CN113699255B - 鉴别具有攻击行为犬的生物标记物、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别具有攻击行为犬的生物标记物，试剂盒和方法。所述生物标记物包括有5个基因的20个SNP位点。本发明发现了与犬攻击行为相关的20个位点，包含与行为或神经疾病有关的5个基因，用以区分高分群体和低分群体的家犬。且发现每个基因不同SNP的P值相同，提示我们可能存在连锁不平衡现象。这些经过筛选的SNP可能与攻击行为关系最为强烈，可通过生物学的检测方法适用于对攻击行为犬的签别。

Description

鉴别具有攻击行为犬的生物标记物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及鉴别具有攻击行为犬的生物标记物、方法和试剂盒。
背景技术
家犬属于脊椎动物门哺乳纲食肉目犬科犬属，是自然界中遗传多样性最为丰富的物种之一。家犬是人类最早驯化的家养动物，承担着人类历史上最广泛的工作、狩猎。在最近几个世纪的文明演化过程中，伴随着审美要求和人类社会需求的发展，培育出了400多个具有不同表型、不同性情的品种，根据各品种犬的警卫性、服从度、狩猎能力等不同功能，担负了狩猎、放牧、警戒、运输、救助等不同任务，甚至还可根据人类不同的狩猎方式和命令，表现出跟踪、追击、围捕、惊飞、寻回等特殊行为(李静,岳锐,陈超,邓卫东,席冬梅,熊和丽,曹剑,黎立光.家犬基因组及表型特征的遗传研究进展[J].中国畜牧杂志,2020,56(01):58-65)。
在过去几十年里，有大量行为测试研究广泛应用于家犬身上，此类行为测试用于研究犬的行为发育规律、预测成年犬的行为，实质都是通过对犬施加一定的外界刺激，观察犬对不同刺激的反应，然后对拟订的观察项目进行统计，最终比较出每个犬的差异。攻击行为(Aggressive Behavior)，是指“攻击是任何形式的有目的的伤害另一生物体，而为该生物体所不愿接受的行为”,是动物和人类社会中普遍存在的一种现象，犬的攻击性与犬的胆量呈较高程度的表型相关，所以选择工作犬时，对攻击性的评估可以参照胆量。
犬的攻击行为是一种经常发生的行为问题，育种者非常希望能阐明攻击行为的遗传基础。目前普遍认为，在所有神经递质中，5-HT系统与攻击行为的关系最为密切。L.vanden Borg等(2003)最先克隆了犬的5-HTR1A基因，随后他又公布了5-HTR1B基因的编码序列，并发现5-HTR1B基因有5个SNP位点(L.van der Borg.Behavior Genetics of CanineAggression:Behavioral Phenotyping of Golden Retrievers by Means of anAggression Test[J].Behavior Genetics,2003，33：469～477)；2005年又接着报道通过构建细菌人工染色体分离出了犬的5-HTR2A及5-HTT(slc6A4)基因，分析金毛猎犬基因的不同发现，5-HTR1A和slc6A4基因各存在两个单核苷酸多态性(SNP)位点，5-HTR2A基因存在一个SNP位点。Masuda等(2004)也报道5-HTR1B、5-HTR2A和5-HTR2C的基因序列，这些基因序列和人的高度相似(Masuda K,Hashizume C,Ogata N,et al.Sequencing of canine5-hydroxytriptamine receptor(5-HTR)1B,2A,2C genes and identification ofpolymorphisms in the 5-HTR1B gene[J].J Vet Med Sci,2004,66(8):965～972.)。
苏威等人应用微卫星标记法，选择位于MAOA和5-HTT基因上的ZuBeCa57和5-HTT(GAAA)n微卫星标记，研究这些微卫星标记的遗传多样性和攻击行为性状之间的关系，发现ZuBeCa57对主动攻击能力影响显著(P<0.05)，5-HTT基因(GAAA)n微卫星位点对犬的护食性攻击行为差异显著(P<0.05)(苏威.犬攻击行为性状及其相关基因研究.扬州大学,2008)。
发明内容
基于此，本发明的目的之一提供一种鉴别具有攻击行为犬的生物标记物。
实现上述目的技术方案如下。
一种鉴别具有攻击行为犬的生物标记物，包括有以下DSC1基因的SNP位点7:58446817，7:58446864，rs850698287，rs850667210，7:58458676，7:58460015，7:58460576，7:58461079，7:58461963，7:58462000，7:58462209中的至少一种；和/或HDAC9基因的SNP位点14:32856381，rs22303726，14:32865852，rs853063162，rs22283554中的至少一种；和/或NOD1基因的SNP位点14:43224056；和/或DPYSL2基因的SNP位点rs23242542，和/或RPP30基因的SNP位点rs852818240，28:5562987中的至少一种。
