CN113151508B - 鉴别具有服从行为犬的生物标记物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别具有服从行为犬的生物标记物、试剂盒和方法。本发明通过对两个独立犬种的行为测试和全基因组测序，以研究家犬服从行为的遗传机制。通过GEMMA、FST分析和飞行时间质谱检测，创造性地发现了与行为或神经疾病有关的11个基因上有与服从行为相关的20个SNP位点，其与犬的服从行为均存在不同程度的相关性，预测这些SNP位点或其组合可适用于鉴别具有服从行为的犬类，特别是警犬。
Description
技术领域
本发明属于生物遗传技术领域，特别是涉及一种鉴别具有服从行为犬的生物标记物、试 剂盒和方法。
背景技术
在过去几十年里，有大量行为测试研究广泛应用于家犬身上，此类行为测试用于研究犬 的行为发育规律、预测成年犬的行为，实质都是通过对犬施加一定的外界刺激，观察犬对不 同刺激的反应，然后对拟订的观察项目进行统计，最终比较出每个犬的差异。
服从行为(Obedience Behavior)，是指“对训练员的指令迅速执行，按照训练员的要求，做 出回应的行为”，是警犬最重要的警用行为之一。警犬对训练员的服从，是警犬训练和使用的 前提条件，育种者非常希望能阐明服从行为的遗传基础。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于鉴别具有服从行为犬的生物标记物。
具体技术方案如下：
一种鉴别具有服从行为犬的生物标记物或其组合，包括有SNP位点18_32591848和/或 23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、 4_71999430、23_7340839、8_11781492中的至少一种，和/或4_55831202、4_55831173、 14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066、 30_23644108中的至少一种。
在其中一些实施例中，上述生物标记物组合包括有SNP位点18_32591848和16_54087058、 23_6661845、23_10664020中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述生物标记物组合包括有SNP位点18_32591848、16_54087058、 23_6661845和23_10664020。
在其中一些实施例中，上述生物标记物组合包括有SNP位点18_32591848、23_7340493、 23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、4_71999430、 23_7340839和8_11781492。
在其中一些实施例中，上述生物标记物组合还包括有SNP位点4_55831202、4_55831173、 14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066和 30_23644108。
本发明的目的之一还在于提供一种上述生物标记物或其组合在制备鉴别具有服从行为犬 的试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种鉴别具有服从行为犬的试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种鉴别具有服从行为犬的试剂盒，包括有检测上述生物标记物或其组合的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒包括针对每个生物标记物的上下游引物，所述上下游 引物分别为：针对16_54087058的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，和/或针对23_7339113的 SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，和/或针对14_33240293的SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8，和/ 或针对4_55831202的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，和/或针对4_55831173的SEQ ID NO.13 和SEQ ID NO.14，和/或针对23_6661845的SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，和/或针对 23_7314687的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，和/或针对16_54084667的SEQ IDNO.22和 SEQ ID NO.23，和/或针对8_11781492的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，和/或针对 23_7329919的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，和/或针对23_7340493的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32，和/或针对8_11779066的SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35，和/或针对 14_33240317的SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38，和/或针对23_7340839的SEQ ID NO.40和 SEQID NO.41，和/或针对23_10664020的SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44，和/或针对 30_23644108的SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47，和/或针对16_56366606的SEQ ID NO.49 和SEQID NO.50，和/或针对14_33244359的SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53，和/或针对 4_71999430的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56，和/或针对18_32591848的SEQ ID NO.58和 SEQID NO.59。
