描述的多核苷酸来生成引物，例如PCR引物，用于备选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显示标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆入载体中。此类引物、探针和其它片段的长度会是至少8个、9个、10个、或15个，诸如至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也涵盖在术语“多核苷酸”内，如本文中所使用的。
可以以重组方式、合成方式、或者通过本领域技术人员可用的任何手段来生成多核苷酸诸如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术来克隆。
一般而言，会通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制备想要的核酸序列，每次一个核苷酸。用于使用自动化技术实现此制备的技术是本领域容易获得的。
包含TAZ片段的引物在检测TAZ表达诸如TAZ表达的下调(例如如与乳腺癌有关的)的方法中是特别有用的。可以自任何合适的TAZ区段生成适合于扩增TAZ的引物。可以使用的引物包括那些能够扩增特异性(即，例如与YAP没有显著的同源性)的TAZ序列的引物。
虽然可以独立地提供TAZ引物，但是它们作为引物对(包含正向引物和反向引物)提供是最有用的。
一般而言，会使用重组手段例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。这会牵涉制备一对引物(例如有约15至30个核苷酸)，使引物与自动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起想要的区域扩增的条件下实施聚合酶链式反应，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收所扩增的DNA。引物可以设计成含有合适的限制酶识别位点，使得能将所扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。
多核苷酸或引物可以携带显示标记物。合适的标记物包括放射性同位素诸如32P或35S、洋地黄毒苷、荧光染料、酶标记物、或其它蛋白质标记物诸如生物素。可以将此类标记物添加至多核苷酸或引物，并且可以通过使用本身已知的技术来检测。本领域技术人员可以在基于核酸的测试中使用标记的或未标记的多核苷酸或引物或其片段以检测人体或动物身体中的多核苷酸或对其测序。
此类用于检测的测试一般包括使含有DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并检测探针与样品中的核酸之间形成的任何双链体。可以使用诸如PCR的技术或者如下来实现此类检测，即在固体支持物上固定化探针，除去样品中不与探针杂交的核酸，然后检测已经与探针杂交的核酸。或者，可以在固体支持物上固定化样品核酸，并可以检测与此支持物结合的探针量。这种和其它形式的合适测定方法可以参见例如WO89/03891和WO90/13667。
用于对核苷酸(例如TAZ核酸)测序的测试牵涉使含有靶DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并通过例如Sanger双脱氧链终止方法(参见Sambrook等)来测定序列。
此方法一般包括在存在合适的试剂的情况中通过合成与靶DNA或RNA互补的链来延伸引物，并在一个或多个A、C、G或T/U残基处选择性终止延伸反应；容许发生链延伸和终止反应；依照大小将所延伸的产物分开以测定已经发生选择性终止的核苷酸的序列。合适的试剂包括DNA聚合酶，脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，缓冲液和ATP。使用双脱氧核苷酸进行选择性终止。
TAZ控制区
出于一些目的，可能有必要利用或调查TAZ的控制区。此类控制区包括启动子、增强子和基因座控制区。控制区指能够调控与其可操作连接的编码序列的表达的核酸序列或结构。
例如，控制区在生成表达TAZ的转基因动物中是有用的。此外，可以使用控制区来生成TAZ的表达构建体。这在下文更为详细地进行描述。
TAZ控制区的鉴定是直接的，并且可以以多种方式实施。例如，可以如下自生物体获得TAZ的编码序列，即使用人或小鼠TAZ cDNA序列作为探针来筛选cDNA文库。可以通过筛选合适的基因组文库，或者通过如本领域中已知的引物延伸来获得5’序列。也可以采用基因组数据库的数据库搜索。特别感兴趣的此类5’序列包括非编码区。可以通过目视或者借助于计算机程序来检查5’区以鉴定指明启动子和/或增强子区存在的序列基序。
此外，可以进行来自两种或更多种生物体的TAZ核酸序列的序列比对。通过比对来自不同物种的TAZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种之间是保守的。此类保守区可能含有所讨论的基因(即TAZ)的控制区。出于此目的可以采用如本文所公开的小鼠和人基因组序列，例如小鼠TAZ基因组序列。此外，可以使用标准的筛选方法来获得来自其它生物体的TAZ同源物，其使用自小鼠和人TAZ序列生成的合适探针来实现。也可以筛选河豚(红鳍东方鲀(Takifugu rubripes))或斑马鱼的基因组来鉴定TAZ同源物；如此，已经鉴定出数种斑马鱼TAZ序列(上文所记录的)。可以使用河豚或斑马鱼TAZ基因与小鼠或人基因组TAZ序列的5’非编码区比较来鉴定含有控制区的保守区。
也可以进行删除研究来鉴定TAZ的启动子和/或增强子区。
可以通过分子生物学实验来证实推定的控制区的身份，其中将候选序列与报告基因连接，并检测报告物的表达。
检测和诊断方法
TAZ表达的检测
我们在实施例中显示了，在与正常的乳腺组织相比时，乳腺癌组织中的TAZ表达是上调的。
因而，我们提供了一种诊断癌症(包括乳腺癌诸如转移性、攻击性或侵入性乳腺癌)的方法，包括在个体的细胞或组织中检测TAZ表达的调控，诸如TAZ表达的上调。
可以使用TAZ表达、活性或量的检测来提供一种测定细胞增殖状态的方法。如此，增殖性细胞是与正常细胞相比具有高水平的TAZ表达、活性或量的细胞。类似地，非增殖性细胞可以是与正常细胞相比具有低水平TAZ表达、活性或量的细胞。
也可以使用此检测来测定细胞是否会变为侵入性的或攻击性的。如此，在细胞中检测出高水平的TAZ表达、量或活性可以指明该细胞有可能是或有可能变为攻击性的、转移性的或侵入性的。类似地，若细胞具有低水平的TAZ表达、量或活性，则所述细胞不是或者不太可能是攻击性的、转移性的或侵入性的。
应当领会的是，因为TAZ的水平随肿瘤的攻击性而变化，所以也可以使用TAZ表达、量或活性的检测来预测患有癌症的个体的存活率，即高水平的TAZ指明较低的存活率或概率，而低水平的TAZ指明较高的存活率或概率，两者都如与具有正常水平的TAZ的个体或关联群体相比的。因此，TAZ表达、量或活性的检测可以作为对患有癌症的个体预后的方法使用。
可以使用TAZ表达、量或水平的检测来测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性。它可以在测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法中使用。
本文件中所描述的诊断方法可以与所描述的治疗方法组合。如此，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来对所述个体施用合适的疗法。
典型地，使用对乳房的身体检查和X线乳房照相术来检测乳腺癌。通常采集肿瘤活检来进行组织病理学检查以诊断乳腺癌。可以使用TAZ表达、量或活性的检测与标准的组织病理学规程一起来诊断乳腺癌，或进一步证实乳腺癌的诊断。这在组织病理学分析没有产生清晰结果时可以是尤其有用的。
可以在样品中检测TAZ多肽和核酸的存在和数量，如下文更为详细地描述的。如此，可以通过如下方法来诊断TAZ相关疾病(包括乳腺癌)，所述方法包括从自受试者衍生的样品测定TAZ多肽或TAZ mRNA的异常降低或升高的表达、量或活性，诸如升高的表达、量或活性。
所述样品可以包含来自患有或怀疑患有与升高的、降低的或在其它方面异常的TAZ表达、量或活性(包括表达、量或活性的水平或样式的空间或时间变化)有关的疾病的生物体或个体的细胞或组织样品。比较患有或怀疑患有此类疾病的生物体中的TAZ表达、量或活性的水平或样式与正常生物体中的表达、量或活性的水平或样式可以有效作为诊断疾病的手段。
所述样品可以包含来自患有或怀疑患有乳腺癌的个体的细胞或组织样品，诸如乳房组织或细胞样品。
在一些实施方案中，在样品中检测出TAZ的表达、量或活性水平升高。在与正常细胞或已知不是癌性的细胞相比时，TAZ的水平可以是程度显著地升高的。可以自所测试的个体，或另一名个体诸如那些与所测试个体在年龄、体重、生活方式等方面匹配的个体获得此类细胞。
在一些实施方案中，TAZ的表达、量或活性水平升高10％、20％、30％或40％或更多。在一些实施方案中，TAZ的表达、量或活性水平升高45％或更多，诸如50％或更多，如通过cDNA杂交所判断的。
可以以多种方式来检测TAZ的表达、量或活性，如本领域中已知的，和如下文更为详细地描述的。通常，测量来自个体的组织样品中的TAZ量，并与来自不受影响的个体的样品比较。可以测量TAZ核酸以及TAZ多肽水平两者。
可以使用TAZ量、活性或表达的检测来对乳腺癌分级。例如，高水平的TAZ量、活性或表达可以指明攻击性、侵入性或转移性癌症。类似地，低水平的TAZ量、活性或表达可以指明非攻击性、非侵入性或非转移性癌症。此分级系统可以与已经建立的分级系统诸如Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(也称为Nottingham分级系统(NGS))(5，6，Haybittle等，1982)一起使用。
此系统是研究最多且广泛使用的乳房肿瘤分级方法。NGS基于表型评分规程，其牵涉对肿瘤细胞的形态学和细胞学特征进行显微镜检查评估，包括小管形成的程度、细胞核多形性和有丝分裂计数(6)。这些得分的总和将乳房肿瘤分层成等级I(G1)(充分分化的、缓慢生长中的)、等级II(G2)(中等分化的)、和等级III(G3)(较差分化的、高度增殖性的)恶性肿瘤。
可以使用许多不同技术来测定TAZ基因表达的水平。
在RNA水平测量TAZ的表达
可以在RNA水平检测TAZ基因表达。
因此，在一个实施方案中，我们公开了一种在样品中检测包含TAZ核酸的核酸的存在的方法，其如下进行，即使所述样品与对TAZ核酸特异性的至少一种核酸探针接触，并对所述样品监测TAZ核酸的存在。例如，所述核酸探针可以特异性结合TAZ核酸或其一部分，并检测两者之间的结合；也可以检测复合物自身的存在。
如此，在一个实施方案中，可以在样品中测量TAZ mRNA形式的TAZ核酸的量。可以通过原位杂交、Northern印迹和逆转录酶-聚合酶链式反应来测定TAZ mRNA。可以通过原位杂交、Southern印迹、单链构象多态性、PCR扩增和DNA芯片分析来鉴定核酸序列，其使用特异性引物(Kawasaki，1990；Sambrook，1992；Lichter等，1990；Orita等，1989；Fodor等，1993；Pease等，1994)。
可以使用RNA提取技术(包括例如使用酸性酚/异硫氰酸胍提取(RNAzolB；Biogenesis)或RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen))自细胞提取TAZ RNA。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀测定法(nuclear run-on assay)、RT-PCR和RNA酶保护测定法(Melton等，Nuc.Acids Res.12：7035)。可以采用的检测方法包括放射性标记物、酶标记物、化学发光标记物、荧光标记物和其它合适的标记物。
这每一种方法容许进行定量测定，并且是本领域公知的。因此，可以使用本领域公知的对多核苷酸定量的任何方法在RNA水平测量降低的或升高的TAZ表达、量或活性。可以使用来自TAZ序列的任何合适的探针(例如合适的人TAZ序列的任何部分)作为探针。用于设计TAZ探针的序列可以包括具有登录号NM_015472的序列，或其部分。
典型地，使用RT-PCR来扩增RNA靶物。在此过程中，使用逆转录酶来将RNA转变成互补DNA(cDNA)，然后可以扩增所述互补DNA以便于检测。
许多DNA扩增方法是已知的，其中大多数依赖于酶促链式反应(诸如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、或自主序列复制)或者复制它被克隆其中的载体的整个或部分。
许多靶物和信号扩增方法已经记载于文献中，例如这些方法的一般性综述记载于Landegren，U.等，Science 242：229-237(1988)和Lewis，R.，GeneticEngineering News 10：1，54-55(1990)。
例如，可以采用聚合酶链式反应来检测TAZ mRNA。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是一种核酸扩增方法，其特别记载于美国专利号4,683,195和4,683,202。在诊断背景中可以使用PCR来扩增任何已知的核酸(Mok等，1994，Gynaecologic Oncology 52：247-252)。自主序列复制(3SR)是TAS的变型，其牵涉经由连续多轮由酶混合物和合适寡核苷酸引物介导的逆转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性来等温扩增核酸模板(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和4种寡核苷酸，每条靶链两种。此技术记载于Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，1989，Genomics 4：560。在Qβ复制酶技术中，使用噬菌体Qβ的RNA复制酶(其复制单链RNA)来扩增靶DNA，如记载于Lizardi等，1988，Bio/Technology6：1197的。
PCR规程基本上牵涉：(1)处理所提取的DNA以形成单链互补链；(2)添加一对寡核苷酸引物，其中该对中的一条引物与有义链中的序列的一部分基本上互补，而每对中的另一条引物与互补反义链中的相同序列的不同部分基本上互补；(3)使配对引物与互补序列退火；(4)从每条引物的3’末端同时延伸退火的引物以合成与每条引物退火的链互补的延伸产物，其中所述延伸产物在与互补物分开后为每对中的另一条引物充当用于合成延伸产物的模板；(5)分开所述延伸产物与所述模板以生成单链分子；并(6)通过重复至少一次所述退火、延伸和分开步骤来扩增所述单链分子。
可以采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。也可以使用定量RT-PCR。此类PCR技术是本领域公知的，并且可以采用来自TAZ序列的任何合适的引物。
也可以利用备选的扩增技术。例如，滚环扩增(Lizardi等，1998，Nat Genet19：225)是由DNA聚合酶驱动且能在等温条件下以线性或几何动力学复制环状寡核苷酸探针的商品化扩增技术(RCATTM)。一种别的技术，即链置换扩增(SDA；Walker等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：392)以对特定靶物独特的明确限定的序列开始。
在多肽水平测量TAZ表达
可以在多肽水平检测TAZ表达。
因此，在又一个实施方案中，可以通过检测样品中TAZ多肽的存在或量来检测TAZ表达、量或活性。这可以是通过使用结合TAZ多肽的分子来实现的。直接或间接结合TAZ多肽以便检测其存在的合适分子/试剂包括天然存在的分子诸如肽和蛋白质，例如抗体，或者它们可以是合成分子。
如此，我们公开了一种检测TAZ多肽的存在的方法，即使细胞样品与能够结合所述多肽的抗体接触，并对所述样品监测所述多肽的存在。
例如，可以使用抗TAZ抗体来检测TAZ多肽。可以通过本领域已知的手段(如下文更为详细地描述的)来生成此类抗体。例如，抗TAZ抗体可以包含针对TAZ之TAZ氨基酸残基160-229的抗体，例如抗肽抗体。
这可以方便地通过监测抗体与多肽之间形成的复合物的存在，或者监测多肽与抗体之间的结合来实现。检测两个实体之间的结合的方法是本领域已知的，并且包括FRET(荧光共振能量转移)、表面等离振子共振等。
可以使用标准的实验室技术诸如如上文所描述的免疫印迹来检测TAZ蛋白水平改变，如与相同细胞群体中的未处理细胞相比的。
也可以通过检测TAZ多肽的翻译后加工或TAZ核酸的转录后修饰的变化来测定基因表达。例如，可以测量TAZ多肽的差异磷酸化、对TAZ多肽的切割或对TAZ RAN的可变剪接等。可以使用专有的蛋白质测定法或技术诸如2D聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测基因产物诸如TAZ多肽的表达水平以及它们的翻译后修饰。
可以用于测定TAZ蛋白在自宿主衍生的样品中的水平的测定技术是本领域技术人员公知的。可以通过本领域已知的任何方法来对抗体测定免疫特异性结合。
可以使用的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统，诸如Western印迹、放射性免疫测定法、ELISA、三明治式免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射计量测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。此类测定法是本领域中常规的(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，通过提及而完整收入本文)。
可以通过免疫组织化学和免疫细胞化学染色来对标本测定多肽/蛋白质(一般参见Stites和Terr，Basic and Clinical Immunology，Appleton and Lange，1994)、ELISA、RIA、免疫印迹、Western印迹、免疫沉淀、功能测定法和蛋白质截短测试。其它测定方法包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。
ELISA测定法是本领域技术人员公知的。可以在测定法中使用多克隆和单克隆抗体两者。若合适的话，可以使用本领域技术人员已知的其它免疫测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)。可用的免疫测定法广泛记载于专利和科学文献中。参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521以及Sambrook等，1992。
检测TAZ诱导的多肽的表达
如实施例中所显示的，TAZ诱导IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1、FBN2AXL、ITGB2、CRIM1和Alcam的表达。