在其中一些实施例中，包括有以下DSC1基因的SNP位点7:58446817，7:58446864，rs850698287，rs850667210，7:58458676，7:58460015，7:58460576，7:58461079，7:58461963，7:58462000，和7:58462209。
在其中一些实施例中，包括有以下HDAC9基因的SNP位点14:32856381，rs22303726，14:32865852，rs853063162，和rs22283554。
在其中一些实施例中，所述可鉴别具有攻击行为犬的生物标记物，包括SNP位点rs850667210、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000、7:58462209中的至少一种，或者全部。
在其中一些实施例中，优选还包括SNP位点rs850667210、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000、和7:58462209。
在其中一些实施例中，优选还包括7:58446817、7:58446864、7:58447841(rs850698287)，7:58461079，14:43224056中的至少一种，或者全部。
在其中一些实施例中，还包括14:32856381，rs22303726，14:32865852，rs853063162，rs22283554，rs852818240，28:5562987，rs23242542中的至少一种，或者全部。
在其中一个优选实施例中，包括有以下DSC1基因的SNP位点7:58446817，7:58446864，rs850698287，rs850667210，7:58458676，7:58460015，7:58460576，7:58461079，7:58461963，7:58462000，7:58462209；和HDAC9基因的SNP位点14:32856381，rs22303726，14:32865852，rs853063162，rs22283554；和NOD1基因的SNP位点14:43224056；和DPYSL2基因的SNP位点rs23242542，和RPP30基因的SNP位点rs852818240，28:5562987。
本发明的另一目的在于提供所述生物标志物在制备鉴别具有攻击行为犬的试剂盒中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别具有攻击行为犬的试剂盒。
一种鉴别具有攻击行为犬的试剂盒，包括有检测上述生物标记物的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂盒是生物芯片。
在其中一些实施例中，所述检测上述生物标记物的方法包括有PCR、荧光定量PCR、RT—PCR、测序法、液相芯片法等。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别具有攻击行为犬的方法。
一种鉴别具有攻击行为犬的方法，包括对待测样本进行上述生物标记物的检测，判断或是否存在相应的SNP突变。
在其中一个优选的实施例中，所述犬是家犬。
本发明通过对两个独立犬种的行为测试和全基因组测序，以研究家犬攻击行为的遗传机制。因为犬的攻击行为与犬的胆量呈较高程度关联，所以本发明发明人研究时在两者中选取了攻击行为形状，通过GEMMA和FST分析，创造性地发现了与攻击行为相关的20个位点，包含与行为或神经疾病有关的5个基因，用以区分高分群体和低分群体。研究结果还发现每个基因不同SNP的P值相同，提示我们可能存在连锁不平衡现象。这些经过筛选的SNP可能与攻击行为关系最为强烈，可适用于用于签别具有攻击行为犬，特别是家犬。
附图说明
图1为实施例1中攻击行为GEMMA曼哈顿图。
图2为实施例1中攻击行为GEMMA QQ图。
图3为实施例1中攻击行为FST曼哈顿图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
1.1行为测试与样品采集
本发明中我们对攻击行为进行测试的样品为20只昆明犬和20只马里努阿犬。根据警用行为评分标准对这20只昆明犬和20只马里努阿犬进行打分，这一步由我们的合作者昆明警犬基地完成，它们的评分标准如下。
表1-1昆明犬与马里努阿犬基本信息
Table 1-1Basic Information of Kunming Dog and Belgian Malinois Dog
