CN108913785A - 一种检测犬epas1和hbb基因突变体的引物、pcr方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测犬epas1和hbb基因突变体的引物、pcr方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物、PCR方法、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增结果和序列分析确定EPAS1和HBB基因多态性位点的基因型，将得到的核酸样本序列与祖先型基因组序列相比对，在突变位点有无突变，指示犬生物样本是否具有高原适应性。由此，对犬类是否具有高原适应性进行预测，进而对有高原适应性差异的各生物样本进行深入研究，为高原疾病防治提供依据和预防方法。而且，本发明的方法简单易行，应用前景广泛。

Description

一种检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物、PCR方法、试剂盒 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及确定犬是否具有高原适应性的方法，具体涉及用于检测犬类高原低氧适应性密切相关的HBB和EPAS1基因突变体的引物、PCR方法、试剂盒及其应用。
背景技术
高原环境中的低氧因素对于栖居在高原上的人类和动物是最极端的生存挑战之一。高原反应其本质是机体的低氧反应。未经适应的人或动物迅速进入高海拔地区，由于空气中的氧含量低下，导致吸入的空气氧分压降低，从而引发机体低氧血症，也就是人们常说的“高原反应”。受低氧环境的胁迫会加速产生血红蛋白以获得更多氧气，然而血红蛋白的过度生产却又会导致血液黏稠。因组织细胞不能充分获得氧和利用氧，碱中毒或酸中毒导致血糖升高、血压或血脂升高；能量减少不能满足细胞组织需求，造成慢性高原疾病，甚至有可能引发肺水肿和脑水肿，导致呼吸困难、呕吐等症状，严重时甚至出现猝死。
低氧适应的本质是在低氧条件下，机体能够最大化的利用有限的氧，进而完成正常的生理生化功能。相比于低海拔地区的犬，高海拔地区的犬在长期生活和适应积累的过程中，形成了特异的高海拔低氧适应性。其中，低氧适应相关基因在犬机体低氧适应的调控过程中起着非常重要的作用，高原世居动物对低氧适应并不太依赖于器官功能的变化，更重要的是通过对细胞代谢的调整和许多抗低氧因子诱导从分子水平上来适应高原低氧环境。研究犬在高海拔低氧适应性有多方面的重要意义，对警犬等用在高原地区出现的高原反应和疾病的防治具有重要作用。同时寻利用低氧适应性相关的分子标记，可以定向培育适应高原环境的犬服务人类和公安工作等需要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测犬EPAS1和HBB 基因突变体的引物、PCR方法、试剂盒及其应用，以确定犬是否具有高原适应性的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物，包括四对引物对，G305S F和 G305S R、D494E/V500M F和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G 14S/L15M F和G14S/L15M R；
G305S F：gaggaaactgaaactaagagggatt；
G305S R：caggttgcgagggttgtagataa；
D494E/V500M F：ccgagtagacagcccaaacagga；
D494E/V500M R：gagcaaagcagagggcaaaggta；
P750S F：acagggctggatggaaactc；
P750S R：atgacagatggcggcggtgg；
G14S/L15M F：gactcaccttgaagttctcggg；
G14S/L15M R：aaacataacacctagaacgccac。
本发明提供含有上述检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物的试剂盒。
进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括PCR扩增试剂。
进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括dNTPs、rTaq酶和10×Bu ffer。
进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：
余量去离子H2O，总计25μL；
所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为G305S F和G305S R、D4 94E/V500MF和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G14S/L15M F和 G14S/L15M R四对引物中的任意一种。
