JP2004345968A - アディポネクチンの新規用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】各種癌、炎症性疾患等の治療又は予防剤を提供する。
【解決手段】アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ−１機能抑制作用を有さない、ＣＯＸ−２特異的機能抑制作用、並びにＭＭＰ機能抑制作用を併せ持つ医薬組成物。
【選択図】 なし。
【解決手段】アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ−１機能抑制作用を有さない、ＣＯＸ−２特異的機能抑制作用、並びにＭＭＰ機能抑制作用を併せ持つ医薬組成物。
【選択図】 なし。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アディポネクチンの新規な用途等に関する。詳しくは、アディポネクチン又はアディポネクチン様の作用を有する物質を有効成分とする、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症及び炎症性疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アディポネクチンは、主に脂肪組織にて発現している、２４７アミノ酸からなる脂肪組織由来の生理活性物質（アディポカイン）の一種であり、Ｎ末端のシグナル配列、ノンホモロガス配列、コラーゲン様ドメインおよびＣ末端のグロビュラードメインの主に４つのドメインで構成されている。コラーゲンドメインとグロビュラードメインとの間にはプロテアーゼ切断部位が存在し、該切断部位で切断されたＣ末側断片はグロビュラーアディポネクチンと呼ばれる。
アディポネクチンの血清中蛋白質濃度は肥満糖尿病マウスや肥満や２型糖尿病の患者において減少しており、これらの病態に関与していることが示唆されている（非特許文献１、２）。実際にマウスに対してアディポネクチンをオスモティックポンプで皮下投与した場合、血糖降下作用、血清脂質低下作用が認められることが報告されている他、グロビュラーアディポネクチンを高発現させたｏｂ／ｏｂマウスでは、非トランスジェニックｏｂ／ｏｂマウスと比較して、空腹時血糖ならびに糖負荷後の血糖値が共に有意に低下しており、グロビュラーアディポネクチンが抗糖尿病作用、血清脂質低下作用を有することが示されている（非特許文献３，４）。
また、高脂肪食を負荷したマウスに対してグロビュラーアディポネクチンを投与すると、コントロールと比較して、肥満発症が抑制され（非特許文献５）、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンは抗肥満作用を示すことが報告されている。
また、アデノウイルスを用いてアディポネクチンを発現させたＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、ならびにグロビュラーアディポネクチンを高発現させたＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、動脈硬化の病巣の形成が抑制されることが報告されており、アディポネクチンが抗動脈硬化作用を有することが示唆されている（非特許文献４、６）。
【０００３】
しかしながら、上記以外の疾患に対してアディポネクチンが関与しているかどうかについては知られていなかった。
【０００４】
一方、ロジグリタゾンやピオグリタゾン等のチアゾリジンジオン系化合物は、核内受容体ＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のγサブタイプへ作用することが知られている。これらのＰＰＡＲγアゴニストは糖尿病、腎癌、膵癌、舌癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、乳癌および肝癌などの各種癌、腸ポリープ、動脈硬化、心肥大、感染症、ならびに線維症等の疾患に対して有効であることが報告されている。例えば癌に対するＰＰＡＲγアゴニストの作用としては、食道癌細胞株における抗腫瘍効果（非特許文献７）、大腸癌の前癌病変であるＡＣＦの形成の抑制（非特許文献８）、胃癌株６株における増殖抑制及びＤＮＡ断片化（非特許文献９）等が報告されている。しかしながら、アディポネクチンがＰＰＡＲγの機能に影響を与えるか否かは不明であった。
【０００５】
また、アスピリン、インドメタシン等の抗炎症剤は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害作用を有するが、その阻害作用はＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２に対して非選択的であり、消化管障害が副作用として問題となっている。それに対して、近年ＣＯＸ−２選択的なシクロオキシゲナーゼ阻害剤が開発され、消化管障害を伴わない抗炎症剤として有用であることが知られている。しかしながら、アディポネクチンがシクロオキシゲナーゼの機能に関与しているか否かについては全く知られていなかった。
【０００６】
また、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、コラーゲンを中心とする細胞外マトリックスの蛋白質分解に関わる一連の酵素であり、ＭＭＰ１〜３、７〜２８の多種類のサブタイプが知られている。ＭＭＰは、胚形成、再生、再吸収、リモデリング、創傷治癒、血管新生などの多岐にわたる生理的機能を担っているが、その異常な機能亢進が様々な疾患の原因となっている。具体的には、慢性関節リウマチ等の炎症性疾患、変形性関節症、癌の病巣部への転移・湿潤、喘息（非特許文献１０）などの増悪因子であることが知られている。
例えば、胃癌において、ＭＭＰ−１，２，９，７，１４が関与していることが報告されている（非特許文献１１）。また、特に、ＭＭＰ−２，７，９が癌細胞による組織破壊に機能すると考えられている（非特許文献１２）。
実際に、ＭＭＰ阻害作用を有する化合物が癌転移抑制剤、または、慢性関節リウマチ、変形性関節症、もしくは歯周病の治療剤として研究・開発されている。
しかしながら、アディポネクチンと上記ＭＭＰの関係は知られていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１０６９７−１０７０３， １９９６
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５７：７９−８３， １９９９
【非特許文献３】
Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４１−９４６， ２００１
【非特許文献４】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：２４６１−２４６８， ２００３
【非特許文献５】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：２００５−２０１０， ２００１
【非特許文献６】
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２７６７−２７７０， ２００２
【非特許文献７】
日本癌学会第６１回総会記事， ４３１， ２００２
【非特許文献８】
Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ． ６１：２４２４−２４２８， ２００１
【非特許文献９】
日本癌学会第６１回総会記事 １６３， ２００２
【非特許文献１０】
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｐｕｌｍ． Ｍｅｄ． ９：２８， ２００３
【非特許文献１１】
日本臨床 ５９巻増刊号４， １０７−１１２， ２００１
【非特許文献１２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３９， ２００２年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、新たなメカニズムによる、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症、及び炎症性疾患等の治療剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アディポネクチンの機能を解明し、既に知られている糖尿病、高脂血症、動脈硬化症以外の疾患の治療剤としても適用すべく鋭意検討を行った。
すなわち、グロビュラーアディポネクチントランスジエニックマウスとＡｐｏＥ欠損マウスを交配して作成したグロビュラーアディポネクチントランスジエニックＡｐｏＥ欠損マウスとＡｐｏＥ 欠損マウスに高コレステロール食を負荷し、該マウスから摘出した起始部から下大動脈分岐部までの大動脈（以下、本明細書において「大動脈」ともいう。）において、アディポネクチンがどのような遺伝子の発現を制御しているかを調べた。その結果、アディポネクチンがＰＰＡＲγの発現を亢進するという新しい知見を見出した。従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＰＰＡＲγのアゴニストが有効性を示す疾患、即ち、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症のみならず、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症及び線維症の治療剤となる。
また、マクロファージ系の培養細胞、すなわちＴＨＰ−１細胞に対してＬＰＳ存在下でアディポネクチン又はグロビュラーアディポネクチンを添加した。細胞から抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行い、アディポネクチンによって発現量が変動する遺伝子を同定した。
その結果、驚くべきことに、アディポネクチンはＣＯＸ−１の発現には影響を与えないにもかかわらず、ＣＯＸ−２の発現を抑制することを見出した。従って、アディポネクチン及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＣＯＸ−２特異的に発現を抑制するため、優れた炎症性疾患の治療又は予防剤となる。
また、本発明者らは、上記細胞において、ＭＭＰ−１，８及び１０の発現量が低下することを見出した。従って、アディポネクチン及びアディポネクチン様作用を有する物質は、癌（特に癌転移）等のＭＭＰの機能亢進により増悪される疾患の治療又は予防剤となる。
本発明は、上記の知見を基に完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
［１］アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進剤、
［２］ 癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤として用いられることを特徴とする、［１］に記載のＰＰＡＲγ機能亢進剤、
［３］ アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＭＭＰ機能抑制剤、
［４］ ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８及び／又はＭＭＰ−１０である、［３］に記載のＭＭＰ機能抑制剤、
［５］ 癌、炎症性疾患、変形性関節症、肩関節周囲炎、頚肩腕症候群又は歯周病の治療又は予防剤であることを特徴とする、［３］又は［４］に記載のＭＭＰ機能抑制剤、
［６］ アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＣＯＸ−２機能抑制剤、
［７］ ＣＯＸ−１に対して作用しないことを特徴とする、［６］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、
［８］ 炎症性疾患の治療又は予防剤であることを特徴とする、［６］又は［７］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、及び、
［９］ 消化管障害を起こす頻度及び／又は程度が低いことを特徴とする［８］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、に関する。
【００１０】
【本発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
「アディポネクチン」とは、脂肪組織において高発現しているアディポカインの一種であり、その配列は、ヒト型については配列番号２、又はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：Ｄ４５３７１）に記載されている。本明細書において、「アディポネクチン」という用語を用いる場合、前記ヒトアディポネクチンやその同族体及び変異体などを包含する。該同族体としてはマウスアディポネクチン（配列番号４又はＧｅｎＢａｎｋ （アクセッション番号：Ｕ３７２２２）に記載されている。）等が知られている。
また、現在公知になっていない同族体についても、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の任意のＤＮＡ断片をプローブとして用いて、当業者によく知られた方法で対応する動物種のｃＤＮＡライブラリーからクローニングして得ることができる。具体的な手順は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）」等に記載されている。
【００１１】
前記「変異体」としては、前記ヒトアディポネクチンもしくはその同族体に対して、１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド等が挙げられ、アディポネクチン活性を保持している限り、本発明のアディポネクチンに含まれる。
具体的には、アディポネクチンは、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、または
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
該アディポネクチン活性としては、
（１） Ｃ２Ｃ１２細胞における、ＡＭＰＫ活性化作用およびＡＣＣ抑制作用、グルコース取り込み促進活性、脂肪酸酸化促進活性（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８：１２８８−１２９５， ２００２） ；
（２） 初代培養肝細胞におけるＡＭＰＫ活性化作用（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８：１２８８−１２９５， ２００２）、グルコース放出抑制作用（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４７−９５３， ２００１）；
（３） 血管内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：２４７３−２４７６， １９９９）；
（４） マクロファージにおける、コレステロールエステル量の低下（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２７：２８５， １９９７）、リピッドドロップレット蓄積低下（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １９：１３３３， １９９９）、スカベンジャーレセプター（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２：２７７， ２０００）、又はリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）発現抑制活性（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １５：５２２， １９９５）、又はＴＮＦ−α産生抑制活性；