IFGBP3具有GenBank登录号AAA52706。ADAMTS1具有GenBank登录号AAZ73034。CTGF具有GenBank登录号CAA63267。Cyr61具有GenBank登录号CAG38757。FSTL1具有GenBank登录号NP_009016。FN1具有GenBank登录号AAH05858。FBN1具有GenBank登录号AAH94721。ITGB2具有GenBank登录号AAH21077。CRIM1具有GenBank登录号AAQ88737。Alcam具有GenBank登录号AAB59499。
因而，可以在核酸水平或多肽水平使用这些蛋白质之任一种或多种的表达作为代替来检测TAZ表达，如上文所描述的。
更一般地，可以检测这些蛋白质之任一种或多种的表达作为诊断癌症(包括乳腺癌诸如转移性、攻击性或侵入性乳腺癌)或致癌性或转移性细胞的手段。可以通过上文所描述的任何方法来完成此类表达的检测。
诊断试剂盒
我们还提供了用于检测个体中的乳腺癌或个体中对乳腺癌的易感性的诊断试剂盒。
诊断试剂盒可以包含用于检测个体中的TAZ表达、量或活性的手段，其通过如本文件中所描述的任何手段来进行。因此，诊断试剂盒可以包含下列任何一项或多项：TAZ多核苷酸或其片段；TAZ核酸的或其片段的互补核苷酸序列；TAZ多肽或其片段，或针对TAZ的抗体，诸如包含针对TAZ氨基酸残基160-229的抗TAZ抗体，例如抗肽抗体人TAZ抗体。
诊断试剂盒可以包含使用指令或其它指示(indicia)。诊断试剂盒可以进一步包含用于治疗或预防乳腺癌的手段，诸如本文件中所描述的任何组合物，或本领域已知的用于治疗乳腺癌的任何手段。具体地，诊断试剂盒可以包含如所描述的抗TAZ剂，例如通过筛选获得的。诊断试剂盒可以包含治疗药物诸如他莫昔芬(Tamoxifen，Nolvadex)或其变体诸如他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬或任何其它的抗雌激素或雌激素阻断剂。治疗药物也可以包含抗TAZ抗体。
预防和治疗方法
我们公开了治疗与TAZ表达或活性的量不足有关的异常状况诸如乳腺癌的方法。预防乳腺癌(即防范)的方法也适合采用相同或类似的办法。
一般而言，我们的方法牵涉通过调控(诸如下调)细胞中的TAZ表达、量或活性来操作癌细胞。可以在操作步骤之前或之后进行检测细胞中受到调控的TAZ表达、量或活性的步骤。检测步骤可以检测上调的或下调的TAZ表达、量或活性。可以使用调控或下调TAZ的任何方法，如本文件中别处详细描述的。
所述方法可以包括将细胞暴露于siRNA或shRNA或能够特异性结合TAZ的抗TAZ抗体。可以通过靶向选自下组的TAZ靶位点来调控TAZ：KD-1(5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、KD-650(5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或KD-652(5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。
依照我们的方法，由于所述操作，癌细胞变为非癌性的或者侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。具体地，癌症可以包括乳腺癌。它可以包括侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。
因为TAZ与癌症的攻击性和侵入性有关，可以在患有癌症的个体的细胞中、在癌或非癌细胞中检测TAZ的水平，并且评估癌症的攻击性。与正常的细胞相比高水平的TAZ量、表达或活性指明攻击性或侵入性癌症，因此可需要和选择更强的或更严厉的疗法。类似地，较低水平可指明攻击性或侵入性较小的疗法。
一般而言，可以使用本文所描述的办法来治疗任何TAZ相关疾病。TAZ相关疾病包括增殖性疾病，并且特别包括癌症。例如，TAZ相关疾病可以包括乳腺癌，诸如转移性、侵入性或攻击性乳腺癌。
若相对于对照而言与疾病有关的状况受到显著抑制(即达50％或更多)，则TAZ相关疾病被定义为得到“治疗”。所述抑制相对于对照而言可以达至少75％，诸如相对于对照而言达90％、95％或100％。所述状况可以包括细胞增殖，或者它可以包括细胞周期时间、细胞数目、细胞迁移、细胞侵入性等。术语“治疗”还包括预防或减轻癌症。
TAZ多肽表示疗法抑制其功能的靶物，特别是在肿瘤细胞和其它增殖性细胞中。
术语增殖性病症在本文中以广义使用，包括需要控制细胞周期的任何病症。具体地，增殖性病症包括恶性的和肿瘤发生前的(pre-neoplastic)病症。本文所描述的方法和组合物涉及治疗或诊断腺癌是尤其有用的，诸如：小细胞肺癌、和肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，可治疗的恶性肿瘤包括急性和慢性白血病(leukaemia)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、肉瘤(sarcoma)诸如纤维肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenicsarcoma)、脊索瘤(chordoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、结肠癌(colon carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胶质瘤(glioma)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cellcarcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweat gland carcinoma)、皮脂腺癌(sebaceous gland carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、乳头状腺癌(papillary adenocarcinomas)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓样癌(medullarycarcinoma)、支气管癌(bronchogenic carcinoma)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、肝瘤(hepatoma)、胆管癌(bile duct carcinoma)、精原细胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、宫颈癌(cervicalcancer)、睾丸肿瘤(testicular tumour)、肺癌(lung carcinoma)、小细胞肺癌(smallcelllung carcinoma)、膀胱癌(bladder carcinoma)、上皮癌(epithelial carcinoma)、胶质瘤(glioma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤(pinealoma)、成血管细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤(acousticneuoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤(melanoma)、成神经细胞瘤(neutroblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)。
一种有可能用于治疗此类病症的办法是表达针对如本文所描述的TAZ多核苷酸的反义构建体，并向肿瘤细胞施用它们，以便抑制基因功能并阻止肿瘤细胞生长或行进。
可以使用反义构建体来抑制基因功能以阻止增殖性细胞的生长或行进。反义构建体，即与有义核酸或mRNA互补的核酸诸如RNA构建体详细记载于US 6,100,090(Monia等)及Neckers等，1992，Crit Rev Oncog 3(1-2)：175-231，通过提及而明确收入所述文件的教导。
在一个具体的例子中，可以如下治疗或预防乳腺癌，即通过例如能够结合和破坏TAZ mRNA的siRNA来完全或部分降低TAZ的量、表达或活性。我们明确提供了一种通过RNA干扰来下调TAZ的抗TAZ剂。抗TAZ剂可以包含小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
抗TAZ剂可以包含shRNA 1(有义寡核苷酸序列5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、shRNA 650(有义寡核苷酸序列5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或shRNA 652(有义寡核苷酸序列5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。下文描述了生成此类shRNA的方法，并在实施例中详细地描述。
RNA干扰(RNAi)是一种通过直接引入双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且已经显现为用于敲除多种生物体中的特定基因的表达的有用工具。RNAi记载于Fire等，Nature 391：806-811(1998)。PTGS的其它方法是已知的，并且包括例如引入转基因或病毒。一般而言，在PTGS中，所沉默的基因的转录物被合成但不积累，因为其被快速降解。用于PTGS的方法(包括RNAi)记载于例如Ambion.com万维网网站，在目录“/hottopics/”中，在“rnai”文件中。
本文中描述了适用于体外RNAi的方法。一种此类方法牵涉引入siRNA(小干扰RNA)。当前的模型指明这些21-23个核苷酸的dsRNA能诱导PTGS。用于设计有效的siRNA的方法记载于例如上文所描述的Ambion网站。RNA前体诸如短发夹RNA(shRNA)也可以由整个或部分TAZ核酸序列编码。
或者，双链(ds)RNA是一种干扰一系列生物体中的基因表达的有力方式，最近已经显示了其在哺乳动物中是成功的(Wianny和Zernicka-Goetz，2000，Nat Cell Biol 2：70-75)。可以将对应于TAZ多核苷酸序列的双链RNA导入候选生物体的细胞和卵母细胞中或者在其中进行表达以干扰TAZ活性。
调控TAZ基因表达的其它方法是本领域技术人员已知的，并且包括显性负性办法。如此，另一种办法是使用本文件中的TAZ多肽的非功能性变体，其与内源基因产物竞争，导致功能抑制。
也可以通过引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子来调控TAZ基因表达。如此，可以向肿瘤或增殖性细胞施用通过本文所描述的测定法鉴定为结合或调控诸如下调TAZ多肽的量、活性或表达的化合物以阻止TAZ多肽的功能。可以与药学可接受载体一起以有效下调TAZ表达或活性的量施用此类化合物，或者通过活化或下调控制TAZ表达、活性或量的第二信号，由此减轻异常状况。
针对如本文中所描述的TAZ多肽的合适抗体也可以作为治疗剂使用。抗TAZ抗体可以包含针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体。此外，抗TAZ抗体可以包含下列任何一项或多项：家兔抗TAZ抗体(产品目录编号2149S，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)、家兔多克隆抗TAZ抗体(产品目录编号NB110-58359SS，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、小鼠单克隆抗TAZ[1B10](产品目录编号H00006901-M12，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、家兔抗人TAZ多克隆抗体(产品目录编号LS-B94，LifeSpanBiosciences，Inc.，Seattle，WA，USA)或p-TAZ(Ser 89)-R(产品目录编号sc-17610-R，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。
或者，可以采用基因疗法来控制受试者中相关细胞诸如乳腺细胞进行的TAZ内源生成。例如，可以工程化改造编码TAZ siRNA或其一部分的多核苷酸以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达，如下文所讨论的。然后可以分离逆转录病毒表达构建体，并导入用含有编码抗TAZ siRNA的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞中，使得所述包装细胞此刻生成含有感兴趣序列的感染性病毒颗粒。可以对受试者施用这些生产细胞以在体内工程化改造细胞，并在体内调控TAZ多肽的表达。关于基因疗法的综述，参见第20章，GeneTherapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches，(及其中所引用的参考文献)，于Human Molecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)。
在一些实施方案中，TAZ的水平在乳腺细胞中降低。此外，在此类实施方案中，治疗可以靶向乳腺细胞，或者是对乳腺细胞特异性的。TAZ的表达可以仅在患病的乳腺细胞(即那些癌性细胞)中特异性降低，而在其它不患病的乳腺细胞中基本上不降低。在这些方法中，TAZ的表达在其它细胞(即非乳腺细胞的细胞)中基本上不降低。如此，在此类实施方案中，TAZ的水平在治疗过程中或者在治疗后在非乳腺细胞中保持基本上相同或相似。
可以通过靶向施用，即仅向乳腺细胞而非其它细胞应用治疗来实现乳腺细胞特异性的TAZ水平降低。然而，在其它实施方案中，采用乳腺细胞中(而基本上不在其它细胞或组织类型中)的TAZ表达下调。为了例如siRNA的乳房特异性表达，此类方法可以有利地利用乳房特异性表达载体来进行，如下文更为详细地描述的。
转基因(抗TAZ siRNA)的乳房特异性表达
癌基因疗法不得不选择性靶向肿瘤组织从而降低正常组织中的不想要的副作用。将转基因表达靶向恶性组织需要使用特定的调控元件，包括基于肿瘤生物学的启动子、组织特异性启动子和诱导型调控元件(A1)。
基于肿瘤生物学的启动子
某些基因在乳腺癌中是上调的。可以使用这些基因的启动子来驱动转基因的肿瘤选择性表达，其使用重组复制缺陷型逆转录病毒载体来实现。此类基因的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)和VEGFR-2，已知它们在乳腺癌中以肿瘤阶段依赖性方式上调(A2)。c-erbB2癌基因在乳腺癌中选择性上调(A3，A6)。L-丝束蛋白(plastin)、即一种人肌动蛋白结合蛋白在恶性上皮细胞中而不是正常组织中进行组成型且丰富的表达，只是在成熟的造血细胞中有低水平表达(A4)。已经发现了抗凋亡基因Bcl-2在乳腺癌细胞中上调(A5)。与正常的乳房组织相比，人乳房肿瘤表达高水平的MUC1(A7)。
组织特异性启动子
某些基因在乳房组织中特异性表达。此类基因的例子是人α-乳清蛋白(ALA)和绵羊β-乳球蛋白(BLG)。可以使用此类基因的启动子来驱动腺病毒载体中的转基因以乳腺癌细胞特异性方式表达(A8)。可以通过修改对此组织具有亲和力的病毒诸如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)来进行乳腺癌的基因疗法。可以使用此逆转录病毒的糖皮质激素响应性长末端重复(LTR)作为启动子用于转基因的糖皮质激素诱导的表达(A9)。
诱导型启动子
使用诱导型启动子作为瞬时转基因表达的介导物。放射或化学治疗处理后，多种应激基因在乳房肿瘤中是上调的。此类应激基因的例子是热休克蛋白(HSP)(A10)和多药抗性基因-1(MDR-1)(A11)。因此，可以使用这些基因的启动子来驱动转基因在已经进行过放射或化学疗法的乳腺癌中的肿瘤特异性表达。
通常通过直接瘤内注射含有感兴趣转基因的复制缺陷型腺病毒表达载体来实现转录靶向的基因疗法(A6，A12，A13)。也可以通过瘤内注射与阳离子脂质体形成的脂质复合物来投递转基因(A14，A15)。
乳腺癌
依照本文所描述的方法和组合物，TAZ对于诊断或治疗乳腺癌是有用的。若本文件提及“癌症”，则这应当理解成包括转移性、攻击性或侵入性癌症。
有数种类型的乳腺癌。最通常的是导管癌，其在乳房乳管的衬里中开始。另一种类型(即小叶癌)在产生母乳的小叶中开始。若恶性肿瘤侵入邻近的组织，则其被称为浸润性或侵入性癌症。在乳腺癌在乳房外扩散时，通常在臂下的淋巴结中发现癌细胞。乳腺癌细胞可以扩散出乳房，诸如至其它淋巴结、骨、肝、或肺。
公认的乳腺癌阶段包括：
0期：极早期乳腺癌。此类型的癌症尚未在乳房内或乳房外扩散。它有时称作DCIS、LCIS、或乳腺原位癌症或非侵入性癌症。
I期：癌症的大小不大于约1英寸，并且尚未在乳房外扩散。(也描述为早期乳腺癌。)
II期：存在任何下列各项：癌症不大于1英寸，但是已经扩散至臂下的淋巴结；癌症在1和2英寸之间。它可以已经或者可以尚未扩散至臂下的淋巴结；癌症大于2英寸，但是尚未扩散至臂下的淋巴结。
III期和IIIA期：存在任何下列各项：癌症小于2英寸，并且已经扩散至臂下的淋巴结，癌症还正进一步扩散至其它淋巴结；癌症大于2英寸，并且已经扩散至臂下的淋巴结。
IIIB期：存在任何下列各项：癌症已经扩散至乳房附近的组织(皮肤、胸壁，包括胸腔中的肋骨和肌肉)；癌症已经扩散至胸壁内沿着胸骨的淋巴结。
IV期：癌症已经扩散至身体的其它部分，最通常是骨、肺、肝、或脑。或者，肿瘤已经局部扩散至颈内的皮肤和淋巴结，在锁骨附近。
炎性乳腺癌：炎性乳腺癌是罕见的，但是是极严重的攻击型乳腺癌。乳房可以显红色，并且感觉温暖。在乳房上可以有脊(ridges)、风团(welts)、或荨麻疹(hives)；或者皮肤可以显得具皱。它有时被误诊为简单感染。
复发性乳腺癌：复发性疾病指癌症在其已经得到治疗后又回复(复发)。它可以在乳房中、在胸腔(胸壁)的软组织中、或者在身体的另一部分中回复。
乳腺原位癌症-DCIS和LCIS
所找到的许多乳腺癌是称为乳腺原位癌症或非侵入性癌症的极早期癌症。大多数这些癌症是通过乳房X线照相术找到的。这些极早期细胞变化可以变为侵入性乳腺癌。两种类型的乳腺原位癌包括下列各项：
DCIS(原位导管癌)，其意味着仅在乳房乳管的衬里中找到异常细胞。异常细胞尚未在导管外扩散。它们尚未在乳房内扩散，尚未扩散出乳房，尚未扩散至臂下的淋巴结，或者尚未扩散至身体的其它部分。有数种类型的DCIS。若不除去，一些类型可随着时间而变化，并变为侵入性癌症。一些可能从未变为侵入性癌症。(DCIS有时被称作导管内癌)。
LCIS(原位小叶癌)，其意味着在乳小叶的衬里中找到异常细胞。虽然认为处于此非侵入性阶段的LCIS不是实际的乳腺癌，但是它是形成侵入性癌症风险升高的警告症候。对在乳房X线照片上发现的另一处肿块或不常见变化进行活检时有时找到LCIS。患有LCIS的患者具有25％的机率在接下去的25年期间在任一乳房中形成乳腺癌。
微钙化是不能感觉到，但是能在乳房X线照片上看到的极小的钙斑点。它们由正在快速分裂的细胞形成。在它们在乳房的一个区域中簇集时，这可以是乳腺原位癌症的早期症候。通过乳房X线照相术找到的约半数乳腺癌表现为微钙化簇。另一半表现为肿块。
诊断