在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括针对每个生物标记物的单碱基延伸引物，所述 单碱基延伸引物分别为：针对16_54087058的SEQ ID NO.3，和/或针对23_7339113的SEQ ID NO.6，和/或针对14_33240293的SEQ ID NO.9，和/或针对4_55831202的SEQ IDNO.12，和 /或针对4_55831173的SEQ ID NO.15，和/或针对23_6661845的SEQ ID NO.18，和/或针对 23_7314687的SEQ ID NO.21，和/或针对16_54084667的SEQ ID NO.24，和/或针对8_11781492 的SEQ ID NO.27，和/或针对23_7329919的SEQ ID NO.30，和/或针对23_7340493的SEQ ID NO.33，和/或针对8_11779066的SEQ ID NO.36，和/或针对14_33240317的SEQ ID NO.39， 和/或针对23_7340839的SEQ ID NO.42，和/或针对23_10664020的SEQID NO.45，和/或针 对30_23644108的SEQ ID NO.48，和/或针对16_56366606的SEQ IDNO.51，和/或针对 14_33244359的SEQ ID NO.54，和/或针对4_71999430的SEQ ID NO.57，和/或针对 18_32591848的SEQ ID NO.60。
本发明的目的之一还在于提供一种鉴别具有服从行为犬的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种鉴别具有服从行为犬的方法，通过对待测样本进行上述生物标记物或其组合检测是 否存在SNP突变。
在其中一些实施例中，上述鉴别具有服从行为犬的试剂盒采用的检测方法包括聚合酶链 式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因 芯片技术或基因测序技术。
在其中的一些实施例中，上述检测方法中，聚合酶链式反应技术包括RT-PCR、免疫PCR、 巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称 PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR中等；高通量检测技术包括简化基因组测序，全 基因组测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序等；基于质谱的GC-MS、LC-MS、MALDI-TOFMS、 FT-MS、ICP-MS、SIMS等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如基因芯片、蛋白质 芯片、细胞芯片、组织芯片等检测技术。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对两个独立犬种的行为测试和全基因组测序，以研究家犬服从行为的遗传机 制。通过GEMMA、FST分析和飞行时间质谱(MALDI-TOF)检测，创造性地发现了与行为或 神经疾病有关的GRIA1、GLAST、AKAP6、HDAC9、ENSCAFG00000025123、CSMD1、GLT-1、TRANK1、ITGA9、ULK4、ADAM10这11个基因上有与服从行为相关的20个SNP位点， 具体为：18_32591848、23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、 23_6661845、23_10664020、4_71999430、23_7340839、8_11781492、4_55831202、4_55831173、 14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066和 30_23644108。这些SNP位点经一系列实验研究发现，其与犬的服从行为均存在不同程度的相关性，预测这些SNP位点或其组合可适用于鉴别具有服从行为的犬类，特别是警犬。
附图说明
图1为实施例3中服从行为GEMMA曼哈顿图。
图2为实施例3中服从行为GEMMAQQ图。
图3为实施例3中服从行为FST曼哈顿图。
图4为实施例4中SNP分型检测流程图。
图5为实施例4中143个样本的服从行为打分情况统计图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形 式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公 开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分 子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或 按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目 的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意 的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有 明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其 可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的 范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除 非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非 上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数 指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1犬的服从行为测试
本发明的研究中我们对衔取行为进行测试的样品为20只昆明犬和20只马里努阿犬。根 据警用行为评分标准对这20只昆明犬和20只马里努阿犬进行打分，这一步由我们的合作者 昆明警犬基地完成，它们基本信息及相关评分标准如下表所示。
表1-1 昆明犬与马里努阿犬基本信息
Table 1-1 Basic Information of Kunming Dog and Belgian Malinois Dog
表1-2 犬服从行为测试项目的描述和评分标准
Table 1-2 Description of sub-tests and scoring standard about canineObedience behavior
对于两个犬种(昆明犬和马里努阿犬)的犬类警用行为，我们重点介绍了方法中描述的服 从性。在服从行为测试中，我们根据服从行为的评分标准给进行打分，得分结果如下表1-3、 1-4所示，其中选择了评分为9分及以上的个体作为高分组，6分及以下的个体作为低分组。
表1-3 犬服从行为低分组
Table 1-3 Dogs'Obedience Behavior Low Group
| 姓名 | 服从行为评分 | SM编号 |
| 瓦火流 | 5 | FAM000210 |
| 格宝数 | 6 | FAM000239 |
| 露罗春 | 6 | FAM000226 |
| 凤飞 | 7 | FAM000221 |
表1-4 犬服从行为高分组
Table 1-4 Dogs'Obedience Behavior High Group
实施例2犬的全基因组测序