（５）血管平滑筋細胞の増殖・遊走抑制活性（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５：２８９３， ２００２） ；
（６）コラーゲンＩ、ＩＩＩ、Ｖ結合活性（Ｈｏｒｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ． ３２：４７−５０， ２０００）、
等を挙げることができる。前記（１）〜（６）に記載されたうちの１又は複数の活性を維持する限り、「アディポネクチン活性を有する」の範疇に含まれる。ここで「アディポネクチン活性を有する」とは好ましくは、配列番号２もしくは配列番号４で表されるアディポネクチン、又は、配列番号６で表されるグロビュラーアディポネクチンと同等の活性を示すことを意味する。
前記（１）〜（６）の活性（作用）はそれぞれ当業者に公知のそれぞれ上記の文献に記載の方法で確認することができる。
【００１２】
具体的には、初代培養肝細胞におけるグルコース放出抑制作用をＢｅｒｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４７−９５３， ２００１に記載された方法で、以下のように測定することができる。すなわち、ＳＤラット由来の肝細胞をＢｅｒｒｙ ａｎｄ Ｆｒｉｅｎｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：５０６， １９６９およびＬｅｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５８：５３６， １９７９に記載された方法により採取し、ラットテイルコラーゲンＩでコートされた２４ウエルプレートに播種する。接着後、グルコースを含む培地（デキサメタゾンおよびインスリンは含まない）を添加し一昼夜加温する。翌朝培地を交換し、インスリンおよびアディポネクチンを添加し２４時間刺激する。刺激後、アラニン、バリン、グリシン、ピルビン酸、乳酸を含む培地（グルコースは含まない）で６時間加温する。その後培地中に放出されたグルコースを、Ｔｒｉｎｄｅｒ ａｓｓａｙ（シグマ社製）等を用いて測定することができる。
【００１３】
また、コレステロールエステル量の低下をＩｓｈｉｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２７：２８５， １９９７に記載された方法で、以下のように測定することができる。すなわち、密度勾配遠心により末梢血から単離した単核球を、１０％ヒト型ＡＢ血清を含む培地にて３７℃で１時間加温する。ＰＢＳにて洗浄後、接着細胞を同じ培地にて培養する。２、３日毎に培地を交換する。コレステロールエステル量の測定は、アディポネクチンで３日間処理した細胞中のトータルコレステロール量からフリーコレステロール量を引いて求める。すなわち、細胞からフリーコレステロール・トータルコレステロールをヘキサン／イソプロパノールにて抽出し、イソプロパノールに懸濁する。フリーコレステロールは、コレステロールオキシダーゼを含む反応液に上清を添加し１時間加温したした後、励起３１０ｎｍ、発光４０７ｎｍにて蛍光強度を測定し、スタンダードとの比較からフリーコレステロールの濃度を測定することができる。トータルコレステロールは、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼを含む反応液に上清を添加し２時間加温した後、励起３１０ｎｍ、発光４０７ｎｍにて蛍光強度を測定し、スタンダードとの比較からトータルコレステロールの濃度を測定することができる。
【００１４】
本明細書において、「１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド」とは、例えば、ポリペプチドが細胞内で受けるプロセシング、動物間の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。なお、ポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能、すなわちアディポネクチン活性が保持される限り制限はない。生物学的機能を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また前記欠失、付加、挿入、又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましく、置換されるアミノ酸は、置換後に得られるポリペプチドが該ポリペプチドの生物学的機能を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１５】
前記「１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、対象となるポリペプチドをコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：９４４１−９４５６， １９８４、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００１６】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリペプチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ該ポリペプチドのアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００１７】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド間の、配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はポリペプチドは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２：４６７３−４６８０， １９９４を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
【００１８】
前記ストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， １９８７） に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。
例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄する。ハイブリダイズ後の洗浄条件として、例えば通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００１９】
本明細書において、前記（ａ）〜（ｄ）で表されるポリペプチドのアミノ末端もしくはリジンの側鎖アミノ基等がアシル化、アルコキシカルボニル化もしくはアルキル化された誘導体もまた、アディポネクチンの「変異体」の範疇である。
具体的には、アミノ基がアセチルアミノ基、プロパノイルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等に変換された誘導体を例示できる。また、アディポネクチンのカルボキシル末端、又はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖がエステル化もしくはアミド化された誘導体が挙げられ、カルボキシ基がエトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基等に変換された誘導体を例示できる。また、システインのメルカプト基が酸化され、ポリマー（ダイマー、ポリマー等）や分子内で環状構造を形成している誘導体が挙げられる。また、システイン、セリン、スレオニンもしくはチロシンの水酸基がエーテル化もしくはアシル化された誘導体等が挙げられ、水酸基又はチオール基がメトキシ基、メチルチオ基、エトキシ基、エチルチオ基、アセチルオキシ基、アセチルチオ基、プロパノイルオキシ基、プロパノイルチオ基等に変換された誘導体が挙げられる。
【００２０】
また、本明細書において、任意の１以上のアミノ酸残基を非天然型アミノ酸へ置換した誘導体もまた、上記アディポネクチン活性を保持している限り、アディポネクチンの「変異体」の範疇である。
【００２１】
前記「アミノ酸残基を非天然型アミノ酸へ置換した誘導体」における非天然型アミノ酸は、天然の蛋白質を構成する２０種類のＬ−α−アミノ酸（天然型アミノ酸）以外の任意のアミノ酸を表し、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、オルニチン、ターシャリーロイシン、ノルロイシンもしくはヒドロキシプロリン等の天然型アミノ酸の側鎖を改変したアミノ酸、Ａｉｂ等のα−アルキル化アミノ酸、Ｎ−メチルグリシン等のＮ−アルキルアミノ酸等が挙げられる。
【００２２】
上記誘導体において、修飾されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数残基、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリペプチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００２３】
本明細書において、「アディポネクチン断片」とは、前記アディポネクチン（ヒトアディポネクチンの同族体及び変異体を含む。）のグロビュラードメインを含む任意のアディポネクチン断片を表す。ここでグロビュラードメインとは、Ｃ末端約１３８残基からなる断片を表す。該アディポネクチン断片として、具体的には配列番号：６で表されるグロビュラーアディポネクチンが挙げられる。
【００２４】
アディポネクチンは、公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号：Ｕ３７２２２）及び配列番号：１に記載された配列に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＤＭ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ （１９８５））などに準じて行うことができる。
【００２５】
具体的には、アディポネクチンをコードする遺伝子に開始コドンを付加し、所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、目的のポリペプチドを得ることができる。
【００２６】
以下具体的に説明する。
アディポネクチンをコードする遺伝子は、公知文献（Ｇｅｎｅ ２２９：１１５８−１１６２， １９９９）、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号： Ｄ４５３７１として登録されている配列情報、本明細書配列番号１に記載された配列情報をもとに適当なＰＣＲプライマーを作製し、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従ってＰＣＲ反応を行うことなどにより、容易にクローニングできる。
また、変異を施す場合は前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして容易に行うことができる。さらに、このようにしてクローニングされたアディポネクチンをコードする遺伝子を用いてアディポネクチンを発現させる方法としては、例えば、前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。発現させたいＤＮＡの上流に、場合によっては転写を制御するプロモーター配列の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えばレトロウイルスベクターｐＬＪなど）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。次に発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を得る。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。形質転換体は、適当な培地で培養することによってフィブロネクチンタンパク質を生産する。以上のようにして得られた培養液中のフィブロネクチンは一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
以上のようにして作製されたアディポネクチンがアディポネクチン活性を有しているか否かは、例えば上記の方法に順じてアディポネクチン活性を測定し、確認することができる。
【００２７】
一方、アディポネクチン断片についても、該断片のアミノ酸配列に基づいて、上記アディポネクチンと同様の方法で、製造することができる。
【００２８】
また、本発明のアディポネクチンおよびアディポネクチン断片は、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
【００２９】
本明細書において、アディポネクチン様作用を有する物質とは、上記のアディポネクチン活性を有する、任意の、天然もしくは非天然の、ポリペプチド、核酸、有機化合物等公知化合物又は新規化合物を表す。コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された有機化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレー法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などが挙げられる。好ましくは分子量２００〜２０００の化合物、更に好ましくは分子量３００〜８００の化合物である。核酸の例としては、遺伝子治療用のアディポネクチン遺伝子を挙げることができる。
【００３０】
本明細書において、アディポネクチン遺伝子とは、配列番号：１で表されるヒトアディポネクチン遺伝子やその同族体、及び変異体等を包含する趣旨で用いられる。ヒトアディポネクチン遺伝子の配列は又、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：Ｄ４５３７１に記載されている。
前記同族体としては、配列番号：３に記載のマウスアディポネクチン遺伝子を例示することができ、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：Ｕ３７２２２に記載されている。
【００３１】
本明細書において「アディポネクチン遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。また当該「アディポネクチン遺伝子」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示されるポリヌクレオチドだけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体及び誘導体）をコードするポリヌクレオチドが包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には、アディポネクチン遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されたポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の配列同一性を有すポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドからなり、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドがアディポネクチン活性を有することを特徴とするポリヌクレオチドである。
【００３２】
