CN106520710B - 表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒的制备方法，包括以下步骤：1）构建致弱新城疫GM株全长质粒；2）构建表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒质粒；3）拯救重组病毒aGM‑prm/E并鉴定。并公开了利用这种方法制备的病毒aGM‑prm/E，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201644。利用该病毒制备的疫苗可以预防新城疫和鸭坦布苏病毒病，并减少新城疫病毒强毒感染后排毒。

Description

表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的 制备及应用

技术领域

本发明涉及一种活载体疫苗的制备及应用，特别涉及鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的制备及应用

背景技术

鸭坦布苏病毒病，或称鸭黄病毒病、鸭出血性卵巢炎等，是2010年在我国新出现的一种传染病，主要危害对象是鸭和鹅。蛋鸭发病后，临床主要表现为体温升高，食欲明显下降，产蛋率急剧下降甚至绝产；剖检症状主要表现为卵泡出血、变性、萎缩或者发育不良。该病发病率可达100％，死亡率低。肉鸭和肉鹅也会发病，临床上主要表现为神经症状，死淘率为10％～30％；此外有报道称鸡也会感染。该病给我国养禽业造成了巨大损失。该病病原是鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)，为黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员。该病毒核酸类型为单股正链RNA，基因组长约11kb，编码一个大ORF，顺序为5’-C-prM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。在翻译时先产生多蛋白前体，随后在宿主细胞基因及病毒基因编码蛋白酶的切割下形成多个蛋白，其中C、prM/M和E为病毒的结构蛋白，NS为非结构蛋白。E蛋白是鸭坦布苏病毒的主要结构蛋白，在病毒吸附、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要作用。此外，E蛋白还含有多个抗原表位，能诱导机体产生保护性免疫应答。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。自1997年报道我国广东、江苏鹅群中发生鹅新城疫并导致鹅群死亡(鹅副黏病毒病)以来，鹅、鸭等水禽常有新城疫发生的报道，这些流行的新城疫病毒绝大多数属于基因VII型，因此被认为是第四次新城疫大流行。

当前，鸭坦布苏病毒灭活疫苗(HB株)已上市，但经研究发现，灭活疫苗需要两次免疫以上才能达到良好的免疫效果，而已获批准的鸭坦布苏病毒活疫苗的病毒效价不高，且具有毒力返强的潜在可能。针对基因VII型新城疫的灭活疫苗(A-VII株)已经上市，但由于活疫苗使用方便，可采取滴鼻、点眼或饮水等灵活的免疫方式，抗体产生速度快，成本低廉，使用方便，因此针对基因VII型新城疫的活疫苗具有良好的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于制备针对流行的基因VII型新城疫和鸭坦布苏病毒病的重组活载体疫苗，用于预防水禽新城疫和鸭坦布苏病毒病的发生。

本发明所采取的技术方案是：

一种表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)构建致弱新城疫GM株全长质粒；

2)构建表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒质粒；

3)拯救重组病毒aGM-prm/E并鉴定。

优选的，构建的致弱新城疫GM株全长质粒的序列为序列SEQ ID NO:1。

优选的，构建致弱新城疫GM株全长质粒的方法是：设计两对引物，经PCR扩增新城疫GM株全长cDNA克隆质粒后，获得两个突变片断，再通过融合PCR获得突变F蛋白裂解位点序列的片断，将该片断和GM株全长cDNA克隆质粒分别经过Age I和Asc I酶切后，进行连接。

优选的所述引物是：

F1-Mut-U：5’-TTGACCGGTGCAGCACCCCTCTGAAT-3’(SEQ ID NO:2)，

F1-Mut-L：5’-CTATAAGGCGTTCCTGTCTCTCTCCTCCAGACATGGACACAGACCCTT-3’(SEQID NO:3)；

F2-Mut-U：5’-GGAGGAGAGAGACAGGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGGCAGTG-3’(SEQ IDNO:4)，

F2-Mut-L：5’-GTTGGCGCGCCACATTCGCTATTGTTCTCAG-3’(SEQ ID NO:5)。

优选的，拯救重组病毒aGM-prm/E的方法是：

1)将病毒的重组质粒转染BSR-T7/5细胞，转染24h后，加入TPCK胰酶或者SPF鸡胚尿囊液；

2)待转染72h后，反复冻融细胞3次，并将混合物接种9日龄SPF鸡胚，0.5mL/胚；

3)弃去24h内的死胚，收获24～120h内所有死亡和存活的鸡胚尿囊液，分别测定其HA效价。

优选的，制备的病毒为aGM-prm/E，并将其保藏；其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(保藏单位代码CCTCC)，保藏单位地址：湖北省武昌珞珈山武汉大学，保藏日为：2016年8月17日，保藏编号CCTCC NO：V201644，分类命名：新城疫病毒(Newcastledisease virus)aGM-prm/E株；保藏机构鉴定存活。

一种表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒的制备方法在制备鸭坦布苏病毒和新城疫病毒双价疫苗中的应用。

