JP4119975B2 - 犬の選別方法、及びその選別方法に使用されるｐｃｒプライマー及びポリヌクレオチドプローブ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、遺伝子多型と行動特性との関係に基づいて、犬を選別する方法に関するものである。さらには、前記犬の選別方法に使用されるＰＣＲプライマー及びポリヌクレオチドプローブに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の有用犬の選別方法としては、例えば、イヌにおけるドーパミン受容体Ｄ４遺伝子多型と行動特性との関連について報告された文献が知られている（非特許文献１参照）。この文献は、イヌのドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン３領域における９種類の対立遺伝子の多型と、行動特性の評価との関連性を、品種間で比較したものである。
【０００３】
【非特許文献１】
井上−村山美穂ら、「イヌにおけるドーパミン受容体Ｄ４遺伝子多型と行動特性との関連」、ＤＮＡ多型、株式会社 東洋書店、２００２年６月１５日、Ｖｏｌ．１０、ｐ．６４−７０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記非特許文献１は、イヌのドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン３領域の多型についてのものであった。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、所定の行動特性を発現しやすい犬を容易に選別することができる犬の選別方法、及びその選別方法に用いられるＰＣＲプライマー及びポリヌクレオチドプローブを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の犬の選別方法は、所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号２の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の発明の犬の選別方法は、所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号３の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明の犬の選別方法は、請求項１又は請求項２に記載の犬の選別方法において、犬の個体から前記エクソン１の対立遺伝子を含むＤＮＡを抽出し、前記エクソン１の対立遺伝子の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後、得られたＰＣＲ産物の長さに基づいて前記エクソン１の対立遺伝子を調べることを特徴とするものである。
請求項４に記載の発明のＰＣＲプライマーは、請求項３に記載の犬の選別方法に使用される一対のＰＣＲプライマーであって、該一対のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列、又はそれぞれ配列番号７と相補的な塩基配列及び配列番号８と相補的な塩基配列であることを特徴とする。
請求項５に記載の発明のポリヌクレオチドプライマーは、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の遺伝子型に基づいて犬を選別する犬の選別方法に使用されるポリヌクレオチドプローブであって、配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を含有することを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。前記及び以下の記載における実質的に同一とは、一塩基多型（single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰ）又は異種生物における対応する遺伝子で見られるＳＮＰのことをいう。以下、配列番号ｎ（ｎ＝１〜６のいずれか）で表される塩基配列又はその配列と実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチドを、ＰＮｎ（ポリヌクレオチドｎ）と記載する。
【００１１】
ＰＮ２及びＰＮ３は、いずれもビーグル犬のドーパミン受容体Ｄ４（ＤＲＤ４）遺伝子のエクソン１を構成する。即ち、ＰＮ２とＰＮ３とは、前記エクソン１における遺伝子多型の関係にある。ＰＮ１は、ＰＮ２の５’末端から６１〜８４番目に位置する。ＰＮ３は、ＰＮ２の６１〜８４番目の２４塩基、即ちＰＮ１の配列が欠失したものであり、ＰＮ２のショートフォーム（Ｓ）である。ＰＮ１〜ＰＮ３の塩基配列は、いずれもイヌの各品種間でかなり保存された配列であり、ＳＮＰを越えるような配列の差は見られない。
【００１２】
ＰＮ５及びＰＮ６は、いずれも同ビーグル犬のＤＲＤ４遺伝子のイントロン２を構成する。即ち、ＰＮ５とＰＮ６とは、前記イントロン２における遺伝子多型の関係にある。ＰＮ４は、ＰＮ５の５’末端から５０〜６６番目に位置する。ＰＮ６は、ＰＮ５の５０〜６６番目に位置する１７塩基、即ちＰＮ４の配列が欠失したものであり、ＰＮ５のショートフォーム（Ｐ）である。ＰＮ４〜ＰＮ６の塩基配列は、いずれもイヌの各品種間でかなり保存された配列であり、ＳＮＰを越えるような配列の差は見られない。
【００１３】
なお、これらＰＮ１〜ＰＮ６は、種々のベクターやプラスミド内に挿入されていてもよい。また、前記ベクターやプラスミドを種々の宿主細胞内に導入した形質転換体として利用してもよい。また、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡとして利用することもできる。また、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション法等に用いられる選抜用又は識別用のプローブとして利用することもできる。このとき、これらのポリヌクレオチドは通常、放射性同位体や蛍光色素で標識化して使用される。また、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１４】
実施形態のポリペプチドは、前記ＰＮ１〜ＰＮ６によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。これらのポリペプチドは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は該モノクローナル抗体用のハイブリドーマを作製するために利用することができる。特に、ＰＮ１〜ＰＮ３によりコードされるポリペプチドに対する抗体は、ＤＲＤ４タンパクの発現に関する知見を得るために利用され得る。また、プロテインチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１５】
前記ＤＲＤ４遺伝子がコードするＤＲＤ４タンパクは、神経伝達物質であるドーパミンやセロトニンと結合して神経伝達を司り精神作用の発現に関与するＧタンパク共役型受容体であり、７回貫通部位を持つ細胞膜タンパクである。このＤＲＤ４タンパクのＮ末端は、前記ＤＲＤ４遺伝子の５’末端側に位置するエクソン１（ＰＮ２又はＰＮ３）によりコードされている。また、前記エクソン１の３’末端のすぐ下流には、前記ＰＮ５又はＰＮ６からなるイントロン２が位置している。
【００１６】
実施形態の有用犬は、人に有益な行動特性を発現する遺伝的資質を備えたイヌの個体である。この有用犬としては、番犬や愛玩犬等のペット、又は盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬、警察犬、聴導犬、牧羊犬、猟犬等のサービスドッグが挙げられる。これらの有用犬は、飼い主又は利用者のニーズに即した行動特性を発現する遺伝的資質を備えたイヌの個体が適宜選択して用いられる。前記遺伝的資質は、下記表１及び表２に示されるような種々の行動特性に関する評価項目を評価した結果に基づいて決定される。これらの遺伝的資質は、主として遺伝的（先天的）に決定されている。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