前記（ｂ）における「１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリヌクレオチド」とは、例えば、ポリヌクレオチドが細胞内で受けるプロセシング、動物間の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、又は人為的な塩基の変異等が含まれる。なお、アディポネクチン遺伝子における塩基の変異数や変異部位は、該遺伝子がコードするタンパク質の生物学的機能、すなわちアディポネクチン活性が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全塩基の１０％以内であり、好ましくは全塩基の５％以内であり、さらに好ましくは全塩基の１％以内である。
【００３３】
前記「１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリヌクレオチド」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、対象となるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施す手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００３４】
前記で改変される塩基の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリヌクレオチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００３５】
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するヒトやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７， １９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。
結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）として他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、アディポネクチン遺伝子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００３６】
前記（ｄ）における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションの条件は、上記のアディポネクチン（蛋白質）における（ｄ）と同じである。
すなわち、「ストリンジェントな条件」は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８７， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ） に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。
例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄する。ハイブリダイズ後の洗浄条件として、例えば通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００３７】
本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有するＰＰＡＲγ機能亢進剤を提供する。
ここで、「ＰＰＡＲγ機能亢進剤」とは、転写因子であるＰＰＡＲγが、ＰＰＡＲ応答配列と結合することによって生ずる転写活性を促進する薬剤を表す。該転写活性は、具体的には、ＰＰＡＲγ遺伝子およびＰＰＡＲ応答配列の下流にレポータ遺伝子を有する細胞に対して刺激した際の、レポータ遺伝子の発現量を指標として測定することができる（ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５３３６−４８， １９９６）。
本明細書において、「ＰＰＡＲγ機能亢進剤」という場合、好ましくはＰＰＡＲγの発現を増加する物質である。
ＰＰＡＲγ機能亢進剤は、癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤として用いられる。すなわち本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤をも包含する。
【００３８】
また、本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）機能抑制剤を提供する。更に詳しくは、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）に対しては機能抑制作用を示さないことを特徴とする。
ここで、「ＣＯＸ−２機能抑制剤」とは、アラキドン酸等の脂肪酸に２分子の酸素原子を導入添加し、ＰＧＧを合成する脂肪酸シクロオキシゲナーゼ反応とＰＧＧの１５−ヒドロペルオキシドを切断し、ＰＧＨを精製するヒドロペルオキシダーゼ反応の２種類の反応を触媒する酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２の酵素活性を抑制する物質を表す。該酵素活性の抑制作用は公知の方法で測定することができる。
本明細書において、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）機能抑制剤とは、好ましくはＣＯＸ−２の発現を抑制する物質である。
【００３９】
従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、消化管障害を伴わない副作用の軽減された、慢性関節リウマチもしくは多発性硬化症等の炎症性疾患の治療又は予防剤として用いることができる。すなわち本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する炎症性疾患治療又は予防剤をも包含する。
【００４０】
本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、マトリクスメタロプロテアーゼ機能抑制剤（ＭＭＰ機能抑制剤）を提供する。
「ＭＭＰ」とは、コラーゲン等の細胞外マトリクスを分解する酵素であり、ＭＭＰ−１〜２８（４，５，６は除く）の多くのサブタイプが存在する。該ＭＭＰは、細胞外マトリックスのほぼすべてのコンポーネント（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等）を基質とする酵素であり、その機能亢進は、種々の疾患の要因となることが知られている。
本明細書において、ＭＭＰ機能抑制剤とは、好ましくはＭＭＰの発現を抑制する物質である。
従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＭＭＰ機能抑制剤が有効である、癌（特に癌転移）、慢性関節リウマチや多発性硬化症等の炎症性疾患、変形性関節症、肩関節周囲炎、頚肩腕症候群、歯周病、喘息等の治療又は予防剤として用いることができる。従って本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する上記疾患の治療又は予防剤をも包含する。
アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、中でもＭＭＰ−１、８、１０に対する機能抑制作用を有する。従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＭＭＰ−１、８、及び／又は１０が増悪因子となっている疾患の治療もしくは予防剤として特に好ましい。
【００４１】
本発明のアディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質は、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ−２機能抑制作用、及び、ＭＭＰ−１、８、１０機能抑制作用を併せ持つことを特徴とする上記疾患の治療又は予防剤として有用である。
【００４２】
本発明のアディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質は、これらを医薬品として用いるにあたり、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、又は膝関節もしくは股関節への関節内投与することが可能である。
また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【００４３】
上記有効成分物質がアディポネクチン遺伝子である場合は、これらを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００４４】
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばアディポネクチン遺伝子またはそれらの化学的修飾体（以下本遺伝子と称することがある。）を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【００４５】
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ” ＷＩＬＥＹ−ＬＩＳＳ刊、１９９２年、ｐｐ．１−５０、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６：１９２３−１９３７， １９９３）が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
【００４６】
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
【００４７】
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは３００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するｉｎ ｖｉｖｏ法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法を包含する（日経サイエンス， １９９４年４月号， ２０−４５頁、月刊薬事， ３６ （１）， ２３−４８ （１９９４）、実験医学増刊， １２ （１５）， 全頁 （１９９４）など参照）。この内ではｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましく、これには、ウイルス的導入法（組換えウイルスを用いる方法）と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照）。
【００４８】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムにアディポネクチン遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【００４９】
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏ法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームなど）とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人１人当たり約０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは約０．００１−１０ｍｇが数日ないし数カ月に１回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、１日患者体重１ｋｇ当たり約１ｘ１０３ｐｆｕ−１ｘ１０１５ｐｆｕとなる量範囲から選ぶことができる。本意電子を導入した細胞の場合は、１ｘ１０４細胞／ｂｏｄｙ−１ｘ１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度を投与すればよい。
【００５０】
【実施例】
実施例１ マウス動脈硬化症モデルの作製および大動脈採取
雌性グロビュラーアディポネクチントランスジエニックＡｐｏＥ欠損マウス（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：２４６１−２４６８， ２００３）と雌性ＡｐｏＥ欠損マウスに高コレステロール食（１．２５％コレステロール含有、オリエンタル酵母）を８週間負荷した後、起始部から下大動脈分岐部までの大動脈を摘出した。
【００５１】
実施例２ マウス動脈硬化症モデル大動脈からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
実施例１で採取したマウスの大動脈からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。具体的には動脈硬化症モデルを作製し８週間高コレステロール食負荷後の大動脈にＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を添加し、ホモゲナイザーでつぶしてからそれぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。
【００５２】
実施例３ マウス動脈硬化症モデル大動脈のＤＮＡチップ解析
実施例２で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。なお、ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｍｕｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ７４Ａ ｖｅｒｓｉｏｎ２を用いて行った。具体的には、解析は、（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからの増幅によるｃＤＮＡの調製、（２） 該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、及び（７） 遺伝子発現解析、の手順で行った。
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからのリニア−増幅によるｃＤＮＡの調製
３００ ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００ ｐｍｏｌのＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ｔ７プロモーター付加オリゴｄＴプライマー：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、エタノール沈殿で濃縮した後当該ｃＤＮＡを鋳型にしてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡをＲＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、再度ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤＮＡを合成した。２回目のｃＤＮＡ合成時のプライマーは、ファーストストランド（センス）合成時にはランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、セカンドストランド（アンチセンス）合成時にはＴ７−（ｄＴ）２４プライマーを用いた（注：ｃＲＮＡ＝アンチセンス）。合成したｃＤＮＡはＤＮＡ精製カラムで精製後、濃度を測定した。
