CN107988379A

CN107988379A - 与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用

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Publication number: CN107988379A
Application number: CN201711092589.2A
Authority: CN
Inventors: 刘秀; 罗玉柱; 李少斌; 王继卿; 张亚强; 王凤璋
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107988379B

Abstract

本发明提供与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好。本发明以藏绵羊为研究对象，采用PCR‑SSCP方法结合DNA测序技术，研究2个绵羊群体PPARα基因的遗传变异特征，初步筛选出藏绵羊在高寒低氧适应性上的分子标记，为后续的相关性分析提供基础。

Description

与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用。

背景技术

青藏高原平均海拔4500m以上，具有低氧、寒冷、强紫外线等极端环境特征，在这种严酷自然环境条件下繁育的高原土著物种是我们开展动物适应性进化研究的优秀“素材”。野牦牛、藏绵羊、藏羚羊等高原土著动物经过漫长的适应性进化，不断地在形态、细胞和分子水平上形成了适应和调节机制。随着基因组学、生物信息学的快速发展，基于基因组学分析生物适应性进化的方法和工具也在不断完善，为探讨不同海拔之间动物基因组变异提供了有力支持。在基因组层面开展高原物种适应性进化研究成为热点，也成为揭示高原土著动物适应性进化分子机制的有效途径。

藏绵羊作为中国三大粗毛绵羊品种之一(另包括蒙古羊和哈萨克羊)，主要分布于海拔2500-5000m的青藏高原地区，形成了对高原低氧极端环境独特的生理及遗传适应机制。近年来，由于自然环境和各种人为因素的影响，藏绵羊的生产性能、抗逆(病)性、适应能力等呈下降趋势。因此，研究藏绵羊的高原低氧适应机制，对于高原土著动物的遗传改良和种质资源保护利用具有重要意义。

过氧化物酶体增殖物激活型受体(peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs) 是一类配体激活的核转录调节因子，属于2型核受体家族成员。在啮齿类动物中最先被发现，根据结构的不同，分为PPARα、PPARβ、PPARγ3种亚型，分别位于人的22、6、3 号染色体，编码468、441、479个氨基酸残基。PPARs结合配体活化与靶基因启动子区域中的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)结合，影响一些与脂肪代谢有关的蛋白或酶基因的表达，进而参与调控机体能量代谢、脂肪代谢、胰岛素敏感、炎症反应、脂肪细胞的生长和分化等过程。

PPARα基因多态性与动物高原低氧的适应性具有相关性。Simonson等人确定PPARα基因为高寒低氧适应候选基因，在机体能量代谢方面具有重要调控作用。如PPARα基因多态性与不同海拔埃塞俄比亚人的血红蛋白水平相关，并且参与HIF通路；坨坨河地区藏族人 PPARα基因的单倍型与血清乳酸和脂肪酸的浓度呈现一定的相关性。在低氧、血液供应不足的情况下，大鼠PPARα基因表达的下调，减少了脂肪酸的氧化供能，提高葡萄糖的氧化来维持机体能量平衡，从而降低对心脏的损伤。

藏绵羊是适应青藏高原低氧环境最典型的模式动物之一。截止目前，有关PPARα基因在藏绵羊高原低氧适应性的研究鲜见报道。

发明内容

本发明基于藏绵羊对藏区人民群众生活生产的重要性以及具有与藏族人相似的高原适应性进化过程，开展藏绵羊高原低氧适应分子标记筛选和适应性进化机制研究，通过检测哺乳动物HIF通路上的PPARα基因在藏绵羊上的耐氧SNPs及其组织表达情况，初步分析其高原低氧适应性进化特征，为藏绵羊耐低氧遗传改良提供基础数据。

本发明的第一个目的是提供与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其位于PPARα 基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好；

所述等位基因A为：在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为A，第111bp处的碱基为C；

所述等位基因B为：在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，第99bp处的碱基为G，第111bp处的碱基为T。

本发明的第二个目的是提供用于检测权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：

上游引物：ATGTTCGCCCACAGTTTGAC

下游引物：TGCTACGACTCTAGCTGACG。

本发明的第三个目的是提供上述与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记在鉴定藏绵羊高原低氧适应性中的应用，所述应用包括以下步骤：

(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；

(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR 扩增；

(3)检测PCR扩增产物，如果扩增序列中，等位基因为A，则藏绵羊高原低氧适应性差；等位基因为B，则藏绵羊高原低氧适应性良好；

或者，检测PCR扩增产物，如果基因型为AA，则藏绵羊高原低氧适应性差；如果基因型为AB或者BB，则藏绵羊高原低氧适应性良好。

作为优选，所述PCR扩增时的扩增体系以20μl计为：

Taq预混酶10μL，去离子水7.6μL，上、下游引物和DNA模板各0.8μL。

作为优选，所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃终延伸7min；4℃保存备用。

作为优选，步骤(3)中，所述检测PCR扩增产物是采用SSCP检测，同时设置标准样，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和标准样结果对待测藏绵羊的高原低氧适应性进行判断。

本发明的第四个目的是提供含有上述引物对的用于检测藏绵羊高原低氧适应性的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供与藏绵羊的高原低氧适应性相关的遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明以藏绵羊为研究对象，采用PCR-SSCP方法结合DNA测序技术，研究藏绵羊PPARα基因的遗传变异特征，初步筛选出藏绵羊在高寒低氧适应性上的分子标记，为后续的相关性分析提供基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为绵羊PPARα基因intron3-intron4PCR-SSCP检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1试验材料与方法