优选的，aGM-prm/E病毒制备而成的表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗。

优选的，疫苗可以预防水禽新城疫和鸭坦布苏病毒病。

本发明的有益效果是：由本发明申请的技术方案制备的重组疫苗可以预防新城疫和鸭坦布苏病毒病，并且减少新城疫病毒强毒感染后排毒。

附图说明

图1 TVT-aGM-prm/E质粒构建示意图。

图2重组病毒aGM-prm/E测序后与DTMUV JM株和新城疫病毒GM株序列比对结果。

图3重组病毒aGM-prm/E的F基因裂解位点突变序列测定及其与强毒GM株的氨基酸比对分析。

图4重组病毒aGM-prm/E感染CEF后激光共聚焦定位；A：DAPI染色的细胞核；B：普通视野下的CEF；C：新城疫病毒的分布情况；D：鸭坦布苏病毒prm和E蛋白的分布情况；E：A-D图叠加。

图5重组病毒aGM-prm/E接种产蛋鸭后对其产蛋率的影响。

具体实施方式

实验例1致弱GM株全长质粒的构建

新城疫GM株(GenBank accession no.DQ486859)全长cDNA克隆质粒(TVT-GM)拯救后所获得的病毒为强毒株，存在生物安全隐患。为了使病毒致弱，本研究设计了两对引物(见表1)，经PCR扩增TVT-GM质粒后，获得两个突变片断，再通过融合PCR获得突变F蛋白裂解位点序列的片断(命名Fa)。将Fa片断和TVT-GM质粒分别经过Age I和Asc I酶切后，回收Fa酶切产物以及TVT-GM质粒酶切后约14kb的片断，并将他们利用T4DNA连接酶进行连接。连接产物经转化DH5α感受态，经Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit提取质粒即为致弱的全长质粒，经过测序确认后命名为TVT-aGM，其序列为SEQ ID NO:1。

表1 GM株F蛋白裂解位点致弱突变引物

^a突变序列以小写字母标示。

实验例2表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒质粒的构建

为了使外源基因能够顺利插入到新城疫病毒中，在获得致弱全长质粒TVT-aGM的基础上，设计Pme-6200U和Pme-6193L引物(表2)，利用表1中上游引物F1-Mut-U和Pme-6193L引物扩增长度290bp的片段，同时利用Pme-6200U和下游引物F2-Mut-L扩增获得长度3629bp的片段。随后，以回收产物为模板，利用F1-Mut-U和F2-Mut-L引物进行PCR扩增，将获得的片断与pMD18T载体连接后，命名为Fa-Pme。随后，利用JM-prm/E-U和JM-prm/E-L引物扩增鸭坦布苏病毒JM株(保藏编号为CCTCC NO：V201131)核酸，获得含prm和E基因片断(GenBankaccession number：JN811559)，长度为2080bp。将该片段与pMD18T进行连接，阳性质粒经过Pme I酶切后与同样经过Pme I酶切的Fa-Pme质粒进行连接，构建Fa-Pme-prm/E质粒。利用Age I和Asc I酶切Fa-Pme-prm/E质粒，回收产物与经同样酶切后的TVT-aGM约14kb回收片断进行连接和转化，最终经Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit提取的阳性质粒命名为TVT-aGM-prm/E(质粒构建示意图见图1)。该质粒进一步经过Hind III酶切进行鉴定，所获得的片段预期大小分别约6kb、5kb、4.3kb、3kb、1.4kb和0.1kb。

表2 插入位点突变引物和鸭坦布苏病毒JM株prm和E基因克隆引物

^aPme I酶切位点以下划线标示。

实验例3重组病毒aGM-prm/E的鉴定

分别用Promega公司pCI-neo质粒构建的表达新城疫病毒NP、P和L基因的真核表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L，按照Lipofectamine LTX说明书的方法，将全长质粒TVT-aGM和辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L按照2：2：1：1的比例共转染铺满细胞板90％的BSR-T7/5细胞。转染24h后，加入终浓度为1μg/μL的TPCK胰酶或者10％的SPF鸡胚尿囊液。待转染72h后，反复冻融细胞3次，并将混合物接种9日龄SPF鸡胚，0.5mL/胚。弃去24h内的死胚，收获24～120h内所有死亡和存活的鸡胚尿囊液，分别测定其HA效价。经HA试验表明，其中的2枚鸡胚血凝效价分别为5log2和7log2。证实所拯救的病毒具有血凝活性。经序列测定，结果显示，鸭坦布苏病毒prm和E基因成功插入到新城疫病毒中。aGM-prm/E与DTMUV病毒JM株序列比对发现，自图中957位以后的序列与JM株的prm和E基因完全一致(图2)，进一步说明通过Pme I酶切位点(GTTTAAAC)新城疫病毒中成功插入了JM株的prm和E基因。与新城疫病毒GM株序列比对后发现，插入位点Pme I之前的序列与新城疫病毒GM株完全一致(图2)。同时其裂解位点序列亦具有弱毒株特征(图3)，与预期弱毒株特征相符。上述结果表明，本研究成功拯救了重组病毒aGM-prm/E，将该菌株保藏，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(保藏单位代码CCTCC)，保藏单位地址：湖北省武昌珞珈山武汉大学，保藏日为：2016年8月17日，保藏编号CCTCC NO：V201644，分类命名：新城疫病毒(Newcastle disease virus)aGM-prm/E株；保藏机构鉴定存活。进一步将该病毒感染CEF后，经激光共聚焦定位，结果显示，aGM-prm/E病毒能同时与抗新城疫病毒血清和抗鸭坦布苏病毒血清反应。同时可见，新城疫病毒在细胞浆中大量分布(图4)，所表达的坦布苏蛋白在细胞浆中分布，且在细胞表面聚集量多(图4)。