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬ（１５０ｎｇ）に、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０ｘＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、該キットに含まれる２０ｘＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ ２０μｇを含む溶液に、５ｘＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、 ５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＤＮＡをフラグメント化した。
（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ ４０μＬに、３ｎＭ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｌｉｇｏ Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）６．７μＬ、２０ｘＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ２０μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２ｘＭＥＳ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ ［Ｎａ＋］， ４０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７） ２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１２５．３μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１ｘＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＭｕｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ７４Ａ ｖｅｒｓｉｏｎ２プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１ｘＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
（５） プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（６ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２ｖ４に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、１Ｍ ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、 ２次染色液（１００μｇ／ｍＬ Ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により染色した。
（６） プローブアレイのスキャン、及び （７） 遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、遺伝子発現の比較解析を行った。
【００５３】
実施例４ 動脈硬化症モデルマウスを用いた大動脈での遺伝子発現の変動解析 ８週間高コレステロール食負荷後の雌性グロビュラーアディポネクチントランスジェニッテニックＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈における遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）を、８週間高コレステロール食負荷後の雌性ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈における発現量と、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にある解析ツールＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて比較した。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓは解析プロトコールに基づいて行った。
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）と遺伝子発現の増減の判定（Ｃｈａｎｇｅ）より、発現変動遺伝子を選抜した。
ＡｐｏＥ欠損マウスとグロビュラーアディポネクチントランスジェニック ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるＰＰＡＲγ遺伝子発現の結果を図１に示した。図１から明らかなように、グロビュラーアディポネクチントランスジェニックマウスとＡｐｏＥ欠損マウスを交配してグロビュラーアディポネクチントランスジェニックＡｐｏＥ欠損マウスを作成し、ＡｐｏＥ欠損マウスと遺伝子発現を比較すると、ＰＰＡＲγ遺伝子の増加が認められた。これは、グロビュラーアディポネクチンがＰＰＡＲγ遺伝子の増加に関わることを示している。この結果から、ＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、グロビュラーアディポネクチンの発現によりＰＰＡＲγ遺伝子を増加させることを示し、グロビュラーアディポネクチンによるＰＰＡＲγの発現制御が判明した。
【００５４】
実施例５ ＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞の調製
ヒトＴＨＰ−１細胞を１２ ウェルプレートに８ ｘ １０の５乗個／ウェルにて播種し、１０％ウシ胎児血清、１２．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４００ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて３日間培養することにより、マクロファージに分化させた。以下の因子を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地に交換し、２４時間培養後、培地を除去してＴＲＩＺＯＬ（インビトロジェン社）にて細胞を溶解した。マニュアルに従って抽出したＲＮＡを、さらにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
〔ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地〕
ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）
ＬＰＳ ＋ アディポネクチン ２．５μｇ／ｍｌ
ＬＰＳ ＋ グロビュラーアディポネクチン ０．５μｇ／ｍｌ
ＬＰＳ ＋ グロビュラーアディポネクチン ２．５μｇ／ｍｌ
【００５５】
実施例６ ＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
実施例５で採取したＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。具体的にはヒトＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させ、上記の因子を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地に交換して２４時間培養後培地を除去しＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を添加し、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。
【００５６】
実施例７ ヒトＴＨＰ−１細胞にアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチン添加するＤＮＡチップ解析
実施例６で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて実施例３と同様の方法によりＤＮＡチップ解析を行った。なお、ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ を用いて行った。
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製
実施例６で得られた各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５ｘＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ ＤＴＴ （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水９１μＬ、該キットに含まれる５ｘＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３μＬ、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ４μＬ（４０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｈｅａｖｙ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むペレットを得た。その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０ｘＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、該キットに含まれる２０ｘＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、（７） 遺伝子発現解析はＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ を用い、実施例３の（３）〜（７）の方法に従った。
【００５７】
実施例８ ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ存在下でアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加した時の遺伝子発現の変動解析
ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ存在下でアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加した時の遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）を、ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳを添加した時の発現量と、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にある解析ツールＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて比較した。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓは解析プロトコールに基づいて行った。
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）および遺伝子発現の増減の判定（Ｃｈａｎｇｅ）より、発現変動遺伝子を選抜した。
ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−２遺伝子発現解析の結果を図２に示す。図２から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したＴＨＰ−１細胞においては、ＣＯＸ−２の遺伝子発現の減少が認められた。
ＬＰＳ存在下でＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を図３、４に示す。図３、４から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したＴＨＰ−１細胞においては、ＣＯＸ−１の遺伝子発現の変動は認められなかった。
これらの結果は、ＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理することによりＣＯＸ−２遺伝子を選択的に減少させ、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンが消化器障害の可能性が少ない抗炎症作用を有することを示している。
ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ−１、８、１０遺伝子発現の結果を図５〜７に示す。図５〜７から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したヒトＴＨＰ−１細胞においては、ＭＭＰ−１、８、１０遺伝子発現の減少が認められた。
この結果は、ＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンは、癌の転移に関わるＭＭＰ遺伝子の発現の減少を導くことが判明した。
【００５８】
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症、及び炎症性疾患等の治療又は予防剤を提供することができる。詳しくは、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ１非選択的なＣＯＸ−２機能抑制作用、並びにＭＭＰ１，８及び１０機能抑制作用を併せ持つ医薬組成物を提供することができる。
【００６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡｐｏＥ欠損マウスとグロビュラーアディポネクチントランスジェニック ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるＰＰＡＲγ遺伝子の発現の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−２遺伝子発現の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を示すグラフである。プローブ２０５１２８＿ｘ＿ａｔのデータを示す。
【図４】図４は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を示すグラフである。プローブ２１５８１３＿ｓ＿ａｔのデータを示す。
【図５】図５は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−１のデータを示す。
【図６】図６は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−８のデータを示す。
【図７】図７は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−１０のデータを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アディポネクチンの新規な用途等に関する。詳しくは、アディポネクチン又はアディポネクチン様の作用を有する物質を有効成分とする、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症及び炎症性疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アディポネクチンは、主に脂肪組織にて発現している、２４７アミノ酸からなる脂肪組織由来の生理活性物質（アディポカイン）の一種であり、Ｎ末端のシグナル配列、ノンホモロガス配列、コラーゲン様ドメインおよびＣ末端のグロビュラードメインの主に４つのドメインで構成されている。コラーゲンドメインとグロビュラードメインとの間にはプロテアーゼ切断部位が存在し、該切断部位で切断されたＣ末側断片はグロビュラーアディポネクチンと呼ばれる。