前記表１に示される評価項目は、盲導犬等の各種イヌの訓練士が訓練前のイヌの個体の行動特性を評価する際に重視する項目である。前記表２に示されるＨａｒｔ＆Ｈａｒｔの評価項目は獣医師及びイヌの訓練士へのアンケートに基づく行動特性評価（１０段階評価）を行った文献（Hart BL, Hart LA: The perfect puppy. W.H.Freeman and Company(USA)1988、「増井久代訳、増井光子監修：生涯の友を得る愛犬選び−一目でわかる犬の性格と行動−。日経サイエンス社（東京）,1992」）で挙げられたものであり、前記田名部と山崎の評価項目は同様に５段階の行動特性評価を行った文献（田名部雄一、山崎薫、評定依頼調査に基づく犬品種による行動特性の違い−家庭犬への適性を中心に−、獣医畜産新報 ＪＶＭ、Ｖｏｌ．５４、Ｎｏ．１、２００１年１月号、９−１４頁）で挙げられたものである。
【００１９】
この有用犬としてペットを選択する際には、例えば番犬の場合には主としてＮｏ．２４，２５，４１の評価に優れたイヌの個体が選択され、愛玩犬の場合には主としてＮｏ．３０，５２の評価に優れたイヌの個体が選択され、その他飼い主の好みや相性等に適う評価項目が適宜考慮される。一方、サービスドッグの場合には、求められている役割に適した評価項目に優れたイヌの個体が適宜選択される。例えば盲導犬、介助犬、聴導犬等の福祉犬の場合には、主としてＮｏ．１〜１５から選ばれる少なくとも１種、好ましくはＮｏ．１〜１５全ての評価に優れたイヌの個体が選択される。その他、各種有用犬と、その有用犬に求められる評価項目との関係を下記表３に示す。
【００２０】
【表３】
これら有用犬において、前記ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１は、対立遺伝子の両方にＰＮ３（ショートフォーム（Ｓ））を持つホモ接合体（Ｓ／Ｓ）、一方にＰＮ３を持ち他方にＰＮ２（ロングフォーム（Ｌ））を持つヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）、又は両方にＰＮ２を持つホモ接合体（Ｌ／Ｌ）の３種類が存在する。さらに、同有用犬において、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２は、対立遺伝子の両方にＰＮ６（ショートフォーム（Ｐ））を持つホモ接合体（Ｐ／Ｐ）、一方にＰＮ６を持ち他方にＰＮ５（ロングフォーム（Ｑ））を持つヘテロ接合体（Ｐ／Ｑ）、又は両方にＰＮ５を持つホモ接合体（Ｑ／Ｑ）の３種類が存在する。
【００２１】
前記エクソン１及びイントロン２の遺伝子多型（ＳとＬ、及びＰとＱ）は、それぞれイヌの個体の行動特性と深い関連性を有している。例えば、前記ホモ接合体（Ｓ／Ｓ）及びヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のイヌの個体は、対立遺伝子の両方にＰＮ２を持つホモ接合体（Ｌ／Ｌ）のイヌの個体よりも表１の評価項目のＮｏ．２，４，５，６，１５に優れており、盲導犬等の福祉犬に適している。また、前記ＳとＬとを比較すると、Ｓを持つ個体は前記評価項目のＮｏ．２，３，４，５，６，７，１２，１５，５１，５２の行動特性を発現しやすく、Ｌを持つ個体はＮｏ．２４，４１，４２，４３，４４の行動特性を発現しやすい。同様に、前記ＰとＱとを比較すると、Ｐを持つ個体はＮｏ．４９の行動特性を発現しやすく、Ｑを持つ個体はＮｏ．２１，２２の行動特性を発現しやすい。つまり、Ｓを持つ個体は特に訓練性能に優れた行動特性を発現しやすいことからサービスドッグ（好ましくは福祉犬、災害救助犬、麻薬探知犬、牧羊犬）に適しており、逆にＬを持つ個体は攻撃性が高い行動特性を発現しやすいことから番犬に適している。同様に、Ｐを持つ個体は社会性に優れた行動特性を発現しやすいことからサービスドッグ（好ましくは福祉犬、災害救助犬、麻薬探知犬、牧羊犬）に適しており、逆にＱを持つ個体は攻撃性が高い行動特性を発現しやすいことから番犬に適している。
【００２２】
この有用犬の選別方法は、最も簡便には以下の方法で行われる。即ち、イヌの個体からＤＲＤ４遺伝子のエクソン１又はイントロン２の対立遺伝子を含むゲノムＤＮＡを抽出し、該対立遺伝子（エクソン１又はイントロン２）の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応を行い、得られたＰＣＲ産物の長さを電気泳動で確認する。なお、前記エクソン１の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーとしては、ＰＮ２の５’末端から６１〜８４番目の配列（ＰＮ１）を増幅するために設計され得る任意の組み合わせが採用され得るが、例えば配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーが好適に用いられる。前記イントロン２の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーとしては、ＰＮ５の５’末端から５０〜６６番目の配列（ＰＮ４）を増幅するために設計され得る任意の組み合わせが採用され得るが、例えば配列番号９及び配列番号１０で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーが好適に用いられる。また、ＰＣＲ法以外にも、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法又は直接塩基配列を決定することにより前記対立遺伝子を調べることもできる。
【００２３】
実施形態のサービスドッグは、盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬、警察犬、聴導犬、牧羊犬又は猟犬として優れた遺伝的資質を備えたイヌの個体である。特に、これらのサービスドッグとしては、訓練性能に優れた行動特性を発現しやすいことから、前記Ｓ又はＰを持つイヌの個体であるのが好ましい。即ち、このサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体、又はＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体である。また、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１にＰＮ３を持つとともに、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２にＰＮ６を持つイヌの個体であるのが最も好ましい。
【００２４】
このサービスドッグに適したイヌの品種としては、非特許文献１のＤＲＤ４遺伝子のエクソン３に関する研究結果によると、攻撃性が少なく訓練性能に優れた遺伝的資質を備えたＡ、Ｂ及びＣグループに属する品種が好適に用いられ、エクソン３についての対立遺伝子４９８を持たない品種が特に好適に用いられる。前記Ａグループに属する品種としては、ボクサー、ヨークシャー・テリア、ジャーマン・シェパード・ドッグ、ビーグル、ゴールデン・レトリーバー、バセット・ハウンド、ポメラニアン等が挙げられ、そのうち、ボクサー、ジャーマン・シェパード・ドッグ、ビーグル又はゴールデン・レトリーバーが好適に用いられる。Ｂグループに属する品種としては、ブルドッグ、シェットランド・シープドッグ、ミニチュア・シュナウザー、コッカー・スパニエル、オールド・イングリッシュ・シープドッグ、ラブラドール・レトリーバー、チワワ、トイ・プードル、マルチーズ、コリー、パグ等が挙げられ、そのうち、ブルドッグ、シェットランド・シープドッグ、ミニチュア・シュナウザー、コッカー・スパニエル、オールド・イングリッシュ・シープドッグ、ラブラドール・レトリーバー、トイ・プードル、コリー又はパグが好適に用いられる。Ｃグループに属する品種としては、スタンダード・プードル、ダルメシアン、ウェルシュ・コーギー・ペンブローク、ドーベルマン等が挙げられる。
【００２５】
これらのイヌの品種のうち、伝統的にサービスドッグとしての有用性が高く評価されていることから、Ｂグループ内のイヌが好適に用いられ、その中でもラブラドール・レトリーバー、シェットランド・シープドッグ、オールド・イングリッシュ・シープドッグ又はコリーが特に好適であり、ラブラドール・レトリーバーが最も好適に用いられる。また、伝統的な観点から警察犬としてシェパードを用いてもよい。また、雑種、特に上記各品種間の雑種、好ましくは上記各品種間の第一世代の雑種（Ｆ１）を用いてもよく、この場合には目的とするサービスドッグを安価に提供することが可能となる。
【００２６】
実施形態のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体を選別するものである。そして、選別されたイヌの個体は、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又はヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のいずれかの遺伝子型であって、前記人に有益な遺伝的資質を備えていることから、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を受けさせるのに適している。また、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体は、サービスドッグの育種のための親犬として利用され、特に雄イヌは種イヌとしての高い価値を有する。