实验例4重组病毒aGM-prm/E的MDT和ICPI值及其安全性

为了明确重组病毒aGM-prm/E的安全性，本研究以10⁷EID₅₀的剂量分别通过滴鼻点眼和肌肉接种1日龄SPF鸡各10只，并设10只PBS接种对照。同样，以10⁷EID₅₀的剂量分别通过滴鼻点眼和肌肉接种产蛋率80％左右的蛋鸭10只，同时设置10只PBS接种对照。所有动物均观察14天，记录SPF鸡的发病、死亡情况，记录蛋鸭的产蛋情况。

经测定，重组病毒aGM-prm/E的MDT值为128h(大于90h)，ICPI值为0.39(小于0.7)。符合新城疫弱毒株特征。该病毒无论是滴鼻点眼还是肌肉接种1日龄SPF鸡，14天内，所有鸡的精神、采食和饮水均正常，无任何不良反应。滴鼻点眼和肌肉接种组蛋鸭产蛋率与对照组十分接近(图5)，其上升趋势一致，说明该病毒对蛋鸭安全。

实验例5重组病毒aGM-prm/E对蛋鸭的免疫效力

以10⁷EID₅₀剂量的aGM-prm/E分别通过滴鼻点眼和肌肉接种产蛋率80％的蛋鸭(新城疫HI抗体和鸭坦布苏病毒中和抗体均为阴性)各10只，同时，这两种接种途径各设置10只PBS接种对照。对重组病毒aGM-prm/E、新城疫LaSota活疫苗和鸭坦布苏病毒HB株对蛋鸭的免疫效力进行比较实验。结果如表4～表6所示：

表4结果显示，蛋鸭通过滴鼻点眼和肌肉接种一次免疫重组病毒aGM-prm/E后14日时，新城疫HI抗体水平平均值分别为5.0log2和6.4log2，肌肉注射组抗体值略高于滴鼻点眼组。此时，LaSota疫苗株滴鼻点眼和肌肉接种免疫后的抗体水平分别为3.8log2和5.1log2。二免14日后，新城疫HI抗体水平平均值分别为7.5log2和7.6log2，此时二者差异不大。LaSota疫苗株免疫后的抗体平均值分别为5.3log2和5.2log2。上述结果表明，aGM-prm/E二次免疫后14日，新城疫HI抗体水平是LaSota疫苗的4倍以上。

表5结果显示，一次免疫14日后，aGM-prm/E滴鼻点眼组和肌肉注射组的鸭坦布苏病毒中和抗体的几何平均值较为接近，分别为1：5和1：6。此时鸭坦布苏病毒灭活疫苗HB株的中和抗体水平较低，个别鸭抗体水平为0。二免14日后，aGM-prm/E滴鼻点眼组和肌肉注射组的中和抗体几何平均值分别为1：16和1：24，此时灭活疫苗HB株的中和抗体水平为1：15。上述结果表明，aGM-prm/E肌肉注射效果好，且鸭坦布苏病毒抗体水平高于灭活疫苗。

攻毒结果显示(表6)，鸭坦布苏病毒JM株攻毒后，滴鼻点眼组和肌肉注射组均出现1例卵巢病变。脏器中E基因RT-PCR检测结果同样显示，重组病毒aGM-prm/E免疫后能够保护60％以上的鸭抵抗鸭坦布苏病毒强毒株的感染。在卵巢病变的保护率上，重组病毒aGM-prm/E与灭活疫苗HB株能够达到相同的保护率，但在aGM-prm/E肌肉注射组能够保护80％以上的鸭抵抗鸭坦布苏病毒强毒株的感染。由此可见，重组病毒aGM-prm/E的保护效果更高。新城疫强毒Goose/GD/2010株攻击蛋鸭4日后，LaSota疫苗株免疫组会出现30％～40％的排毒，aGM-prm/E免疫后则检测不到新城疫病毒，这说明重组病毒aGM-prm/E免疫后能够有效阻止新城疫强毒株的攻击和排毒。

表4 蛋鸭滴鼻点眼和肌肉注射免疫aGM-prm/E后新城疫的HI抗体水平

表5 蛋鸭滴鼻点眼和肌肉注射免疫后鸭坦布苏病毒的中和抗体水平

表6 鸭坦布苏病毒JM株和新城疫病毒Goose/GD/2010株攻击后病变及RT-PCR检测结果

注：“/”表示未进行相应病毒的攻击试验。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所 ；华南农业大学

<120> 表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的制备及应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15192