进一步通过对上述测试的20只昆明犬和20只马里努阿犬分别进行采样测序，采样工作 由昆明警犬基地完成。具体步骤如下：
1、DNA的提取
本研究中样品均为全血，在样品采集过程中为了保证DNA的稳定，采集到的家犬全血 加入肝素钠血液抗凝剂，并将采血管置于液氮罐中保存。采样结束回到实验室后，按DNA保存液：全血(1:3)的比例转入特定的样品保存管中-80℃长期保存。研究中，我们采用苯酚- 氯仿-异戊醇抽提法进行全血DNA的提取，提取的DNA进行定量后稀释到合适的浓度用于 PCR的片段扩增实验。具体的抽提方法如下：
⑴150ml全血或0.03g组织样品(充分剪碎或研细)，加入450ul STE缓冲液(30mMTris-HCL，200mM EDTA，50mM NaCl，pH 8.0)和终浓度为10％的SDS 75ul，混合后加入200mg/ml的蛋白酶K，25ul，充分混匀后置于56℃水浴锅中消化8-12小时至澄清，适当增 加消化时间，以使消化效果较好，其间摇匀数次。
⑵加入等体积(600-700ul)的水饱和酚或Tris饱和酚(酚的PH值必须接近8.0，以防止 DNA在有机相与水相的交界面上滞留)，人工缓慢混匀30分钟或在DNA混合仪上缓慢转动 抽提24小时，小心地混合两相。于室温9000rpm/min离心10分钟，小心转移上清液至另一干净的Eppendorf管中。
⑶加入300ul苯酚，氯仿：异戊醇(24:1)300ul，缓慢混匀抽提30分钟或在DNA混合仪 上缓慢转动抽提24小时，9000rpm/min离心10分钟，小心转移上清液至另一干净的Eppendorf管。
⑷再加入600-700ul的氯仿：异戊醇(24:1，氯仿可使蛋白质变异并有助于液相与有机相 分离；异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫)，抽提10分钟或在DNA混合仪上缓慢转动 抽提24小时，每次9000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净Eppendorf管中，重复两次。
⑸加入等体积预冷半小时以上的异丙醇(600ul)沉淀DNA，于-20℃静置2小时以上沉淀 DNA(过夜更好)，12000转/分离心10分钟后，小心移除上清，防止底部的DNA沉淀被吸出。 加入1000ml70％乙醇小心振荡洗涤，除去一些盐分或其他不利于DNA溶解的成分，13000rpm/min离心10分钟后，弃上清，重复两次。
⑹尽可能彻底除去70％乙醇，于室温将DNA沉淀置于敞开的Eppendorf管内，直至乙醇 挥发殆尽(注意不要使DNA沉淀完全干燥，否则很难使DNA溶解)。
⑺加入适量TE(10mM Tris-HCL,1mM EDTA,pH＝8.0)缓冲液溶解，置37℃充分溶解，68℃ 加热灭活，待DNA完全溶解后在68℃的水浴锅中灭活10分钟，使DNA降解酶失活，置于 4℃冰箱或长期保存于-20℃待用。
2、DNA定量与稀释
DNA样品原液，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解。取1ul，DNA原液通过紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA样品用TE(10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH＝8.0)稀 释至50-100ng/ul作为PCR反应工作液。原液放在-20℃冰箱长期保存，工作液则保存在4℃ 冰箱，待用。
3、全基因组测序
在Illumina HiSeq4000平台上对提取到的每个DNA样本进行全基因组测序，获得了50GB 以上的数据。
4、数据处理
使用BWA软件(版本0.7.10-r789)进行数据比对，将测序所得的原始序列比对到家犬的 参考基因组(版本:Canfam3.1)上，产生二进制的BAM文件，之后以PICARD软件集(版本： 1.87)对获得的BAM文件进行操作去除冗余序列。然后我们使用GATK软件(版本：2.5-2-gf57256b)对序列进行局部的重新比对和碱基的质量校正，得到我们所需的最终BAM 文件。
再进行全基因组单核苷酸多态位点(SNPs)的检测及过滤，通过GATK工具集中的Unified Genotype Caller模块对BAM文件进行处理获得原始VCF文件后，结合EnsemblDatabase数 据库中公布且验证过的家犬基因组SNPs列表作为参照，对获得的原始VCF文件中每个的SNP 位点进行质量校正得到初步过滤后的VCF文件，我们还需对所得的突变位点进行进一步过滤。 从获得的VCF文件中删除插入/缺失(INDELs)，并且将那些数据缺失、三等位基因或接近Indels(不超过5bp)的SNPs从VCF文件中删除，以获得高质量的SNPs数据集。
最终，这40个个体的测序结果最低深度17.65×，最高深度27.38×。经进一步完成比对、 多态位点检测和过滤后，分型并确定8,065,485个常染色体单核苷酸多态性(SNPs)供后续分析。
实施例3犬全基因组信息GWAS分析
GEMMA进行单变量线性混合模型GWAS分析。根据服从行为的评分，分别选出它们的高分组与低分组，并以此从VCF文件中挑选出相应的数据集，合并马里努阿犬组和昆明犬组的SNPs信息。通过使用Plink和Vcftools将VCF文件转化为BED文件，准备GEMMA的输 入文件，并进行主成分分析(PCA)用于控制群体结构，将PCA结果当做协变量。
这是一种两阶段的GWAS方法，在第一阶段中根据上述得到的数据集，通过使用GEMMA 先生成亲缘矩阵，这是先对样本之间的关系进行样本结构分析，得到亲缘矩阵的输出文件。 在第二阶段中，同样使用之前的数据集，并且将第一步得到的亲缘矩阵文件一起当做输入文 件，进行关联测试，并拟合到单变量线性混合模型中。选择了称为Wald检验的常检验来检验 SNP的关联性，将GEMMA选出的前100位点挑出作为候选区域。使用相同的数据集，通过使用Vcftools对每个SNPs进行FST分析，以检验高分组和低分组之间的差异，过高的FST 值可能是导致行为差异的原因。
将GEMMA选出的前100位点和FST的位点的重叠部分挑出，用ANNOVAR软件对每 个多态位点进行功能注释，找出序列中包含的基因，之后进一步筛选出与行为或神经疾病相关的基因作为候选基因，挑出的位点就是候选位点。
我们将马里努阿犬和昆明犬群体基因型数据，结合上述实施例1中划分的高分个体和低 分个体这两个群体，进一步分别对这两个群体进行GEMMA和FST分析，从而最大限度地反 映两个群体之间的遗传差异。
GEMMA结果中，经过注释发现我们获得了11个基因，位于4号染色体的GRIA1、GLAST， 位于8号染色体的AKAP6，位于14号染色体的HDAC9，位于16号染色体的ENSCAFG00000025123和CSMD1，位于18号染色体的GLT-1，位于23号染色体的TRANK1、 ITGA9和ULK4，位于30号染色体的ADAM10，全基因组关联性分析结果如图1，位点都处 于蓝线之上，阈值为0.05，表明找到的位点都是显著的，同时我们也观察到在图中具有多个 统计显著性的峰，在不同的染色体上都具有峰值，这个结果符合行为性状作为数量性状的微 效多基因的假设。而且如图2所示，我们看到在后半部分GWAS结果开始与均匀分布出现快 速分离，自然选择开始发挥作用，致使服从行为表型在警犬群体中快速摆脱随机性，我们会 看到高高翘起的QQ-plot，这说明我们所研究的服从行为表型性状和基因结果之间是存在着显 著相关的选择作用的。FST分析结果中，全基因组的选择分析结果如图3所示，不同的染色 体上的峰值与全基因组关联性分析一致，说明我们的结果可信。