【００２７】
或いは、前記サービスドッグの選別方法として、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を選別してもよい。特に、前記ＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体は、サービスドッグの育種のための親犬として利用され、特に雄イヌは種イヌとしての高い価値を有する。また、前記サービスドッグの選別方法として、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１及びイントロン２の２種類の対立遺伝子を調べ、エクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなり、イントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を選別するのが最も好ましい。これらのサービスドッグの選別方法は、上記有用犬の選別方法と同様の操作（ＰＣＲ法及び電気泳動染色）を行うことによって、前記対立遺伝子の遺伝子型を調べ、その遺伝子型に基づいてサービスドッグとして有用なイヌの個体を選別するのが最も簡便である。
【００２８】
実施形態のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体を育種する方法である。そして、育種されたイヌの個体は、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又はヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のいずれかであって、前記人に有益な遺伝的資質を備えていることから、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を受けさせるのに適している。また、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体は、さらなるサービスドッグの育種のために利用され得る。このサービスドッグの育種方法としては、上記サービスドッグの選別方法によって選別されたＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又は前記サービスドッグの育種方法によって育種されたＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体（成犬）を、少なくとも一方の親犬として用いるものである。
【００２９】
或いは、前記サービスドッグの育種方法として、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を育種してもよい。特に、前記ＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体は、さらなるサービスドッグの育種のために利用され得る。このサービスドッグの育種方法としては、上記サービスドッグの選別方法によって選抜されたＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）又は前記サービスドッグの育種方法によって育種されたＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体（成犬）を、少なくとも一方の親犬として用いるものである。また、前記サービスドッグの育種方法として、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるとともに、イントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を育種するのが最も好ましい。
【００３０】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 実施形態のＰＮ２とＰＮ３とは、イヌのＤＲＤ４遺伝子のエクソン１において、新規な塩基配列であるＰＮ１の有無に起因する遺伝子多型である。これらＰＮ１〜ＰＮ３は、いずれもイヌの行動特性と深い関連を有していることから、人に有益な遺伝的資質を備えたイヌの個体の選別及び育種に利用することができる。また、前記ＰＮ１〜ＰＮ３によってコードされるポリペプチドについても全く同様である。また、ＰＮ１はＤＲＤ４遺伝子のエクソン１で発見された新規な塩基配列であることから、ＰＮ２も新規な塩基配列である。
【００３１】
・ 実施形態の有用犬の選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１又はイントロン２の対立遺伝子を調べ、その対立遺伝子の遺伝子型に基づいて飼い主又は利用者にとって有用であるか否かを識別するものである。また、前記エクソン１及びイントロン２の２種類の対立遺伝子を調べ、それらの対立遺伝子の遺伝子型に基づいて有用であるか否かを識別してもよい。これらの有用犬の選別方法は、エクソン１又はイントロン２の遺伝子多型と、イヌの行動特性との関連性についての科学的根拠に基づいた選別方法であることから、飼い主又は利用者のニーズに適合するイヌの個体を極めて的確に選別して彼らに提供することができる。さらに、これらの選別方法では、有用犬を飼い主又は利用者に提供する前にその相性等を判別できることから、提供後のミスマッチを容易に低減させることができる。また、この選別方法としてＰＣＲ法を用いる場合には、著しく容易かつ短時間に有用犬を選別することができて便利である。
【００３２】
・ 実施形態のサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体である。このサービスドッグは、他のイヌ、食べ物及び臭いに対する過度の執着がなく、過度の興奮が起こりにくく、適度な集中力で訓練等に取り組めるうえ、人の動きに従順であるといったサービスドッグに適した行動特性を発現するための遺伝的資質を備えている。また、実施形態の別のサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体である。このサービスドッグは、攻撃性や反抗性が少なく社会性に富んだ行動特性を発現しやすいことから、サービスドッグに適した行動特性を発現するための遺伝的資質を備えている。このため、これらのサービスドッグは、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を行う際に、訓練士による指導を集中して受けることができることから、潜在的に優れたサービスドッグになる可能性が高い。さらに、これらのサービスドッグは、サービスドッグになるための訓練開始後に不合格となるおそれが少ないうえ、訓練期間の短縮を図ることが容易である。
【００３３】
・ 実施形態のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなる個体を選別するものである。また、実施形態の別のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなる個体を選別するものである。このため、これらの選別方法では、極めて簡単な方法によりサービスドッグとしての優れた遺伝的資質を備えた個体を選別することが可能である。さらに、これらの選別方法では、盲導犬等のサービスドッグに訓練する前にサービスドッグとしての資質を判別できることから、訓練にかかる時間と手間を容易に低減させることができる。加えて、サービスドッグになるための訓練開始後に不合格となる個体数を減らすことが容易であることから、サービスドッグの供給量を容易に増大させることが可能である。特に、訓練期間が長く需要量に対する供給量が少ない盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬又は警察犬の選別に利用するとよい。また、これらサービスドッグの選別方法としてＰＣＲ法を用いる場合には、著しく容易かつ短時間にサービスドッグを選別することができて便利である。
【００３４】