表1-2犬攻击行为测试项目的描述和评分标准
Table 1-2Description of sub-tests and scoring standard about canineaggressive behaviors
我们对上述测试的20只昆明犬和20只马里努阿犬进行采样测序，采样工作由我们的合作者昆明警犬基地完成。
1.2DNA的提取
本研究中样品均为全血，在样品采集过程中为了保证DNA的稳定，采集到的家犬全血加入肝素钠血液抗凝剂，并将采血管置于液氮罐中保存。采样结束回到实验室后，按DNA保存液：全血(1:3)的比例转入特定的样品保存管中-80℃长期保存。研究中，我们采用苯酚-氯仿-异戊醇抽提法进行全血DNA的提取，提取的DNA进行定量后稀释到合适的浓度用于PCR的片段扩增实验。具体的抽提方法如下：
⑴150ml全血或少许组织样品(充分剪碎或研细)，加入450ul STE缓冲液(30mMTris-HCL，200mM EDTA，50mMNaCl，pH 8.0)和终浓度为10％的SDS75ul，混合后加入200mg/ml的蛋白酶K，25ul，充分混匀后置于56℃水浴锅中消化8-12小时至澄清，适当增加消化时间，以使消化效果较好，其间摇匀数次。
⑵加入等体积600-700ul的水饱和酚或Tris饱和酚(酚的PH值必须接近8.0，以防止DNA在有机相与水相的交界面上滞留)，人工缓慢混匀30分钟或在DNA混合仪上缓慢转动抽提24小时，小心的混合两相。于室温9000rpm/min离心10分钟，小心转移上清液至另一干净的Eppendorf管中。
⑶加入300ul苯酚，氯仿：异戊醇(24:1)300ul，缓慢混匀抽提30分钟或在DNA混合仪上缓慢转动抽提24小时，9000rpm/min离心10分钟，小心转移上清液至另一干净的Eppendorf管。
⑷再加入600-700ul的氯仿：异戊醇(24:1，氯仿可使蛋白质变异并有助于液相与有机相分离；异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫)，抽提10分钟或在DNA混合仪上缓慢转动抽提24小时，每次9000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中，重复两次。
⑸加入等体积预冷半小时以上的异丙醇(600ul)沉淀DNA，于-20℃静置2小时以上沉淀DNA(过夜更好)，12000转/分离心10分钟后，小心移除上清，防止底部的DNA沉淀被吸出。加入1000ml 70％乙醇小心振荡洗涤，除去一些盐分或其他不利于DNA溶解的成分，13000rpm/min离心10分钟后，弃上清，重复两次。
⑹尽可能彻底除去70％乙醇，于室温将DNA沉淀置于敞开的Eppendorf管内，直至可见痕量乙醇挥发殆尽(注意不要使DNA沉淀完全干燥，否则很难使DNA溶解)。⑺加入适量TE(10mM Tris-HCL,1mM EDTA,pH＝8.0)缓冲液溶解，置37℃充分溶解，68℃加热灭活，待DNA完全溶解后在68℃的水浴锅中灭活10分钟，使DNA降解酶失活，置于4℃冰箱或长期保存于-20℃待用。
1.3DNA定量与稀释DNA样品原液，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否降解。取1ul，DNA原液通过紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA样品用TE(10mM Tris-HCL，1mMEDTA，pH＝8.0)稀释至50-100ng/ul作为PCR反应工作液。原液放在-20℃冰箱长期保存，工作液则保存在4℃冰箱，待用。
1.4全基因组测序在Illumina HiSeq4000平台上对提取到的每个DNA样本进行全基因组测序，获得了50GB以上的数据。
1.5数据处理首先是数据比对，我们使用BWA软件，我们所用的版本为0.7.10-r789，将我们测序所得的原始序列比对到家犬的参考基因组(版本:Canfam3.1)上，这会产生二进制的BAM文件，之后以PICARD软件集(版本：1.87)对获得的BAM文件进行操作去除冗余序列。然后我们使用GATK软件(版本：2.5-2-gf57256b)对序列进行局部的重新比对和碱基的质量校正，得到我们所需的最终BAM文件。
最后一步是要进行全基因组单核苷酸多态位点(SNPs)的检测及过滤，通过GATK工具集中的UnifiedGenotypeCaller模块对BAM文件进行处理获得原始VCF文件后，我们结合Ensembl Database数据库中公布且验证过的家犬基因组SNPs列表为参照对获得的原始VCF文件中每个的SNP位点进行质量校正得到初步过滤后的VCF文件，我们还需对所得的突变位点进行进一步过滤。从获得的VCF文件中删除插入/缺失(INDELs)，并且将那些数据缺失、三等位基因或接近Indels(不超过5bp)的SNPs从VCF文件中删除，以获得高质量的SNPs数据集。
