CN104258414A - 自噬基因atg10参与rna病毒复制的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人自噬基因ATG10的基因和蛋白影响RNA病毒复制的新功能及其应用，具体是利用人自噬基因atg10的两种全长编码区(CDS)序列及其调控区序列(涉及但不限于启动子序列、第一、第二、第三和第四内含子序列)，以及由atg10基因两种编码序列翻译的两种ATG10蛋白分子ATG10-L和ATG10-S，包括其序列类似物和microRNAs等为靶点或目标物，通过基因操作、筛选、原核和真核细胞的体外表达等研发新的抗RNA病毒的蛋白类新药及相关产品；通过筛选可调控两种ATG10蛋白差异性表达的化合物研发具有新的作用靶点的抗RNA病毒的新药候选化合物。

Description

自噬基因ATG10参与RNA病毒复制的功能及应用

技术领域

本发明涉及人自噬基因atg10的基因和蛋白影响RNA病毒复制的功能及其应用，具体是利用人自噬基因atg10的两种全长编码区(CDS)序列及其调控区序列(涉及但不限于启动子序列、第一、第二、第三和第四内含子序列)，以及由atg10基因两种编码序列翻译的两种ATG10蛋白分子，包括其序列类似物和microRNAs等为靶点或目标物，通过基因操作、筛选、原核和真核细胞的体外表达等研发新的抗RNA病毒的蛋白类新药及相关产品；通过筛选可调控两种ATG10蛋白差异性表达的化合物研发具有新的作用靶点的抗RNA病毒的新药候选化合物。

背景技术

在人类感染性疾病中RNA病毒导致的人类疾病占据相当比例，如丙型肝炎病毒(HCV)导致的丙型肝炎并由此发展为肝硬化、肝癌；脊髓灰质炎病毒(polio Virus)导致的小儿麻痹症、流感病毒导致的流行性感冒(其中近几年爆发的H7N9病毒可致严重的肺部感染，具有较高的致死性)、HIV导致的艾滋病等等。除了针对脊髓灰质炎病毒已有较好疫苗外，在临床上其它RNA病毒疾病仍缺少有效的抗病毒药物。以丙型肝炎病毒(HCV)为例，目前，全球已有超过1.7亿人感染HCV，且这一数字每年以300至400万的速度递增。持续性HCV感染是发展成肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。目前，尚无有效疫苗针对丙型肝炎病毒进行疾病防控，且治疗手段单一，有效率仅为50％，毒副作用明显，耐药问题严重，急需新型的抗HCV药物。而抗HCV新药研发的主要障碍之一在于缺乏针对HCV与宿主细胞相互作用新靶点而无法研制真正意义的新药。这一问题在RNA病毒性疾病的新药研发中是一共性问题。

近年来，自噬机制与疾病的相关性的研究成果引起了医药研发领域的极人关注。自噬基因家族成员众多，分别参与了自噬过程的不同阶段。研究表明，自噬机制除了涉及发育和分化、正常细胞稳态的维持等正常细胞生理外，还涉及一些疾病病理过程，如神经退行性疾病、代谢性疾病、癌症和病原微生物的侵染等方面。研究表明，病毒感染能够激活细胞的自噬过程，而细胞自噬机制对病毒感染起着双重作用：一方面，病毒进入细胞后能够被机体识别，活化自噬相关信号通路，利用自噬过程将病毒粒子或蛋白转运至溶酶体，以降解病毒；自噬过程还可以将病毒核酸和蛋白转运至胞内感受器，激活天然免疫；也可将降解的病毒蛋白递呈至MHC II分子，激活获得性免疫系统。因此，自噬在病毒感染中发挥着重要的抗病毒作用。另一方面，有些病毒可以利用细胞自噬过程进行自身基因组的复制及病毒蛋白的表达，如甲型流感病毒能够通过病毒蛋白M2与自噬蛋白LC3直接相互作用，破坏LC3在细胞内分布，影响自噬双层膜泡结构的形成，维持自身病毒粒子的稳定性以及促进其在机体组织中的传播；牛病毒性腹泻病毒能够激活自噬过程，并且自噬对于该病毒在感染早期的复制起着重要的促进作用。研究还发现，HCV病毒的生命周期与自噬过程密切相关。HCV病毒感染细胞早期即可迅速活化自噬，上调细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达，通过内质网压力途径激活细胞自噬相关信号通路，诱导双层膜泡结构形成。细胞自噬对于HCV的复制过程是至关重要的：HCV病毒RNA聚合酶NS5B在感染早期能够与自噬相关蛋白ATG5发生直接相互作用，HCV病毒复制复合体及新合成的病毒RNA定位于由LC3-II分子参与组成的双层膜结构上。除了HCV病毒蛋白与自噬相关蛋白的直接相互作用外，下调自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3等，可以有效抑制HCV复制能力；使用影响自噬过程的药物如氯喹、二甲双胍等，也可观察到明显的抗HCV作用。在众多的自噬基因中，ATG10的功能除了做为自噬系统中泛素样E2酶外，最近研究认为ATG10样蛋白在酵母中可能参与在压力应激下阻断细胞周期的过程，并且该蛋白对细胞周期的影响完全不同于自噬机制的作用。临床研究还发现，ATG10还与结直肠癌、乳腺癌患病风险和预后相关。然而，ATG10在抗病毒方面的功能研究未见报道。