・ 実施形態のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の両方がＰＮ３からなるホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体を、少なくとも一方の親犬として用いることによって行われる。また、実施形態の別のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の両方がＰＮ６からなるホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体を、少なくとも一方の親犬として用いることによって行われる。このため、これらの育種方法では、前記ホモ接合体（Ｓ／Ｓ又はＰ／Ｐ）のイヌの個体を用いることにより、人に有益な遺伝的資質を備えたサービスドッグ（Ｓ／Ｓ、Ｓ／Ｌ、Ｐ／Ｐ又はＰ／Ｑ）を容易かつ確実に育種することができる。また、前記親犬、特に雄イヌは、繰返し何度でも育種のために利用できることから、サービスドッグの供給量を容易に増大させることが可能である。
【００３５】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜ＰＮ２，３の同定＞
複数のビーグル犬から口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡに対し、ヒトのＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、前記一対のＰＣＲプライマーは配列番号７及び８で示される塩基配列から構成されている。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行ったところ、２種類の長さのＰＣＲ産物、即ちロングフォーム（Ｌ）とショートフォーム（Ｓ）とが存在していた。これら２種類のＰＣＲ産物それぞれについて塩基配列を調べたところ、前記Ｌは配列番号２で表される塩基配列であり、前記Ｓは配列番号３で表される塩基配列であることが確認された。なお、配列番号２の５’末端から６１〜８４番目の配列（ＰＮ１）は、新規な配列であることも確認された。
【００３６】
＜ＰＮ４，５の同定＞
複数のビーグル犬から口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡに対し、ヒトのＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の配列を増幅するための一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、前記一対のＰＣＲプライマーは配列番号９及び１０で示される塩基配列から構成されている。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行ったところ、２種類の長さのＰＣＲ産物が存在していた。これら２種類のＰＣＲ産物それぞれについて塩基配列を調べたところ、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列であることが確認された。なお、配列番号５の５’末端から５０〜６６番目の配列（ＰＮ４）は、新規な配列であることも確認された。
【００３７】
＜ＰＮ２，３と行動特性との関連についての検証１＞
関西盲導犬協会のラブラドール・レトリーバー７０頭の口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られた各個体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号７及び８で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を判定した結果、Ｓ／Ｓ（２９個体）、Ｓ／Ｌ（２９個体）、Ｌ／Ｌ（１２個体）の３種類に分類された。
【００３８】
一方、上記表１に示される行動特性についての評価項目（Ｎｏ．１〜１５）のそれぞれについて、盲導犬の訓練士２名による５段階評価を行うことにより、イヌの各個体に対して評価項目毎のスコアを付けた。前記５段階評価は、盲導犬としての資質、即ち人に有益であるかという観点から、とても良い＝５点、やや良い＝４点、どちらとも言えない＝３点、やや問題あり＝２点、とても問題あり＝１点という評価基準に従って行われた。
【００３９】
次に、各個体をＳ／Ｓ、Ｓ／Ｌ、Ｌ／Ｌの３種類のグループに分け、前記Ｎｏ．１〜１５の各評価項目について、各遺伝子型に属する個体数と、それら個体のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４の遺伝子型欄に記載した。一方、Ｓ／Ｓ及びＳ／Ｌの個体（Ｓを有する個体からなるグループ）と、Ｌ／Ｌの個体（Ｓを有しない個体からなるグループ）とを別々のグループに分け、同様に分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４のＳの有無欄に記載した。また、Ｓ／Ｓ（Ｌを有しない個体からなるグループ）と、Ｓ／Ｌ及びＬ／Ｌの個体（Ｌを有する個体からなるグループ）とを別々のグループに分け、同様に分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４のＬの有無欄に記載した。
【００４０】
【表４】
なお、表４中及び以下の分散分析の解析結果において、有意差が検出されたものについては、その危険率が５％未満の場合には（＊）、１％未満の場合には（＊＊）、０．１％未満の場合には（＊＊＊）マークを付す。その結果、Ｎｏ．２，４，５，６，７，１５の６種類の項目では、遺伝子型及びＬの有無でのグループ分けにおいて有意差が検出された。また、Ｎｏ．３，５，６，１２，１５の５種類の項目ではＳの有無でのグループ分けにおいて有意差が検出された。さらに、前記遺伝子型でのグループ分けにおいて有意差が検出された６種類の項目のそれぞれについて、Ｓ／Ｓ、Ｓ／Ｌ、Ｌ／Ｌのいずれの遺伝子型のスコアが高いかを比較した結果を表５の遺伝子型欄に示すとともに、その結果より判断されるＳ及びＬの有用性についての総合判定を同表の対立遺伝子欄に示す。
【００４１】
【表５】
表５の結果より、Ｓを有するイヌの個体が盲導犬としての優れた遺伝的資質を備えていることが示された。さらに、Ｓ／Ｓのホモ接合体がＳ／Ｌのヘテロ接合体よりも優れていることが確認された。特に、これら６種類の項目に関しては、いずれもＳ／Ｓの個体のスコアが高い傾向にあり、他のイヌ、食べ物、臭いに対しての執着及び興奮性が低く、集中力及び服従性が高いことが確認された。また、データは示さないが、Ｎｏ．３の項目でもＳがＬよりも有用であることも分かった。一方、盲導犬としての訓練の合否と、上記各評価項目との関係を調べるための予備実験を行ったところ、盲導犬としての訓練に合格したイヌの個体は、不合格であったイヌの個体と比較して、Ｎｏ．６，７のスコアが有意に高かったことが示された。なお、この試験は盲導犬を用いて行われたものであるが、得られた試験結果は、盲導犬以外の犬（サービスドッグ及びペット）でも全く同様に解釈され得る。
【００４２】
＜ＰＮ２，３と行動特性との関連についての検証２＞
獣医師及びイヌの訓練士へのアンケートに基づく行動特性評価（Ｈａｒｔ＆Ｈａｒｔ及び田名部と山崎）がなされている約３０品種数百頭（１品種４個体以上）のイヌの血液又は口腔内細胞を採取した。それらの細胞からカラム法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号７及び８で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を確定した。次に、各品種について、前記確定された遺伝子型を、Ｓを有する個体からなるグループと、Ｌを有する個体からなるグループとにグループ分けした後、各グループに属する個体数と、その個体が属する品種のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。結果を表６に示す。
【００４３】
＜ＰＮ５，６と行動特性との関連についての検証＞
獣医師及びイヌの訓練士へのアンケートに基づく行動特性評価（Ｈａｒｔ＆Ｈａｒｔ及び田名部と山崎）がなされている約２５品種数百頭（１品種４個体以上）のイヌの血液又は口腔内細胞を採取した。それらの細胞からカラム法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号９及び１０で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を確定した。次に、各品種について、前記確定された遺伝子型を、Ｐを有する個体からなるグループと、Ｑを有する個体からなるグループとにグループ分けした後、各グループに属する個体数と、それら個体が属する品種のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。結果を表６に示す。
【００４４】
【表６】