<212> DNA

<213> TVT-aGM

<400> 1

accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgagga agcaatcgag atcgtacggg 60

tagaaggtgt gaaccccgag cgcgaggccg aagcttgaac ccgagggaac cttctaccga 120

tatgtcgtct gttttcgacg aatacgagca gctcctcgct gctcagaccc gccctaacgg 180

agctcatgga gggggagaga aagggagcac tttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240

aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ttttgcggta ttctgtcttc ggattgctgt 300

tagcgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360

ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgagg ccacactggc 420

tgttcttgag atcgatggtt ttgctaacag tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480

gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aatcgcagga tccctccctc gggcatgcag 540

caacggtact ccgtttgtca cagctggggt tgaagacgat gcaccagaag atatcactga 600

cactctggaa agaatcctat ctatccaagt ccaggtatgg gtcacggtag caaaggccat 660

gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720

aggtagagtt cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcac 780

aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctagttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840

tacagcaggt gggagctcta catattacaa cttggtcggg gatgtagact catacatcag 900

aaacaccggg cttactgcat ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960

agccctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080

gagctttgca ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcggt 1140

cttagataag gggactggca agtaccaatt cgccagggac tttatgagca catcattctg 1200

gagacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagc atcaatgagg acatggctgc 1260

tgagttaaaa ctaaccccgg cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320

tgaagaagtc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagcg ggagtcctca ccgggctcag 1380

tgacgagggc ccccgaactt cacagggcgg atcaaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440

cggggatggg gagacccaat tcttggattt tatgagagca gtggcgaaca gcatgcggga 1500

agcgccaaat cctgcacaga gcaccaccca tccagagccc cccccaaccc ctggggcgtc 1560

ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactaca cccagcctgc cttcacagga 1620

tcacatcaaa ccctccgccc aaaaccctcc cacactccct gacccacaac cctgcacgac 1680

cccacctaca aaagatcccc cccaccctct cccccactcc cagccgcacg atcccaccta 1740

cccgggacag cacaggcaca gctcggttag tcaacaatcc gcccagagtc caaggtatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagacatcc agagaccagg acgggtcacc aagttctctg 1860

ttctcccttc tacctagtga attagggtga agatggccac ctttacagat gcggagatag 1920

atgacatatt tgagaccagt gggactgtca ttgacagcat aattacggcc cagggcaaat 1980

cagttgagac cgtcggaaga agcgcgatcc cgcagggcaa gaccaaagct ctaagcatag 2040

catgggagaa gcacgggagt gtccagccac acgccagtca ggacgcccct gaccaacaag 2100

acagaacaga aaaacagcca tccacacctg agcaggcgac tccacacaac aacccgccga 2160

tcacatccac tgaaccgcct cccactcagg ccgcaagcga gaccagtgac acacagctca 2220

agaccggagc aagcaactcc cttctgtcca tgctcgacaa attgagcaat aaatcgtcta 2280

atgctaaaaa gggcccatgg tcgggtcccc aagaagggca tcaccaacct ccggcccaac 2340

aacacgggaa ccaaccgagc tatggaagca gccagggaag accgcagcac caggccaagg 2400

ccgtccctgg aaaccggggc atagacgaga acacagcata tcatggacaa tggaaggagt 2460

cacaaccatc agctggtgca acccctcatg cgccccagtc agggcagagc caagacaata 2520

ctcctgtacc tgtggatcgt gtccagctac ctgccgactt tgcgcaggcg atgatgtcta 2580

tgatggaggc attatcacag aaggtaagta aagttgatca tcagctggac ctagtcttga 2640

aacagacatc ctctattcct atgatgcgat ctgaaatcca acagctcaag acatctgttg 2700

cgatcatgga agctaactta ggcatgatga aaattctgga ccctggttgt gccaacgttt 2760

catccttaag tgatctccgg gcagtagccc gatcccaccc agtcctagtt tcaggccccg 2820

gagacccatc tccttacgtg acacaagggg gtgaaatgac gctcaataaa ctctcacaac 2880

cggtgcagca cccctctgaa ttgattaagc ctgccactgc aagcgggcct gacatgggag 2940

tggagaagga cactgtccgc gcattaatca cctcacgccc gatgcatcca agctcctcgg 3000

ctaagctcct gagcaagcta gatgcagcca ggtcaattga agagatcagg aagatcaaac 3060

gccttgcgct gaatggttga tggccatcac aactcataac aggctcctgt cacttcagcg 3120

tcacacggaa tcccttgggg gccccccctt gcaaatccac gcttcaacac cccatacaac 3180

agccctctct cacccccccc aatcccccga atgatcgcac aactgcaacc aatccagcag 3240

cattagaaat taagaaaaaa tacgggtaga atcaaagtgc ctcgattgca ccaaaatgga 3300

ctcatccagg acaatcgggc tgtactttga ttctgccctc ccttccagca gcctgttagc 3360

atttccgatt gtcttacaag acacaggaga cgggaagaag caaatcaccc cacaatacag 3420

gatccagcgt cttgattcgt ggacagacag taaggaagac tcggtattca tcaccaccta 3480

cgggttcatc tttcaagttg ggaatgaaga agccaccgtc ggtgtgatca atgacaatcc 3540

caggcacgag ctactatctt ccgcaatgct ctgcttaggg agtgtcccga acgatggaga 3600

tcttgttgag ctggcgagag cctgcctcac catggtggtc acctgcaaga agagtgcaac 3660

taacactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgggtgctgc aaagctgtat 3720