根据GenBank登录信息，ATG10基因组序列经基因预测方法“BestRefSeq，Gnomon”的自动计算分析和RNAseq alignments注释分析，认为atg10转录产物可有五种剪接方式，即有五种mRNA。然而，其编码区只有两种，一种编码220个氨基酸(本发明命名为ATG10-L)，一种编码184个氨基酸(本发明命名为ATG10-S)。这两种版本的ATG10蛋白分子的生物学意义及其功能有何差异至今未见报道。

RNA病毒的复制过程是其生命周期的重要环节之一，也是抗RNA病毒药物研究的热点靶位之一。HCV病毒是一种具有包膜的单链正义RNA病毒。我们在前期研究中，建立了HCV亚复制子的斑马鱼模型和细胞模型；同时，对一些自噬相关基因和蛋白与HCV复制的相互作用进行了研究，发现了一些自噬基因及其蛋白与HCV复制元件的相互作用的新机制和新功能，其中关于ATG10基因与RNA病毒复制的相互作用是我们首次发现的。我们发现atg10的两种编码序列产生的两种ATG10蛋白对于HCV复制和对宿主免疫系统具有差异性调节作用。这些研究成果揭示了一种抗RNA病毒的新的宿主效应因子和限制因子，并且该基因和蛋白具有药靶性，为进一步研发抗RNA病毒新药奠定了基础。

发明内容

本发明涉及人自噬基因ATG10基因及其蛋白分子参与和影响HCV复制的新功能。这些研究成果揭示了ATG10s是RNA病毒的新的宿主限制因子或宿主效应因子，并具有新药靶的特性，为围绕ATG10s研发抗HCV新药奠定了基础，如研发包括ATG10蛋白本身和其序列类似物，以及与该基因相关的microRNAs等作为抗RNA病毒类新药；研发可调控ATG10蛋白表达的化合物作为抗RNA病毒类新药。

本发明所述的RNA病毒包括但不限于HCV、HIV等病毒基因组为RNA单链或双链的病毒。

本发明所述ATG10s蛋白分子，包括ATG10基因组序列编码的两种ATG10蛋白序列，ATG10-S蛋白由184个氨基酸组成；ATG10-L蛋白由220个氨基酸组成。这两种ATG10蛋白的氨基酸序列差异表现在ATG10-S比ATG-L少36个氨基酸：在ATG-L蛋白N端第37到72个氨基酸片段缺失，其余氨基酸序列完全相同。具体蛋白序列见“人自噬基因ATG10的核苷酸和氨基酸序列表”。

本发明所述的人自噬基因atg10，包括该基因的基因组序列、转录本，以及通过不同剪接方式产生的多种mRNA和编码区序列。其中，重点关注但不限于人ATG10基因组序列启动子序列、第一、第二、第三和第四内含子序列(introns)，以及全部外显子序列(exons)；atg10-I的编码区序列由663个核苷酸组成，atg10-s的编码区序列由555个核苷酸组成；(依据基因序列：ACCESSION NC_000005 REGION：81972025..82256139 GPC_000001297；VERSION NC_000005.10，GI：568815593；″autophagy related 10，transcript variant 3″)。