表６の結果より、Ｓを有する個体は穏やかな行動特性を発現しやすく、Ｌを有する個体は攻撃的な行動特性を発現しやすいという傾向が見られる。同様に、Ｐを有する個体は穏やかな行動特性を発現しやすく、Ｑを有する個体は攻撃的な行動特性を発現しやすいという傾向も見られる。
【００４９】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 犬の選別方法に用いられる犬の選別用キットであって、前記一対のＰＣＲプライマーを含有することを特徴とする犬の選別用キット。
【００５０】
【発明の効果】
以上詳述したように、各請求項に記載の発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１から請求項３に記載の発明の犬の選別方法によれば、所定の行動特性を発現しやすい犬の個体を容易に選別することができる。請求項４のＰＣＲプライマー及び請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブは、犬の選別方法に使用することができる。
【００５１】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
この発明は、遺伝子多型と行動特性との関係に基づいて、犬を選別する方法に関するものである。さらには、前記犬の選別方法に使用されるＰＣＲプライマー及びポリヌクレオチドプローブに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の有用犬の選別方法としては、例えば、イヌにおけるドーパミン受容体Ｄ４遺伝子多型と行動特性との関連について報告された文献が知られている（非特許文献１参照）。この文献は、イヌのドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン３領域における９種類の対立遺伝子の多型と、行動特性の評価との関連性を、品種間で比較したものである。
【０００３】
【非特許文献１】
井上−村山美穂ら、「イヌにおけるドーパミン受容体Ｄ４遺伝子多型と行動特性との関連」、ＤＮＡ多型、株式会社 東洋書店、２００２年６月１５日、Ｖｏｌ．１０、ｐ．６４−７０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記非特許文献１は、イヌのドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン３領域の多型についてのものであった。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、所定の行動特性を発現しやすい犬を容易に選別することができる犬の選別方法、及びその選別方法に用いられるＰＣＲプライマー及びポリヌクレオチドプローブを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の犬の選別方法は、所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号２の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の発明の犬の選別方法は、所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号３の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明の犬の選別方法は、請求項１又は請求項２に記載の犬の選別方法において、犬の個体から前記エクソン１の対立遺伝子を含むＤＮＡを抽出し、前記エクソン１の対立遺伝子の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後、得られたＰＣＲ産物の長さに基づいて前記エクソン１の対立遺伝子を調べることを特徴とするものである。
請求項４に記載の発明のＰＣＲプライマーは、請求項３に記載の犬の選別方法に使用される一対のＰＣＲプライマーであって、該一対のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列、又はそれぞれ配列番号７と相補的な塩基配列及び配列番号８と相補的な塩基配列であることを特徴とする。
請求項５に記載の発明のポリヌクレオチドプライマーは、ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の遺伝子型に基づいて犬を選別する犬の選別方法に使用されるポリヌクレオチドプローブであって、配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を含有することを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。前記及び以下の記載における実質的に同一とは、一塩基多型（single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰ）又は異種生物における対応する遺伝子で見られるＳＮＰのことをいう。以下、配列番号ｎ（ｎ＝１〜６のいずれか）で表される塩基配列又はその配列と実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチドを、ＰＮｎ（ポリヌクレオチドｎ）と記載する。
【００１１】
ＰＮ２及びＰＮ３は、いずれもビーグル犬のドーパミン受容体Ｄ４（ＤＲＤ４）遺伝子のエクソン１を構成する。即ち、ＰＮ２とＰＮ３とは、前記エクソン１における遺伝子多型の関係にある。ＰＮ１は、ＰＮ２の５’末端から６１〜８４番目に位置する。ＰＮ３は、ＰＮ２の６１〜８４番目の２４塩基、即ちＰＮ１の配列が欠失したものであり、ＰＮ２のショートフォーム（Ｓ）である。ＰＮ１〜ＰＮ３の塩基配列は、いずれもイヌの各品種間でかなり保存された配列であり、ＳＮＰを越えるような配列の差は見られない。
【００１２】
ＰＮ５及びＰＮ６は、いずれも同ビーグル犬のＤＲＤ４遺伝子のイントロン２を構成する。即ち、ＰＮ５とＰＮ６とは、前記イントロン２における遺伝子多型の関係にある。ＰＮ４は、ＰＮ５の５’末端から５０〜６６番目に位置する。ＰＮ６は、ＰＮ５の５０〜６６番目に位置する１７塩基、即ちＰＮ４の配列が欠失したものであり、ＰＮ５のショートフォーム（Ｐ）である。ＰＮ４〜ＰＮ６の塩基配列は、いずれもイヌの各品種間でかなり保存された配列であり、ＳＮＰを越えるような配列の差は見られない。
【００１３】
なお、これらＰＮ１〜ＰＮ６は、種々のベクターやプラスミド内に挿入されていてもよい。また、前記ベクターやプラスミドを種々の宿主細胞内に導入した形質転換体として利用してもよい。また、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡとして利用することもできる。また、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション法等に用いられる選抜用又は識別用のプローブとして利用することもできる。このとき、これらのポリヌクレオチドは通常、放射性同位体や蛍光色素で標識化して使用される。また、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１４】
実施形態のポリペプチドは、前記ＰＮ１〜ＰＮ６によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。これらのポリペプチドは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は該モノクローナル抗体用のハイブリドーマを作製するために利用することができる。特に、ＰＮ１〜ＰＮ３によりコードされるポリペプチドに対する抗体は、ＤＲＤ４タンパクの発現に関する知見を得るために利用され得る。また、プロテインチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１５】
前記ＤＲＤ４遺伝子がコードするＤＲＤ４タンパクは、神経伝達物質であるドーパミンやセロトニンと結合して神経伝達を司り精神作用の発現に関与するＧタンパク共役型受容体であり、７回貫通部位を持つ細胞膜タンパクである。このＤＲＤ４タンパクのＮ末端は、前記ＤＲＤ４遺伝子の５’末端側に位置するエクソン１（ＰＮ２又はＰＮ３）によりコードされている。また、前記エクソン１の３’末端のすぐ下流には、前記ＰＮ５又はＰＮ６からなるイントロン２が位置している。
【００１６】