进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增程序：预变性94℃15min，循环中94℃变性1min，各引物退火温度如表1，退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸20min后终止反应。
表1
本发明还提供上述扩增引物在判断犬是否具有高原适应性中的应用。
本发明还同时提供上述试剂盒在判断犬是否具有高原适应性中的应用。
一本发明另外提供种判断犬是否具有高原适应性方法，采用上述试剂盒或者上述扩增引物，包括如下步骤：
步骤(1)，从待测犬生物样品中提取DNA样本；
步骤(2)，以步骤(1)得到的DNA作为模板进行制备如下扩增体系：
余量去离子H2O，总计25μL；
所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为G305S F和G305S R、D4 94E/V500MF和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G14S/L15M F和 G14S/L15M R四对引物中的任意一种，得到4个扩增体系；
步骤(3)，将步骤(2)制备好的4个扩增体系进行PCR反应；设置扩增程序：预变性94℃15min，循环中94℃变性1min，各引物对应退火温度如下，退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸20min后终止反应；
G305S F和G305S R引物对的退火温度为61.5℃；
D494E/V500M F和D494E/V500M R引物对的退火温度为66℃；
P750S F和P750S R引物对的退火温度为66℃；
G14S/L15M F和G14S/L15M R引物对的退火温度为61.5℃；
步骤(4)，对步骤(3)得到的扩增产物进行测序，并与祖先型相比，比较在EPAS1和HBB基因突变位点是否具有突变，如果有，则待测犬具有高原适应性，反之，则不具有高原适应性。
进一步，优选的是，所述待测犬生物样品为犬血样本；EPAS1基因突变位点位于EPAS1基因第10号染色体上，HBB基因突变位点位于HBB基因第21 号染色体。
本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过全基因组关联分析(GWADS)的方法，联合候选基因突变验证的方法，发现了犬在EPAS1基因和 HBB基因呈现出最强的受适应性选择的信号，与高海拔适应相关。本发明涉及到的确定犬个体是否具有高原适应性的方法在现有研究技术中并未被提到。
EPAS1基因(Endothelial PAS domain protein 1，内皮细胞含PAS结构域蛋白-1)，在家犬中编码HIF-2α蛋白，位于家犬第10号染色体Chr10:51,676,7 59-51,760,023包含有个16外显子和15个内含子，全长103.27kb，共转录2607 bp碱基，编码869个氨基酸。在低氧条件下对系统的低氧应答起到至关重要的作用，是主要的低氧诱导因子之一。
HBB基因(Hemoglobinβ，HBB，血红蛋白β基因)，又称β珠蛋白基因，在家犬基因组上位于Chr21：31，299，273-31，306，907，由3个外显子构成，全长7.57kb，共转录635bp碱基，编码147个氨基酸。HBB基因编码血红蛋白中的β多肽链，与血红素结合形成β-珠蛋白。高原低氧适应方面的研宄中，是基于HBB基因在功能上参与了氧从肺部输送交换至全身各器官的重要功能，这一点在高原适应性上可能起到至关重要的作用。
本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过对不同海拔地区的家犬进行等量混合重测序，成功筛选并且定位到了EPAS1和HBB基因。与祖先型相比，分别在HBB基因中找到2个非同义突变，EPAS1基因中找到4个非同义突变，具有突变的个体更具有高原适应性。
第一个方面，本发明提出了EPAS1和HBB基因突变体，在上述位点具有突变体与犬高原适应性密切相关。通过检测犬在上述几个位点是否突变，可以检测犬是否具有高原适应性。进一步检测警犬是否可以作为高原地区的工作犬训练使用，为公安工作提供强有力的技术支撑。
第二个方面，本发明提出了一种能确定犬是否具有高原适应性的方法。该方法包括以下步骤：从犬生物样品中提取DNA样本；确定犬生物样本的核酸序列；所述DNA样本的核酸序列与祖先型相比，在所述突变位点是否具有突变是其具有高原适应的指示。通过根据本发明确定犬生物样本是否具有高原适应性的方法，可以有效确定犬是否具有高原适应性，筛选警犬是否适应高原环境而作为警用装备配发至高原环境下使用，进一步为高原环境下警犬的使用和高原疾病的防治奠定基础。
第三个方面，本发明提供一种用PCR方法检测EPAS1和HBB基因的引物。可以根据电泳后再测序结果确定EPAS 1和HBB基因多态性突变位点的基因型，在基因型分析的基础上可以预测犬是否具有高原适应性。
一种用PCR方法检测EPAS1和HBB基因的引物。通过对HBB基因进行扩增和测序获取信息后检测中发现，G14S与L15M两个位点位置紧邻，且等位基因处于完全连锁的状态，既每个个体的突变位点均为纯合型祖先型，杂合型均为突变型。因此下面的分析中我们将这两个位点合并做一个位点(G14S/L15M) 来进行分析，将EPAS1基因的D494E/V500M合并作为一个位点来进行分析。分析过程中使用“G”指代祖先型等位基因，“A”指代突变型等位基因。