アディポネクチンの血清中蛋白質濃度は肥満糖尿病マウスや肥満や２型糖尿病の患者において減少しており、これらの病態に関与していることが示唆されている（非特許文献１、２）。実際にマウスに対してアディポネクチンをオスモティックポンプで皮下投与した場合、血糖降下作用、血清脂質低下作用が認められることが報告されている他、グロビュラーアディポネクチンを高発現させたｏｂ／ｏｂマウスでは、非トランスジェニックｏｂ／ｏｂマウスと比較して、空腹時血糖ならびに糖負荷後の血糖値が共に有意に低下しており、グロビュラーアディポネクチンが抗糖尿病作用、血清脂質低下作用を有することが示されている（非特許文献３，４）。
また、高脂肪食を負荷したマウスに対してグロビュラーアディポネクチンを投与すると、コントロールと比較して、肥満発症が抑制され（非特許文献５）、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンは抗肥満作用を示すことが報告されている。
また、アデノウイルスを用いてアディポネクチンを発現させたＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、ならびにグロビュラーアディポネクチンを高発現させたＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、動脈硬化の病巣の形成が抑制されることが報告されており、アディポネクチンが抗動脈硬化作用を有することが示唆されている（非特許文献４、６）。
【０００３】
しかしながら、上記以外の疾患に対してアディポネクチンが関与しているかどうかについては知られていなかった。
【０００４】
一方、ロジグリタゾンやピオグリタゾン等のチアゾリジンジオン系化合物は、核内受容体ＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のγサブタイプへ作用することが知られている。これらのＰＰＡＲγアゴニストは糖尿病、腎癌、膵癌、舌癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、乳癌および肝癌などの各種癌、腸ポリープ、動脈硬化、心肥大、感染症、ならびに線維症等の疾患に対して有効であることが報告されている。例えば癌に対するＰＰＡＲγアゴニストの作用としては、食道癌細胞株における抗腫瘍効果（非特許文献７）、大腸癌の前癌病変であるＡＣＦの形成の抑制（非特許文献８）、胃癌株６株における増殖抑制及びＤＮＡ断片化（非特許文献９）等が報告されている。しかしながら、アディポネクチンがＰＰＡＲγの機能に影響を与えるか否かは不明であった。
【０００５】
また、アスピリン、インドメタシン等の抗炎症剤は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害作用を有するが、その阻害作用はＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２に対して非選択的であり、消化管障害が副作用として問題となっている。それに対して、近年ＣＯＸ−２選択的なシクロオキシゲナーゼ阻害剤が開発され、消化管障害を伴わない抗炎症剤として有用であることが知られている。しかしながら、アディポネクチンがシクロオキシゲナーゼの機能に関与しているか否かについては全く知られていなかった。
【０００６】
また、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、コラーゲンを中心とする細胞外マトリックスの蛋白質分解に関わる一連の酵素であり、ＭＭＰ１〜３、７〜２８の多種類のサブタイプが知られている。ＭＭＰは、胚形成、再生、再吸収、リモデリング、創傷治癒、血管新生などの多岐にわたる生理的機能を担っているが、その異常な機能亢進が様々な疾患の原因となっている。具体的には、慢性関節リウマチ等の炎症性疾患、変形性関節症、癌の病巣部への転移・湿潤、喘息（非特許文献１０）などの増悪因子であることが知られている。
例えば、胃癌において、ＭＭＰ−１，２，９，７，１４が関与していることが報告されている（非特許文献１１）。また、特に、ＭＭＰ−２，７，９が癌細胞による組織破壊に機能すると考えられている（非特許文献１２）。
実際に、ＭＭＰ阻害作用を有する化合物が癌転移抑制剤、または、慢性関節リウマチ、変形性関節症、もしくは歯周病の治療剤として研究・開発されている。
しかしながら、アディポネクチンと上記ＭＭＰの関係は知られていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１０６９７−１０７０３， １９９６
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５７：７９−８３， １９９９
【非特許文献３】
Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４１−９４６， ２００１
【非特許文献４】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：２４６１−２４６８， ２００３
【非特許文献５】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：２００５−２０１０， ２００１
【非特許文献６】
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２７６７−２７７０， ２００２
【非特許文献７】
日本癌学会第６１回総会記事， ４３１， ２００２
【非特許文献８】
Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ． ６１：２４２４−２４２８， ２００１
【非特許文献９】
日本癌学会第６１回総会記事 １６３， ２００２
【非特許文献１０】
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｐｕｌｍ． Ｍｅｄ． ９：２８， ２００３
【非特許文献１１】
日本臨床 ５９巻増刊号４， １０７−１１２， ２００１
【非特許文献１２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３９， ２００２年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、新たなメカニズムによる、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症、及び炎症性疾患等の治療剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アディポネクチンの機能を解明し、既に知られている糖尿病、高脂血症、動脈硬化症以外の疾患の治療剤としても適用すべく鋭意検討を行った。
すなわち、グロビュラーアディポネクチントランスジエニックマウスとＡｐｏＥ欠損マウスを交配して作成したグロビュラーアディポネクチントランスジエニックＡｐｏＥ欠損マウスとＡｐｏＥ 欠損マウスに高コレステロール食を負荷し、該マウスから摘出した起始部から下大動脈分岐部までの大動脈（以下、本明細書において「大動脈」ともいう。）において、アディポネクチンがどのような遺伝子の発現を制御しているかを調べた。その結果、アディポネクチンがＰＰＡＲγの発現を亢進するという新しい知見を見出した。従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＰＰＡＲγのアゴニストが有効性を示す疾患、即ち、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症のみならず、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症及び線維症の治療剤となる。
また、マクロファージ系の培養細胞、すなわちＴＨＰ−１細胞に対してＬＰＳ存在下でアディポネクチン又はグロビュラーアディポネクチンを添加した。細胞から抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行い、アディポネクチンによって発現量が変動する遺伝子を同定した。
その結果、驚くべきことに、アディポネクチンはＣＯＸ−１の発現には影響を与えないにもかかわらず、ＣＯＸ−２の発現を抑制することを見出した。従って、アディポネクチン及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＣＯＸ−２特異的に発現を抑制するため、優れた炎症性疾患の治療又は予防剤となる。
また、本発明者らは、上記細胞において、ＭＭＰ−１，８及び１０の発現量が低下することを見出した。従って、アディポネクチン及びアディポネクチン様作用を有する物質は、癌（特に癌転移）等のＭＭＰの機能亢進により増悪される疾患の治療又は予防剤となる。
本発明は、上記の知見を基に完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
［１］アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進剤、
［２］ 癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤として用いられることを特徴とする、［１］に記載のＰＰＡＲγ機能亢進剤、
［３］ アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＭＭＰ機能抑制剤、
［４］ ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８及び／又はＭＭＰ−１０である、［３］に記載のＭＭＰ機能抑制剤、
［５］ 癌、炎症性疾患、変形性関節症、肩関節周囲炎、頚肩腕症候群又は歯周病の治療又は予防剤であることを特徴とする、［３］又は［４］に記載のＭＭＰ機能抑制剤、
［６］ アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＣＯＸ−２機能抑制剤、
［７］ ＣＯＸ−１に対して作用しないことを特徴とする、［６］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、
［８］ 炎症性疾患の治療又は予防剤であることを特徴とする、［６］又は［７］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、及び、
［９］ 消化管障害を起こす頻度及び／又は程度が低いことを特徴とする［８］に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤、に関する。
【００１０】
【本発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
「アディポネクチン」とは、脂肪組織において高発現しているアディポカインの一種であり、その配列は、ヒト型については配列番号２、又はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号：Ｄ４５３７１）に記載されている。本明細書において、「アディポネクチン」という用語を用いる場合、前記ヒトアディポネクチンやその同族体及び変異体などを包含する。該同族体としてはマウスアディポネクチン（配列番号４又はＧｅｎＢａｎｋ （アクセッション番号：Ｕ３７２２２）に記載されている。）等が知られている。
また、現在公知になっていない同族体についても、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の任意のＤＮＡ断片をプローブとして用いて、当業者によく知られた方法で対応する動物種のｃＤＮＡライブラリーからクローニングして得ることができる。具体的な手順は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）」等に記載されている。
【００１１】
前記「変異体」としては、前記ヒトアディポネクチンもしくはその同族体に対して、１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド等が挙げられ、アディポネクチン活性を保持している限り、本発明のアディポネクチンに含まれる。
具体的には、アディポネクチンは、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、または
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
該アディポネクチン活性としては、
（１） Ｃ２Ｃ１２細胞における、ＡＭＰＫ活性化作用およびＡＣＣ抑制作用、グルコース取り込み促進活性、脂肪酸酸化促進活性（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８：１２８８−１２９５， ２００２） ；
（２） 初代培養肝細胞におけるＡＭＰＫ活性化作用（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８：１２８８−１２９５， ２００２）、グルコース放出抑制作用（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４７−９５３， ２００１）；
（３） 血管内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：２４７３−２４７６， １９９９）；
（４） マクロファージにおける、コレステロールエステル量の低下（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２７：２８５， １９９７）、リピッドドロップレット蓄積低下（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １９：１３３３， １９９９）、スカベンジャーレセプター（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２：２７７， ２０００）、又はリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）発現抑制活性（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １５：５２２， １９９５）、又はＴＮＦ−α産生抑制活性；
（５）血管平滑筋細胞の増殖・遊走抑制活性（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５：２８９３， ２００２） ；
（６）コラーゲンＩ、ＩＩＩ、Ｖ結合活性（Ｈｏｒｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ． ３２：４７−５０， ２０００）、
等を挙げることができる。前記（１）〜（６）に記載されたうちの１又は複数の活性を維持する限り、「アディポネクチン活性を有する」の範疇に含まれる。ここで「アディポネクチン活性を有する」とは好ましくは、配列番号２もしくは配列番号４で表されるアディポネクチン、又は、配列番号６で表されるグロビュラーアディポネクチンと同等の活性を示すことを意味する。
前記（１）〜（６）の活性（作用）はそれぞれ当業者に公知のそれぞれ上記の文献に記載の方法で確認することができる。
【００１２】
具体的には、初代培養肝細胞におけるグルコース放出抑制作用をＢｅｒｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：９４７−９５３， ２００１に記載された方法で、以下のように測定することができる。すなわち、ＳＤラット由来の肝細胞をＢｅｒｒｙ ａｎｄ Ｆｒｉｅｎｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：５０６， １９６９およびＬｅｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５８：５３６， １９７９に記載された方法により採取し、ラットテイルコラーゲンＩでコートされた２４ウエルプレートに播種する。接着後、グルコースを含む培地（デキサメタゾンおよびインスリンは含まない）を添加し一昼夜加温する。翌朝培地を交換し、インスリンおよびアディポネクチンを添加し２４時間刺激する。刺激後、アラニン、バリン、グリシン、ピルビン酸、乳酸を含む培地（グルコースは含まない）で６時間加温する。その後培地中に放出されたグルコースを、Ｔｒｉｎｄｅｒ ａｓｓａｙ（シグマ社製）等を用いて測定することができる。