本发明所述人自噬基因ATG10参与RNA病毒复制的功能，是指RNA病毒可引起宿主细胞的ATG10-S和ATG-L的表达水平升高，提示ATG10蛋白可能是RNA病毒的效应因子，具有潜在的药靶特性。

本发明所述人自噬基因ATG10s参与和影响RNA复制的新功能，涉及过表达ATG10较短编码区的蛋白产物ATG10-S和ATG10较长编码区的蛋白产物ATG10-L蛋白分子对RNA病毒复制能力的影响，其中ATG10-S具有抑制RNA病毒复制的作用，ATG 10-L具有促进RNA病毒复制的作用。

本发明所述人自噬基因ATG10-L可促进HCV复制，涉及ATG10-L蛋白通过阻止自噬过程进入成熟的自噬体阶段——不完全自噬途径，来避免RNA病毒复制复合物的降解，起到保护病毒复制的作用。

本发明所述人自噬基因ATG10-S可抑制RNA病毒复制，涉及ATG10-S蛋白通过恢复或维持自噬过程进入成熟的自噬体阶段——完整的自噬途径，促进RNA病毒复制复合物降解的作用。

本发明所述人自噬基因ATG10参与和影响RNA病毒复制的功能，涉及ATG10-L和ATG10-S对宿主免疫相关因子包括干扰素家族成员、Toll样受体、病毒模式识别受体、干扰素调节因子等的表达水平的差异性调节作用。

本发明所述的以ATG10基因为靶点，研发抗RNA病毒新药，是指人ATG10-S和ATG10-L两种作用相反的功能来自不同剪接方式——涉及第三和第四内含子序列及剪接复合物，故，这两种mRNA剪接方式的选择可作为调控点和新药作用的靶点。后者包括但不限于1.利用可导致ATG10-S和ATG10-L蛋白差异性表达的基因调控元件，尤其是ATG10-L编码区的exon4相邻上下游内含子序列(ATG10-L的intron3和intron4)，以此序列为靶点，研发可致此exon4缺失的ATG10-S蛋白高表达的药物或其它分子(包括microRNAs)，以达上调宿主细胞内源性ATG 10-S的表达水平，进而激活宿主细胞的免疫系统，达到限制RNA病毒基因组复制的目的。2.以ATG10-L的mRNA和蛋白，以及ATG10-L的启动子序列、intron3和intron4为靶点，研发可下调或降解ATG10-L蛋白的药物或其它分子(包括microRNAs)，以达限制RNA病毒基因组复制的目的。

本发明所述的“抗RNA病毒新药”包括但不限于通过调节ATG10蛋白进而上调或下调(激活或沉默)免疫相关因子(如干扰索、模式识别受体、免疫效应因子和干扰素调节因子等)的化合物，因为这些免疫相关因子可以对病毒RNA单链或RNA双链识别和反应，激活免疫系统，发挥相应的抗病毒作用。

本发明所述的研发“抗RNA病毒新药，包括ATG10蛋白本身和其序列类似物作为抗RNA蛋白类新药的研发”，是指利用基因重组技术，体外表达(原核细胞表达和真核细胞表达系统)、生产ATG10s蛋白和其序列类似物(包括碱基替代导致的氨基酸变异)，并进行成药性研究，以达作为一类新的抗RNA病毒的蛋白类新药进入临床应用的目的。

附图说明

图1是HCV亚复制子对细胞自噬水平标志分子LC3蛋白和P62蛋白的影响

(A)HCV亚复制子细胞48小时时的P62蛋白水平和LC3II/LC3I蛋白比值明显比两个对照组升高。(B)HCV亚复制子细胞中P62蛋白水平和LC3II/LC31比值的时间曲线。##P＜0.01 vs Control；**P＜0.01 vsMock。结果显示，HCV亚复制子可促进细胞的自噬水平且属于不完全自噬。

图2是HCV亚复制子对自噬蛋白ATG10表达的影响

Western blotting检测显示ATG10的蛋白水平在HCV亚复制子细胞模型中比两个对照组明显增强.