表3-1 家犬服从行为基因列表
Table 3-1 The Gene List of Dogs'Aggressive Behavior
进一步将GEMMA结果与FST结果进行验证，获取和行为或神经疾病相关的基因与位点， 得到了20个位点，这20个位点所在的11个基因都与神经或行为相关，基因列表见上表3-1。 从表格中可以看到，p_wald都小于0.05，这些SNP很显著，说明在这些位点上跟性状的关联 很强，极有可能是导致家犬产生服从行为的原因，我们用FST结果进行辅助验证，说明这20 个SNP位点确实与服从行为具有较强的关联。
实施例4犬服从行为相关位点SNP分型实验验证
通过PCR扩增包含SNP位点的DNA序列，然后通过特异性单碱基延伸引物(extension primer)扩增上述PCR产物，在ddNTP反应体系中，该延伸引物只扩增与待检测SNP位点互 补的碱基即终止，具体检测流程如图4所示，步骤参考如下：
(1)SNP序列整理。
通过dbSNP数据库，汇总包含待检测SNP位点在内共计200bp的gDNA序列，并以 txt格式保存。
(2)同源序列比对。
通过UCSC数据库核实SNP位点所在基因序列在基因组同源性，从而评估分型检测的 潜在风险。
(3)设计引物。
采用Agena公司的Assay Designer4.0软件进行多重SNP位点的引物设计评估，并根据 不同的位点信息酌情调整设计参数，满足最优化标准。
(4)引物合成。
采用PAGE引物纯化方法，合成每个SNP位点对应的三条引物，分别为两条PCR引 物和一条UEP引物，示例如下。具体引物序列如下表4-1所示：
表4-1
(5)引物配置。
PCR引物master mix引物配置：稀释单管PCR master至浓度100μM，加入去离子水混 合所有单管PCR master使最终反应PCR master mix浓度为0.5μM。
Extend UEP引物Mix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后 使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子 量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。将混合好的单管延伸 引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于 7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。
(6)DNA质检。
采用商业化DNA提取试剂盒，提取血样、组织、细胞、唾液等不同样本类型中的DNA。针对所有DNA样本使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，1.25％琼脂糖凝胶电泳检测， 进行质检评估是否符合Massarray SNP分型DNA质量要求，质检标准如下表4-2所示：
表4-2
| 质检项目 | 标准 |
| DNA浓度 | ＞20ng/ul以上 |
| OD260/280值 | 2.2～1.6 |
| OD260/230值 | >0.6 |
| OD230nm | 无吸收峰 |
| DNA电泳结果 | gDNA完整无严重降解 |
然后将质检合格样本转移至96孔板作为工作液，储存于-20℃备用。
(7)PCR扩增反应。该步骤反应是通过PCR扩增，将含有SNP位点的基因片段从gDNA基因组扩增，产物长度在100-200bp之间。
(8)碱性磷酸酶(SAP)反应
该步骤反应通过碱性磷酸酶处理，将上述PCR反应体系中的dNTP进行磷酸化。
(9)单碱基延伸反应
该步骤反应通过UEP引物，在ddNTP体系中进行单碱基延伸反应，形成与待检测SNP基因型互补的单碱基延伸产物。
(10)树脂纯化
1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。
2)在384样本板的每个孔中加16μL水。
3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
4)将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
(11)芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上。
(12)质谱检测及数据输出
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储 媒介并递交生物信息室分析。
然后我们采集了143只昆明犬和马里努阿犬个体样本的样本进行了基因分型实验，根据 实际检测情况需要，进一步地对其样本进行服从行为表型打分，并计算了基因型与表型之间 的关联性和相关系数，对全基因组研究发现的结果进行验证。SNP分型实验结果中，如下表 4-3所示，对于20个待检的SNP位点检出率大于80％，并且我们得到了每个样本这20个SNP 的基因型，同时也有这143个样本的服从行为表型数据，如图5所示。
表4-3 SNP位点检出率统计表
Table4-3 Statistical table of SNP detection rate
| CHROM | POS | Call_num | Call_rate |
| 4 | 55831173 | 142 | 99.30％ |
| 4 | 55831202 | 143 | 100.00％ |
| 4 | 71999430 | 139 | 97.20％ |
| 16 | 54084667 | 133 | 93.01％ |
| 8 | 11779066 | 115 | 80.42％ |
| 14 | 33240293 | 138 | 96.50％ |
| 14 | 33240317 | 136 | 95.10％ |
| 14 | 33244359 | 132 | 92.31％ |
| 16 | 54087058 | 142 | 99.30％ |
| 16 | 56366606 | 141 | 98.60％ |
| 18 | 32591848 | 140 | 97.90％ |
| 23 | 6661845 | 136 | 95.10％ |
| 23 | 7314687 | 139 | 97.20％ |
| 23 | 7329919 | 126 | 88.11％ |
| 23 | 7339113 | 138 | 96.50％ |
| 23 | 7340493 | 142 | 99.30％ |
| 23 | 10664020 | 141 | 98.60％ |
| 30 | 23644108 | 140 | 97.90％ |
| 8 | 11781492 | 134 | 93.71％ |
| 23 | 7340839 | 140 | 97.90％ |
实施例5犬服从行为相关位点相关性分析