実施形態の有用犬は、人に有益な行動特性を発現する遺伝的資質を備えたイヌの個体である。この有用犬としては、番犬や愛玩犬等のペット、又は盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬、警察犬、聴導犬、牧羊犬、猟犬等のサービスドッグが挙げられる。これらの有用犬は、飼い主又は利用者のニーズに即した行動特性を発現する遺伝的資質を備えたイヌの個体が適宜選択して用いられる。前記遺伝的資質は、下記表１及び表２に示されるような種々の行動特性に関する評価項目を評価した結果に基づいて決定される。これらの遺伝的資質は、主として遺伝的（先天的）に決定されている。
【００１７】
【表１】
【表２】
【００１９】
この有用犬としてペットを選択する際には、例えば番犬の場合には主としてＮｏ．２４，２５，４１の評価に優れたイヌの個体が選択され、愛玩犬の場合には主としてＮｏ．３０，５２の評価に優れたイヌの個体が選択され、その他飼い主の好みや相性等に適う評価項目が適宜考慮される。一方、サービスドッグの場合には、求められている役割に適した評価項目に優れたイヌの個体が適宜選択される。例えば盲導犬、介助犬、聴導犬等の福祉犬の場合には、主としてＮｏ．１〜１５から選ばれる少なくとも１種、好ましくはＮｏ．１〜１５全ての評価に優れたイヌの個体が選択される。その他、各種有用犬と、その有用犬に求められる評価項目との関係を下記表３に示す。
【００２０】
【表３】
【００２１】
前記エクソン１及びイントロン２の遺伝子多型（ＳとＬ、及びＰとＱ）は、それぞれイヌの個体の行動特性と深い関連性を有している。例えば、前記ホモ接合体（Ｓ／Ｓ）及びヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のイヌの個体は、対立遺伝子の両方にＰＮ２を持つホモ接合体（Ｌ／Ｌ）のイヌの個体よりも表１の評価項目のＮｏ．２，４，５，６，１５に優れており、盲導犬等の福祉犬に適している。また、前記ＳとＬとを比較すると、Ｓを持つ個体は前記評価項目のＮｏ．２，３，４，５，６，７，１２，１５，５１，５２の行動特性を発現しやすく、Ｌを持つ個体はＮｏ．２４，４１，４２，４３，４４の行動特性を発現しやすい。同様に、前記ＰとＱとを比較すると、Ｐを持つ個体はＮｏ．４９の行動特性を発現しやすく、Ｑを持つ個体はＮｏ．２１，２２の行動特性を発現しやすい。つまり、Ｓを持つ個体は特に訓練性能に優れた行動特性を発現しやすいことからサービスドッグ（好ましくは福祉犬、災害救助犬、麻薬探知犬、牧羊犬）に適しており、逆にＬを持つ個体は攻撃性が高い行動特性を発現しやすいことから番犬に適している。同様に、Ｐを持つ個体は社会性に優れた行動特性を発現しやすいことからサービスドッグ（好ましくは福祉犬、災害救助犬、麻薬探知犬、牧羊犬）に適しており、逆にＱを持つ個体は攻撃性が高い行動特性を発現しやすいことから番犬に適している。
【００２２】
この有用犬の選別方法は、最も簡便には以下の方法で行われる。即ち、イヌの個体からＤＲＤ４遺伝子のエクソン１又はイントロン２の対立遺伝子を含むゲノムＤＮＡを抽出し、該対立遺伝子（エクソン１又はイントロン２）の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応を行い、得られたＰＣＲ産物の長さを電気泳動で確認する。なお、前記エクソン１の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーとしては、ＰＮ２の５’末端から６１〜８４番目の配列（ＰＮ１）を増幅するために設計され得る任意の組み合わせが採用され得るが、例えば配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーが好適に用いられる。前記イントロン２の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーとしては、ＰＮ５の５’末端から５０〜６６番目の配列（ＰＮ４）を増幅するために設計され得る任意の組み合わせが採用され得るが、例えば配列番号９及び配列番号１０で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーが好適に用いられる。また、ＰＣＲ法以外にも、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法又は直接塩基配列を決定することにより前記対立遺伝子を調べることもできる。
【００２３】
実施形態のサービスドッグは、盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬、警察犬、聴導犬、牧羊犬又は猟犬として優れた遺伝的資質を備えたイヌの個体である。特に、これらのサービスドッグとしては、訓練性能に優れた行動特性を発現しやすいことから、前記Ｓ又はＰを持つイヌの個体であるのが好ましい。即ち、このサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体、又はＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体である。また、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１にＰＮ３を持つとともに、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２にＰＮ６を持つイヌの個体であるのが最も好ましい。
【００２４】
このサービスドッグに適したイヌの品種としては、非特許文献１のＤＲＤ４遺伝子のエクソン３に関する研究結果によると、攻撃性が少なく訓練性能に優れた遺伝的資質を備えたＡ、Ｂ及びＣグループに属する品種が好適に用いられ、エクソン３についての対立遺伝子４９８を持たない品種が特に好適に用いられる。前記Ａグループに属する品種としては、ボクサー、ヨークシャー・テリア、ジャーマン・シェパード・ドッグ、ビーグル、ゴールデン・レトリーバー、バセット・ハウンド、ポメラニアン等が挙げられ、そのうち、ボクサー、ジャーマン・シェパード・ドッグ、ビーグル又はゴールデン・レトリーバーが好適に用いられる。Ｂグループに属する品種としては、ブルドッグ、シェットランド・シープドッグ、ミニチュア・シュナウザー、コッカー・スパニエル、オールド・イングリッシュ・シープドッグ、ラブラドール・レトリーバー、チワワ、トイ・プードル、マルチーズ、コリー、パグ等が挙げられ、そのうち、ブルドッグ、シェットランド・シープドッグ、ミニチュア・シュナウザー、コッカー・スパニエル、オールド・イングリッシュ・シープドッグ、ラブラドール・レトリーバー、トイ・プードル、コリー又はパグが好適に用いられる。Ｃグループに属する品種としては、スタンダード・プードル、ダルメシアン、ウェルシュ・コーギー・ペンブローク、ドーベルマン等が挙げられる。
【００２５】
これらのイヌの品種のうち、伝統的にサービスドッグとしての有用性が高く評価されていることから、Ｂグループ内のイヌが好適に用いられ、その中でもラブラドール・レトリーバー、シェットランド・シープドッグ、オールド・イングリッシュ・シープドッグ又はコリーが特に好適であり、ラブラドール・レトリーバーが最も好適に用いられる。また、伝統的な観点から警察犬としてシェパードを用いてもよい。また、雑種、特に上記各品種間の雑種、好ましくは上記各品種間の第一世代の雑種（Ｆ１）を用いてもよく、この場合には目的とするサービスドッグを安価に提供することが可能となる。
【００２６】
実施形態のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体を選別するものである。そして、選別されたイヌの個体は、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又はヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のいずれかの遺伝子型であって、前記人に有益な遺伝的資質を備えていることから、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を受けさせるのに適している。また、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体は、サービスドッグの育種のための親犬として利用され、特に雄イヌは種イヌとしての高い価値を有する。
【００２７】