图3是自噬基因atg10-L和atg10-S的过表达对HCV亚复制子复制能力的影响

分别转染atg10-L和atg10-S的真核表达质粒，采用HCV RNA core(+)依赖的反转录引物和RT-PCR方法，检测HCV亚复制子的特征基因HCV-core复制的拷贝水平。结果提示，两种ATG10自噬蛋白对HCV亚复制子的复制具有相反的调节作用。#P＜0.05 vs Model。

图4是自噬基因atg10-L和atg10-S的过表达对HCV亚复制子细胞模型自噬水平的影响

分别转染atg10-L和atg10-S的真核表达质粒，采用Western blotting方法检测P62蛋白水平和LC3II/LC3I蛋白比值。结果显示，atg10-L和atg10-S均能明显增加HCV复制模型细胞的LC3II/LC3I的比值，但Atg10-S过表达使P62蛋白水平较模型组有显著下降，而Atg10-L无此作用。##P＜0.01 vs Model；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Control.

图5是HCV亚复制子和过表达自噬基因atg10-s对免疫相关因子转录水平的影响

(A)三种干扰素基因表达的比较；##P＜0.01 vs Model；**P＜0.01 vs Control.(B)三种模式识别受体(PRR)基因表达的电泳图；(C)四种干扰素调节因子基因表达的电泳图。

图6是IFNλ2抑制HCV RNA的复制

在细胞培养液中添加重组人IFNλ2蛋白；RT-PCR检测显示，随IFNλ2浓度的增加，HCV-core水平下降。##P＜0.01 vs Model.

序列说明

SEQ ID NO：1是ATG10-L蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是ATG10-S蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是ATG10-L基因的全长编码区(由6个外显子组成)。

SEQ ID NO：4是ATG10-S基因的全长编码区(由5个外显子组成)。

SEQ ID NO：5是ATG10-S基因的mRNA序列。

SEQ ID NO：6是ATG10-L基因的mRNA序列。

SEQ ID NO：7是可能的人ATG10基因的启动子序列。

SEQ ID NO：8是部份内含子2、全部外显子3和部份内含子3的序列。

SEQ ID NO：9是部份内含子3和全部外显子4的序列。

SEQ ID NO：10是全部外显子4和部份内含子4的序列。

SEQ ID NO：11是部份内含子4和全部外显子5的序列。

具体实施方式

为了探讨ATG10自噬基因和蛋白对HCV复制过程的影响，本研究首先利用HepG2细胞建立了能够模拟HCV复制过程且可稳定重复的HCV亚复制子细胞模型。在此细胞模型的基础上，首先证实了HCV亚复制子与自噬途径的相关性：HCV模型细胞可导致P62、LC3II/I比值升高——将细胞引向不完全自噬途径，维持HCV RNA复制能力。然后，检测了数种自噬基因ATGs，发现了人atg10基因在HCV模型组存在两种cds差异表达，并克隆了这两种全长cds，构建了atg10基因与荧光蛋白基因共表达的真核表达载体。通过细胞转染实验，发现ATG10-S可抑制HCV亚复制子的复制能力、上调多种免疫相关因子的表达。推测ATG10-S可能是宿主细胞抵抗HCV RNA复制的限制因子。

材料与方法

细胞株：人肝癌细胞系HepG2细胞。

大肠杆菌菌株：E.coli DH5α.

质粒：

pIRES2-EGFP和pIRES2-DsRed(Clontech公司产品)本实验室保存；pMD19-T购自Taraka公司。p5BR和prGC3N质粒由本实验室构建(Ding C-B，Zhang J-P，Zhao Y，Peng Z-G，Song D-Q，Jiang J-D.(2011)Zebrafish as a Potential Model Organism for Drug Test Against Hepatitis C Virus.PLoS ONE 6(8)：e22921.doi：10.1371/journal.pone.0022921)。

主要试剂盒、酶、抗体及试剂

DNA片段凝胶回收试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶，以及分子生物学试剂和酶类均购自北京全式金公司、美国Qiagen公司、Takara公司、Promega公司美国Thermo公司、和NEB公司。

其他化学试剂均为国产分析纯，购自北京益利精细公司。

干扰素购自PROSPEC公司。

研究所用抗体及相关试剂主要来自美国Abcam公司、日本MBL株式会社、Cell Signaling Technology公司、北京中杉金桥公司。

常用培养基及溶液配制

见《分子克隆实验指南》和《细胞实验指南》。

实验方法

1.常用基本方法：

质粒的提取：按照试剂盒说明书方法(北京天根公司产品)。

琼脂糖凝胶电泳DNA片段的回收：采用Qiagen公司的Qia Quick Gel Extraction Kit回收。

SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达：参照汪家政等(2000)编的《蛋白质技术手册》方法。

Western blotting检测：按照马歇克等(1999)方法进行。

RT-PCR半定量检测各靶基因的水平。

2.细胞转染：

采用LipofectamineTM 2000 Reagent转染试剂盒。

3.细胞总RNA的提取及RT-PCR检测

收集药1×10⁶个转染HepG2细胞，用灭菌PBS洗涤2-3次后，使用TRIZOL提取总RNA.