我们对所得到的SNP分型实验结果中的143个与其相对应的服从行为打分表型数据进行 相关性分析，皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)描述的是两个变量间线性相关强 弱的程度，相关系数用r表示，其中n为样本量，分别为两个变量的观测值和均值。r描述的 是两个变量间线性相关强弱的程度，0.8-1.0：极强相关，0.6-0.8：强相关，0.4-0.6：中等程度 相关，0.2-0.4：弱相关，0.0-0.2：极弱相关或无相关，其绝对值越大表明相关性越强。
通过使用相关系数分别验证了20个位点服从性行为的相关程度，服从性行为的最高分为 10分，这143个样品的打分情况在3分到10分之间，143个样品的具体打分情况如图5所示， 其中，在7分到9分的区间，警犬个体数量最多，我们统计了20个位点在所有个体的基因型 频率与打分平均数的相关系数，发现23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、4_71999430、23_7340839、8_11781492、18_32591848 的相关系数都在0.6以上，属于强相关；4_55831202和4_55831173的相关系数为0.4，为中 度相关；14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606的相关系 数在0.2及以上，为弱相关；8_11779066和30_23644108的相关系数均为0.1，为极弱相关。
表5-1 相关系数统计表
Table 5-1 Statistical table of correlation coefficients
因此，通过皮尔森相关性检验验证，上述11个基因中的20个SNP位点均与犬的服从行 为具有相关性，预测这些SNP位点或其组合可有效应用于鉴别具有服从行为的犬类。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 云南大学
<120> 鉴别具有服从行为犬的生物标记物、试剂盒和方法
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
acgttggatg caatatgtcc atttgcaggg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acgttggatg tgtggtgtac acatgtgtgc 30
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtgcctttgg ggttt 15
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
acgttggatg aatggaaagc tgtacacagt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
acgttggatg aacaggaggc acagtttcag 30
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acccctgtat gtttgc 16
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
acgttggatg aaacttctac caacctctcc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acgttggatg gtccccaccc ccaataaaat 30
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acctctcctt attccct 17
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acgttggatg gggctctgga gagaattcag 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
acgttggatg cccaagcaat agtgagtcag 30
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
acttcccttc gtggggc 17
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
acgttggatg gggctctgga gagaattcag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
acgttggatg cccaagcaat agtgagtcag 30
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agagaattca ggcagag 17
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
acgttggatg tgtcgatgat cttcatggcg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
acgttggatg aacttcgcgg tggtcaagga 30
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
accggcaccg ccagacgc 18
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
acgttggatg gacaatactc cacgggattc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
acgttggatg ggtgataaca ttcttagccc 30
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ttccatctgt ggatgagtg 19
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
acgttggatg agcacccatt agttaacctc 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
acgttggatg ccaattttgg tccttgggtg 30
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tgggtgacac ctcagaaaga 20
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
acgttggatg gagatgagaa aagttgtgcc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
acgttggatg cctagaacaa ctcctgttac 30