或いは、前記サービスドッグの選別方法として、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を選別してもよい。特に、前記ＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体は、サービスドッグの育種のための親犬として利用され、特に雄イヌは種イヌとしての高い価値を有する。また、前記サービスドッグの選別方法として、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１及びイントロン２の２種類の対立遺伝子を調べ、エクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなり、イントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を選別するのが最も好ましい。これらのサービスドッグの選別方法は、上記有用犬の選別方法と同様の操作（ＰＣＲ法及び電気泳動染色）を行うことによって、前記対立遺伝子の遺伝子型を調べ、その遺伝子型に基づいてサービスドッグとして有用なイヌの個体を選別するのが最も簡便である。
【００２８】
実施形態のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体を育種する方法である。そして、育種されたイヌの個体は、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又はヘテロ接合体（Ｓ／Ｌ）のいずれかであって、前記人に有益な遺伝的資質を備えていることから、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を受けさせるのに適している。また、前記ＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体は、さらなるサービスドッグの育種のために利用され得る。このサービスドッグの育種方法としては、上記サービスドッグの選別方法によって選別されたＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）又は前記サービスドッグの育種方法によって育種されたＰＮ３のホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体（成犬）を、少なくとも一方の親犬として用いるものである。
【００２９】
或いは、前記サービスドッグの育種方法として、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を育種してもよい。特に、前記ＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体は、さらなるサービスドッグの育種のために利用され得る。このサービスドッグの育種方法としては、上記サービスドッグの選別方法によって選抜されたＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）又は前記サービスドッグの育種方法によって育種されたＰＮ６のホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体（成犬）を、少なくとも一方の親犬として用いるものである。また、前記サービスドッグの育種方法として、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるとともに、イントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体を育種するのが最も好ましい。
【００３０】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 実施形態のＰＮ２とＰＮ３とは、イヌのＤＲＤ４遺伝子のエクソン１において、新規な塩基配列であるＰＮ１の有無に起因する遺伝子多型である。これらＰＮ１〜ＰＮ３は、いずれもイヌの行動特性と深い関連を有していることから、人に有益な遺伝的資質を備えたイヌの個体の選別及び育種に利用することができる。また、前記ＰＮ１〜ＰＮ３によってコードされるポリペプチドについても全く同様である。また、ＰＮ１はＤＲＤ４遺伝子のエクソン１で発見された新規な塩基配列であることから、ＰＮ２も新規な塩基配列である。
【００３１】
・ 実施形態の有用犬の選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１又はイントロン２の対立遺伝子を調べ、その対立遺伝子の遺伝子型に基づいて飼い主又は利用者にとって有用であるか否かを識別するものである。また、前記エクソン１及びイントロン２の２種類の対立遺伝子を調べ、それらの対立遺伝子の遺伝子型に基づいて有用であるか否かを識別してもよい。これらの有用犬の選別方法は、エクソン１又はイントロン２の遺伝子多型と、イヌの行動特性との関連性についての科学的根拠に基づいた選別方法であることから、飼い主又は利用者のニーズに適合するイヌの個体を極めて的確に選別して彼らに提供することができる。さらに、これらの選別方法では、有用犬を飼い主又は利用者に提供する前にその相性等を判別できることから、提供後のミスマッチを容易に低減させることができる。また、この選別方法としてＰＣＲ法を用いる場合には、著しく容易かつ短時間に有用犬を選別することができて便利である。
【００３２】
・ 実施形態のサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなるイヌの個体である。このサービスドッグは、他のイヌ、食べ物及び臭いに対する過度の執着がなく、過度の興奮が起こりにくく、適度な集中力で訓練等に取り組めるうえ、人の動きに従順であるといったサービスドッグに適した行動特性を発現するための遺伝的資質を備えている。また、実施形態の別のサービスドッグは、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなるイヌの個体である。このサービスドッグは、攻撃性や反抗性が少なく社会性に富んだ行動特性を発現しやすいことから、サービスドッグに適した行動特性を発現するための遺伝的資質を備えている。このため、これらのサービスドッグは、盲導犬等のサービスドッグになるための訓練を行う際に、訓練士による指導を集中して受けることができることから、潜在的に優れたサービスドッグになる可能性が高い。さらに、これらのサービスドッグは、サービスドッグになるための訓練開始後に不合格となるおそれが少ないうえ、訓練期間の短縮を図ることが容易である。
【００３３】
・ 実施形態のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ３からなる個体を選別するものである。また、実施形態の別のサービスドッグの選別方法は、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方がＰＮ６からなる個体を選別するものである。このため、これらの選別方法では、極めて簡単な方法によりサービスドッグとしての優れた遺伝的資質を備えた個体を選別することが可能である。さらに、これらの選別方法では、盲導犬等のサービスドッグに訓練する前にサービスドッグとしての資質を判別できることから、訓練にかかる時間と手間を容易に低減させることができる。加えて、サービスドッグになるための訓練開始後に不合格となる個体数を減らすことが容易であることから、サービスドッグの供給量を容易に増大させることが可能である。特に、訓練期間が長く需要量に対する供給量が少ない盲導犬、災害救助犬、介助犬、麻薬探知犬又は警察犬の選別に利用するとよい。また、これらサービスドッグの選別方法としてＰＣＲ法を用いる場合には、著しく容易かつ短時間にサービスドッグを選別することができて便利である。
【００３４】
・ 実施形態のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子の両方がＰＮ３からなるホモ接合体（Ｓ／Ｓ）のイヌの個体を、少なくとも一方の親犬として用いることによって行われる。また、実施形態の別のサービスドッグの育種方法は、ＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の対立遺伝子の両方がＰＮ６からなるホモ接合体（Ｐ／Ｐ）のイヌの個体を、少なくとも一方の親犬として用いることによって行われる。このため、これらの育種方法では、前記ホモ接合体（Ｓ／Ｓ又はＰ／Ｐ）のイヌの個体を用いることにより、人に有益な遺伝的資質を備えたサービスドッグ（Ｓ／Ｓ、Ｓ／Ｌ、Ｐ／Ｐ又はＰ／Ｑ）を容易かつ確実に育種することができる。また、前記親犬、特に雄イヌは、繰返し何度でも育種のために利用できることから、サービスドッグの供給量を容易に増大させることが可能である。
【００３５】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜ＰＮ２，３の同定＞