我们的诊断方法可以与任何已知的乳腺癌诊断方法一起使用，包括检测已知的乳腺癌基因BRCA1和BRCA2之任一者或两者中的突变。或者/另外，可以如下实施诊断，即通过例如使用抗Her2抗体来检测Her2表达。
治疗
已知的针对乳腺癌的治疗可以由下列任何一项或多项组成：手术、放射疗法、化学疗法、高剂量化学疗法、激素疗法和免疫疗法。因而，本文所描述的任何治疗方法可以与任何一种或多种在先已知疗法组合。另外，可以使用任何一种或多种已知对治疗或减轻癌症有效的下列一般疗法。
非特异性免疫调节剂
非特异性免疫调节剂是刺激或间接提升免疫系统的物质。通常，这些药剂靶向关键的免疫系统细胞，并引起次反应诸如升高的细胞因子和免疫球蛋白生成。癌症治疗中使用的两种非特异性免疫调节剂是卡介苗(BCG)和左旋咪唑(levamisole)。本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类非特异性免疫调节剂一起使用。
生物学应答修饰剂
可以在实验室中生成一些抗体、细胞因子、和其它免疫系统物质以在癌症治疗中使用。这些物质通常称作生物学应答修饰剂(BRM)。它们改变身体的免疫防御与癌细胞之间的相互作用以加强、指导、或恢复身体抵抗疾病的能力。BRM包括干扰素、白介素、集落刺激因子、单克隆抗体、和疫苗。本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类生物学应答修饰剂一起使用。
干扰素(IFN)
有三种主要类型的干扰素—干扰素α、干扰素β、和干扰素γ；干扰素α是癌症治疗中最广泛使用的类型。
干扰素能改善癌症患者的免疫系统针对癌细胞起作用的方式。另外，干扰素可以直接对癌细胞起作用，其通过减缓它们的生长或促进它们形成更具正常行为的细胞来实现。一些干扰素还可以刺激NK细胞、T细胞、和巨噬细胞，加强免疫系统的抗癌功能。
本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类干扰素一起使用。
白介素(IL)
与干扰素一样，白介素是身体中天然存在的细胞因子。已经鉴定出许多白介素；白介素-2(IL-2或阿地白介素)已经在癌症治疗中进行了最广泛的研究。IL-2刺激许多能破坏癌细胞的免疫细胞诸如淋巴细胞的生长和活性。
本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类白介素一起使用。
集落刺激因子(CSF)
集落刺激因子(CSF)(有时称作造血生长因子)通常不直接影响肿瘤细胞；更确切地，它们促进骨髓干细胞分裂和发育成白细胞、血小板、和红细胞。骨髓对于身体的免疫系统是至关重要的，因为它是所有血细胞的来源。
G-CSF(非格司亭(filgrastim))和GM-CSF(沙格司亭(sargramostim))能增加白细胞的数目，由此降低接受化学疗法的患者的感染风险。G-CSF和GM-CSF还能刺激干细胞的生成，为干细胞或骨髓移植作准备；(促)红细胞生成素能增加红细胞的数目，并降低接受化学疗法的患者对输注红细胞的需要；而奥普瑞白介素(Oprelvekin)能降低接受化学疗法的患者对输注血小板的需要。
本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类集落刺激因子一起使用。
单克隆抗体(MOAB)
使用赫赛汀来治疗患有生成过量的称作HER-2的蛋白质的肿瘤的患者中的转移性乳腺癌。(约25％的乳腺癌肿瘤生成过量的HER-2)。在具体的实施方案中，本文所描述的治疗方法可以与施用抗Her2抗体(例如赫赛汀)组合给所关注的个体使用。
本文所描述的抗TAZ剂可以与任何此类单克隆抗体一起使用。
Her2/Neu
HER-2/neu(erbB-2)基因产物是185-kDA跨膜受体酪氨酸激酶，其属于表皮生长因子受体家族。其较为详细地记载于Reese，D.M.等，Stem Cells，15，1-8(1997)，通过提及而将其收入本文。
最近，已经对HER-2/neu在乳腺癌中的重要性给予了极大的关注。20-30％的人乳腺癌中过表达HER-2/neu，并且已经将升高的表达与不良的预后联系起来。此项发现已经导致赫赛汀，即针对HER-2/neu的抗体的开发，在测试中已经发现其延长转移性乳腺癌中的缓解(remission)时间。HER-2/neu是将生长信号传送至细胞核的细胞表面受体。赫赛汀表现为阻断这些信号，由此明显抑制HER-2/neu阳性乳腺癌中由HER-2/neu介导的细胞增殖。
也已经在卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌(salivary cancer)、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、和非小细胞肺癌的一部分中发现了HER-2/neu的过表达。可用赫赛汀潜在地治疗与HER-2-neu过表达有关的其它癌症。
因而，我们的诊断方法可以与在个体中检测Her2的过表达组合。同样地，在降低TAZ的活性、量或表达外，本文所描述的治疗方法可以包括对个体施用赫赛汀。因此，我们提供了TAZ核酸或TAZ多肽与抗Her2抗体一起的组合。我们还提供了抗TAZ抗体与抗Her2抗体一起的组合。在一些实施方案中，所述抗Her2抗体包含赫赛汀。
筛选抗TAZ剂
鉴定TAZ调控剂、激动剂和拮抗剂
可以使用拮抗剂，特别是小分子来特异性抑制TAZ以作为抗TAZ剂使用。
因此，我们公开了TAZ拮抗剂和小分子TAZ抑制剂，以及用于筛选这些的测定法。可以通过检测对结合或其它TAZ活性的调控诸如下调来筛选TAZ拮抗剂。也可以通过检测对TAZ和TAZ结合蛋白诸如TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4间的结合的调控来筛选TAZ拮抗剂。
因此，我们提供了一种能够下调TAZ多肽的表达、量或活性的化合物。可以在本文所描述的方法和组合物中使用此类化合物以治疗或预防癌症，特别是乳腺癌。
因此，可以在例如细胞、无细胞的制备物、化学文库、和天然产物混合物中使用TAZ来评估小分子物质和配体的结合。这些物质和配体可以是天然物质和配体，或者可以是结构或功能模拟物。参见Coligan等，CurrentProtocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)。此外，可以进行筛选以鉴定影响TAZ表达(特别是在乳腺细胞中)的因子。
一般而言，用于激动剂和拮抗剂的测定法依赖于测定候选分子对一种或多种TAZ活性的影响。测定法可以牵涉在存在候选分子的情况中，和任选地在没有候选分子的情况中，或者在存在已知抑制或活化TAZ活性的分子的情况中测定TAZ活性。可以通过检测TAZ与另一种实体诸如TAZ结合蛋白的结合来检测TAZ活性的测定法或调控剂。TAZ结合蛋白的例子包括TEAD1、TEAD2、TEAD3和TEAD4。因而，可以如下进行对TAZ活性的调控剂诸如TAZ拮抗剂的筛选，即提供TAZ和TEAD多肽，并在存在和没有候选分子的情况中检测它们之间的结合。感兴趣的分子是那些中断、减少、消除、破坏或以任何方式调控TAZ和TEAD多肽间的结合的分子。
我们已经证明了TAZ的表达在乳腺癌细胞中是升高的；因而，可以采用对TAZ表达的控制来治疗乳腺癌和其它癌症。因此，期望找到刺激TAZ的表达和/或活性，或者能抑制此蛋白质的功能的化合物和药物。一般而言，出于治疗和预防目的对任何已知癌症，特别是乳腺癌采用激动剂和拮抗剂。
“下调”包括对所研究行为的任何负面影响；这可以是完全的或者部分的。如此，在检测结合的情况中，候选拮抗剂能够降低、改善、或消除两个实体之间的结合。与在没有候选分子的情况中的结合(或无论哪种活性)相比，候选分子实现的结合(或任何其它活性)的下调可以是至少10％，诸如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。如此，适合于作为拮抗剂使用的候选分子是能够降低大于10％的结合或其它活性的分子。
术语“化合物”指化学化合物(天然存在的或合成的)诸如生物学大分子(例如核酸、蛋白质、非肽、或有机分子)，或自生物学材料诸如细菌、植物、真菌、或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物，或者甚至无机元素或分子。化合物可以是抗体。
潜在的TAZ拮抗剂的例子包括抗体、小分子、核苷酸及其类似物，包括嘌呤和嘌呤类似物，寡核苷酸或与TAZ的结合配偶紧密相关的蛋白质，例如结合配偶的片段，或如下的小分子等，所述小分子结合TAZ多肽，但不引发响应，使得该多肽的活性得到阻止。
筛选试剂盒
可以将要进行的此类筛选所必需的材料包装入筛选试剂盒中。
此类筛选试剂盒对于鉴定TAZ多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等或降低或增强TAZ生成的化合物是有用的。筛选试剂盒可以包含：(a)TAZ多肽；(b)表达TAZ多肽的重组细胞；或(c)针对TAZ多肽的抗体；或(d)TAZ结合蛋白诸如TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4。筛选试剂盒可以包含文库。筛选试剂盒可以包含筛选所需要的任何一种或多种成分，如下文所描述的。任选地，筛选试剂盒可以包含使用指令。
还可以提供能够在核酸水平检测TAZ表达的筛选试剂盒。此类试剂盒可以包含用于扩增TAZ的引物，或一对用于扩增的引物。可以自任何合适的序列(例如TAZ序列的一部分)选择所述一种或多种引物。鉴定引物序列的方法是本领域公知的，并且熟练技术人员会能够容易地设计此类引物。试剂盒可以包含用于TAZ表达的核酸探针，如本文件中所描述的。任选地，试剂盒还可以包含使用指令。
理性设计
可能能够与TAZ相互作用的候选化合物的理性设计可以基于TAZ多肽的分子形状的结构研究。
例如，我们已经建立了，TAZ的残基52和53牵涉TAZ和TEAD多肽之间的结合。实施例显示了这些位置任一处的TAZ突变体(例如F52A、F53A)破坏TAZ和TEAD多肽间的结合，破坏TAZ的细胞核定位，及破坏TAZ的致癌潜力。
因而，包含在第52位和第53位周围的TAZ序列的分子可以作为TAZ活性的调控剂使用，诸如通过调控TAZ和TEAD多肽间的结合，例如通过竞争性结合来实现。此类分子可以包括包含TAZ第52位和/或第53位的肽。
此外，可以设计来自TEAD(包括TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4)的TAZ结合区的肽，并对其测试对TAZ-TEAD结合活性的调控。
一种别的用于测定哪些位点与特定的其它蛋白质相互作用的手段是物理结构测定，例如X射线晶体学或二维NMR技术。
这些会提供关于哪些氨基酸残基形成分子接触区的指导。关于蛋白质结构测定的详细描述，参见例如Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography，Academic Press，New York。
多肽结合测定法
可以通过本领域已知的任何手段来鉴定TAZ活性或表达的调控剂和拮抗剂。
在它们的最简单形式中，测定法可以仅包括以下步骤，即混合候选化合物与含有TAZ多肽的溶液以形成混合物，测量混合物中的TAZ多肽活性，并比较混合物与标准品的活性。
此外，可以在检测TAZ与推定分子之间的结合的测定法中通过其对TAZ的结合来鉴定分子。
一类用于鉴定结合本文所描述的TAZ多肽的物质的测定法牵涉使固定化在固体支持物上的TAZ多肽与非固定化的候选物质接触，测定感兴趣的TAZ多肽与候选物质是否彼此结合和/或以何种程度彼此结合。或者，候选物质可以是固定化的，而如本文件中所列出的TAZ多肽是非固定化的。
所述物质与TAZ多肽的结合可以是瞬时的、可逆的或永久的。所述物质可以以如下的Kd值结合所述多肽，所述Kd值低于结合对照多肽(例如已知不涉及癌症生长或行进的多肽)的Kd值。所述物质的Kd值可以比结合对照多肽的Kd值小2倍，诸如比结合对照多肽的Kd小100倍的Kd值或小1000倍的Kd。
在一个例示性的测定方法中，可以在珠诸如琼脂糖珠上固定化TAZ多肽。通常，这可以如下实现，即在细菌、酵母或高等真核细胞系中以GST-融合蛋白表达TAZ多肽，并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠自粗制细胞提取物纯化GST-TAZ融合蛋白(Smith和Johnson，1988；Gene 67(10)：31-40)。作为对照，可以在没有TAZ多肽的情况中测定候选物质(其不是GST-融合蛋白)与固定化的多肽的结合。然后可以测定候选物质与固定化的TAZ多肽的结合。此类测定法在本领域中称为GST下拉(pulldown)测定法。再一次，候选物质可以是固定化的，而TAZ多肽是非固定化的。
使用不同亲和纯化系统(例如Ni-NTA琼脂糖和加有组氨酸标签的成分)固定化成分之一来实施此类型的测定法也是有可能的。
可以通过本领域公知的多种方法来测定多肽与候选物质的结合。例如，可以(用例如放射性标记物、表位标签或酶-抗体偶联物)标记非固定化的成分。或者，可以通过免疫学检测技术来测定结合。例如，可以对反应混合物进行Western印迹，并用检测非固定化成分的抗体探查印迹。也可以使用ELISA技术。
通常添加候选物质至1至1000nmol/ml，诸如1至100nmol/ml的终浓度。在抗体的情况中，所使用的终浓度通常自100至500μg/ml，诸如自200至300μg/ml。
也可以通过检测对TAZ与此多肽结合的任何分子之间的结合的调控，或对因此类结合或释放引起的任何活性的调控来鉴定TAZ的调控剂和拮抗剂。
基于细胞的测定法
基于细胞的测定法可以仅测试候选化合物的结合，其中借助于与候选化合物直接或间接关联的标记物或者在牵涉与经标记竞争剂竞争的测定法中检测对携带TAZ多肽的细胞的粘着。
此外，这些测定法可以测试候选化合物是否导致通过结合TAZ多肽产生的信号，其使用适合于在其表面上携带多肽的细胞的检测系统来实现。一般而言，在存在已知激动剂的情况中测定活化的抑制剂，并观察候选化合物的存在对激动剂进行的活化的影响。此类信号可以包括细胞核定位，其可以如实施例中所描述的那样测定。可以检测的另一种信号是致癌活性，其可以通过软琼脂测定法来测定，如实施例中所描述的。
另一种筛选化合物的方法利用用表达化合物文库的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。可以使用此类细胞(或是活的或是固定的形式)来进行标准结合配偶测定法。还可参见Parce等(1989)Science 246：243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA 87；4007-4011，其记载了用于检测细胞应答的灵敏方法。
竞争性测定法是特别有用的，其中使表达化合物文库的细胞与已知结合TAZ多肽的经标记抗体(诸如125I-抗体)、和测试样品诸如候选化合物(其就是要测量其对结合组分的结合亲和力的)接触或一起温育。然后分开结合的和游离的经标记TAZ多肽结合配偶以评估结合程度。所结合的测试样品量与结合TAZ多肽的经标记抗体量成反比。
可以使用众多技术之任一种来分开结合的与游离的结合配偶以评估结合程度。此分开步骤通常可牵涉如下规程，诸如对滤器的粘着，接着进行清洗，对塑料的粘着，接着进行清洗，或细胞膜离心。
所述测定法可以牵涉将候选分子暴露于细胞，诸如乳腺细胞，并通过任何合适的手段来测定TAZ的表达。任选地，可以选择在此类测定法中下调TAZ表达的分子，用于进一步的研究，和作为下调TAZ表达的药物使用。可以有效地采用此类药物来治疗或预防乳腺癌。
也可以使用编码TAZ蛋白的cDNA和针对所述蛋白质的抗体来配置用于检测添加的化合物对细胞中TAZ mRNA和蛋白质生成的影响的测定法。例如，可以构建如下的ELISA，其用于通过本领域已知的标准方法使用单克隆和多克隆抗体来测量分泌的或细胞结合的TAZ多肽水平，并且这可以用于发现可抑制或增强自合适操作的细胞或组织生成TAZ蛋白的药剂(分别也称作拮抗剂或激动剂)。用于进行筛选测定法的标准方法是本领域中充分理解的。
活性测定法
用于检测调控剂或拮抗剂的测定法通常牵涉在存在候选分子的情况中检测对TAZ的任何活性的调控，任选地，以及在没有候选分子的情况中检测对活性的调控。
可检测的活性可以包含任何TAZ依赖性活性，诸如结合活性。已知TAZ在质膜上经由PDZ基序结合SLC9A3R2，并且可以通过本领域已知的手段例如GST下拉测定法来测定TAZ对SLC9A3R2的结合活性。可以固定化TAZ和SLC9A3R2之一，而另一个进行放射性标记。然后可以在TAZ暴露于SLC9A3R2后通过测定所捕获的放射性活性来检测TAZ对SLC9A3R2的结合。
类似地，已知TAZ经由磷酸丝氨酸结合基序RSHSSP在体内和在体外结合YWHAZ。因而，可以经由本领域已知的手段诸如上文所描述的技术来检测TAZ对YWHAZ结合的检测，并可以测定对此类结合的调控以检测TAZ的调控剂或拮抗剂。
显示了TAZ结合TEAD多肽，包括TEAD1、TEAD2、TEAD3和TEAD4。因此，可以通过本领域已知的手段诸如本文件中所描述的技术来检测TAZ和TEAD多肽间的结合，并可以测定对此类结合的调控以检测TAZ的调控剂或拮抗剂。
也可以使用检测TAZ的特定生物学活性的测定法。测定法通常牵涉使候选分子(例如处于文库形式)与TAZ(无论处于多肽、编码多肽的核酸、还是处于包含其的细胞、细胞器、提取物或其它材料形式)及候选调控剂接触。可以检测TAZ的相关活性(如下文所描述的)，以建立候选调控剂的存在是否有任何效果。
或者/另外，可以使用如由Kanai(2000)所描述的测定TAZ和14-3-3之间的结合来检测TAZ的调控剂。Hong等(2005)描述了检测RUNX2依赖性基因转录的TAZ依赖性共激活的测定法。Murakami等(2005)描述了TAZ对TBX5的反式激活。
可以在存在或没有候选调控剂的情况中实施由Kanai(2000)、Hong等(2005)或Murakami等(2005)所描述的测定法，并检测合适的活性以检测对TAZ活性的调控，因此鉴定TAZ的候选调控剂和/或拮抗剂。
也可以使用用于检测结合和/或影响TAZ的转录或表达的候选调控剂的启动子结合测定法。然后可以为进一步研究而选择候选调控剂，或者为了使用而分离候选调控剂。此类筛选规程的详情是本领域公知的，并且例如记载于Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)。
本文所描述的筛选方法可以采用体内测定法，虽然它们可以为了体外使用而进行设定。体内测定法一般牵涉将包含TAZ的细胞暴露于候选分子。在体外测定法中，将TAZ暴露于候选分子，任选地，在存在其他成分诸如粗制的或半纯化的细胞提取物，或纯化的蛋白质的情况中。若进行体外测定法，则这些可以采用候选分子的阵列(例如阵列化的文库)。可以采用体内测定法。因此，TAZ多肽可包含在细胞中，诸如以异源方式。此类细胞可以是转基因细胞，其已经进行过工程化改造以表达如上文所描述的TAZ。
若采用提取物，则它可以包含细胞质提取物或细胞核提取物，其制备方法是本领域公知的。
应当领会的是，可以采用包含TAZ的细胞的任何成分，诸如细胞器。一个实施方案利用细胞质或细胞核制备物，例如包含细胞核，其包含如所描述的TAZ。细胞核制备物可以包含一个或多个细胞核，其可通过例如去污剂处理来透化(permeabilise)或半透化。
如此，在一个具体的实施方案中，测定形式可以包括下列各项：建立多孔微量滴定板，每孔中包括一个或多个表达TAZ多肽的细胞；可以将自例如文库衍生的个别候选分子，或候选分子的集合添加至各个孔，并测量对TAZ活性的调控。若使用集合，则可以将这些细分成进一步的集合，并以相同的方式测试。然后可以测定TAZ活性，例如结合活性或转录共活化活性，如本文件别处所描述的。