【００１３】
また、コレステロールエステル量の低下をＩｓｈｉｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２７：２８５， １９９７に記載された方法で、以下のように測定することができる。すなわち、密度勾配遠心により末梢血から単離した単核球を、１０％ヒト型ＡＢ血清を含む培地にて３７℃で１時間加温する。ＰＢＳにて洗浄後、接着細胞を同じ培地にて培養する。２、３日毎に培地を交換する。コレステロールエステル量の測定は、アディポネクチンで３日間処理した細胞中のトータルコレステロール量からフリーコレステロール量を引いて求める。すなわち、細胞からフリーコレステロール・トータルコレステロールをヘキサン／イソプロパノールにて抽出し、イソプロパノールに懸濁する。フリーコレステロールは、コレステロールオキシダーゼを含む反応液に上清を添加し１時間加温したした後、励起３１０ｎｍ、発光４０７ｎｍにて蛍光強度を測定し、スタンダードとの比較からフリーコレステロールの濃度を測定することができる。トータルコレステロールは、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼを含む反応液に上清を添加し２時間加温した後、励起３１０ｎｍ、発光４０７ｎｍにて蛍光強度を測定し、スタンダードとの比較からトータルコレステロールの濃度を測定することができる。
【００１４】
本明細書において、「１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド」とは、例えば、ポリペプチドが細胞内で受けるプロセシング、動物間の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。なお、ポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能、すなわちアディポネクチン活性が保持される限り制限はない。生物学的機能を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また前記欠失、付加、挿入、又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましく、置換されるアミノ酸は、置換後に得られるポリペプチドが該ポリペプチドの生物学的機能を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１５】
前記「１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリペプチド」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、対象となるポリペプチドをコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：９４４１−９４５６， １９８４、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００１６】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリペプチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ該ポリペプチドのアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００１７】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド間の、配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はポリペプチドは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２：４６７３−４６８０， １９９４を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
【００１８】
前記ストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， １９８７） に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。
例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄する。ハイブリダイズ後の洗浄条件として、例えば通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００１９】
本明細書において、前記（ａ）〜（ｄ）で表されるポリペプチドのアミノ末端もしくはリジンの側鎖アミノ基等がアシル化、アルコキシカルボニル化もしくはアルキル化された誘導体もまた、アディポネクチンの「変異体」の範疇である。
具体的には、アミノ基がアセチルアミノ基、プロパノイルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等に変換された誘導体を例示できる。また、アディポネクチンのカルボキシル末端、又はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖がエステル化もしくはアミド化された誘導体が挙げられ、カルボキシ基がエトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基等に変換された誘導体を例示できる。また、システインのメルカプト基が酸化され、ポリマー（ダイマー、ポリマー等）や分子内で環状構造を形成している誘導体が挙げられる。また、システイン、セリン、スレオニンもしくはチロシンの水酸基がエーテル化もしくはアシル化された誘導体等が挙げられ、水酸基又はチオール基がメトキシ基、メチルチオ基、エトキシ基、エチルチオ基、アセチルオキシ基、アセチルチオ基、プロパノイルオキシ基、プロパノイルチオ基等に変換された誘導体が挙げられる。
【００２０】
また、本明細書において、任意の１以上のアミノ酸残基を非天然型アミノ酸へ置換した誘導体もまた、上記アディポネクチン活性を保持している限り、アディポネクチンの「変異体」の範疇である。
【００２１】
前記「アミノ酸残基を非天然型アミノ酸へ置換した誘導体」における非天然型アミノ酸は、天然の蛋白質を構成する２０種類のＬ−α−アミノ酸（天然型アミノ酸）以外の任意のアミノ酸を表し、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、オルニチン、ターシャリーロイシン、ノルロイシンもしくはヒドロキシプロリン等の天然型アミノ酸の側鎖を改変したアミノ酸、Ａｉｂ等のα−アルキル化アミノ酸、Ｎ−メチルグリシン等のＮ−アルキルアミノ酸等が挙げられる。
【００２２】
上記誘導体において、修飾されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数残基、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリペプチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００２３】
本明細書において、「アディポネクチン断片」とは、前記アディポネクチン（ヒトアディポネクチンの同族体及び変異体を含む。）のグロビュラードメインを含む任意のアディポネクチン断片を表す。ここでグロビュラードメインとは、Ｃ末端約１３８残基からなる断片を表す。該アディポネクチン断片として、具体的には配列番号：６で表されるグロビュラーアディポネクチンが挙げられる。
【００２４】
アディポネクチンは、公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号：Ｕ３７２２２）及び配列番号：１に記載された配列に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＤＭ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ （１９８５））などに準じて行うことができる。
【００２５】
具体的には、アディポネクチンをコードする遺伝子に開始コドンを付加し、所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、目的のポリペプチドを得ることができる。
【００２６】
以下具体的に説明する。
アディポネクチンをコードする遺伝子は、公知文献（Ｇｅｎｅ ２２９：１１５８−１１６２， １９９９）、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号： Ｄ４５３７１として登録されている配列情報、本明細書配列番号１に記載された配列情報をもとに適当なＰＣＲプライマーを作製し、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従ってＰＣＲ反応を行うことなどにより、容易にクローニングできる。
また、変異を施す場合は前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして容易に行うことができる。さらに、このようにしてクローニングされたアディポネクチンをコードする遺伝子を用いてアディポネクチンを発現させる方法としては、例えば、前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。発現させたいＤＮＡの上流に、場合によっては転写を制御するプロモーター配列の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えばレトロウイルスベクターｐＬＪなど）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。次に発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を得る。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。形質転換体は、適当な培地で培養することによってフィブロネクチンタンパク質を生産する。以上のようにして得られた培養液中のフィブロネクチンは一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
以上のようにして作製されたアディポネクチンがアディポネクチン活性を有しているか否かは、例えば上記の方法に順じてアディポネクチン活性を測定し、確認することができる。
【００２７】
一方、アディポネクチン断片についても、該断片のアミノ酸配列に基づいて、上記アディポネクチンと同様の方法で、製造することができる。
【００２８】
また、本発明のアディポネクチンおよびアディポネクチン断片は、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
【００２９】
本明細書において、アディポネクチン様作用を有する物質とは、上記のアディポネクチン活性を有する、任意の、天然もしくは非天然の、ポリペプチド、核酸、有機化合物等公知化合物又は新規化合物を表す。コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された有機化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレー法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などが挙げられる。好ましくは分子量２００〜２０００の化合物、更に好ましくは分子量３００〜８００の化合物である。核酸の例としては、遺伝子治療用のアディポネクチン遺伝子を挙げることができる。
【００３０】
本明細書において、アディポネクチン遺伝子とは、配列番号：１で表されるヒトアディポネクチン遺伝子やその同族体、及び変異体等を包含する趣旨で用いられる。ヒトアディポネクチン遺伝子の配列は又、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：Ｄ４５３７１に記載されている。
前記同族体としては、配列番号：３に記載のマウスアディポネクチン遺伝子を例示することができ、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：Ｕ３７２２２に記載されている。
【００３１】
本明細書において「アディポネクチン遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。また当該「アディポネクチン遺伝子」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示されるポリヌクレオチドだけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体及び誘導体）をコードするポリヌクレオチドが包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には、アディポネクチン遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１個以上の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されたポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の配列同一性を有すポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドからなり、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドがアディポネクチン活性を有することを特徴とするポリヌクレオチドである。
【００３２】
前記（ｂ）における「１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリヌクレオチド」とは、例えば、ポリヌクレオチドが細胞内で受けるプロセシング、動物間の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、又は人為的な塩基の変異等が含まれる。なお、アディポネクチン遺伝子における塩基の変異数や変異部位は、該遺伝子がコードするタンパク質の生物学的機能、すなわちアディポネクチン活性が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全塩基の１０％以内であり、好ましくは全塩基の５％以内であり、さらに好ましくは全塩基の１％以内である。
【００３３】
前記「１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入等の変異を施したポリヌクレオチド」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、対象となるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施す手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００３４】
前記で改変される塩基の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、元のポリヌクレオチドに対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアディポネクチン活性を維持する範囲であればよい。前記配列同一性は、好ましくは、８０％、更に好ましくは９０％、更に好ましくは９５％である。