反转录：按照试剂盒(Thermo)说明书，以总RNA为模板、Oigo dT₁₈、正链特异引物和负链特异引物分别逆转录合成cDNA。

以cDNA为模板进行PCR。

HCV亚复制子core(+)检测引物表

4.HCV亚复制子细胞模型的建立

将质粒prGC3N转染HepG2细胞，用10％胎牛血清的MEM培养基培养，所有细胞均在5％CO₂浓度、37℃培养箱中培养。培养24小时后，用终浓度为800μg/mL G418处理，每3天更换一次培养基；一个月后，收集细胞，通过RT-PCR鉴定：采用Oligo dT逆转录的cDNA样本中可以检测到Core转录本，而采用Core-R逆转录的cDNA样本中无条带，提示该细胞能够稳定转录HCV Core(-)。将筛选得到的细胞进行多次冻存和复苏处理，复苏后的细胞仍然能够稳定表达HCV Core(-)，提示已得到稳定的HCV亚复制子模型细胞株，并将该稳定株细胞命名为GH细胞。

将HCV-NS5B真核表达质粒p5BR转染GH细胞，分别于0，3，6，12，24，48hr收集细胞，用RT-PCR方法检测core(+)水平，并用Western blotting检测NS5B的蛋白水平。将48hr时core(+)与β-actin以及NS5B与β-actin的比值均设定为1，将各个时间点的比值同48hr的相比，得到core(+)及NS5B的时间曲线。结果显示，在0-24hr内，core(+)与NS5B的mRNA均随时间延长而增加，24hr后，二者水平达到较高的平衡水平；表明成功建立了HCV亚复制子细胞模型，命名为HCVmodel(在后续实验中简称model)。

5.HCV亚复制子对细胞自噬相关蛋白的影响检测

将HCV亚复制子细胞培养48小时收集细胞，对照组为转染pIRES2-DsRED质粒的HepG2细胞，于转染后48h收集细胞。采用Oligo dT₁₈进行逆转录，用RT-PCR检测自噬相关基因转录水平的变化；采用Western blotting方法对自噬基因atg10的蛋白水平进行检测。

自噬基因atg10检测的RT-PCR引物

PCR产物：ATG10-L：594 bp.ATG10-S：486 bp.

6.自噬基因atg10-S和atg10-L的克隆与鉴定

根据GenBank登录的人自噬相关基因Atg10的mRNA序列，设计克隆Atg10 CDS的引物，从HepG2细胞cDNA1 st中通过PCR扩增全长atg10-S和atg10-L编码区序列，连入pMD19-T载体后，送测序检测。测序结果显示atg10-S和atg10-L编码区序列克隆正确；然后将其连接到pIRES2-EGFP真核表达载体。

人自噬基因atg10全长编码区(cds)克隆引物

向HepG2细胞中分别转染pIRES2-EGFP-Atg10-S和pIRES2-EGFP-Atg10-L质粒，于转染48hr后收集细胞，通过RT-PCR鉴定为阳性，提示这两种质粒所含自噬基因在真核细胞内表达。

7.过表达自噬基因atg10-S和atg10-L对HCV亚复制子复制能力和免疫相关因子的影响

对HCV亚复制子模型细胞分别转染pIRES2-EGFP-Atg10-S或pIRES2-EGFP-Atg10-L质粒，于48h收集细胞样本于Trizol试剂中，用于RT-PCR检测：抽提RNA后，每组分为两份，分别以Oligo dT₁₈和Core-R引物进行逆转录，其中，以Core-R为引物获得的cDNA1st样品用于检测Core(+)，以Oligo dT₁₈为引物获得的cDNA1st样本用于自噬相关基因及免疫相关分子的检测；用RIPA裂解液收集细胞样品，用于Westernblotting检测。