作为上文所描述的测定方法的替代或附加，也可以使用“扣除”规程来鉴定TAZ的调控剂或拮抗剂。在此类“扣除”规程下，提供了多种分子，其包含一种或多种能够发挥调控剂功能的候选分子(例如细胞提取物、细胞核提取物、分子文库等)，并从所述多种分子除去、消减或扣除一种或多种成分。然后通过暴露于包含所述TAZ的细胞(或其成分)来对“扣除后的”提取物等测定活性。
如此，例如，可以进行“免疫消减”测定法来如下鉴定此类调控剂。可以自细胞制备细胞质或细胞核提取物。可以消减或分级提取物来除去推定的调控剂，诸如通过使用用合适的抗体进行的免疫消减来实现。若提取物消减去调控剂，则它会丧失影响TAZ功能或活性或表达的能力。可能需要一系列扣除和/或消减来鉴定调控剂或拮抗剂。
还应当领会的是，可以使用上文的“消减”或“扣除”测定法作为初步步骤来鉴定推定的调控因子以进行进一步筛选。此外/或者，可以使用“消减”或“扣除”测定法来证实通过其它手段(例如如本文件别处所描述的“正”筛选)鉴定为推定的调控剂的分子的调控活性。
可以分离进行所述测定法并发现为感兴趣的候选分子，并进行进一步研究。分离感兴趣分子的方法会取决于所采用分子的类型、其是否处于文库形式、在任一时间测试多少候选分子、是否遵循分批规程等。
可以以文库形式提供候选分子。在一个实施方案中，可以同时筛选超过一种候选分子。可以通过本领域已知的手段来生成候选分子的文库，例如，小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(诸如组合文库)、反义分子诸如反义DNA或反义RNA的文库、抗体文库等。此类文库适合于高通量筛选。可以将包含TAZ的不同细胞暴露于文库的各成员，并测定对TAZ活性的影响。可以为此目的采用阵列技术。细胞在空间上可以是分开的，例如在微量滴定板的孔中。
在一个实施方案中，采用小分子文库。“小分子”指其分子量可以小于约50kDa的分子。在具体的实施方案中，小分子可以具有小于约30kDa，诸如小于约15kDa或小于约10kDa左右的分子量。此类小分子的文库(在本文称为“小分子文库”)可以含有多肽、小肽，例如20个氨基酸或更少(例如15、10或5个氨基酸)的肽、简单化合物等。
或者/另外，可以对组合文库(如下文更为详细地描述的)筛选TAZ的调控剂或拮抗剂。上文描述了用于TAZ活性的测定法。
文库
可以在本文所描述的TAZ拮抗剂和抑制剂的筛选中采用候选分子的文库，诸如多肽或核酸的文库。将此类文库暴露于TAZ蛋白，并测定它们对蛋白质活性的影响，若有的话。
用于分离大文库的想要成员的选择方案是本领域已知的，如噬菌体展示技术所代表的。已经证明了此类系统(其中多种多样的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上(Scott和Smith(1990见上文))可用于创建抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库来体外选择和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段。将编码VH和VL区的核苷酸序列与编码将它们指引至大肠杆菌(E.coli)的周质空间的前导信号的基因片段连接，因此所得的抗体片段展示在噬菌体的表面上，通常作为与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)的融合物。或者，在λ噬菌体壳体上在外部展示抗体片段(噬菌体抗体(phagebody))。基于噬菌体的展示系统的优点在于，因为它们是生物学系统，所以能仅仅通过在细菌细胞中培养含有选定文库成员的噬菌体来扩增选定的文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和随后的遗传操作是相对直接的。
用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的(McCafferty等(1990)见上文；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等(1991)Nature，352：624；Lowman等(1991)Biochemistry，30：10832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling等(1991)Gene，104：147；Marks等(1991)见上文；Barbas等(1992)见上文；Hawkins和Winter(1992)J Immunol.，22：867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner等(1992)Science，258：1313，通过提及而收入本文)。若对于表达(一般是多肽文库的)必要的话，可以修改此类技术。
一种特别有利的办法是scFv噬菌体文库的使用(Bird，R.E.等(1988)Science 242：423-6，Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty等(1990)见上文；Clackson等(1991)见上文；Marks等(1991)见上文；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks等(1992)见上文)。展示在噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的各种实施方案已经有记载。噬菌体展示办法的改进也是已知的，例如如记载于WO96/06213、WO92/01047(MedicalResearch Council等)和WO97/08320(Morphosys，见上文)的，通过提及而将其收入本文。
备选的文库选择技术包括噬菌体λ表达系统，其可以直接以噬菌体噬斑或者以溶源体菌落筛选，均如先前所记载的(Huse等(1989)Science，246：1275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并且在本文所描述的方法和组合物中使用。可以使用这些表达系统来筛选文库中约106或甚至更高阶的众多不同成员。其它筛选系统依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早期方法牵涉在一组针或棒上合成肽，诸如记载于WO84/03564的。一种牵涉珠上的肽合成的类似方法(其形成肽文库，其中每粒珠是单个文库成员)记载于美国专利号4,631,211，而一种相关方法记载于WO92/00091。基于珠的方法的显著改进牵涉用独特的标识标签诸如寡核苷酸给每粒珠加上标签，以便促进对每个文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些改良的基于珠的方法记载于WO93/06121。
另一种化学合成方法牵涉以如下方式在表面上合成肽(或肽模拟物(peptidomimetics))的阵列，所述方式在阵列中在离散的、预定的位置处放置每个独特的文库成员(例如独特的肽序列)。每个文库成员的身份由其在阵列中的空间位置决定。测定阵列中发生预先确定的分子(例如受体)与反应性文库成员之间的结合相互作用的位置，由此基于空间位置来鉴定反应性文库成员的序列。这些方法记载于美国专利号5,143,854；WO90/15070和WO92/10092；Fodor等(1991)Science，251：767；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26：271。
用于生成多肽或核苷酸文库的其它系统牵涉使用无细胞的酶促机器(machinery)来在体外合成文库成员。在一种方法中，通过交替多轮的针对靶配体的选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249：505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346：818)。可以使用类似的技术来鉴定结合预先确定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic AcidsRes.，18：3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似的方式，可以使用体外翻译来合成多肽，作为一种用于生成大文库的方法。这些一般包含稳定化的多核糖体复合物的方法进一步记载于WO88/08453，WO90/05785，WO90/07003，WO91/02076，WO91/05058，和WO92/02536。不基于噬菌体的备选展示系统诸如那些披露于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的展示系统使用多核糖体来展示多肽以进行选择。也通过提及而将这些和所有上述文件收入本文。
文库可以特别包含锌指文库；锌指是本领域中已知的，并且充当转录因子。合适的锌指文库披露于例如WO 96/06166和WO 98/53057。锌指文库的构建可以利用关于测定与特定DNA序列的相互作用的规则，如披露于例如WO 98/53058和WO 98/53060的。能够与甲基化DNA特异性相互作用的锌指披露于WO 99/47656。可以以阵列形式固定化上述锌指文库，例如如披露于WO 01/25417的。
组合文库
文库，特别是候选分子的文库可以适当地处于组合文库(也称为组合化学文库)的形式。
“组合文库”在该术语在本文件中使用时指由随机选择的亚基组成的多种化学化合物的集合。可以对组合文库筛选能够抑制TAZ的分子。
化学化合物的多种组合文库是目前可用的，包括对蛋白水解酶和非蛋白水解酶有活性的文库、G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂和拮抗剂的文库、对非GPCR靶物(例如整联蛋白、离子通道、域相互作用、细胞核受体、和转录因子)有活性的文库和全细胞肿瘤学和抗感染靶物的文库等。在Dolle和Nelson(1999)，Journal of Combinatorial Chemistry，第1卷第4期，235-282中提供了组合文库，特别是其构建和用途的全面综述。还可参考Combinatorialpeptide library protocols(Shmuel Cabilly编，Totowa，NJ.：Humana Press，c1998.Methods in Molecular Biology v.87)。特定的组合文库和其构建方法披露于美国专利6,168,914(Campbell等)，以及Baldwin等(1995)，“Synthesis of a SmallMolecule Library Encoded with Molecular Tags，”J.Am.Chem.Soc.117：5588-5589，及那些文件中所提及的参考文献。
在一个实施方案中，筛选的组合文库是为了潜在地包括与细胞成分相互作用以影响基因表达的分子而设计的组合文库。例如，可以筛选针对染色质结构蛋白的组合文库。对于该实施方案有用的其它文库包括针对组蛋白修饰酶(例如组蛋白乙酰化或组蛋白甲基化酶)、或DNA修饰(例如DNA甲基化或脱甲基化)的组合文库。
记载化学组合文库、其生成和用途的别的参考文献包括那些可自URLhttp://www.netsci.org/Science/Combichem/获得的，包括The ChemicalGeneration of Molecular Diversity.Michael R.Pavia，Sphinx Pharmaceuticals，ADivision of Eli Lilly(1995年7月出版)；Combinatorial Chemistry：A Strategy forthe Future-MDL Information Systems discusses the role its Project Libraryplays in managing diversity libraries(1995年7月出版)；Solid SupportCombinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization，Adnan M.M.Mjalli and Barry E.Toyonaga，Ontogen Corporation(1995年7月出版)；Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally DirectedNon-Peptide Library.Sarvajit Chakravarty，Babu J.Mavunkel，Robin Andy，Donald J.Kyle*，Scios Nova Inc.(1995年7月出版)；Combinatorial ChemistryLibrary Design using Pharmacophore Diversity Keith Davies and Clive Briant，Chemical Design Ltd.(1995年7月出版)；A Database System for CombinatorialSynthesis Experiments-Craig James and David Weininger，Daylight ChemicalInformation Systems，Inc.(1995年7月出版)；An Information ManagementArchitecture for Combinatorial Chemistry，Keith Davies and Catherine White，Chemical Design Ltd.(1995年7月出版)；Novel Software Tools for AddressingChemical Diversity，R.S.Pearlman，Laboratory for Molecular Graphics andTheoretical Modeling，College of Pharmacy，University of Texas(1996年6月/7月出版)；Opportunities for Computational Chemists Afforded by the NewStrategies in Drug Discovery：An Opinion，Yvonne Connolly Martin，ComputerAssisted Molecular Design Project，Abbott Laboratories(1996年6月/7月出版)；Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University ofLouisville：A Description，Arno F.Spatola，Department of Chemistry，Universityof Louisville(1996年6月/7月出版)；Chemically Generated Screening Libraries：Present and Future.Michael R.Pavia，Sphinx Pharmaceuticals，A Division of EliLilly(1996年6月/7月出版)；Chemical Strategies For Introducing CarbohydrateMolecular Diversity Into The Drug Discovery Process.Michael J.Sofia，Transcell Technologies Inc.(1996年6月/7月出版)；Data Management forCombinatorial Chemistry.Maryjo Zaborowski，Chiron Corporation and Sheila H.De Witt，Parke-Davis Pharmaceutical Research，Division of Warner-LambertCompany(1995年11月出版)；及The Impact of High Throughput OrganicSynthesis on R&D in Bio-Based Industries，John P.Devlin(1996年3月出版)。
组合化学中的技术在用于产生新的药学前导物(pharmaceutical lead)的现代方法中获得广泛的接受(Gallop，M.A.等，1994，J.Med.Chem.37：1233-1251；Gordon，E.M.等，1994，J.Med.Chem.37：1385-1401)。使用的一种组合办法基于如下策略，其牵涉在每个固相支持物颗粒上合成含有不同结构的文库，使文库与可溶性受体相互作用，鉴定与大分子靶物相互作用的“珠”，并测定由鉴定出的“珠”携带的结构(Lam，K.S.等，1991，Nature 354：82-84)。此办法的一种备选是自固体支持物序贯释放化合物的确定等分试样，随后测定溶液中的活性，鉴定释放活性化合物的颗粒，并通过直接测序(Salmon，S.E.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712)，或者通过阅读其密码(Kerr，J.M.等，1993，J.Am.Chem.Soc.115：2529-2531；Nikolaiev，V.等，1993，Pept.Res.6：161-170；Ohlmeyer，M.H.J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10922-10926)来阐明其结构。
可以使用由Furka首次记载的用于产生肽的等摩尔混合物的简单原理来合成可溶性随机组合文库(Furka，A.等，1988，Xth International Symposium onMedicinal Chemistry，Budapest 1988；Furka，A.等，1988，14th InternationalCongress of Biochemistry，Prague 1988；Furka，A.等，1991，Int.J.PeptideProtein Res.37：487-493)。用于重复筛选的可溶性文库的构建也已经有记载(Houghten，R.A.等，1991，Nature 354：84-86)。K.S.Lam披露了使用不溶性随机组合文库的新的且有力得出乎意料的技术。Lam在固相支持物上合成随机组合文库，使得每个支持物具有一致分子结构的测试化合物，并在事先不从支持物除去测试化合物的情况中通过固相结合方案来筛选文库(Lam，K.S.等，1991，Nature 354：82-84)。
如此，候选分子的文库可以是合成的组合文库(例如组合化学文库)、细胞提取物、体液(例如尿液、血液、泪液、汗液、或唾液)、或者合成的或天然的产物的其它混合物(例如小分子的文库或发酵混合物)。
分子文库可以包括例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、或肽或蛋白质的片段；核酸(例如反义的；DNA；RNA；或肽核酸，即PNA)；适体；或碳水化合物或多糖。文库的每个成员可以是单个的或者可以是混合物(例如压缩的文库)的一部分。文库可以含有纯化的化合物或者可以是“脏的”(即，含有显著数量的杂质)。