所述PCR引物由以下四对引物对组成，即八条序列组成，所述四对引物为与SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对、SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8所示引物对分别对应的引物序列。
上述引物对在检测EPAS1和HBB基因多态性位点突变方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
发明人基于目标序列特点多次设计，多次组合试验筛选，确定了这一组PC R引物，利于在同一反应体系统一条件下进行有效扩增。而且，利用该组引物扩增获得的扩增产物的长度接近，利于后续扩增产物的分离提纯等进一步操作分析。
第四个方面，本发明的另一个目的是提供上述引物通过PCR扩增犬生物样本检测EPAS1和HBB基因多态性位点突变的试剂中的应用。
一种通过PCR扩增生物样品检测犬EPAS1和HBB基因多态性位点突变的方法，是以待测犬生物样品的DNA为模板，以上述引物对进行PCR扩增，根据扩增结果确定EPAS1和HBB基因多态性位点的基因型。
另外，第四个方面，本发明提供一种用于检测犬生物样品是否具有高原适应的试剂盒。上述引物对通过PCR扩增和测序结果确定犬生物样品检测EPAS1 和HBB基因多态性突变位点的试剂盒中的应用，以及包含上述引物对的EPAS1 和HBB基因多态性位点检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
利用根据本发明的试剂盒，能快速、准确确定犬生物样本是否具有高原适应性，是否适宜作为高原环境下的警犬使用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明公开了用于检测犬类高原低氧适应性密切相关的HBB和EPAS1基因多态性的引物及其PCR方法。
利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增和测序结果确定EPAS 1和HBB基因多态性位点的基因型，将得到的核酸样本序列与祖先型基因组序列相比对，在突变位点有无突变，指示犬生物样本是否具有高原适应性。
本发明涉及的确定EPAS1和HBB基因多态性位点突变的核酸，是本发明人根据全基因组关联分析(GWADS)的方法，联合候选基因突变验证的方法确定的在犬中是否具有高原适应性的方法，在现有犬的研究技术中并未被提到。
由此，对犬类是否具有高原适应性进行预测，进而对有高原适应性差异的各生物样本进行深入研究，为高原疾病防治提供依据和预防方法。而且，本发明的方法简单易行，应用前景广泛。
附图说明
图1为本发明实施例提供的PCR的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为2000b pDNAMarker，1为G305S位点，2为D494E/V500MF位点，3为P750S位点， 4为G14S/L15M位点；
图2为犬基因型与高原适应性的关联检验图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，百分号代表质量百分数。
本发明提出了EPAS1和HBB基因突变体，在上述位点具有突变体与犬高原适应性密切相关，通过检测犬是否具有突变体，可准确检测犬是否具有高原适应性。
以上所述EPAS1和HBB基因突变体，是本申请发明人通过等量混合重测序联合候选基因突变的验证方法确定的。根据电泳和测序结果确定其基因型，确定犬生物个体在以下基因位点是否突变(位点如表2)，发明人发现HBB基因突变体与EPAS1基因突变体由祖先型突变为其他碱基时，验证EPAS1和HBB基因突变和高原适应性的相关性，判断犬是否具有高原适应性的潜能。
表2.候选基因非同义突变位点的坐标，突变及氨基酸的改变
确定犬生物样本是否具有高原适应性的方法
根据本发明第二个方面，本发明提出了一种能确定犬是否具有高原适应性的方法。根据本发明的实施例，该方法具体包括以下步骤：
实施例1检测EPAS1和HBB基因多态性的引物及其方法
分别对42只犬生物样品(犬生活平均海拔>3000m)采集并进行基因检测，针对EPAS1和HBB基因设计引物，通过PCR扩增、产物纯化以及测序的方法获得相关序列，根据序列比对情况确定基因型。具体步骤：
1采样与提取DNA
1.1采集新鲜犬只血液1-3mL于抗凝管中并标号，-40℃冰箱保存样品。采用市售的血液与组织试剂盒提取DNA。利用分光光度计检测DNA提取的浓度, 用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、320nm时的OD值,计算DN A的浓度和纯度。提取好的DNA样品于-40℃冰箱保存。
DNA浓度(ug/ml)＝(OD260-OD320)*50ug/ml*稀释倍数
DNA纯度＝(OD260-OD320)/(OD280-OD320)
纯度为1.8时表示纯度最好；<1.6表示蛋白含量太高；>1.9表示有RNA污染,可用RNA酶进行处理。
2引物设计及PCR设计