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gggttgcctg ctaagaaaat 20
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
acgttggatg ggtttgggta tggctttagg 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
acgttggatg aaaggtctct ggtacagagc 30
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
agagggtaca gagcaaggca c 21
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
acgttggatg ataactcccc acattgtgcc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
acgttggatg acccttgtac ttagggaagc 30
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
acaacccaac caatgtatct taat 24
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
acgttggatg cagactcgaa ttattttcc 29
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
acgttggatg ggaaaacttg aaccttgggc 30
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
gagactcgaa ttattttcct attca 25
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
acgttggatg aaacttctac caacctctcc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
acgttggatg gtccccaccc ccaataaaat 30
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
attcataaat acagagtaga atagt 25
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
acgttggatg atgccagggc agatttagac 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
acgttggatg ctctacccca aatcactgac 30
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
aacaaaatca ctgacatgtc agtatc 26
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
acgttggatg ctcaagggac ctaacctaag 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
acgttggatg tcttttgagc tgcccttgtc 30
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
ggaaatgtgt gtgccttt 18
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
acgttggatg gagctgatca cagaagacac 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
acgttggatg ttttcttcct tcctcctccc 30
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
aggaaaagaa agaaggga 18
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
acgttggatg tgaccaacag gaaaccacag 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
acgttggatg cacatcttct gtcttggagc 30
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
cacagaaaat acaggcttaa 20
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
acgttggatg cctgctgtct ttttttgtgc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
acgttggatg aataaaaatg caccactggg 30
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
ccatagtggt acattttttt tt 22
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
acgttggatg actcacatgc aagatggctc 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
acgttggatg agatcctacc tgggaaatag 30
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
cttttcattg acagcatata ctg 23
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
acgttggatg caaaccagga ttgcctcagc 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
acgttggatg atacacagca gatgtgttcc 30
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
ctacctcatc aatgattttt cttat 25
Claims (7)
1.一种生物标记物组合在制备鉴别具有服从行为犬的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标记物组合包括SNP位点18_32591848、23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、4_71999430、23_7340839和8_11781492；所述犬为昆明犬或马里努阿犬，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述生物标记物组合还包括SNP位点4_55831202、4_55831173、14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066和30_23644108。