也可以与本文所描述的方法一起使用商品化的文库(例如来自Affymetrix、ArQule、Neose Technologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、或Tripose)。
在如上文所描述的文库外，可以使用称作多样性文件的特殊文库来评估新方法的特异性、可靠性、或再现性。多样性文件含有许多化合物(例如1000种或更多种小分子)，其代表多类能潜在导致测定法中的非特异性检测的化合物。多样性文件是商品化的或者也可以自购自上文所列厂商的个别化合物装配。
抗TAZ抗体
抗TAZ剂(包括TAZ的拮抗剂或调控剂)(其可以用于调节此蛋白质的活性，例如用于治疗或预防疾病诸如癌症的方法，如本文件中所描述的)可以包括针对TAZ蛋白的抗体。
因此，我们提供了结合TAZ多肽、其片段、同源物、变体或衍生物的抗体。此类抗体在检测TAZ表达，并且特别在诊断TAZ相关疾病诸如乳腺癌中是有用的。其它抗体包括那些具有治疗活性的，即其可以以治疗方式用于治疗、管理或预防任何TAZ相关疾病(包括乳腺癌)。
能够结合TAZ的抗体的例子包括针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体、家兔抗TAZ抗体(产品目录编号2149S，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)、家兔多克隆抗TAZ抗体(产品目录编号NB110-58359SS，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、小鼠单克隆抗TAZ[1B10](产品目录编号H00006901-M12，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、家兔抗人TAZ多克隆抗体(产品目录编号LS-B94，LifeSpan Biosciences，Inc.，Seattle，WA，USA)或p-TAZ(Ser 89)-R(产品目录编号sc-17610-R，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。
此外，可以针对任何合适的表位(例如自TAZ蛋白衍生的表位)生成对TAZ特异性的抗体。合适的TAZ片段的序列可以包含TAZ的残基160-229，并且可以使用来自此序列的任何表位来生成特异性TAZ抗体。
出于本文件的目的，术语“抗体”指能够结合选定靶物的完整抗体或抗体片段。除非相反地规定，该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、天然的或工程化改造的抗体，包括嵌合的、CDR嫁接的和人源化的抗体，和使用噬菌体展示或备选技术生成的人工选择的抗体。该术语还包括单链、Fab片段和自Fab表达文库生成的片段。此类片段包括整个抗体中保留其对靶物质的结合活性的片段、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段，以及单链抗体(scFv)、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白和其它合成蛋白。小片段诸如Fv和ScFv由于其小尺寸和随后的卓越组织分布而在诊断和治疗应用方面拥有有利的特性。
抗体及其片段可以是人源化抗体，例如如记载于EP-A-239400的。此外，也可以使用具有完全人的可变区(或其片段)的抗体，例如如记载于美国专利号5,545,807和6,075,181的。中和性抗体(即那些抑制TAZ的任何生物学活性的抗体)可以用于诊断学和治疗学。
本文所描述的抗体可以是经过改变的抗体，其包含效应蛋白诸如标记物。可以使用容许在体内或在体外对抗体分布成像的标记物。此类标记物可以是放射性标记物或不透射线的标记物，诸如金属颗粒，其可容易地在胚胎或细胞团内显现。此外，它们可以是在组织样品上可显现的荧光标记物或其它标记物。
可以通过标准技术诸如通过免疫(接种)或者通过使用噬菌体展示文库来生成抗体。此类抗体可能够特异性结合TAZ蛋白或同源物、片段等。
多克隆抗体
若多克隆抗体是想要的，则可以用包含TAZ多肽或肽的免疫原性组合物来免疫选定的哺乳动物(例如小鼠、家兔、山羊、马等)。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来提高免疫学应答。此类佐剂包括但不限于弗氏，矿物凝胶诸如氢氧化铝，和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔
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血蓝蛋白、和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)是潜在有用的人佐剂，如果出于刺激系统防御的目的给免疫学受损的个体施用纯化的物质氨基酸序列，那么其可以被采用。
依照已知的规程收集和处理来自经过免疫的动物的血清。若含有针对自TAZ多肽可获得的表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于生成和加工多克隆抗血清的技术是本领域中已知的。为了可以制备此类抗体，我们还提供了作为半抗原与另一种氨基酸序列联合(haptenise)的TAZ氨基酸序列或其片段以在动物或人中作为免疫原使用。
单克隆抗体
本领域技术人员也能容易地生成针对自TAZ多肽或肽可获得的表位的单克隆抗体。用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，并且也可以通过其它技术诸如用致癌性DAN直接转化B淋巴细胞，或者用埃巴病毒进行转染来创建永生的抗体生成细胞系。可以对针对眶表位(orbit epitope)生成的数组单克隆抗体筛选各种特性，即同种型和表位亲和力。
可以使用提供由培养中的连续细胞系进行的抗体分子生成的任何技术来制备单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein(1975 Nature256：495-497)记载的杂交瘤技术、三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4：72；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，第77页-第96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
可以使用重组DNA技术来改善抗体，如本文所描述的。如此，可以构建嵌合抗体以在诊断或治疗应用中降低其免疫原性。此类技术包括将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有合适的抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312：604-608；Takeda等(1985)Nature 314：452-454)。此外，可以如下使免疫原性最小化，即通过CDR嫁接[参见欧洲专利申请0 239 400(Winter)]和任选地，框架修饰[EP 0 239 400]来使抗体人源化。
或者，可以改编为生成单链抗体而描述的技术(美国专利号4,946,779)以生成物质特异性单链抗体。
针对自TAZ多肽或肽可获得的表位的抗体(单克隆和多克隆两者)在诊断中是特别有用的。具体地，可以使用单克隆抗体来制备抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带所期望的保护针对的物质和/或媒介物的“内影像”(internalimage)的免疫球蛋白。用于制备抗独特型抗体的技术是本领域中已知的。这些抗独特型抗体在治疗中也可以是有用的。
也可以如下生成抗体，即在淋巴细胞群体中诱导体内生成或者筛选重组免疫球蛋白文库或数组高度特异性的结合剂，如披露于Orlandi等(1989，ProcNatl Acad Sci 86：3833-3837)及Winter G和Milstein C(1991；Nature349：293-299)的。
还可以生成含有针对多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab’)2片段和可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而生成的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以容许快速且容易地鉴定具有想要的特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等(1989)Science 256：1275-1281)。
也可以改编用于生成单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)来生成针对TAZ多肽的单链抗体。还有，可以使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。
可以采用上文所描述的抗体来分离或鉴定表达多肽的克隆或者通过亲和层析来纯化多肽。
抗体生成的重组技术
可以依照已建立的规程使用重组DNA技术在细菌或哺乳动物细胞培养物中生成抗体。选定的细胞培养系统可以分泌抗体产物。
因此，我们公开了一种用于生成抗体的方法，包括培养宿主(例如大肠杆菌或哺乳动物细胞)，并分离所述蛋白质，所述宿主已经用包含如下表达盒的杂合载体转化，所述表达盒包含启动子、与其可操作连接的编码信号肽的第一DNA序列、与第一DNA序列以符合正确读码框的方式连接的编码所述抗体蛋白质的第二DNA序列。
在合适的培养基中实施杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖，所述合适的培养基是常规的标准培养基，例如Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基，任选地，补充有哺乳动物血清，例如胎牛血清、或痕量元素和生长维持补充物，例如饲养细胞诸如正常的小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、运铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同样在本领域已知的合适培养基中实施宿主细胞(其是细菌细胞或酵母细胞)的增殖，例如对于细菌，在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、极端培养基(Terrific Broth)、SOB、SOC、2x YT、或M9基本培养基中，而对于酵母，在培养基YPD、YEPD、基本培养基、或完全极限撤除成分培养基(Complete Minimal Dropout Medium)中。
体外生成提供相对较纯的抗体制备物，并容许放大至给出大量的想要抗体。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或者在连续搅拌器反应器中，或者固定化的或俘获的(entrapped)细胞培养，例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷筒上。
也可以通过在体内增殖哺乳动物细胞来获得大量的想要抗体。出于此目的，将生成想要的抗体的杂交瘤细胞注射入组织相容性哺乳动物中以引起抗体生成肿瘤的生长。任选地，用烃引发(prime)动物，尤其是矿物油诸如姥鲛烷(四甲基十五烷)，之后进行注射。1至3周后，自那些哺乳动物的体液分离抗体。例如，将通过融合合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体生成脾细胞获得的杂交瘤细胞，或自杂交瘤细胞系Sp2/0衍生的生成想要的抗体的经转染细胞腹膜内注射入任选地用姥鲛烷预处理的Balb/c小鼠中，并在1至2周后，自动物采集腹水。
上述的和其它的技术记载于例如Kohler和Milstein，(1975)Nature256：495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，通过提及而收入本文。用于制备重组抗体分子的技术记载于上文的参考文献中，并且还记载于例如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597，通过提及而将它们收入本文。
对细胞培养物上清液筛选想要的抗体，其优先通过对PGC或其它多能细胞诸如ES或EG细胞的免疫荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定法(例如三明治式测定法或斑点测定法)、或放射性免疫测定法来进行。
为了分离抗体，可以通过例如用硫酸铵进行的沉淀、针对吸湿性材料诸如聚乙二醇进行的透析、流过选择性膜的过滤等来浓缩培养物上清液中或腹水中的免疫球蛋白。若必要和/或想要的话，通过常规的层析方法，例如凝胶过滤、离子交换层析、流过DEAE-纤维素的层析和/或(免疫)亲和层析(例如用抗原或其片段、或用蛋白A进行的亲和层析)来纯化抗体。
还提供了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞可以是遗传方面稳定的，分泌具有想要的特异性的单克隆抗体，并可以通过融化和再克隆自深度冷冻培养物活化。
还包括一种用于制备分泌针对TAZ多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于用一种或多种TAZ多肽或其抗原性片段免疫合适的哺乳动物例如Balb/c小鼠；融合经过免疫的哺乳动物的抗体生成细胞与合适的骨髓瘤细胞系的细胞，克隆在融合中获得的杂交细胞，并选择分泌想要的抗体的细胞克隆。例如，融合用TAZ免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞，对获得的杂交细胞筛选想要的抗体的分泌，并克隆阳性杂交瘤细胞。
我们描述了一种用于制备杂交瘤细胞系的方法，其特征在于在数月(例如2个和4个月之间)里通过数次(例如4至6次)皮下和/或腹膜内注射10和107和108个之间的表达TAZ的细胞和合适的佐剂来免疫Balb/c小鼠，并在最后一次注射后2至4天采集来自经过免疫的小鼠的脾细胞，并在存在融合促进剂诸如聚乙二醇的情况中与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。可以在含有约30％至约50％的分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合骨髓瘤细胞与3至20倍过量的来自经过免疫的小鼠的脾细胞。融合后，如上文所描述的那样在合适的培养基中扩充细胞，以有规律的时间间隔补充选择培养基，例如HAT培养基，以便阻止正常的骨髓瘤细胞长得超过想要的杂交瘤细胞。
还公开了包含插入物的重组DNA，所述插入物编码如上文所描述的针对TAZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域。根据定义，此类DNA包含编码单链DNA、由所述编码DNA构成及其互补DNA构成的双链DNA、或这些互补(单链)DNA自身。
此外，编码针对TAZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA可以是以酶促方式或以化学方式合成的DNA，其具有编码重链可变域和/或轻链可变域的真实DNA序列或其突变体。真实DNA的突变体是编码上文所提及抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA，其中删除一个或多个氨基酸或者一个或多个氨基酸用一个或多个其它氨基酸替换。修饰可以在抗体的重链可变域和/或轻链可变域的CDR外。还意图此类突变型DNA是沉默突变体，其中一个或多个核苷酸用其它核苷酸替换，新的密码子编码相同的氨基酸。此类突变型序列也是简并序列。简并序列在遗传密码的意义内是简并的，即不限数目的核苷酸用其它核苷酸替换，而不导致最初编码的氨基酸序列的变化。此类简并序列由于它们不同的限制性位点和/或特定宿主(特别是大肠杆菌)优选的特定密码子的频率(以便获得重链鼠可变域和/或轻链鼠可变域的最佳表达)而可以是有用的。
术语突变体意图包括依照本领域已知的方法通过在体外诱变真实DNA来获得的DNA突变体。
为了装配完整的四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合抗体，融合编码重链和轻链可变域的重组DNA插入物与编码重链和轻链恒定域的相应DNA，然后转移入合适的宿主细胞中，例如在掺入杂合载体中后。
还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域g，例如γ1、γ2、γ3或γ4，诸如γ1或γ4融合的针对TAZ的抗体的重链鼠可变域。同样的，还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域κ或λ诸如κ融合的针对TAZ的抗体的轻链鼠可变域。
在另一个实施方案中，我们公开了编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变域和轻链可变域经由间隔物基团而相连接，任选地，包含便于在宿主细胞中加工抗体的信号序列和/或编码便于纯化抗体的肽和/或切割位点和/或肽间隔物和/或效应分子的DNA。
意图编码效应分子的DNA是编码在诊断或治疗应用中有用的效应分子的DNA。如此，特别指明如下的效应分子，其是毒素或酶，特别是能够催化前药活化的酶。编码此类效应分子的DNA具有天然存在的酶的序列或者毒素编码DNA，或其突变体，并且可以通过本领域公知的方法来制备。
用途
可以在检测生物学样品中存在的TAZ多肽的方法中使用抗TAZ抗体，其通过包括如下各项的方法来进行：(a)提供抗TAZ抗体；(b)在容许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物学样品与所述抗体一起温育；并(c)测定是否形成包含所述抗体的抗体-抗原复合物。
合适的样品包括提取物组织诸如脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉和骨组织或者来自自此类组织衍生的赘生性生长。具体地，样品可以包含乳房组织，诸如来自怀疑患有乳腺癌的个体的乳房组织。
可以将抗体结合至固体支持物和/或在合适的容器中与合适的试剂、对照、指令等一起包装入试剂盒中。
抗体投递
可以依靠本领域已知的技术，例如通过使用脂质体、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺型胺类(polyamidoamine，PAMAM)树状聚物、HEMA、线性聚酰胺型胺类聚合物等)等将针对TAZ蛋白的抗体投递入细胞中。也可以将免疫球蛋白和/或抗体作为蛋白质融合物或与能够穿越质膜和/或核膜的蛋白质的偶联物投递入细胞中。例如，可以将免疫球蛋白和/或靶物与来自负责移位活性的此类蛋白质的域或序列融合或偶联。移位域和序列可以包括来自HIV-1反式活化蛋白(Tat)、果蝇(Drosophila)触角(Antennapedia)同源域蛋白和单纯疱疹-1病毒VP22蛋白的域和序列。