ggttgtgtca aataggtact catcagtgaa tgcagtgaag catgtgaagg cgcccgaaaa 3780

gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttt gtctctttga ctgtggtgcc 3840

gagaaaggat gtctacagga tcccaactgc agtattgaaa gtgtctggct caagcctgta 3900

caatcttgcg ctcaatgtca ctattgatgt ggacgtggat ccgaagagcc cgttagtcaa 3960

atccctttct aagtccgata gcggatacta tgcgaatctt tttctgcata tcgggcttat 4020

gtccactgta gataagaagg gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag 4080

gagactcaat ctatctgttg ggctcagtga tgtgctcgga ccctctgtgc ttgtgaaggc 4140

gagaggtgca cggactaagc tacttgctcc ttttttctct agcagtggga cagcctgcta 4200

ccctatagca aatgcctctc cccaggttgc caagatactc tggagccaga ccgcgcacct 4260

gcggagcgtg aaagtcatca ttcaagccgg cactcagcgt gctgtcgcag tgaccgccga 4320

tcatgaggta acctccacta agatagagag gaggcacgcc attgctaaat acaatccttt 4380

caggaaataa gttgcatccc taagactgca gttcatctgc tttcctgaat caccatgaca 4440

ccagataatg atccatctcg accgcttata gttagttcac ctgtctagca aattagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtctg gatcccgacc ggcacattca ggtcacaata tgggcttcaa 4560

accttctacc aggatcccag cacctctaat gctgatcact cggattatgc tgatattgag 4620

ctgtatccgt ctgacaagct ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtagt 4680

aacaggagat aaggcagtca atgtatacac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740

gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca aaagccccat tagaggcata 4800

taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccatccgca agatccaagg 4860

gtctgtgtcc atgtctggag gagagagaca ggaacgcctt ataggtgctg ttattggcag 4920

tgtagctctt ggggttgcaa cagcggccca gataacagca gctgcggccc taatacaagc 4980

caaacagaat gccgccaaca tcctccggct taaggagagc attgccgcaa ccaatgaagc 5040

tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca actatcagtg gcagttggga agatgcagca 5100

gtttgtcaat gaccagttta ataatacggc gcgagaattg gactgtataa aaatcacaca 5160

acaggtcggt gtagaactca acctatacct aactgaattg actacagtat tcgggccaca 5220

gatcacctcc cctgcattaa ctcagctgac catccaggca ctttataatt tagctggtgg 5280

caatatggat tacttattaa ctaagttagg tataggaaac aatcaactca gctcattaat 5340

tggtagcggc ctgatcactg gttatcctat actgtatgac tcacatactc aactcttggg 5400

catacaagta aacctgccct cagtcgggaa cttaaataat atgcgtgcca cctatttgga 5460

gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata tgcctcagca cttgtcccga aagtagtgac 5520

acaagtcggt tctgtgatag aagagcttga cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga 5580

tttatattgt actagaatag tgacattccc catgtcccca ggtatttatt cctgtttgag 5640

cggcaacaca tcagcttgca tgtattcaaa gactgaaggt gcactcactg cgccatatat 5700

ggcccttaaa ggctcagtta ttgccaattg taagataaca acatgtagat gtacagaccc 5760

tcctggtatc atatcgcaaa attatggaga agctgtatcc ctgatagata gacattcatg 5820

caatgtctta tcattagacg gaataactct gaggctcaat ggggaatttg atgcaactta 5880

tcaaaagaac atctcaatat tagattctca agtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc 5940

aactgaactt ggaaacgtca acaattcaat cagcaatgcc ttggataggt tggcagaaag 6000

caacagcaag ctagaaaaag tcgatgtcag actaactagc acatctgctc tcattaccta 6060

tattgttcta actgtcattt ctctaatttt cggtgcactt agtctggttt tagcgtgtta 6120

cctgatgtac aaacagaagg cacaacaaaa gaccttgcta tggcttggga ataataccct 6180

cgatcagatg agagccacta caagagcatg aatgcagata agaggtggat atatacccga 6240

cagcagcctg tgtgccaatt ccgataacct gtcaagtaga agacttaaga aaaaattact 6300

gggaacaagc aactaaagaa caatacacgg gtagaacggt cagaggagcc acccttcaat 6360

cgagaattag gcttcacaac atccgttcta ccacatcacc agcaacaaga gtcaatcatg 6420

gaccgcgcgg ttaacagagt cgtgctggag aatgaggaaa gagaagcaaa gaacacatgg 6480

cgcctggttt tccgggtcgt agtcttactt ttaatggtaa tgactctagc tatctccgca 6540

gctgccctgg catacagcac gggggccagt acgccgcacg acctcgcagg catatcgact 6600

gtgatctcca agacagaaga taagattacg tctttactca gttcaagtca agatgtgata 6660

gataggatat acaagcaggt ggctcttgaa tccccgctgg cgctactaaa cactgaatct 6720

ataattatga atgcaataac ctctctttct tatcaaatta acggggctga gaacaatagc 6780

gaatgtggtg cgcctgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata 6840

gtggacgaca tcagtgatgt cacatcattt tatccttctg catatcaaga acacttgaat 6900

ttcatcccgg cgcctactac aggatcaggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgagc 6960