3.一种鉴别具有服从行为犬的试剂盒，其特征在于，包括检测生物标记物组合的试剂，所述生物标记物组合包括SNP位点18_32591848、23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、4_71999430、23_7340839和8_11781492，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
4.根据权利要求3所述的剂盒，其特征在于，还包括检测生物标记物SNP位点4_55831202、4_55831173、14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066和30_23644108的试剂。
5.根据权利要求4所述鉴别具有服从行为犬的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对每个生物标记物的上下游引物，所述上下游引物分别为：针对16_54087058的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，针对23_7339113的SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，针对14_33240293的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，针对4_55831202的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，针对4_55831173的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，针对23_6661845的SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17针对23_7314687的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，针对16_54084667的SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23，针对8_11781492的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，针对23_7329919的SEQID NO.28和SEQ ID NO.29，针对23_7340493的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32，针对8_11779066的SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35，针对14_33240317的SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.38，针对23_7340839的SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41，针对23_10664020的SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44，针对30_23644108的SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47，针对16_56366606的SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50，针对14_33244359的SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53，针对4_71999430的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56，针对18_32591848的SEQ IDNO.58和SEQ ID NO.59；
还包括针对每个生物标记物的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物分别为：针对16_54087058的SEQ ID NO.3，针对23_7339113的SEQ ID NO.6，针对14_33240293的SEQ IDNO.9，针对4_55831202的SEQ ID NO.12，针对4_55831173的SEQ ID NO.15，针对23_6661845的SEQ ID NO.18，针对23_7314687的SEQ ID NO.21，针对16_54084667的SEQ ID NO.24，针对8_11781492的SEQ ID NO.27，针对23_7329919的SEQ ID NO.30，针对23_7340493的SEQID NO.33，针对8_11779066的SEQ ID NO.36，针对14_33240317的SEQ ID NO.39，针对23_7340839的SEQ ID NO.42，针对23_10664020的SEQ ID NO.45，针对30_23644108的SEQ IDNO.48，针对16_56366606的SEQ ID NO.51，针对14_33244359的SEQ ID NO.54，针对4_71999430的SEQ ID NO.57，针对18_32591848的SEQ ID NO.60。
6.一种鉴别具有服从行为犬的方法，其特征在于，对待测样本进行生物标记物组合检测是否存在SNP突变，所述生物标记物组合包括SNP位点18_32591848、23_7340493、23_7314687、23_7329919、16_54087058、23_7339113、23_6661845、23_10664020、4_71999430、23_7340839和8_11781492；所述犬为昆明犬或马里努阿犬，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
7.根据权利要求6所述的鉴别具有服从行为犬的方法，其特征在于，所述生物标记物组合还包括SNP位点4_55831202、4_55831173、14_33240317、14_33240293、14_33244359、16_54084667、16_56366606、8_11779066和30_23644108。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN202110574050.0A CN113151508B (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 鉴别具有服从行为犬的生物标记物、试剂盒和方法 |
Publications (2)
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