药物组合物和施用
虽然有可能单独施用抗TAZ剂，包括TAZ核酸、多肽、其片段、同源物、变体或衍生物，调控剂、激动剂或拮抗剂，结构相关化合物，或任一者的酸式盐，可以将活性成分配制为药学配制剂。
因此，我们还公开了包含抗TAZ剂的药物组合物。此类药物组合物可用于向个体投递抗TAZ剂诸如以如所描述的组合物的形式以治疗或减轻症状，如所描述的。
本文件的上下文中的药物组合物是至少包含抗TAZ剂(作为活性成分)的物质组合物。
药学配制剂包含有效量的抗TAZ剂以及一种或多种药学可接受载体。“有效量”指足以减轻如所描述的疾病的至少一种症状的量。
有效量会随要治疗或减轻的特定疾病或综合征、以及其它因素(包括患者的年龄和重量、疾病等状态是何种程度的晚期、患者的一般健康、症状的严重程度、和抗TAZ剂是单独施用还是与其它疗法组合施用)而有所变化。
合适的药学可接受载体是本领域公知的，并且随药学配制剂的想要的形式和施用模式而变化。例如，它们可以包括稀释剂或赋形剂诸如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂等。通常，载体是固体、液体或可蒸发的载体，或其组合。每种载体应当是“可接受的”，其意义为与配制剂中的其它成分是相容的而且对患者无害。载体应当是生物学可接受的，在对宿主施用时不会引发不利反应(例如免疫应答)。
涵盖的是，药物组合物的活性成分在例如减轻癌症、肿瘤、新生物和其它相关疾病中展现出治疗活性。可以调整剂量方案来提供最佳的治疗响应。例如，可以每天施用数个分剂或者可以按比例降低剂量，如治疗状况的紧急事件所指明的。
可以以方便的方式诸如通过口服、静脉内(在水溶性的情况中)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂路径或植入(例如使用缓慢释放分子)来施用活性化合物。根据施用路径，活性成分可能需要被包被在某种材料中以保护所述成分免于可灭活所述成分的酶、酸和其它天然条件的作用。
可以单独地或与其它治疗剂组合地施用抗TAZ剂。适合于本文中使用的其它治疗剂是对预期目的有效的任何相容性药物或与药剂配制剂互补的药物。可以与其它治疗同时或者序贯施用联合疗法中利用的配制剂，使得实现联合效果。
口服施用
在一些实施方案中，以口服组合物形式提供并相应施用TAZ活性、表达或量的抑制剂。TAZ活性、表达或量的抑制剂的剂量可以在约1mg/天至约10mg/天之间。
可以在片剂、胶囊或溶液形式的口服配制剂中施用药物组合物。每天对患者施用1至3次有效量的口服配制剂，直至疾病的症状得到减轻。
药剂的有效量取决于患者的年龄、重量和状况。一般而言，药剂的日口服剂量小于1200mg，且大于100mg。日口服剂量可以是约300-600mg。方便地以单位剂量形式呈现口服配制剂，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。组合物可以与合适的药学可接受载体一起配制成任何想要的剂量形式。典型的单位剂量形式包括片剂、丸剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳液、粒剂、胶囊、栓剂。一般而言，如下制备配制剂，即均一且密切地达到药剂组合物与液体载体和/或细碎的固体载体的联合，并在必要时，使产物成形。可以以液体、粉剂、片剂或胶囊形式将活性成分掺入各种基本材料中以给出有效量的活性成分来治疗疾病。
可以适当地与例如惰性稀释剂或可同化的、可食用的载体一起口服施用组合物，或者它可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它可以压制成片剂，或者它可以直接与饮食食物一起掺入。为了口服治疗性施用，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并且以可摄食的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、速溶片(wafer)等形式使用。会获得此类合适剂量的此类治疗有用组合物中的活性化合物的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列成分：粘合剂诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂诸如硬脂酸镁；并可以添加甜味剂诸如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。在剂量单位形式是胶囊时，在上述类型的材料外，它可以含有液体载体。
多种其它材料可以作为涂层存在或者以其它方式修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶/虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂、或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或桔香料。当然，制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是药学上纯的，且所采用的量基本上无毒。另外，可以将活性化合物掺入持续释放制剂和配制剂中。
可注射或静脉内施用
在一些实施方案中，作为可注射或静脉内组合物提供并相应施用抗TAZ剂。抗TAZ剂抑制剂的剂量可以在约5mg/kg/2周至约10mg/kg/2周之间。可以以10-300mg/天之间，诸如至少30mg/天，小于200mg/天或30mg/天至200mg/天之间的剂量提供抗TAZ剂抑制剂。
适合于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。在所有情况中，所述形式必须是无菌的，而且必须有存在容易的可注射性的程度的流动性。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，而且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用进行保存/防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
表面施用
本文所公开的药物组合物包括那些适合于表面和口服施用的，其中表面配制剂在受累组织主要是皮肤或表皮(例如，银屑病、湿疹和其它表皮疾病)的情况中是优选的。
表面配制剂包括如下那些药学形式，其中通过与要治疗的皮肤表面直接接触来外部应用所述组合物。供表面应用的常规药学形式包括浸泡液、软膏剂、乳剂、洗剂、糊剂、凝胶、贴片(stick)、喷雾剂、气雾剂、沐浴油、溶液等。通过各种媒介物投递表面疗法，媒介物的选择可以是重要的，并且一般涉及要治疗的是急性还是慢性疾病。作为一个例子，一般用水性干燥制剂治疗急性皮肤增殖疾病，而用水合制剂治疗慢性皮肤增殖疾病。浸泡液是干燥急性潮湿疹的最容易方法。洗剂(水悬浮液中的粉末)和溶液(溶解于溶剂中的药疗)对于多毛和擦烂区域是理想的。软膏剂或油包水乳剂是最有效的水合剂，适合于干燥的鳞屑疹，但是是多脂的，并且取决于损伤位置有时是不想要的。在适当时，它们可以与绷带联合应用，特别在想要提高药剂组合物透入损伤中时。乳剂或水包油乳剂和凝胶是可吸收的，并且在美容方面是患者最可接受的(Guzzo等，于Goodman & Gilman’s Pharmacological Basisof Therapeutics，第9版，第1593页-第15950页(1996))。一般而言，乳剂配制剂包括如下成分，诸如石油、羊毛脂、聚乙二醇、矿物油、甘油、棕榈酸异丙酯、硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、醋酸生育酚(tocopherylacetate)、肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)、羊毛脂醇、西甲硅油(simethicone)、卡波姆(carbomen)、甲基氯异噻唑啉酮(methylchlorisothiazolinone)、甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone)、环甲硅油(cyclomethicone)和羟丙基甲基纤维素，以及其混合物。
供表面应用的其它配制剂包括洗发剂、肥皂、摇荡剂等，特别是那些配制成在下面的皮肤诸如头皮上留下残留物的(Arndt等，于Dermatology InGeneral Medicine 2：2838(1993))。
一般而言，表面配制剂中的组合物浓度为约0.5至50％(按组合物的重量计)，诸如约1至30％，约2-20％，或约5-10％的量。最初，所使用的浓度可以在范围的上部部分中，随着治疗继续，可以降低浓度或者配制剂的应用频率可以更小。表面应用通常每天应用两次。然而，较大剂量的每天一次应用或较小剂量的较频繁应用可以是有效的。角质层可以起贮器作用，并容许药物在延长的一段时间里逐渐渗透入活的皮肤层中。
在表面应用中，足够量的活性成分必须渗透患者的皮肤，以便获得想要的药理学效果。一般了解的是，药物向皮肤中的吸收是药物性质、媒介物行为、和皮肤的函数。三个主要变量导致不同表面药物或不同媒介物中的相同药物的吸收或流出速率；媒介物中的药物浓度、角质层和媒介物之间的药物分配系数和角质层中的药物扩散系数不同。为了有效治疗，药物必须穿越负责皮肤屏障功能的角质层。一般而言，施加高的体外皮肤渗透的表面配制剂在体内是有效的。Ostrenga等(J.Pharm.Sci.，60：1175-1179(1971))证明了表面应用的类固醇的体内功效与体外类固醇进入取皮的(dermatomed)人皮肤中的渗透速率(rate)成比例。
可以将皮肤病学可接受的且与药剂相容的皮肤渗透增强剂掺入配制剂中以提高活性化合物自皮肤表面进入表皮角质形成细胞中的渗透。提高活性化合物进入皮肤的吸收的皮肤增强剂降低有效治疗所需要的药剂量，并提供持续更长的配制剂效果。皮肤渗透增强剂是本领域公知的。例如，已知二甲亚砜(美国专利No.3,711,602)；油酸、1，2-丁二醇表面活性剂(Cooper，J.Pharm.Sci.，73：1153-1156(1984))；乙醇和油酸或油醇的组合(EP 267,617)、2-乙基-1，3-己二醇(WO 87/03490)；癸基甲基亚砜和Azone.RTM.(Hadgraft，Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21：165-173(1996))；醇、亚砜、脂肪酸、酯、Azone.RTM.、吡咯烷酮、尿素和多元醇(polyoles)(Kalbitz等，Pharmazie，51：619-637(1996))；萜诸如1，8-桉油素、薄荷酮、柠檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy & Pharmocology，47：978-989(1995))；Azone.RTM.和Transcutol(Harrison等，Pharmaceutical Res.13：542-546(1996))；和油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh等，Pharmazie，51：741-744(1996))改善活性成分的皮肤渗透。
可以通过本领域技术人员已知的技术来确定药剂或组合物的渗透水平。例如，对活性化合物放射性标记，接着测量皮肤吸收的放射性标记的化合物的量使本领域技术人员能够使用测定测试化合物的皮肤渗透的数种方法之任一种来测定所吸收的组合物的水平。涉及皮肤渗透研究的出版物包括Reinfenrath，W G和G S Hawkins.The Weaning Yorkshire Pig as an AnimalModel for Measuring Percutaneous Penetration.于：Swine in BiomedicalResearch(M.E.Tumbleson编)Plenum，New York，1986，和Hawkins，G.S.Methodology for the Execution of In Vitro Skin Penetration Determinations.于：Methods for Skin Absorption，B W Kemppainen和W G Reifenrath编，CRC Press，Boca Raton，1990，第67页-第80页；及W.G.Reifenrath，Cosmetics & Toiletries，110：3-9(1995)。
对于一些应用，可以使用本领域已知的配制剂诸如聚合物来施用长效形式的药剂或组合物。可以依照本领域已知的方法将药剂掺入皮肤贴片(Junginger，H.E.，于Acta Pharmaceutica Nordica 4：117(1992)；Thacharodi等，于Biomaterials 16：145-148(1995)；Niedner R.，于Hautarzt 39：761-766(1988))或绷带中，以提高向要治疗的区域投递药物的功效。
任选地，本文所描述的表面配制剂可以具有例如别的赋形剂；防腐剂诸如对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸或季铵化合物；稳定剂诸如EDTA，抗氧化剂诸如丁羟甲苯或丁羟茴醚，和缓冲剂诸如柠檬酸盐和磷酸盐。
胃肠外施用
也可以胃肠外或腹膜内施用活性化合物。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在一些实施方案中，可以在30％Capsitol(CyDex，Inc.，Lenexa，Kansas，USA)中制备分散体。Capsitol是一种聚阴离子β-环糊精衍生物，其中磺酸钠盐通过丁基醚间隔基团，或磺丁基醚(SBE)与亲脂性空穴分开。环糊精可以是SBE7-β-CD。
佐剂
组合物可以在佐剂中施用，与酶抑制剂共施用或者在脂质体中施用。佐剂以其最广义使用，并且包括任何免疫刺激化合物诸如干扰素。本文中所涵盖的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂诸如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体。
微生物生长的预防
在贮存和使用的通常条件下，这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物生长。
可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来引起对微生物作用的预防。在许多情况中，有可能包括等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射组合物的吸收延长。
如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有上文所列举的各种其它成分的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着进行过滤灭菌。一般而言，分散体通过将经过灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中而制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自那些上文所列举的成分的所需其它成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥技术，其自先前经过无菌过滤的溶液产生含有活性成分加任何别的所需成分的粉末。
药学可接受载体
如本文中所使用的，“药学可接受载体和/或稀释剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或药剂与活性成分不相容，涵盖其在治疗性组合物中的应用。还可以将补充性的活性成分掺入组合物中。
剂量单位形式
为了容易施用和剂量的一致性，以剂量单位形式配制药物组合物是尤其有利的。
如本文中所使用的，剂量单位形式指物理上离散的单元，适合作为要治疗的受试者的单一剂量；每个单元含有与所需要的药学载体联合的，预先确定数量的活性材料，其根据计算，产生想要的治疗效果。新的剂量单位形式的规格由下述各项规定，并直接取决于下述各项：(a)所述活性材料的独特特性和要达到的具体治疗效果，和(b)本领域配合此类活性材料以治疗身体健康受损的具有患病状况的活受试者中的疾病所固有的限制。
为了方便且有效的施用，主要的活性成分以有效量与合适的药学可接受载体在剂量单位形式中配合。在含有补充性的活性成分的组合物的情况中，通过参照施用所述成分的通常剂量和方式来确定剂量。
实施例
实施例1：细胞系和质粒
细胞系MCF10A、MCF7、MDA-MB-231、Hs578T、ZR-75-1购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，并且除MCF10A细胞外在推荐的培养基中维持，将MCF10A细胞在补充有5％马血清、20ng/mlEGF、0.5μg/ml氢化可的松、100ng/ml霍乱毒素、10μg/ml胰岛素和青霉素/链霉素的DMEM中培养。将BT-549细胞在补充有10％FBS的RPMI中培养。MDA-MB-435S、T-47D细胞来自Lo Ting Ling(分子和细胞生物学研究所)，并在补充有10％FBS和10μg/ml胰岛素的DMEM中维持。BT-20、MDA-MB-453和BT-474由Yoshiaki Ito(分子和细胞生物学研究所)提供。将BT-20细胞在补充有10％FBS的MEM中维持。将MDA-MB-453细胞在补充有10μg/ml胰岛素的含10％FBS的DMEM中维持。双嗜性Phoenix包装细胞由G.Nolan(斯坦福大学)友好提供，并在补充有10％FBS的DMEM中维持。
人TAZ的cDNA来自MCG克隆19891。通过使用MCG19891克隆进行的聚合酶链式反应(PCR)来构建全长TAZ或加有Flag标签的TAZ，并克隆入逆转录病毒载体pBABEpuro的BamH1-Sal1位点中。通过使用来自Naiyang Fu(分子和细胞生物学研究所)的小鼠cDNA文库进行的PCR来构建加有Flag标签的小鼠TAZ，并克隆入来自Sofie Van Huffel(分子和细胞生物学研究所)的逆转录病毒载体pBABEhygromycin的SnaB1-Sal1位点中。通过将PCR扩增的编码指定氨基酸的cDNA片段分别克隆入pGEX4T-1(Amersham Biosciences)和pET32a(Novagen)的EcoR1/Xho1位点中来构建pGEX-TAZ(氨基酸160-229)和pET-TAZ(氨基酸160-229)。通过将PCR扩增的来自人cDNA文库的片段克隆入pGEX4T-1的EcoR1/Sal1位点中来构建pGEX-YAP(氨基酸206-262)。
实施例2：加有GST标签的蛋白质的纯化
将1升携带pGEX-TAZ或pGEX-YAP构建体的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养，直至OD 0.8-1，并于室温用0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导过夜。通过离心收获细胞，并通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中超声处理来溶胞。以10,000g于40℃旋转溶胞物30分钟，并将上清液与0.5ml谷胱甘肽-Sepharose 4B(Amersham Biosciences)于4℃混合2小时。用PBS清洗珠四次。用5个体积的在50mM Tris(pH 8)中的10mM还原型谷胱甘肽洗脱结合的蛋白质。