表2.5人免疫相关分子RT-PCR检测引物表

8.统计学分析

实验数据以表示，n≥3。各组间用单因索方差分析进行比较，P＜0.05表示有统计学差异。

结果与分析

1.HCV亚复制子影响HepG2细胞的自噬水平

选择自噬水平标志分子LC3和P62为指标进行检测。收集培养48小时的HCV亚复制子模型细胞和对照组(转染商品质粒pIRES2-DsReD)细胞，采用Western blot方法检测LC3及P62蛋白水平。结果显示，在HCV亚复制子细胞模型中，LC3II/I比值增加(图1A)，提示HCV亚复制子能够提高细胞的自噬水平；而P62蛋白水平也显著增加，提示HCV亚复制子诱导的自噬过程属于不完全自噬。检测HCV亚复制子细胞模型在3，6，12，24，48hr的P62和LC3随时间变化趋势，结果显示，P62蛋白水平随时间延长而逐渐增强，LC3 I型向LC3II型的转化也随时间延长而逐渐加强(图1B)。进一步证实HCV亚复制子促进细胞自噬水平的影响是逐步累积的，且属于不完全自噬。

2.HCV亚复制子影响自噬基因atg10的表达

对自噬基因Atg10在HCV亚复制子细胞中的表达水平进行检测，Western blot检测显示ATG10蛋白水平在HCV亚复制子细胞中明显升高(图2“Model”)。

3.自噬基因ATG10s过表达对HCV亚复制子复制功能的影响

对HCV复制模型细胞分别转染Atg10-S和Atg10-L表达质粒，采用HCV RNA core(+)依赖的反转录引物和RT-PCR方法，检测HCV亚复制子的特征基因HCV-core复制的拷贝水平。结果显示，过表达Atg10-S质粒细胞中HCV复制能力被明显抑制。而转染Atg10-L表达质粒，则明显促进了HCV亚复制子的复制(图3)。提示，两种ATG10自噬蛋白对HCV亚复制子的复制具有相反的调节作用。

4.自噬基因ATG10s过表达对HCV复制模型细胞的自噬水平的影响

细胞过表达Atg10-L和Atg10-S后，采用Western blotting方法检测自噬标志蛋白，结果显示Atg10-L和Atg10-S均能明显增加HCV复制模型细胞的LC3II/LC31的比值，说明这两种ATG10蛋白均能促进HCV复制模型细胞的自噬过程(图4)。但是Atg10-S过表达使得P62蛋白水平较模型组有显著下降，而Atg10-L无此作用(图4)。提示Atg10-L可能导致HCV复制模型细胞发生不完全自噬，使得HCV RNA不被自噬机制降解；而ATG10-S可以维持HCV复制模型细胞发生完整的自噬过程，致HCV RNA被自噬机制降解。

5.HCV亚复制子和自噬基因atg10-s对宿主免疫相关因子的影响

本研究通过检测HCV亚复制子及过表达自噬基因atg10-s对细胞天然免疫因子的影响，证明ATG10-S的过表达可以调节HCV亚复制子宿主细胞中的免疫相关因子的转录表达水平。如图5(A)所示，HCV亚复制子可以刺激提高宿主细胞的三种干扰素基因的表达水平；而ATG10-S基因的过表达，只明显增强了III型干扰素(IFN-λ2)的表达水平。

病毒感染后宿主天然免疫的激活有赖于一系列保守的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRR)。这些PRR参与病毒识别与免疫激活主要有两种类型：TLR(Toll-like receptor)和RLR(RIG-I-likereceptor)，其中DDX58(RIG-I)是RLR型受体的代表之一，TLR-3和TLR-7是TLR的重要成员，这三种分子均为胞内受体，DDX58和TLR3以识别双链病毒RNA为主，而TLR-7主要识别单链病毒RNA。我们的检测结果显示(图5B)，ATG10-S可促进DDX58和TLR3的高表达，提示，ATG10-S激活的天然免疫系统以识别RNA病毒dsRNA(病毒RNA复制产物)为主要靶点，并通过DDX58和TLR3激活IFN-λ的表达。我们进一步检测了干扰素调节因子(Interferon-regulatory factor)，如图5C所示，HCV亚复制子仅对IRF-2有微弱的上调效应，对IRF-1、IRF-3和IRF-7均表现出明显的抑制效应；而过表达Atg10-S对以上四种干扰素调节因子均表现出明显的上调作用；这些因子的上调均可增强IFN-I和IFN-III的表达。提示：上调自噬蛋白ATG10-S的表达水平，能够促进细胞的自噬过程及免疫系统的活化，从多方面抑制HCV RNA的复制。