1.6GWAS分析
线性混合模型是一种强大且有效的工具，可用于解释遗传关联测试中的群体分层、相关性和和其他混杂因素，在本研究中我们使用的是GEMMA进行单变量线性混合模型GWAS分析。根据攻击行为的评分，分别选出它们的高分组与低分组，并以此从VCF文件中挑选出相应的数据集，合并马里努阿犬组和昆明犬组的SNPs信息。通过使用Plink和Vcftools将VCF文件转化为BED文件，准备GEMMA的输入文件，并进行主成分分析(PCA)用于控制群体结构，将PCA结果当做协变量。
这是一种两阶段的GWAS方法，在第一阶段中根据上述得到的数据集，通过使用GEMMA先生成亲缘矩阵，这是先对样本之间的关系进行样本结构分析，得到亲缘矩阵的输出文件。
在第二阶段中，同样使用之前的数据集，并且将第一步得到的亲缘矩阵文件一起当做输入文件，进行关联测试，并拟合到单变量线性混合模型中。选择了称为Wald检验的常检验来检验SNP的关联性，因为它也考虑了数据集中个体之间的关系。将GEMMA选出的前100位点挑出作为候选区域。
使用相同的数据集，通过使用Vcftools对每个SNPs进行FST分析，以检验高分组和低分组之间的差异，过高的FST值可能是导致行为差异的原因。
将GEMMA选出的前100位点和FST的位点的重叠部分挑出，用ANNOVAR软件对每个多态位点进行功能注释，找出序列中包含的基因，之后进一步筛选出与行为或神经疾病相关的基因作为候选基因，挑出的位点就是候选位点。
2.1攻击行为测试
对于两个犬种(昆明犬和马里努阿犬)的犬类警用行为，我们重点介绍了方法中描述的攻击性。在攻击行为测试中，我们根据攻击行为的评分标准给进行打分，选择了成绩高的作为高分组，成绩低的作为低分组，高分组与低分组的数量尽量相平。
表2-1犬攻击行为低分组(Table 2-1Dogs'Aggressive Behavior Low Group)
表2-2犬攻击行为高分组(Table 2-2Dogs'Aggressive Behavior High Group)
2.2全基因组测序
这40个个体的测序结果最低深度17.65×，最高深度27.38×。最终完成比对、多态位点检测和过滤后，我们确定了5,776,352个常染色体单核苷酸多态性(SNPs)供进一步分析。
2.3.1卡方检验和FST分析
我们结合马里努阿犬和昆明犬群体基因型数据，人为分成高分个体和低分个体两个群体，为了最大限度的反映两个群体之间的遗传差异，我们对这两个群体进行GEMMA和FST分析。GEMMA结果中，经过注释发现我们获得了16个基因，全基因组的选择分析结果如图1、图2所示。FST分析结果中，全基因组的选择分析结果如图3所示。
我们将GEMMA结果中前100个位点在FST结果前5000位点中进行验证，结果我们得到了38个重叠的位点，包含了5个基因。对这一结果进行进一步的筛选，获取和行为或神经疾病相关的基因与位点，得到了20个位点，这5个基因都与神经或行为相关，基因列表见表3。从表格中可以看到，p_wald都小于10-6，这些SNP极其显著，说明在这些位点上跟性状的关联很强，极有可能是导致家犬产生攻击行为的原因。然后我们用FST结果进行辅助验证，发现这些SNP的FST值都在0.52以上，说明这些SNP确实与攻击行为具有较强的关联。
表2-3家犬攻击行为基因列表
/>
实施例2位点验证
我们从全国各地犬舍采集了110只犬舍的犬，包含拉布拉多，卡迪根小鹿犬，哈士奇等犬只。其中拉布拉多50只，德牧7只，金毛2只，萨路基6只，阿富汗猎犬1只，卡迪根小鹿犬16只，马犬1只，西伯利亚哈士奇4只，标准贵宾4只，法斗6只，玩具贵宾7只，彭布罗克威尔士柯基犬1只，5只柴犬。这些犬只包含幼犬，种犬。详细进行了性格，谱系，图像的登记。
表3-1犬只品种及攻击行为打分表
/>
/>
对上述所有犬只采集口腔拭子，用50K芯片进行了基因分型(委托赛默飞公司生产，23魔方公司检测。方法为：用济凡磁珠法口腔拭子DNA提取试剂盒提取DNA，然后经过扩增反应，片段化，酶切等反应，形成片段大小为25bp-125bp的高浓度段片段文库，变性后，与芯片上的探针在48℃的环境下进行特异性结合之后，上机洗去非特异性结合的DNA，并在AT/GC两个通道染上两种不同的颜色，放大DNA的为位点信号，以便位点信息捕捉，然后通过高像素相机对染色后的FDNA进行扫描，转变为光信号的过程。之后，按照affymetrix官方APT流程默认参数进行数据处理)。根据实际检测情况需要，进一步地对其样本进行攻击行为表型打分，并计算了基因型与表型之间的关联性和相关系数，对全基因组研究发现的结果进行验证，SNP分型实验结果，如下表3-3所示，该表列出了每个待测位点的物理位置(所在染色体编号和染色体上的位置)，Rs编号，样本数以及检出率)。20个待检的SNP位点检出率大于95％，并且我们得到了每个样本这20个SNP的基因型，同时也有这110个样本的攻击行为表型数据。