实施例3：加有His标签的蛋白质的纯化
如pGEX-TAZ那样诱导1升携带pET-TAZ融合构建体的大肠杆菌BL21(DE3)。通过在破裂缓冲液(100mM Hepes-KOH，pH7.4，5mM MgCl2、500mMKCl、0.1％Triton-X-100、2mM β-巯基乙醇和来自Roche MolecularBiochemicals的蛋白酶抑制剂混合物)中进行超声处理来溶解细菌。旋转溶胞物，收集上清液，并与1ml Talon金属亲和树脂(Clontech)一起于4℃温育2小时。用清洗缓冲液(20mM Hepes，pH7.4，200mM KCl、10％甘油、10mM咪唑和2mM β-巯基乙醇)清洗树脂四次，并用5个体积的洗脱缓冲液(20mMHepes，pH7.4，200mM KCl、10％甘油、250mM咪唑和2mM β-巯基乙醇)洗脱。
实施例4：抗体
商品化TAZ抗体购自Abeam和Imgenex。YAP抗体购自Cell Signaling。肌动蛋白抗体来自Sigma。如下生成家兔多克隆TAZ特异性抗体，即给家兔注射GST-TAZ(氨基酸160-229)三次，接着用His-TAZ(氨基酸160-229)进行两次额外的加强注射，之后收集血清。使用固定化的His-TAZ来亲和纯化抗体。为了特异性检测TAZ，在存在100倍过量的GST-YAP的情况中使用抗体。
实施例5：Western印迹分析
用冰冷的PBS清洗指定的细胞一次，随后在冰冷的溶胞缓冲液(补充有蛋白酶抑制剂混合物的150mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 7.3，0.25mM EDTA，pH 8.0，1％脱氧胆酸钠、1％Triton X-100、0.2％氟化钠和0.1％原钒酸钠)中溶解。通过旋转(10,000g，15分钟)澄清后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上解析溶胞物，并印迹至硝酸纤维素膜上。在PBS中的5％脱脂奶中封闭滤膜，并用指定的一抗接着用辣根过氧化物酶偶联的二抗(pierce)探查。使用Supersignal(Pierce)来显现信号。
实施例6：逆转录病毒生成和感染
使用Lipofectamine依照制造商的指令(Invitrogen)用指定的逆转录病毒载体转染双嗜性Phoenix包装细胞。48小时后，收集逆转录病毒上清液，过滤(0.45μm；Millipore)，并在存在5μg/ml Polybrene(Sigma-Aldrich)的情况中添加至靶细胞上达6-8小时。进行感染两次。感染后，用嘌呤霉素(1μg/ml)选择细胞1周，之后通过Western印迹分析TAZ表达。对于小鼠TAZ在MCF-KD-715和MCF7-KD-652细胞中的再表达，将自用pBABEhygromycin-mTAZ转染双嗜性Phoenix细胞衍生的逆转录病毒上清液添加至MCF-KD-715和MCF7-KD-652细胞，用潮霉素(500μg/ml)和嘌呤霉素(1μg/ml)选择所述细胞1周，之后进行实验。
实施例7：shRNA介导的TAZ敲低
使用来自Dharmacon的siRNA设计程序来设计针对人TAZ的短发夹RNA(shRNA)，并亚克隆入pSuper.Retro.puro载体(Oligoengine)的BglII-Xho1位点中。经由转导入MCF7和Hs578T细胞中和用TAZ抗体对总细胞溶胞物的Western印迹分析来测试构建体的功效。敲低构建体的有义寡核苷酸的序列是：KD-1，5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’；KD-650，5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’；KD-652，5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’；KD-715，5’-CAGCCTCTGAATCATATGA-3’；KD-1331，5’-AACAAACGTTGACTTAGGA-3’。
实施例8：伤口愈合测定法
在伤口愈合测定法中评估细胞迁移。简言之，通过用200μl吸管尖端手动刮涂使组织培养皿上铺板的汇合的MCF10A-GFP、MCF10A-TAZ、Hs578T-KD-715和Hs578T-KD-652细胞受伤，用PBS清洗，并在完全培养基中于37℃温育。在指定的时间点，捕获在特定伤口位置上的相差图像。
实施例9：软琼脂中的贴壁不依赖性生长
将1.5ml补充有RPMI，10％FBS的0.5％琼脂(电泳级超纯；Invitrogen，Carlsbad，CA)在6孔平板中倒板作为底层琼脂。将5000个细胞与1.5ml补充有RPMI，10％FBS的0.35％琼脂混合，并在固化的底层琼脂上倒板。在固化的琼脂层上添加1ml培养基，并容许集落在培养箱中于37℃，5％CO2生长2至3周。用倒置显微镜捕获细胞集落的图像。
实施例10：细胞迁移率和侵入测定法(转孔测定法)
通过使用具有8μm孔聚碳酸酯膜(BD Biosciences)的24孔室来测定细胞迁移率。在无血清培养基中再水合所述室，如制造商所描述的。使用含10％FBS的完全培养基(750μL)作为化学引诱物。将500μL含0.5％FBS的完全培养基中的5X104个细胞的悬浮液添加至插入物，并于37℃，5％CO2温育48小时。用棉拭子除去插入物上部膜表面上剩余的细胞，而对下部表面上的细胞以及孔中的细胞进行胰蛋白酶处理，并对细胞数计数。
基本上与细胞迁移率测定法相同地进行细胞侵入性，只是所使用的室是24孔Matrigel侵入室，其中8μm孔聚碳酸酯膜用Matrigel基底膜基质(BDBiosciences)的薄层预包被。
实施例11：裸鼠中的肿瘤发生
给4至6周龄雌性裸鼠在左后和右后体侧中或向胸部乳房脂肪垫中皮下接种100μL PBS中悬浮的5x106个MCF7-KD-715或MCF7-KD-652细胞，并且同时接受含有0.72mg β-雌二醇(Innovative Research of America，Toledo，OH)的60天释放团粒。监测肿瘤形成，并在肿瘤大小大于5mm时拍摄小鼠的照片。
实施例12：免疫组织化学
使用人乳房组织阵列(InnoGenex)来检查TAZ和细胞角蛋白(Cam 5.2，Becton Dickinson)在正常组织和癌症组织中的表达。使用Dako Envision TM系统K1395(Dako，Carpinteria，CA)来实施免疫组织化学。在新鲜的二甲苯中使载玻片脱蜡5分钟达三次，并用100％、95％、80％和75％乙醇和PBS序贯地再水合(每步5分钟)，接着在柠檬酸钠缓冲液，pH6中用2100-修复器(Retriever)(PickCell Laboratories BV Prestige Medical Ltd)进行抗原修复达12分钟。于室温(RT)冷却4小时后，用水和具有0.1％Tween-20的PBS漂洗载玻片，之后在黑暗中用0.6％H2O2淬灭20分钟。用PBS漂洗后，用具有5％山羊血清和2％BSA的PBS于RT封闭载玻片2小时，并与一抗一起于4℃温育过夜。随后，用具有0.1％Tween-20的PBS清洗载玻片，接着用生物素化的二抗达2小时。清洗后，将载玻片与VECTASTATIN ABC试剂一起温育60分钟。将二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)过氧化物酶底物在黑暗中应用至载玻片达3-5分钟，并通过用PBS清洗来终止反应。在显微镜下分析结果。
实施例13：乳腺癌细胞系中的TAZ表达
通过使用总细胞溶胞物进行的免疫印迹分析来检查乳腺癌细胞系中的TAZ表达。测试数种商品化的以及内部生成的抗体显示所有抗体均与TAZ和同源性YAP两者起反应。由于商品化抗体(IMGENEX)高效检测出TAZ和YAP两者，我们贯穿整项研究(除图5中所描绘的实验外)使用此抗体。
自代表性实验衍生的结果(在图1A中显示的)指明TAZ在所检查的所有乳腺癌细胞系中以变化的水平表达。相对于肌动蛋白的表达水平标准化TAZ和YAP两者的表达水平，并以图1B中所显示的任意单位呈现自三项独立实验衍生的定量结果。
乳腺癌细胞系中，在Hs578T、BT-549、和MDA-MB-435S细胞中检测出高水平的TAZ(4个任意单位左右)，而在MDA-MB-231、BT-20、和T-47D细胞中观察到中等水平(2个任意单位左右)。MCF10A、MCF7、MDA-MB-453、ZR-75-1、和BT-474细胞表达低水平(1个任意单位左右)的TAZ。
显著的是，四种高侵入性癌细胞系的三种(Hs578T、BT-549、和MDA-MB-435S)展现出高水平的TAZ表达，而MDA-MB-231细胞表达中等水平。Neve等(2006)中显示了这四种细胞系对应于基底样或基底B癌症类型，代表侵入性乳腺癌细胞类型。
大多数(5/7)弱侵入性细胞表达低水平的TAZ，而两种细胞系(BT-20和T-47D)表达中等的水平。这些结果提示大多数高侵入性乳腺细胞表达高水平的TAZ，而大多数弱侵入性细胞表达低水平的TAZ。
没有注意到YAP表达水平与乳腺癌细胞侵入性的此类关联(图1B)。TAZ表达水平与乳腺癌细胞侵入性的关联提示，TAZ可以是决定乳腺癌细胞侵入性的机制的一部分。
实施例14：MCF10A细胞中的TAZ过表达诱导成纤维细胞样形态学，并促进细胞迁移和侵入
为了检查乳腺癌细胞中TAZ表达的功能后果，我们以如下水平在MCF10A细胞(其展现出低内源水平的TAZ)中过表达TAZ或加有Flag标签的TAZ，所述水平是高度表达侵入性细胞诸如Hs578T和BT-549中找到的水平的约2-3倍(图2A)。这是通过逆转录病毒介导的转导实现的，因为MCF10A细胞没有得到满意地转染以表达内源蛋白质。分析用合适的逆转录病毒感染的MCF10A细胞的集合以避免克隆变异。EGFP表达细胞(图2B的左侧小图)保留亲本MCF10A细胞所看到的上皮外观。然而，过表达TAZ(图2B的右侧小图)或Flag-TAZ(数据未显示)的细胞形成细胞转化特征性的更具反射性和纺锤状的成纤维细胞样形态学。
因为TAZ表达水平与乳腺癌细胞侵入性相关联，我们检查TAZ过表达是否能促进细胞迁移和侵入。使用伤口愈合测定法，我们相对于表达EGFP的细胞比较表达TAZ的MCF10A细胞的细胞迁移率(图2B)。TAZ表达细胞的迁移率得到显著增强。在14小时内，迁移的TAZ过表达细胞显著恢复伤口区域。在24小时内迁移的细胞完全恢复伤口区域(右侧小图)。在明显的对比下，表达EGFP的MCF10A细胞的伤口闭合在14小时内是不显著的，而且在24小时内仅仅是部分的(左侧小图)。使用转孔测定法来独立地评估这些细胞的迁移率和侵入性(图2C)。TAZ表达细胞的迁移和侵入性与表达EGFP的对照细胞相比分别升高约5倍和2-3倍。这些结果提示，TAZ促进细胞迁移和侵入，并且这些特性可以促成过表达TAZ的细胞的形态学改变。
实施例15：MCF7和Hs578T细胞中shRNA介导的TAZ敲低抑制细胞迁移和侵入
为了证实TAZ在细胞迁移和侵入中的作用，使用互补但独立的办法，其基于RNA干扰(RNAi)介导的基因表达敲低。为了持续的敲低而避免克隆变异，我们分析用基于逆转录病毒的载体稳定感染的细胞集合，所述基于逆转录病毒的载体表达靶向TAZ mRNA的多个区域的shRNA。对一个报告的RNAi靶位点(KD-1)加上TAZ mRNA的4个其它位点测试它们在MCF7细胞中对敲低TAZ蛋白质表达的易感性，如通过免疫印迹分析所评估的。如图3A(左侧小图)中所显示的，基于报告靶物的shRNA显著地降低TAZ蛋白质水平。基于4种新靶物的shRNA中，2种(715和1331)对TAZ蛋白质水平没有显著影响，1种(650)具有与报告靶物相当的RNAi效果，而另一种(652)具有最有效的抑制TAZ表达的效果。还使用4种shRNA表达逆转录病毒来感染Hs578T细胞(右侧小图)，并对稳定转导的细胞集合分析TAZ表达。再一次，shRNA 715和1331没有显著效果，而shRNA 650和652两者都显著降低TAZ的蛋白质水平。因此，我们使用用shRNA 652敲低的细胞来进行随后分析，与用shRNA715转导的细胞比较，因为用shRNA715转导的细胞在所有分析中与亲本和经载体转导的细胞表现一样。与降低的TAZ表达一致，细胞簇变为更密集压缩和紧凑的细胞片层，其中与MCF7-KD-715细胞相比，簇的细胞密度在MCF7-KD-652细胞中得到增强(上部小图，图3B)。扫描电子显微术揭示，与MCF7-KD-715细胞相比，细胞间的间隔在MCF7-KD-652细胞中是缩短的(下部小图，图3B)，导致更紧密排列/压缩和紧凑的上皮外观。此观察在细胞以低或高密度铺板在标准条件下培养时是明显的。因为使用大多数测定法MCF7细胞没有显著迁移和侵入，我们使用Hs578T细胞分析迁移和侵入。相对于没有可检测RNAi效果的Hs578T-KD-715细胞(其在伤口愈合测定法中强烈地迁移)(左侧小图，图3C)，TAZ的敲低显著降低Hs578T-KD-652细胞的迁移(右侧小图，图3C)。还使用转孔测定法揭示迁移和侵入能力的降低(图3D)。这些RNAi实验进一步支持自过表达实验推导的结论，即TAZ是细胞迁移和侵入的重要调节物。其表达水平与乳腺细胞的上皮外观负相关，而与迁移和侵入特性正相关。
实施例16：TAZ对于贴壁不依赖性生长和肿瘤发生是重要的
为了检查TAZ在乳腺癌细胞的肿瘤发生中的重要性，我们首先评估与MCF7-KD-715细胞相比TAZ敲低MCF7-KD-652细胞的贴壁不依赖性生长能力。MCF7-KD-715细胞在软琼脂中良好生长(上部小图，图4A)，而软琼脂中培养的集落数目对于MCF7-KD-652细胞是显著降低的。与MCF7-KD-715细胞的细胞集落的发育良好的球形(左侧小图，图4B)相比，MCF7-KD-652细胞不能成长，而且仅观察到细胞碎片的小聚集体(右侧小图，图4B)。这些结果提示，TAZ对于MCF7的贴壁不依赖性生长是至关重要的。随后，我们检查了TAZ是否在裸鼠中促成肿瘤发生。分开将MCF7-KD-715和MCF7-KD-652细胞注射入裸鼠的股和脂肪垫中，并监测肿瘤的生长(图4C)。与MCF7-KD-715细胞(右侧)相比，MCF7-KD-652细胞(左侧)在股(左侧小图)和脂肪垫(右侧小图)注射位置处在形成肿瘤方面都是受损的。在补充的图S1中显示了对所得肿瘤的定量分析。这些结果提示，TAZ对于MCF7细胞的体内肿瘤发生也是重要的。
实施例17：TAZ在乳腺癌中的过表达
为了评估我们自分析乳腺癌细胞获得的发现是否具有生理学和临床关联性，我们检查了自原发性乳腺癌衍生的组织切片中的TAZ表达。为了克服抗TAZ抗体与YAP的交叉反应性，我们生成针对TAZ中与YAP最趋异的区域的家兔抗体。亲和纯化的抗体优先识别TAZ，但是也以较低的效率与YAP起反应(左侧小图，图5A)。然而，抗体在存在100倍过量(超过抗体)的与作为抗原使用的TAZ区对应的重组YAP片段的情况中特异性识别TAZ(右侧小图，图5A)。使用此办法来特异性检测TAZ，使用免疫组织化学来检查原发性乳腺癌样品。126份所分析的乳腺癌样品中，27份(21.4％)过表达TAZ，并且大多数(21份样品)TAZ表达癌症是侵入性(浸润性)导管癌(IDC)，提示TAZ在显著分数的IDC中过表达。显示了IDC中代表性的TAZ阳性标记(右侧小图，图5B)。下文表E1中显示了我们对癌症样品的免疫组织学分析的汇总。这些结果提示TAZ过表达对于乳腺癌向IDC的行进是重要的，而且确立了我们关于乳腺癌细胞系的发现的生理学和临床关联性。
  Nor.乳房   纤维腺瘤    LCIS   IDC  ILC  DCIS    LN met   髓样Ca
  0/4   0/8    2/2   21/87   3/6  0/7    1/11   0/5
表E1：在不同类型的乳腺癌中分析TAZ过表达。使用免疫组织化学来检查TAZ在每种乳腺癌类型中的表达。所显示的数目代表每种乳腺癌类型的样品总数中过表达TAZ的样品数目。Nor.乳房，正常的乳房；LCIS，原位小叶癌；IDC，侵入性导管癌；ILC，侵入性小叶癌；DCIS，原位导管癌；LN met，淋巴结转移；髓样ca，髓样癌。
实施例18：TAZ与转录因子TEADl、TEAD2、TEAD3和TEAD4相互作用
使用本文中所描述的和本领域中已知的方法来用TAZ和GST-TEAD和HA-TEAD(细胞中表达的)进行体外结合实验。
在第一项实验中，将自Hs578t细胞衍生的细胞提取物与固定化的GST-TEADl(96-412)、GST-TEAD2(121-448)、GST-TEAD3(115-436)、GST-TEAD4(119-435)或GST一起温育。通过SDS-PAGE来解析被珠保留的蛋白质及起始材料，接着用与TAZ和YAP两者都起反应的抗体进行免疫印迹。
图8A中显示了结果。此图像显示了，TAZ和YAP两者均被固定化的GST-TEAD，而不是GST有效地保留。
在第二项实验中，溶解用逆转录病毒载体稳定转导以表达HA-TEAD 1-4的s578T细胞，并用抗HA抗体免疫沉淀所得的细胞溶胞物。通过SDS-PAGE来解析免疫沉淀物以及起始材料，接着使用抗HA抗体或与TAZ和YAP两者都起反应的抗体进行免疫印迹。
图8B中显示了结果。此图像显示了，内源TAZ和YAP(以低得多的效率)与稳定表达的HA-TEAD1-4免疫共沉淀。
实施例19：牵涉结合TEAD2的TAZ残基的鉴定
使用标准的诱变技术来生成TAZ的突变体S89A。此突变体是获致癌功能突变体，并且在下文更为详细地描述。
使用标准的诱变技术来生成许多TAZ S89A突变体。这些中有TAZ S89A的突变F52A和F53A(M9)。它们称作M1-M9。
然后生成表达加有FLAG标签的M1-M9突变体的构建体。
用HA-TEAD2和加有Flag标签的TEAD结合TAZ突变体(加有FLAG标签的M1-M9)感染MCF10A细胞。生成经转染MCF10A细胞的溶胞物。用抗HA免疫沉淀溶胞物，并用抗Flag抗体探查。
图9中显示了结果。图9显示了TAZ N端区域中的残基F52和F53(M9)对于与TEAD2的相互作用是重要的。F52A和F53A突变体不能与TEAD2相互作用。
实施例20：与TEAD2相互作用方面有缺陷的突变体F53A被排除在细胞核积累之外
使用本文所描述的和熟练读者已知的方法，用抗Flag抗体对用加有Flag标签的TAZ-S89A和M9(即F53A)感染的MCF10A细胞染色。
图10显示了结果。TEAD结合突变体不能在细胞核中积累。这显示了，TEAD对于TAZ在细胞核中积累是至关重要的。
实施例21：在与TEAD2相互作用方面有缺陷的突变体F53A不驱动贴壁不依赖性生长
在软琼脂中培养用TAZ-S89A或M9(即F53A)突变体感染的20,000个MCF10A细胞达1个月，并对集落染色，其使用本文所描述的和熟练读者已知的方法来进行。
图11显示了结果。TEAD结合突变体不能在软琼脂中生长。这显示了，与TEAD的相互作用对于TAZ诱导致癌性转化是至关重要的。
实施例22：TAZ诱导分泌性蛋白质和表面膜蛋白质的表达
TAZ(S89A)是通过标准的诱变技术生成的TAZ突变体。将TAZ的第89位丝氨酸突变成丙氨酸。显示了其为获致癌功能突变体。