2.1引物设计
设计EPAS1和HBB的PCR扩增引物，如表3所示。
表3.引物序列
2.2 PCR反应体系及反应条件
PCR反应体系如表4：
表4
总体积 H2O dNTPs 上游引物 下游引物 10*Buffer rTaq 模板
25μL 18.81μL 1.3μL 0.63μL 0.63μL 2.5μL 0.13μL 1μL
PCR反应条件：
预变性94℃15min，循环中94℃变性1min，各引物退火温度如表5，退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸20min后终止反应。
表5
2.3 PCR产物检测
采用1.2％琼脂糖凝胶，电压为120V。点样时需点DL2000作为标记，其次取2μL PCR产物与1μL 6×Loadding Buffer混合点样。凝胶成像图见图1。
2.4回收PCR产物
PCR产物电泳结果如果条带单一，且无杂带，酶切纯化。采用市售的通用型DNA纯化回收试剂盒操作。
3Sanger测序
采用PE公司的BigDye Terminator Kit对PCR扩增产物直接进行进行DN A测序反应，以便获得测序结果，并基于测序结果确定犬在各突变位点的基因型。根据比对，发现检测42只犬生物样本在HBB基因中的G14S/L15M位点存在10个突变个体，EPAS1中G305S位点存在11个突变个体，D494E/V500M位点存在9个突变个体，P750S位点存在9个突变个体(见表6)。表7说明EPAS 1和HBB基因等位基因与基因型频率。使用“G”指代祖先型等位基因，“A”指代突变型等位基因。
表6.候选基因非同义突变位点的坐标，突变及氨基酸的改变
表7.EPAS1和HBB基因等位基因与基因型频率
实施例2确定犬基因型与高原适应性的关联检验
根据实施例1中确定的基因型，验证EPAS1和HBB基因突变体高原适应性的相关性。进一步，发明人对EPAS1和HBB基因突变杂合体的祖先型在高原地区(海拔>3000m)的血氧饱和度(SPO2)、血红蛋白总数(HGB)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)进行一元线性回归F检验，发明人发现，突变位点不同基因型犬高原血氧饱和度水平差异不显著(P>0.05)，血红蛋白总数(HGB)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)存在统计学差异(P<0.05)，结果见图2。
综上，发明人证明了突变位点基因型与血红蛋白总数(HGB)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)方面有显著关联。并且，如果上述位点突变为“A”，则认为该犬具有一定的高原适应能力。其可能通过低血红蛋白浓度(HGB)、低红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，进而降低血液粘滞性，保证高原环境下血液的正常流速，保证机体的氧气的供给而降低高原反应。
以上结果表明，本发明的一种判断犬是否具有高原适应性方法，可以精准可靠地对犬类EPAS1和HBB基因多态性突变进行快速检测，判断是否具有高原适应性。并且本发明在犬类是首次提出检测高原适应性的方法，在其他物种方面，只有在人类的Chr2,46441523位点的EPAS1基因突变可以判断高原适应性。而本发明是一种具有较高灵敏度、特异性与准确性，检测工序易于掌握的，提供了一种全新简便地检测犬类EPAS1和HBB基因多态性突变判断高原适应性的方法，具有广泛的应用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
。
序列表
<110> 公安部昆明警犬基地
<120> 一种检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物、PCR方法、试剂盒及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gaggaaactg aaactaagag ggatt 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
caggttgcga gggttgtaga taa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccgagtagac agcccaaaca gga 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gagcaaagca gagggcaaag gta 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
acagggctgg atggaaactc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atgacagatg gcggcggtgg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gactcacctt gaagttctcg gg 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aaacataaca cctagaacgc cac 23