【００３５】
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するヒトやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７， １９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。
結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）として他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、アディポネクチン遺伝子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００３６】
前記（ｄ）における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションの条件は、上記のアディポネクチン（蛋白質）における（ｄ）と同じである。
すなわち、「ストリンジェントな条件」は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８７， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ） に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。
例えば、６ｘＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄する。ハイブリダイズ後の洗浄条件として、例えば通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００３７】
本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有するＰＰＡＲγ機能亢進剤を提供する。
ここで、「ＰＰＡＲγ機能亢進剤」とは、転写因子であるＰＰＡＲγが、ＰＰＡＲ応答配列と結合することによって生ずる転写活性を促進する薬剤を表す。該転写活性は、具体的には、ＰＰＡＲγ遺伝子およびＰＰＡＲ応答配列の下流にレポータ遺伝子を有する細胞に対して刺激した際の、レポータ遺伝子の発現量を指標として測定することができる（ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５３３６−４８， １９９６）。
本明細書において、「ＰＰＡＲγ機能亢進剤」という場合、好ましくはＰＰＡＲγの発現を増加する物質である。
ＰＰＡＲγ機能亢進剤は、癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤として用いられる。すなわち本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤をも包含する。
【００３８】
また、本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）機能抑制剤を提供する。更に詳しくは、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）に対しては機能抑制作用を示さないことを特徴とする。
ここで、「ＣＯＸ−２機能抑制剤」とは、アラキドン酸等の脂肪酸に２分子の酸素原子を導入添加し、ＰＧＧを合成する脂肪酸シクロオキシゲナーゼ反応とＰＧＧの１５−ヒドロペルオキシドを切断し、ＰＧＨを精製するヒドロペルオキシダーゼ反応の２種類の反応を触媒する酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２の酵素活性を抑制する物質を表す。該酵素活性の抑制作用は公知の方法で測定することができる。
本明細書において、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）機能抑制剤とは、好ましくはＣＯＸ−２の発現を抑制する物質である。
【００３９】
従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、消化管障害を伴わない副作用の軽減された、慢性関節リウマチもしくは多発性硬化症等の炎症性疾患の治療又は予防剤として用いることができる。すなわち本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する炎症性疾患治療又は予防剤をも包含する。
【００４０】
本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、マトリクスメタロプロテアーゼ機能抑制剤（ＭＭＰ機能抑制剤）を提供する。
「ＭＭＰ」とは、コラーゲン等の細胞外マトリクスを分解する酵素であり、ＭＭＰ−１〜２８（４，５，６は除く）の多くのサブタイプが存在する。該ＭＭＰは、細胞外マトリックスのほぼすべてのコンポーネント（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等）を基質とする酵素であり、その機能亢進は、種々の疾患の要因となることが知られている。
本明細書において、ＭＭＰ機能抑制剤とは、好ましくはＭＭＰの発現を抑制する物質である。
従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＭＭＰ機能抑制剤が有効である、癌（特に癌転移）、慢性関節リウマチや多発性硬化症等の炎症性疾患、変形性関節症、肩関節周囲炎、頚肩腕症候群、歯周病、喘息等の治療又は予防剤として用いることができる。従って本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン断片又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する上記疾患の治療又は予防剤をも包含する。
アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、中でもＭＭＰ−１、８、１０に対する機能抑制作用を有する。従って、アディポネクチン、アディポネクチン断片及びアディポネクチン様作用を有する物質は、ＭＭＰ−１、８、及び／又は１０が増悪因子となっている疾患の治療もしくは予防剤として特に好ましい。
【００４１】
本発明のアディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質は、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ−２機能抑制作用、及び、ＭＭＰ−１、８、１０機能抑制作用を併せ持つことを特徴とする上記疾患の治療又は予防剤として有用である。
【００４２】
本発明のアディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質は、これらを医薬品として用いるにあたり、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、又は膝関節もしくは股関節への関節内投与することが可能である。
また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【００４３】
上記有効成分物質がアディポネクチン遺伝子である場合は、これらを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００４４】
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばアディポネクチン遺伝子またはそれらの化学的修飾体（以下本遺伝子と称することがある。）を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【００４５】
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ” ＷＩＬＥＹ−ＬＩＳＳ刊、１９９２年、ｐｐ．１−５０、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６：１９２３−１９３７， １９９３）が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
【００４６】
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
【００４７】
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは３００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するｉｎ ｖｉｖｏ法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法を包含する（日経サイエンス， １９９４年４月号， ２０−４５頁、月刊薬事， ３６ （１）， ２３−４８ （１９９４）、実験医学増刊， １２ （１５）， 全頁 （１９９４）など参照）。この内ではｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましく、これには、ウイルス的導入法（組換えウイルスを用いる方法）と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照）。
【００４８】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムにアディポネクチン遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【００４９】
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏ法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームなど）とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人１人当たり約０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは約０．００１−１０ｍｇが数日ないし数カ月に１回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、１日患者体重１ｋｇ当たり約１ｘ１０３ｐｆｕ−１ｘ１０１５ｐｆｕとなる量範囲から選ぶことができる。本意電子を導入した細胞の場合は、１ｘ１０４細胞／ｂｏｄｙ−１ｘ１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度を投与すればよい。
【００５０】
【実施例】
実施例１ マウス動脈硬化症モデルの作製および大動脈採取
雌性グロビュラーアディポネクチントランスジエニックＡｐｏＥ欠損マウス（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：２４６１−２４６８， ２００３）と雌性ＡｐｏＥ欠損マウスに高コレステロール食（１．２５％コレステロール含有、オリエンタル酵母）を８週間負荷した後、起始部から下大動脈分岐部までの大動脈を摘出した。
【００５１】
実施例２ マウス動脈硬化症モデル大動脈からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
実施例１で採取したマウスの大動脈からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。具体的には動脈硬化症モデルを作製し８週間高コレステロール食負荷後の大動脈にＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を添加し、ホモゲナイザーでつぶしてからそれぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。
【００５２】
実施例３ マウス動脈硬化症モデル大動脈のＤＮＡチップ解析
実施例２で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。なお、ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｍｕｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ７４Ａ ｖｅｒｓｉｏｎ２を用いて行った。具体的には、解析は、（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからの増幅によるｃＤＮＡの調製、（２） 該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、及び（７） 遺伝子発現解析、の手順で行った。
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからのリニア−増幅によるｃＤＮＡの調製
３００ ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００ ｐｍｏｌのＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ｔ７プロモーター付加オリゴｄＴプライマー：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、エタノール沈殿で濃縮した後当該ｃＤＮＡを鋳型にしてＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡをＲＮＡ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、再度ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤＮＡを合成した。２回目のｃＤＮＡ合成時のプライマーは、ファーストストランド（センス）合成時にはランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、セカンドストランド（アンチセンス）合成時にはＴ７−（ｄＴ）２４プライマーを用いた（注：ｃＲＮＡ＝アンチセンス）。合成したｃＤＮＡはＤＮＡ精製カラムで精製後、濃度を測定した。
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬ（１５０ｎｇ）に、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０ｘＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、該キットに含まれる２０ｘＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ ２０μｇを含む溶液に、５ｘＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、 ５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＤＮＡをフラグメント化した。