表3-3SNP位点检出率统计表
/>
犬攻击行为相关位点相关性分析
我们对所得到的SNP分型实验结果中的110个与其相对应的攻击行为打分表型数据进行相关性分析，皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)描述的是两个变量间线性相关强弱的程度，相关系数用r表示。r描述的是两个变量间线性相关线性相关强弱的程度，0.8-1.0：极强相关，0.6-0.8：强相关，0.4-0.6：中等程度相关，0.2-0.4：弱相关，0.0-0.2：极弱相关或无相关，其绝对值越大表明相关性越强。
/>
通过使用相关系数分别验证了20个位点攻击性行为的相关程度。我们统计了20个位点所在个体的基因型频率与打分平均数的相关系数，发现7:58457616(rs850667210)、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000、7:58462209相关系数在0.5以上，为中度相关。7:58446817、7:58446864、7:58447841(rs850698287)，7:58461079，14:43224056在0.2及以上，为弱相关，14:32856381，14:32858229(rs22303726)，14:32865852，14:32871225(rs853063162)，14:32872309(rs22283554)，28:5558244(rs852818240)，28:5562987，25:30998670(rs23242542)为极弱相关。
因此，通过皮尔森相关性检验验证，上述5个基因中的20个SNP位点均与犬的攻击行为具有相关性，预测这些SNP位点或其组合(特别是7:58457616、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000、7:58462209的组合)可有效应用于鉴定具有攻击行为的犬类。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

Claims (6)

1.检测生物标记物的试剂在制备鉴别具有攻击行为犬的试剂盒中的应用，其特征是，所述生物标记物由SNP位点7:58457616、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000和7:58462209组成，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定，所述犬是马里努阿犬或昆明犬。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述生物标记物进一步包括SNP位点7:58446817、7:58446864、7:58447841、7:58461079、14:43224056中的至少一种，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述生物标记物进一步包括SNP位点7:58446817、7:58446864、7:58447841、7:58461079和14:43224056，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
4.一种鉴别具有攻击行为犬的方法，其特征是，对待测样本的生物标记物检测是否存在SNP突变，所述生物标记物由SNP位点7:58457616、7:58458676、7:58460015、7:58460576、7:58461963、7:58462000和7:58462209组成，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定，所述犬是马里努阿犬或昆明犬。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述生物标记物进一步包括SNP位点7:58446817、7:58446864、7:58447841、7:58461079、14:43224056中的至少一种，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述生物标记物进一步包括SNP位点7:58446817、7:58446864、7:58447841、7:58461079和14:43224056，所述SNP位点是与版本为Canfam3.1的参考基因组比对确定。
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