複数のビーグル犬から口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡに対し、ヒトのＤＲＤ４遺伝子のエクソン１の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、前記一対のＰＣＲプライマーは配列番号７及び８で示される塩基配列から構成されている。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行ったところ、２種類の長さのＰＣＲ産物、即ちロングフォーム（Ｌ）とショートフォーム（Ｓ）とが存在していた。これら２種類のＰＣＲ産物それぞれについて塩基配列を調べたところ、前記Ｌは配列番号２で表される塩基配列であり、前記Ｓは配列番号３で表される塩基配列であることが確認された。なお、配列番号２の５’末端から６１〜８４番目の配列（ＰＮ１）は、新規な配列であることも確認された。
【００３６】
＜ＰＮ４，５の同定＞
複数のビーグル犬から口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡに対し、ヒトのＤＲＤ４遺伝子のイントロン２の配列を増幅するための一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、前記一対のＰＣＲプライマーは配列番号９及び１０で示される塩基配列から構成されている。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行ったところ、２種類の長さのＰＣＲ産物が存在していた。これら２種類のＰＣＲ産物それぞれについて塩基配列を調べたところ、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列であることが確認された。なお、配列番号５の５’末端から５０〜６６番目の配列（ＰＮ４）は、新規な配列であることも確認された。
【００３７】
＜ＰＮ２，３と行動特性との関連についての検証１＞
関西盲導犬協会のラブラドール・レトリーバー７０頭の口腔内細胞を採取した後、該細胞からカラム法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られた各個体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号７及び８で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を判定した結果、Ｓ／Ｓ（２９個体）、Ｓ／Ｌ（２９個体）、Ｌ／Ｌ（１２個体）の３種類に分類された。
【００３８】
一方、上記表１に示される行動特性についての評価項目（Ｎｏ．１〜１５）のそれぞれについて、盲導犬の訓練士２名による５段階評価を行うことにより、イヌの各個体に対して評価項目毎のスコアを付けた。前記５段階評価は、盲導犬としての資質、即ち人に有益であるかという観点から、とても良い＝５点、やや良い＝４点、どちらとも言えない＝３点、やや問題あり＝２点、とても問題あり＝１点という評価基準に従って行われた。
【００３９】
次に、各個体をＳ／Ｓ、Ｓ／Ｌ、Ｌ／Ｌの３種類のグループに分け、前記Ｎｏ．１〜１５の各評価項目について、各遺伝子型に属する個体数と、それら個体のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４の遺伝子型欄に記載した。一方、Ｓ／Ｓ及びＳ／Ｌの個体（Ｓを有する個体からなるグループ）と、Ｌ／Ｌの個体（Ｓを有しない個体からなるグループ）とを別々のグループに分け、同様に分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４のＳの有無欄に記載した。また、Ｓ／Ｓ（Ｌを有しない個体からなるグループ）と、Ｓ／Ｌ及びＬ／Ｌの個体（Ｌを有する個体からなるグループ）とを別々のグループに分け、同様に分散分析を行って解析した。その結果（Ｐ値）を表４のＬの有無欄に記載した。
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】
＜ＰＮ２，３と行動特性との関連についての検証２＞
獣医師及びイヌの訓練士へのアンケートに基づく行動特性評価（Ｈａｒｔ＆Ｈａｒｔ及び田名部と山崎）がなされている約３０品種数百頭（１品種４個体以上）のイヌの血液又は口腔内細胞を採取した。それらの細胞からカラム法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号７及び８で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を確定した。次に、各品種について、前記確定された遺伝子型を、Ｓを有する個体からなるグループと、Ｌを有する個体からなるグループとにグループ分けした後、各グループに属する個体数と、その個体が属する品種のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。結果を表６に示す。
【００４３】
＜ＰＮ５，６と行動特性との関連についての検証＞
獣医師及びイヌの訓練士へのアンケートに基づく行動特性評価（Ｈａｒｔ＆Ｈａｒｔ及び田名部と山崎）がなされている約２５品種数百頭（１品種４個体以上）のイヌの血液又は口腔内細胞を採取した。それらの細胞からカラム法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号９及び１０で示される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を用いて蛍光シーケンサーによる電気泳動を行った後、前記ＰＣＲ産物の長さに基づいて各個体の遺伝子型を確定した。次に、各品種について、前記確定された遺伝子型を、Ｐを有する個体からなるグループと、Ｑを有する個体からなるグループとにグループ分けした後、各グループに属する個体数と、それら個体が属する品種のスコアとを用いて分散分析を行って解析した。結果を表６に示す。
【００４４】
【表６】
【００４９】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 犬の選別方法に用いられる犬の選別用キットであって、前記一対のＰＣＲプライマーを含有することを特徴とする犬の選別用キット。
【００５０】
【発明の効果】
以上詳述したように、各請求項に記載の発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１から請求項３に記載の発明の犬の選別方法によれば、所定の行動特性を発現しやすい犬の個体を容易に選別することができる。請求項４のＰＣＲプライマー及び請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブは、犬の選別方法に使用することができる。
【００５１】
【配列表】
Claims (5)
- 所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、
ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号２の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする犬の選別方法。 - 所定の行動特性を発現しやすい犬を選別するための犬の選別方法であって、
ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の少なくとも一方に配列番号３の塩基配列を有する犬を選別することを特徴とする犬の選別方法。 - 犬の個体から前記エクソン１の対立遺伝子を含むＤＮＡを抽出し、前記エクソン１の対立遺伝子の両末端に結合する一対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後、得られたＰＣＲ産物の長さに基づいて前記エクソン１の対立遺伝子を調べることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の犬の選別方法。
- 請求項３に記載の犬の選別方法に使用される一対のＰＣＲプライマーであって、
該一対のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号７及び配列番号８で表される塩基配列、又はそれぞれ配列番号７と相補的な塩基配列及び配列番号８と相補的な塩基配列であることを特徴とする一対のＰＣＲプライマー。 - ドーパミン受容体Ｄ４遺伝子のエクソン１の対立遺伝子を調べ、該対立遺伝子の遺伝子型に基づいて犬を選別する犬の選別方法に使用されるポリヌクレオチドプローブであって、
配列番号１の塩基配列、又は配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列を含有することを特徴とするポリヌクレオチドプローブ。
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