Claims (10)

1.检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物，其特征在于，包括四对引物对，G305S F和G305S R、D494E/V500M F和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G14S/L15M F和G14S/L15MR；
G305S F：gaggaaactgaaactaagagggatt；
G305S R：caggttgcgagggttgtagataa；
D494E/V500M F：ccgagtagacagcccaaacagga；
D494E/V500M R：gagcaaagcagagggcaaaggta；
P750S F：acagggctggatggaaactc；
P750S R：atgacagatggcggcggtgg；
G14S/L15M F：gactcaccttgaagttctcggg；
G14S/L15M R：aaacataacacctagaacgccac。
2.含有权利要求1所述检测犬EPAS1和HBB基因突变体的引物的试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括dNTPs、rTaq酶和10×Buffer。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：
模板 1μL，
上游引物10pmol 0.63μL，
下游引物10pmol 0.63μL，
10×Buffer 2.5μL，
dNTPs 1.3μL，
rTaq酶 0.13μL，
余量去离子H2O，总计25μL；
所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为G305S F和G305S R、D494E/V500M F和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G14S/L15M F和G14S/L15M R四对引物中的任意一种。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的扩增程序：预变性94℃15min，循环中94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸20min后终止反应；
G305S F和G305S R引物对的退火温度为61.5℃；
D494E/V500M F和D494E/V500M R引物对的退火温度为66℃；
P750S F和P750S R引物对的退火温度为66℃；
G14S/L15M F和G14S/L15M R引物对的退火温度为61.5℃。
7.权利要求1所述扩增引物在判断犬是否具有高原适应性中的应用。
8.权利要求2-6任意一项所述试剂盒在判断犬是否具有高原适应性中的应用。
9.一种判断犬是否具有高原适应性方法，采用权利要求2-6任意一项所述试剂盒或者权利要求1所述扩增引物，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），从待测犬生物样品中提取DNA样本；
步骤（2），以步骤（1）得到的DNA作为模板进行制备如下扩增体系：
模板 1μL，
上游引物 10pmol 0.63μL，
下游引物 10pmol 0.63μL，
10×Buffer 2.5μL，
dNTPs 1.3μL，
rTaq酶 0.13μL，
余量去离子H2O，总计25μL；
所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为G305S F和G305S R、D494E/V500M F和D494E/V500M R、P750S F和P750S R、G14S/L15M F和G14S/L15M R四对引物中的任意一种，得到4个扩增体系；
步骤（3），将步骤（2）制备好的4个扩增体系进行PCR反应；设置扩增程序：预变性94℃15min，循环中94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸20min后终止反应；
G305S F和G305S R引物对的退火温度为61.5℃；
D494E/V500M F和D494E/V500M R引物对的退火温度为66℃；
P750S F和P750S R引物对的退火温度为66℃；
G14S/L15M F和G14S/L15M R引物对的退火温度为61.5℃；
步骤（4），对步骤（3）得到的扩增产物进行测序，并与祖先型相比，比较在EPAS1和HBB基因突变位点是否具有突变，如果有，则待测犬具有高原适应性，反之，则不具有高原适应性。
10.根据权利要求9所述的判断犬是否具有高原适应性方法，其特征在于，所述待测犬生物样品为犬血样本；EPAS1基因突变位点位于EPAS1基因第10号染色体上，HBB基因突变位点位于HBB基因第21号染色体。
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