accacccatt attgttatac tcacaatgtg atactatccg gttgcagaga tcactcacac 7020

tcacatcaat acttagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080

tctactctgc gctccatcaa tttagatgac acccaaaatc ggaagtcctg cagtgtgagt 7140

gcaacccctc taggttgtga tatgctgtgc tctaaggtca cagggactga agaggaggat 7200

tacaagtcag ttgcccccac atcaatggtg cacggaaggc tagggtttga cggtcaatac 7260

catgagaagg acttagacac cacggtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccggga 7320

gtgggaggag ggtcttttat tggcgaccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctcaaa 7380

cccaattcac ccagtgacac tgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgccataac 7440

aacacatgcc ccgatgaaca agattaccaa attcggatgg ctaagtcttc atataaaccc 7500

gggcgatttg gtggaaagcg catacagcaa gccatcctat ccatcaaagt gtcaacatcc 7560

ctgggtaagg acccagtgct gactattcca cctaatacaa tcacactcat gggagccgaa 7620

ggcagaatcc tcacagtagg gacatctcat ttcttgtacc aacgagggtc ttcatatttc 7680

tcccctgcct tattatatcc catgacagta aataacaaaa cggctacact ccatagtcct 7740

tacacgttta atgctttcac tcgaccaggt agtgtccctt gccaggcatc agcaagatgc 7800

cccaactcat gcatcactgg ggtctatacc gatccatatc ccttaatctt ccataggaat 7860

catactctac gaggggtctt cgggacgatg cttgatgatg aacaagcgag gcttaacccc 7920

gtatctgcag tatttgacaa catatctcgc agtcgtgtca cccgggtgag ttcaagcagc 7980

accaaggcag catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagaccaa taaagcttat 8040

tgtcttagta tcgcagaaat atccaatacc ctattcgggg aatttaggat cgttccctta 8100

ctagttgaga tcctcaagga tgatagagtt taagaagcta gacttagccg attgagccaa 8160

tcataggatg gttgggaaga cgacaccgcg ccaatcatct cccataatgc ttagagtcaa 8220

gctgaatatt aacataagcc aggatcccat gttgttgggc aaccacaatc cgacaatgct 8280

aacatgatta ttctgagtcc cgcccactgt cattttatta agaaaaaaaa caagaagcat 8340

tgagatataa gggaaaacaa ccaacaagag agaacacggg taggacatgg cgggctccgg 8400

tcccgaaagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca catctatcct ccccattggt 8460

caagcacaaa ttgctatact actggaaatt gactgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 8520

ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagaaaata ctggagtcgg ccactcctga 8580

cacagagaga atgataaaac tcgggcgggc agtgcaccag actctcaacc acaattccaa 8640

gataaccgga gtgctccatc ccaggtgttt agaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700

ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caaggtatgg 8760

agacctgttc acaaagctgt gcacgcaagt tgagaataaa ttgctaggat catctcggtc 8820

taataatgtc ccacgatcag aggaattcag tagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880

tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat ataaaacaag tccaaaggca 8940

tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag ttagtaacat taagtcataa 9000

gataggccac gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg acacatacag atgagaacaa 9060

attcacatgc ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg gatatgatgg aaggcaggga 9120

catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcaga aacctatccg agaaaattga 9180

tgatattctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta ggtaatcaag tctatgatgt 9240

tgtagcatta atggagggat ttgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc catcaggtac 9300

atttgcagga gatttctttg catttaacct acaggagctc aaagacacgt taatcgaact 9360

tctcccaaat aatatagcgg aatcagtaac tcacgctatt gccactgtat tctccggctt 9420

agaacagaat caagcagctg agatgttgtg cttactgcgt ttgtggggcc acccattgct 9480

tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540

cttcgatatg atcctccagg tattatcttt cttcaaagga acaatcatca atggatacag 9600

aaagaagaac tcaggtgtgt ggccgcgtgt caaagtagat acaatatacg gaaatatcat 9660

tgggcagcta catgctgatt cagcagagat ctcacatgat gtcatgttga gggagtacaa 9720

gagtttatct gctcttgaat ttgagccatg tatagattat gaccctgtta ccaatctaag 9780

catgttccta aaagacaagg caatcgcaca tcctagtgat aactggctcg cctcatttag 9840

gcggaaccta ctctctgagg accagaagaa acagataaaa gaggcaactt caactaaccg 9900

cctcctgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatcca tataaagaaa tggaatacct 9960

gacaaccctc gagtacctaa gagatgacag tgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa 10020