对表达TAZ和TAZ(S89A)的细胞进行RT-PCR以建立多种分泌性蛋白质和表面膜蛋白质的表达。
如图12中所显示的，TAZ上调8种分泌性蛋白质(IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1和FBN2)及4种表面膜蛋白质(AXL、ITGB2、CRIM1、和Alcam)的表达。
这些蛋白质(包括这些蛋白质的组合)会为乳腺癌和其它癌症提供新的诊断性生物标志。此外，表面膜蛋白质可以为抗体疗法提供候选物。
实施例23：讨论
在我们对人癌细胞系中的蛋白质的蛋白质组学分析中，我们注意到侵入性较大的乳腺癌细胞中TAZ的表达水平较高。此观察促使我们调查生理学/临床关联性和TAZ在乳腺癌肿瘤发生中的作用。TAZ在乳腺癌细胞中广泛表达。一项重要的观察结果是，最高度侵入性的乳腺癌细胞系以如下水平表达TAZ，所述水平是由大多数弱侵入性乳腺癌细胞所表达的水平的约4倍，暗示TAZ在乳腺癌细胞侵入性中的作用。此观察结果的临床关联性得到如下发现的支持，即TAZ在显著分数的乳腺癌(占所检查的126份商品化乳腺癌样品的约21.4％)中过表达。因为癌细胞的侵入性依赖于迁移和侵入特性的升高，我们测试了如下假设，即乳腺癌和细胞系中TAZ过表达的作用机制是促进乳腺癌细胞的迁移和侵入。使用获功能(通过过表达)和失功能(通过shRNA介导的敲低)两种方法来建立TAZ在乳腺癌细胞迁移和侵入中的至关重要的作用。在MCF10A细胞中以在高侵入性细胞中检测出的水平的约2-3倍的水平过表达TAZ引起自上皮向成纤维细胞样外观的形态变化和细胞迁移和侵入特性的显著升高。此外，MCF7和Hs578T细胞中shRNA介导的TAZ表达敲低降低细胞迁移和侵入。MCF7细胞的上皮簇在TAZ表达被敲低时变为更密集压缩的细胞。这些结果指明，TAZ是上皮形态/结构的负调节物以及侵入和迁移行为的正调节物。可想像的是，乳腺癌中的TAZ过表达能触发上皮特性的丧失以促进迁移特性，即一项对于原位导管癌行进成IDC重要的事件。最后，在MCF7细胞中敲低TAZ表达时，它们在软琼脂中的贴壁不依赖性生长和在裸鼠中的肿瘤发生受到延迟，提示TAZ过表达是牵涉乳腺癌形成和行进的过程的重要部分。我们认为，我们的实验已经直接解决了TAZ而非shRNA脱靶(off-target)的作用。首先，我们已经采用数种不同shRNA，而且观察到敲低程度与对细胞行为观察到的后果之间的关联。第二，自MCF10A细胞中的过表达衍生的结果导致类似的结论。最后，在MCF7-KD-652(TAZ敲低的)中再导入编码加有Flag标签的小鼠TAZ(mTAZ)的RNAi抗性小鼠cDNA显著恢复细胞在软琼脂中形成集落的能力，并且结果作为补充的图S2显示。
虽然决定TAZ功能的分子机制不完全清楚，但是关于TAZ作用的机制之一是触发上皮形态的丧失，促进细胞迁移和侵入，和支持贴壁不依赖性生长，它们对于癌症启动、行进和侵入都是重要的。虽然TAZ过表达不足以使MCF10A细胞能够在软琼脂中生长(未发表的观察结果)，但是它对于MCF7细胞的贴壁不依赖性生长是重要的。如此TAZ可以发挥至关重要的作用，但是对于乳腺癌细胞的贴壁不依赖性生长并不是完全足够的。由于TAZ过表达引起的MCF10A细胞形态变化与以细胞粘着丧失和细胞迁移率增加为特征的上皮-间充质转换(EMT)相似(21)，而由于TAZ敲低引起的MCF7细胞形态改变可以与间充质-上皮转换(MET)有关。TAZ还可以是决定乳房上皮细胞中的EMT/MET事件的调节机器的一部分，而且其下调的表达会增强EMT以促进乳腺癌的形成和侵入特性。初步研究提示，通过TAZ的过表达或敲低没有显著改变MCF10A和MCF7细胞中的E-钙粘着蛋白表达水平，指明TAZ能经由与由Twist、Snail、和Slug(已知其通过下调E-钙粘着蛋白来促进EMT(22))所利用的机制不同的机制来调节EMT/MET。基于我们当前关于TAZ作为基因转录共激活物的知识，关于TAZ作用的一种可能的机制是与其它转录激活物相互作用以增强细胞迁移中牵涉的基因的转录。我们初步的微阵列分析似乎支持此可能性，因为细胞迁移和其它细胞过程中潜在牵涉的许多基因受到TAZ上调。我们处于证实这些结果以鉴定细胞迁移中牵涉的、TAZ的真实下游靶物的过程。同时，TAZ可经由其PDZ域、WW域或卷曲螺旋域直接与细胞迁移中牵涉的蛋白质相互作用。我们对表达加有EGFP标签的TAZ的细胞的初步分析指明，在膜皱褶中能检测出一些EGFP-TAZ。进一步的研究对于探索这些可能性会是必需的。
最近，YAP，即一种与TAZ高度同源的蛋白质被鉴定为染色体11q22扩增子上的候选癌基因。未转化的乳房上皮细胞中人YAP的过表达诱导EMT，抑制凋亡，并促进在软琼脂中的生长因子不依赖性增殖和贴壁不依赖性生长(23)。因此，YAP和TAZ可以共享类似或交叠的功能。然而，我们没有观察到YAP表达水平与乳腺癌细胞侵入性的明显关联，而TAZ表达在侵入性较大的乳腺癌细胞系中升高很多(图1)。连同如下观察结果，即YAP的表达不受shRNA介导的TAZ敲低影响，看来TAZ和YAP受到独立地调节。少数其它研究提示，YAP可通过与细胞核中用于正确执行细胞死亡途径的肿瘤抑制基因p73相互作用并使其稳定化而具有肿瘤抑制特性(24)。需要更多未来的研究来获得关于这些问题的完全了解。
关于TAZ在乳腺癌和癌细胞系中过表达及其在细胞迁移、侵入和肿瘤发生中至关重要的作用的发现是有意义的。首先，它可充当乳腺癌(尤其是IDC)的新生物标志，而且我们的发现提示，根据流行性、临床结果、和对各种治疗的响应，在大量乳腺癌中广泛检查TAZ表达是有正当理由的(warranted)。第二，我们的发现为未来的研究打下了新的且坚实的基础，未来的研究旨在揭示对决定其在乳腺癌细胞迁移、侵入和肿瘤发生中的作用及其与乳腺癌形成、行进和转移中牵涉的其它蛋白质的相互影响的分子机制的别的了解。此外，TAZ可提供一种新的靶物来治疗乳腺癌，因为其表达优先在侵入性乳腺癌细胞中升高，而且水平与侵入性相关联。因为TAZ在乳腺癌细胞的肿瘤发生中发挥重要的作用，但对于小鼠发育和生育明显不是至关重要的，所以它可以是用于乳腺癌疗法的有效且选择性靶物。
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在此通过提及而将本文件中所提及的每篇申请和专利，和每篇上述申请和专利中(包括在每篇申请和专利的审查过程中)引用或提及的每篇文件(“申请引用的文件”)，和每篇申请和专利中和任何申请引用的文件中引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。此外，在此通过提及而将本文本中所引用的所有文件、和本文本中所引用的文件中所引用或提及的所有文件、和本文本中所引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。
在不背离本发明的范围和精神的前提下本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，应当理解的是，要求保护的发明不应过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰意图在权利要求书的范围内。

Claims (59)

1.一种抗TAZ剂，其用于治疗、预防或减轻癌症。
2.依照权利要求1的抗TAZ剂，其中所述抗TAZ剂能够下调以GenBank登录号NP_056287所显示的TAZ序列或与该序列具有至少90％序列同一性的序列的表达、量或活性的任意组合。
3.依照权利要求1或2的抗TAZ剂，其中所述癌症包括乳腺癌。
4.依照权利要求1、2或3任一项的抗TAZ剂，其中所述癌症包括侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。
5.依照前述权利要求任一项的抗TAZ剂，其中所述抗TAZ剂通过RNA干扰诸如包含小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)来下调TAZ。
6.依照前述权利要求任一项的抗TAZ剂，其中所述抗TAZ剂包含shRNA 1(有义寡核苷酸序列5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、shRNA650(有义寡核苷酸序列5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或shRNA652(有义寡核苷酸序列5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。
7.依照前述权利要求任一项的抗TAZ剂，其中所述抗TAZ剂包括抗TAZ抗体，诸如选自下组：针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体、家兔抗TAZ抗体(产品目录编号2149S，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)、家兔多克隆抗TAZ抗体(产品目录编号NB110-58359SS，NovusBiological，Littleton，CO，USA)、小鼠单克隆抗TAZ[1B10](产品目录编号H00006901-M12，Novus Biological，Littleton，CO，USA)、家兔抗人TAZ多克隆抗体(产品目录编号LS-B94，LifeSpan Biosciences，Inc.，Seattle，WA，USA)或p-TAZ(Ser 89)-R(产品目录编号sc-17610-R，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。
8.包含shRNA 650(有义寡核苷酸序列5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)、shRNA 652(有义寡核苷酸序列5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)、5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’、5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’、或其互补物的核酸，或能够与任何此类序列特异性杂交的核酸。
9.一种针对TAZ氨基酸160-229的家兔抗TAZ抗体，任选地，其与包含YAP序列(GenBank登录号：NP_006097)或与该序列具有至少90％序列同一性的序列诸如GST-YAP组合。
10.一种MCF 10A-TAZ、MCF7-KD-1、MCF7-KD-650、MCF7-KD-652或Hs578T-KD-652细胞或细胞系，例如作为癌症诸如侵入性乳腺癌的模型使用。
11.一种用于检测个体中的乳腺癌或个体对乳腺癌的易感性的试剂盒，其包含用于检测所述个体或自他或她采集的样品中的TAZ表达的手段。
12.依照权利要求11的试剂盒，其中所述用于检测的手段选自下组：TAZ多核苷酸或其片段；与TAZ核酸或其片段互补的核苷酸序列；TAZ多肽或其片段，或抗TAZ抗体，可包括针对TAZ氨基酸160-229的抗体，和任选地，使用指令。
13.依照权利要求11或12的试剂盒，其进一步包含依照权利要求1至7任一项的抗TAZ剂。
14.依照权利要求11、12或13的试剂盒，其进一步包含用于治疗、预防或减轻乳腺癌的治疗药物，诸如包含他莫昔芬或赫赛汀。
15.一种检测癌细胞的方法，该方法包括检测所述细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
16.依照权利要求15的方法，其中所述癌症包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。
17.依照权利要求15或16的方法，其中比较所述TAZ表达与已知为非癌性的对照细胞中TAZ的表达、量或活性。
18.依照权利要求15、16或17任一项的方法，其中所述方法包括检测所述细胞中TAZ表达、量或活性的上调。
19.依照权利要求15至18任一项的方法，其中所述方法包括检测TAZ核酸，诸如依靠包含如下核酸的至少一部分的探针，所述核酸具有以GenBank登录号NM_015472显示的序列或与此序列具有至少90％序列同一性的序列。
20.依照权利要求15至19任一项的方法，其中所述方法包括检测TAZ多肽，诸如依赖权利要求7中所列的抗TAZ抗体。
21.依照权利要求20的方法，其中所述方法包括检测一种或多种选自下组的蛋白质的表达：IGFBP3、ADAMTS1、CTGF、Cyr61、FSTL1、FN1、FBN1、FBN2AXL、ITGB2、CRIM1和Alcam。
22.依照权利要求15至21任一项的方法，其进一步包括组织学分级，诸如通过使用Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(Nottingham分级系统(NGS))。
23.一种测定细胞的增殖状态或者测定细胞会变为侵入性或攻击性的可能性的方法，该方法包括检测所述细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
24.一种预测患有癌症的个体的存活率的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ表达的调控。
25.一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ表达的调控，基于所述癌症的攻击性来选择合适的疗法。
26.一种测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性的方法，该方法包括比较所述疗法与通过依照权利要求25的方法确定的疗法。
27.依照权利要求23至26任一项的方法，进一步包括权利要求16至22任一项中所列的特征。
28.一种操作癌细胞的方法，该方法包括调控所述细胞中的TAZ表达、量或活性。
29.依照权利要求28的方法，其中所述癌症包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。
30.依照权利要求28或29的方法，其中由于所述操作，所述癌细胞变为非癌性的或者所述侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。
31.依照权利要求28、29或30任一项的方法，其中所述方法包括下调所述细胞中的TAZ表达、量或活性。
32.依照权利要求28至31任一项的方法，其中所述方法包括将所述细胞暴露于能够特异性结合TAZ的siRNA或shRNA。
33.依照权利要求32的方法，其中所述shRNA包括权利要求6中所列的shRNA。
34.依照权利要求28至31任一项的方法，其中所述方法包括将所述细胞暴露于权利要求7中所列的抗TAZ抗体。
35.一种操作细胞的方法，该方法包括下列步骤：(a)检测细胞中升高的TAZ表达、量或活性；并(b)降低所述细胞中的TAZ水平。
36.一种调控TAZ表达的方法，该方法包括靶向选自下组的TAZ靶位点：KD-1(5’-GATGAATCCGGCCTCGGCGCC-3’)、KD-650(5’-AGAGGTACTTCCTCAATCA-3’)或KD-652(5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’)。
37.一种鉴定能够结合TAZ多肽的分子的方法，该方法包括
(a)使TAZ多肽与候选分子接触，并测定所述候选分子是否结合所述TAZ多肽；或
(b)使细胞与候选分子接触，并检测所述细胞中的或所述细胞的升高或降低的TAZ表达、量或活性。
38.一种鉴定TAZ多肽调控剂的方法，该方法包括容许TAZ结合包括TEAD1、TEAD2、TEAD3或TEAD4的TEAD多肽，并检测候选分子的存在对此类结合的调控。
39.一种鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法，该方法包括测定候选分子是否是TAZ1/WWTR的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂。
40.TAZ或与其具有至少90％序列同一性的序列在鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的方法中的用途。
41.依照权利要求39或40的方法或用途，其中将候选分子暴露于TAZ多肽或表达TAZ多肽的细胞，以便测定所述候选分子是否是其激动剂或拮抗剂。
42.TAZ多核苷酸或与其具有至少90％序列同一性的序列用于鉴定适合于治疗、预防或减轻癌症的分子的用途。
43.一种鉴定TAZ的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括对动物施用候选分子，并测定所述动物是否展现出升高或降低的TAZ的表达、量或活性。
44.一种表达载体，其包含如权利要求8中所列的核酸，诸如逆转录病毒载体。
45.一种宿主细胞，其包含如权利要求8中所列的核酸或依照权利要求44的表达载体。
46.一种非人动物，其包含依照权利要求45的宿主细胞。
47.一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括调控个体的细胞中的TAZ表达、量或活性。
48.依照权利要求47的方法，其中所述TAZ表达、量或活性在所述个体的乳腺细胞中降低。
49.一种在个体中诊断癌症或对癌症的易感性的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
50.一种对患有癌症的个体预后的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
51.一种测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法，该方法包括检测所述个体的肿瘤细胞中TAZ的表达、量或活性的调控。
52.一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中TAZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来对所述个体施用合适的疗法。
53.依照权利要求47至52任一项的方法，其中所述癌症包括乳腺癌，诸如侵入性或转移性癌症诸如侵入性导管癌(IDC)。
54.依照权利要求47至53任一项的方法，其中通过评估肿瘤大小和/或淋巴结阶段，任选地与其它风险因素一起或组合来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。
55.依照权利要求47至53任一项的方法，其中通过评估所述肿瘤的雌激素受体(ER)状态来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。
56.供在个体中治疗、预防或减轻癌症诸如乳腺癌的方法中使用的TAZ。
57.TAZ多肽的分子、激动剂或拮抗剂，其是通过依照权利要求37至43任一项的方法或用途鉴定的。
58.一种供在治疗、预防或减轻癌症中使用的分子，其能够调控诸如下调TAZ的表达。
59.一种方法或事物，如本文参照附图的图1至7所描述的，和如附图的图1至7中所显示的。
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