（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ ４０μＬに、３ｎＭ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｌｉｇｏ Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）６．７μＬ、２０ｘＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ２０μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２ｘＭＥＳ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ ［Ｎａ＋］， ４０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７） ２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１２５．３μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１ｘＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＭｕｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ７４Ａ ｖｅｒｓｉｏｎ２プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１ｘＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
（５） プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（６ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２ｖ４に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、１Ｍ ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、 ２次染色液（１００μｇ／ｍＬ Ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により染色した。
（６） プローブアレイのスキャン、及び （７） 遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、遺伝子発現の比較解析を行った。
【００５３】
実施例４ 動脈硬化症モデルマウスを用いた大動脈での遺伝子発現の変動解析 ８週間高コレステロール食負荷後の雌性グロビュラーアディポネクチントランスジェニッテニックＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈における遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）を、８週間高コレステロール食負荷後の雌性ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈における発現量と、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にある解析ツールＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて比較した。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓは解析プロトコールに基づいて行った。
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）と遺伝子発現の増減の判定（Ｃｈａｎｇｅ）より、発現変動遺伝子を選抜した。
ＡｐｏＥ欠損マウスとグロビュラーアディポネクチントランスジェニック ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるＰＰＡＲγ遺伝子発現の結果を図１に示した。図１から明らかなように、グロビュラーアディポネクチントランスジェニックマウスとＡｐｏＥ欠損マウスを交配してグロビュラーアディポネクチントランスジェニックＡｐｏＥ欠損マウスを作成し、ＡｐｏＥ欠損マウスと遺伝子発現を比較すると、ＰＰＡＲγ遺伝子の増加が認められた。これは、グロビュラーアディポネクチンがＰＰＡＲγ遺伝子の増加に関わることを示している。この結果から、ＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、グロビュラーアディポネクチンの発現によりＰＰＡＲγ遺伝子を増加させることを示し、グロビュラーアディポネクチンによるＰＰＡＲγの発現制御が判明した。
【００５４】
実施例５ ＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞の調製
ヒトＴＨＰ−１細胞を１２ ウェルプレートに８ ｘ １０の５乗個／ウェルにて播種し、１０％ウシ胎児血清、１２．５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４００ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて３日間培養することにより、マクロファージに分化させた。以下の因子を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地に交換し、２４時間培養後、培地を除去してＴＲＩＺＯＬ（インビトロジェン社）にて細胞を溶解した。マニュアルに従って抽出したＲＮＡを、さらにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。
〔ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地〕
ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）
ＬＰＳ ＋ アディポネクチン ２．５μｇ／ｍｌ
ＬＰＳ ＋ グロビュラーアディポネクチン ０．５μｇ／ｍｌ
ＬＰＳ ＋ グロビュラーアディポネクチン ２．５μｇ／ｍｌ
【００５５】
実施例６ ＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
実施例５で採取したＬＰＳ存在下アディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加したヒトＴＨＰ−１細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。具体的にはヒトＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させ、上記の因子を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地に交換して２４時間培養後培地を除去しＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を添加し、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。なお、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。
【００５６】
実施例７ ヒトＴＨＰ−１細胞にアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチン添加するＤＮＡチップ解析
実施例６で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて実施例３と同様の方法によりＤＮＡチップ解析を行った。なお、ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ を用いて行った。
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製
実施例６で得られた各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５ｘＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ ＤＴＴ （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水９１μＬ、該キットに含まれる５ｘＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３μＬ、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ４μＬ（４０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｈｅａｖｙ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むペレットを得た。その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０ｘＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０ｘＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、該キットに含まれる２０ｘＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、（７） 遺伝子発現解析はＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ を用い、実施例３の（３）〜（７）の方法に従った。
【００５７】
実施例８ ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ存在下でアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加した時の遺伝子発現の変動解析
ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳ存在下でアディポネクチンまたはグロビュラーアディポネクチンを添加した時の遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）を、ヒトＴＨＰ−１細胞にＬＰＳを添加した時の発現量と、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にある解析ツールＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて比較した。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓは解析プロトコールに基づいて行った。
これらの比較解析の結果から得られた、遺伝子発現量（ｓｉｇｎａｌ）および遺伝子発現の増減の判定（Ｃｈａｎｇｅ）より、発現変動遺伝子を選抜した。
ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−２遺伝子発現解析の結果を図２に示す。図２から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したＴＨＰ−１細胞においては、ＣＯＸ−２の遺伝子発現の減少が認められた。
ＬＰＳ存在下でＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を図３、４に示す。図３、４から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したＴＨＰ−１細胞においては、ＣＯＸ−１の遺伝子発現の変動は認められなかった。
これらの結果は、ＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理することによりＣＯＸ−２遺伝子を選択的に減少させ、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンが消化器障害の可能性が少ない抗炎症作用を有することを示している。
ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ−１、８、１０遺伝子発現の結果を図５〜７に示す。図５〜７から明らかなように、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを処理したヒトＴＨＰ−１細胞においては、ＭＭＰ−１、８、１０遺伝子発現の減少が認められた。
この結果は、ＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンは、癌の転移に関わるＭＭＰ遺伝子の発現の減少を導くことが判明した。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、各種癌、心肥大、腸ポリープ、感染症、線維症、及び炎症性疾患等の治療又は予防剤を提供することができる。詳しくは、アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進作用、ＣＯＸ１非選択的なＣＯＸ−２機能抑制作用、並びにＭＭＰ１，８及び１０機能抑制作用を併せ持つ医薬組成物を提供することができる。
【００６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡｐｏＥ欠損マウスとグロビュラーアディポネクチントランスジェニック ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるＰＰＡＲγ遺伝子の発現の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−２遺伝子発現の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を示すグラフである。プローブ２０５１２８＿ｘ＿ａｔのデータを示す。
【図４】図４は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＣＯＸ−１遺伝子発現の結果を示すグラフである。プローブ２１５８１３＿ｓ＿ａｔのデータを示す。
【図５】図５は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−１のデータを示す。
【図６】図６は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−８のデータを示す。
【図７】図７は、ＬＰＳ存在下でヒトＴＨＰ−１細胞に対して、アディポネクチンおよびグロビュラーアディポネクチンを添加した場合のＭＭＰ遺伝子発現の結果を示すグラフである。ＭＭＰ−１０のデータを示す。
Claims (9)
- アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＰＰＡＲγ機能亢進剤。
- 癌、心肥大、腸ポリープ、感染症又は線維症の治療又は予防剤として用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＰＰＡＲγ機能亢進剤。
- アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＭＭＰ機能抑制剤。
- ＭＭＰが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８及び／又はＭＭＰ−１０である、請求項３に記載のＭＭＰ機能抑制剤。
- 癌、炎症性疾患、変形性関節症、肩関節周囲炎、頚肩腕症候群又は歯周病の治療又は予防剤であることを特徴とする、請求項３又は４に記載のＭＭＰ機能抑制剤。
- アディポネクチン、アディポネクチン断片、又はアディポネクチン様作用を有する物質を有効成分として含有する、ＣＯＸ−２機能抑制剤。
- ＣＯＸ−１に対して作用しないことを特徴とする、請求項６に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤。
- 炎症性疾患の治療又は予防剤であることを特徴とする、請求項６又は７に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤。
- 消化管障害を起こす頻度及び／又は程度が低いことを特徴とする請求項８に記載のＣＯＸ−２機能抑制剤。
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