agaggtgaaa gtgaatgggc ggatttttgc taaattaaca aagaaactaa ggaactgcca 10080

ggtaatggca gaaggaattc tagctgacca gattgcacct ttctttcagg gaaatggggt 10140

cattcaagat agcatatcct tgacaaagag tatgttagcg atgagtcaac tgtcctttaa 10200

cagcaataag aaacgtatca ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaacc gcaatcatga 10260

tcctaagagc aagaatcgta gaagagttgc cacttttatc acgactgacc tacaaaagta 10320

ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa actattcgcc catgccatca atcagctgat 10380

gggcctacct catttctttg agtggattca tcttaggctg atggacacta caatgtttgt 10440

aggggatcct ttcaatcctc caagtgaccc gactgactgt gatctatcaa gagtcccgaa 10500

tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggactctgcc agaagctatg 10560

gacgatgatc tcgattgctg caatccaact tgctgcagca agatctcatt gtcgagttgc 10620

ctgcatggta caaggtgaca accaagtaat agctgtaacg agagaggtga gatcagacga 10680

ttccccggat atggtgttga cgcagttgca tcaagctagt gataatttct tcaaggaatt 10740

gattcatgtc aatcatctga ttggccataa cctgaaggat cgtgaaacca ttagatcaga 10800

cacattcttc atatacagca aacgaatatt caaagatgga acaatactca gtcaggtcct 10860

caaaaattca tctaaattgg tgctaatatc aggcgacctt agcgagaaca ctgtaatgtc 10920

ttgtgccaac attgcatcca ctgtggcacg actatgtgag aatgggcttc ctaaggattt 10980

ctgttactat ttgaactacc taatgagttg cgtgcagaca tactttgatt cggagttttc 11040

tattactcac agctcgcaat cagattccaa ccagtcctgg atcgaggata tctctttcgt 11100

acactcatac gtgttaaccc ctgcccagct ggggggactg agcaaccttc aatactcaag 11160

gctctacaca aggaatattg gtgacccagg gaccactgct tttgcagagg tcaagcgact 11220

agaagcagtg gggttgctga gtcccagcat catgactaac atcttaacca ggccacctgg 11280

caatggagac tgggccagcc tatgcaatga cccatactct tttaattttg agactgttgc 11340

aagcccaaat attgtcctca agaaacatac acagaaagtc ctatttgaga catgttcaaa 11400

ccctttatta tccggggtac atacagagga caatgaggca gaagagaaag cattggctga 11460

attcttactc aatcaagaag tgattcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag 11520

ctctgtgggt aggagaaagc aaattcaagg gcttgttgac acaacgaaca ctgtgattaa 11580

gattgcactg actaggaggc ccctcggtat caaaagactg atgcggataa tcaattactc 11640

gagcatgcat gcaatgttgt tcagagatga tattttctta tccaatagat ccaaccaccc 11700

attagtttct tctaatatgt gctcgctgac gctagcagat tatgcccgga acagaagctg 11760

gtcacccctg acagggggca ggaaaatact gggtgtatcc aaccccgata ccatagaact 11820

tgtggaggga gagattctca gcgtcagtgg agggtgtaca aaatgtgaca gcggagatga 11880

gcagtttact tggttccatc ttccaagcaa tatagagctg actgatgaca ccagcaagaa 11940

tcccccgatg agagtgccat atctcgggtc gaagactcaa gagaggagag ccgcctcgct 12000

tgcgaaaata gcccacatgt caccacatgt gaaagcagca ctaagggcat catccgtgtt 12060

aatctgggct tatggggaca atgaagtgaa ctggactgct gctcttaata ttgcaaggtc 12120

tcgatgcaac ataagctcag agtatcttcg gctattgtca cccctgccca cagctgggaa 12180

tctccaacat agattggatg atggcataac ccagatgaca tttacccctg catctctcta 12240

cagagtgtcg ccttacgttc acatatccaa cgattctcaa aggctattca ccgaagaagg 12300

ggtcaaagag ggaaacgtgg tttaccaaca aattatgctc ttgggtttat ctctaattga 12360

atcactcttc ccaatgacaa caaccagaac atatgatgag atcacattac acctccacag 12420

taaatttagc tgctgtatcc gagaagcgcc tgttgcggtt cctttcgagc tcttcgggct 12480

ggcaccggaa ttaaggatgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccca gtcctatatc 12540