6.IFNλ2可抑制HCV RNA的复制

鉴于ATG10-S可有效提高IFNλ2的表达水平，我们进一步检测了后者对HCV亚复制子复制的影响。在细胞培养液中添加IFNλ2蛋白，48小时后检测HCV-core(+)水平，发现，随着IFNλ2浓度的提高，HCV-core(+)水平降低(图6)。提示ATG10-S可通过促进IFNλ2的表达，达到抑制HCV RNA复制的目的。

结论：

本研究首次揭示了人自噬基因ATG10的新功能：作为宿主细胞对RNA病毒感染的效应因子和限制因子参与或抵抗HCV RNA复制的复杂作用。ATG10蛋白有两种氨基酸序列，较长的ATG10-L对HCV RNA的复制具有促进作用，较短的ATG10-S对HCV RNA的复制具有抑制作用。这两种ATG10蛋白版本的产生涉及宿主细胞防御机制与病毒复制机制相互作用，具体聚焦在mRNA剪接机制对exon4的选择与否。ATG10-S对HCV RNA复制的抑制作用涉及对宿主自噬过程和膜网的调控，以及对诸多的免疫相关因子和IFN表达水平的调控。这两种ATG10蛋白分子及其相关基因序列(包括启动子和introns序列，以及编码区)可做为抗RNA病毒新药靶点进行新药及相关产品的研发；ATG10-S蛋白本身可做为抗RNA病毒的蛋白类新药进行开发。

Claims (10)

1.人自噬基因ATG10基因及其蛋白参与和影响HCV复制的功能。

2.根据权利要求1所述的功能，其特征在于，所述ATG10基因包括启动子区，外显子1-6以及内含子1-4；所述蛋白为ATG10-S蛋白和ATG10-L蛋白。

3.人白噬基因ATG10基因及其蛋白在制备增强免疫的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述ATG10基因包括启动子区，外显子1-6以及内含子3-4；所述蛋白为ATG10-S蛋白；优选地，所述增强免疫是通过上调干扰素家族成员、Toll样受体、病毒模式识别受体、干扰素调节因子等的表达水平来实现的。

5.人自噬基因ATG10基因及其蛋白在制备抑制HCV复制的药物中的用途；优选地，所述ATG10基因包括启动子区，外显子1-6以及内含子3-4；所述蛋白为ATG10-S蛋白。

6.根据权利要求3-5任一项所述的用途，其特征在于，所述药物可以为ATG10蛋白及其序列类似物和/或microRNAs。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述ATG10蛋白及其序列类似物和microRNAs是通过基因操作、定点突变、物理或化学诱变，筛选获得的ATG10蛋白及其序列类似物，以及通过筛选天然存在的或人工设计合成的与ATG10基因表达和功能相关的microRNAs。

8.人白噬基因ATG10基因及其蛋白用于药物的筛选和开发的用途；优选地，所述ATG10基因包括启动子区，外显子1-6以及内含子3-4；所述蛋白为ATG10-L和ATG10-S蛋白。

9.权利要求8所述的用途，其特征在于，以ATG10蛋白的mRNA剪接方式的选择作为调控点和新药作用的靶点；优选地，以导致ATG10-S和ATG10-L蛋白差异性表达的基因调控元件，尤其是ATG10基因的内含子3、外显子4和内含子4为靶点，筛选和研发可致ATG10-S蛋白高表达的药物(包括microRNAs、多肽和化合物)；或者优选地，以ATG10-L的mRNA以及ATG10的启动子序列、内含子3、外显子4和内含子4为靶点，筛选和研发可下调或降解ATG10-L蛋白的药物(包括microRNAs、多肽、化合物等)。

10.权利要求8所述的用途，其特征在于，筛选和开发调节ATG10蛋白表达的新药候选化合物；优选地，筛选和开发下调ATG10-L蛋白表达或上调ATG10-S蛋白表达的新药候选化合物；更优选地，所述调节ATG10蛋白的新药候选化合物是指研发可上调或下调ATG10蛋白进而激活或沉默免疫相关因子的化合物，所述免疫相关因子选自干扰素、模式识别受体、免疫效应因子和干扰素调节因子或其结合物。