agagagagat tttgcgagac ttgacttagc tatcttcaag agttatgagc ttaatttgga 12600

atcatattcc acgctggagc taatgaacat tctttcaata tctagcggga aattgattgg 12660

ccaatccgtg gtttcttatg atgaagatac ttctataaag aatgatgcta taatagtgta 12720

tgacaacaca cgaaattgga ttagtgaggc gcagaactca gatgtggtcc gcctgtttga 12780

gtatgcagca ctcgaagtgc tccttgactg tgcttatcaa ctctactatc tgagggtaag 12840

gggtctaaac aacatcgtcc tatacatgaa tgacttatat aagaacatgc cagggatcct 12900

actctctaat attgcggcca cgatatccca ccccctcatt cactcaaggt tgaatgcagt 12960

aggtctaatt aaccatgacg ggtcacacca gcttgcagat atagacttcg tcgaggtgtc 13020

tgcgaaattg ttagtctctt gcactcgacg cgtggtctca ggcttatatg cagggaataa 13080

gtacgatctg ctgttcccat ctgtcttaga tgataacctg aatgagaaga tgcttcaact 13140

gatttcccgg ttatgctgtc tgtacacagt gctctttgct acaacaagag aaatcccaaa 13200

aataaggggc ctatcggcag aagagaaatg ctcaatactc actgagtatc tactgtcaga 13260

tgctgtaaaa ccgttgctta ggcccgaaca agtgagttct atcatgtctc ccaacataat 13320

cacgttccca gccaatctat attacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagagaacg 13380

agaggacaga gatactatct tgtcgttgtt gttccctcag gaaccactgc ttgagcttcg 13440

cccagtacga gacattggtg ctcgagtgaa agacccgttt acccgacaac ccgcatcatt 13500

catacaagag ctagatctga gtgccccagc aaggtacgac gcatttacac tgagtaaggt 13560

ttgcttcgag cacacattac cgaacccaaa ggaagattac ctagtacggt acttgttcag 13620

aggaataggg actgcttcat cttcttggta taaggcatct catcttctat ccgtacctga 13680

ggtcaggtgt gcaagacatg ggaactcctt atacttagca gaaggaagcg gagccatcat 13740

gagtcttctt gaattgcata taccacatga gactatctat tacaatacac ttttctcgaa 13800

tgagatgaac cctccacagc gacatttcgg acctacacca acacagtttc tgaactcggt 13860

cgtttatagg aatctacaag cggaagtgcc gtgtaaagat ggatatgtcc aggagttctg 13920

cccattatgg agagagaatg cagaagaaag tgacctgacc tcagataagg cagttggata 13980

tatcacatct gtggtaccct acaggtctgt atcattacta cattgtgaca ttgagattcc 14040

tccagggtcc agtcaaagct tattagatca actggccact aatttatccc tgattgccat 14100

gcattctgtg agagagggcg gggtagtgat catcaaagta ctgtatgcaa tggggtacta 14160

cttccattta ctcatgaatt tattcactcc atgttccacg aaaggataca tactctccaa 14220

tggctatgcc tgtagagggg atatggagtg ttacctgata ttcgttatgg gctacttagg 14280

cgggcccacc ttcgtgcacg aagtggtaag gatggcaaaa actctaatac aacgacacgg 14340

tacacttcta tctaaatcag atgaaatcac attgactaag ctatttacct cacagcagcg 14400

tcgtgtaaca gatctcctat ccagcccttt accgaagcta atgaagctct taagtgaaaa 14460

tattgatgct gcactaattg aagccggggg acagcccgtc cgtccattct gtgcagaaag 14520

tttggtgagc acactaacag atatgaccca gacaactcag atcattgcca gccacattga 14580

cacagtcatt cggtctgtga tttacatgga ggctgagggt gacctcgccg acacagtgtt 14640

cttatttact ccttacaatc tatccacaga cggtaaaaag agaacatcac ttaagcagtg 14700

caccaaacag atcttggaag tcacaatact gggtctcaga gccaaagata tcaataaagt 14760

aggtgatgta atcagcttag tactcagagg tgcggtttcc ttagaggatc tcatcccatt 14820

aaggacatac ctgaagcgca gtacctgccc taaatacctg aaagcggtcc taggtattac 14880

taaactcaaa gaaatgttca cagatacctc gttactgtac ttgactcgtg ctcaacaaaa 14940

attctacatg aaaaccatag gtaatgctgc caagggatat tacagtaata atgactctta 15000

aaggcaatcg tacaccaatc agttatcttc ttagctgatg actccctcac tgacttaatt 15060

ataccagatt agaaaaaagt taaattccga ctctttggaa ctcgtattcg gattcagtta 15120

gttaacgtta agcaaaaatg cgcaaagtcg tccctaatta tagttatgtc attcaccaaa 15180

tctctgtttg gt 15192

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgaccggtg cagcacccct ctgaat 26

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctataaggcg ttcctgtctc tctcctccag acatggacac agaccctt 48

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaggagaga gacaggaacg ccttataggt gctgttattg gcagtg 46

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttggcgcgc cacattcgct attgttctca g 31

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatccacgtt taaacacccc atacaacagc cctct 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttgtatgg ggtgtttaaa cgtggatttg caagg 35

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtttaaactt aagaaaaaat acgggtagaa gccaccatgc tgaagcttgg aaattat 57

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtttaaactt aggcattgac atttactgcc aggaag 36

Claims (3)

1.一种表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白的重组新城疫病毒aGM-prm/E，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201644。

2.一种如权利要求1所述的病毒制备而成的表达鸭坦布苏病毒prm和E蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗。

3.根据权利要求1所述的病毒在制备预防水禽新城疫和鸭坦布苏病毒病的疫苗中的应用。

Images