1.1实验动物及样品采集

采集藏绵羊血样共340份。颈静脉采血8-10mL，肝素钠抗凝剂抗凝，实验室-20℃冻存备用。部分血液滴至FTA卡上晾干，常温保存。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA和总RNA提取

基因组DNA提取：采用北京全式金生物技术有限公司的DNA提取试剂盒EasyBlood Genomic DNA Kit和Zhou等描述的两步法提取血液基因组。

1.2.2 PPARα基因PCR扩增

根据NCBI里提供的绵羊PPARα基因序列(登录号：NC_019460.2)，利用PrimerPrimer5.0和DNAMAN设计特异引物P1(表1)，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

表1引物P1信息

PCR反应体系：总反应体系20μL，其中Taq预混酶10μL(南京诺唯赞生物科技有限公司)，去离子水(ddH₂O)7.6μL，上、下游引物(浓度10pmol)和DNA模板(浓度50ng/ml) 各0.8μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃终延伸7min；4℃保存备用。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

SSCP步骤：取PCR产物3.0μL，加入变性缓冲液(包括98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTApH 8.0)9.0μL，105℃变性5min，立即置于冰水混合物中，冰浴10min。然后迅速上样于10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，200v，8℃，21h，电泳过夜。电泳结束后，将非变性聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色。

1.3测序

根据SSCP检测结果，初步判定SSCP条带为纯合型或杂合型。纯合型直接应用PCR产物测序，杂合型则根据Gong等描述的方法进行切胶测序。序列由上海生工生物工程有限公司测定完成。

1.4统计分析

采用MEGA5.0软件对等位基因核苷酸序列进行比对，应用Popgene32软件计算基因型频率、等位基因频率、遗传纯合度(Homozygosity,Ho)、遗传杂合度(Heterozygosity,He)，有效等位基因数(Effective number of alleles,Ne)和χ²检验，PIC6.0软件计算多态性信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

应用MINTAB(Version 16，Minitab Inc.，Pennsylavania)一般线性混合效应模型(General Liner Mixed-effect Models，GLMMs)评估特定等位基因的存在/缺失及基因型是否对血红蛋白总量和血氧饱和度存在影响。

2结果与分析

2.1 PPARα基因遗传特征分析

2.1.1 SSCP检测

经SSCP检测，在藏绵羊PPARα基因intron3-intron4中共发现2个(A和B)等位基因，形成AA、AB、BB共3种基因型(图1)。

2.1.2 PPARα基因序列变异分析

分别对检测到的2个等位基因进行双向测序，测序结果为等位基因*A和等位基因*B，测序结果利用MEGA 5.0软件进行等位基因之间序列比对。在PPARα基因第3内含子区域发现2个突变位点，分别为SNP1(c.515-22A>G)、SNP2(c.515-10C>T)。由于SNP1、 SNP2位于内含子区域，故未引起氨基酸的改变。

等位基因*A的核苷酸序列为：

ATGTTCGCCCACAGTTTGACCCATAGTGTGAACTTTCCCTGCAGCTGTTAGTCATCACTCCCCATTATGCCCTTCGTTTCTCTGTTTTCCATGATTCCATGTCTCCCCTCCGACCCCCAGCGATTCGTTTTGGACGAATGCCAAGATCTGAAAAAGCAAAATTGAAGGCAGAAATCCTTACGTGTGAACATGACCTAGAAGATTCCGAAACCGCAGATCTCAAGTCTCTGGCCAAGAGGATTTATGAGGCCTACTTGAAGAACTTCAACATGAACAAGGTCAAGGCCCGGGTCATCCTTGCCGGGAAGACCAACAACAATCCGGTGGGTGGCTCTGCTCTGTTTGTTACGGTCTGACAGGCTCCCTGGGCAACCCGTCAGCTAGAGTCGTAGCA

等位基因*B的核苷酸序列为：

ATGTTCGCCCACAGTTTGACCCATAGTGTGAACTTTCCCTGCAGCTGTTAGTCATCACTCCCCATTATGCCCTTCGTTTCTCTGTTTTCCATGATTCCGTGTCTCCCCTCTGACCCCCAGCGATTCGTTTTGGACGAATGCCAAGATCTGAAAAAGCAAAATTGAAGGCAGAAATCCTTACGTGTGAACATGACCTAGAAGATTCCGAAACCGCAGATCTCAAGTCTCTGGCCAAGAGGATTTATGAGGCCTACTTGAAGAACTTCAACATGAACAAGGTCAAGGCCCGGGTCATCCTTGCCGGGAAGACCAACAACAATCCGGTGGGTGGCTCTGCTCTGTTTGTTACGGTCTGACAGGCTCCCTGGGCAACCCGTCAGCTAGAGTCGTAGCA

等位基因之间的核苷酸差异见表2。

表2藏绵羊PPARα等位基因核苷酸变异

2.1.3等位基因频率和基因型频率

藏绵羊PPARα基因intron3-intron4的等位基因频率和基因型频率(表3)。由表2可知，检测到2个等位基因(A、B)，其中，藏绵羊的等位基因频率分别为A(61.2％)、B(38.8％)，优势等位基因为A，优势基因型为AB(52.1％)和BB(12.6％)。经χ²适应性检验，藏绵羊群体符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表3绵羊PPARα基因等位基因和基因型频率

2.1.4遗传纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态性信息含量

藏绵羊PPARα基因intron3-intron4区遗传变异参数见表4。遗传杂合度(He)分别为 0.52，遗传纯合度(Ho)为0.48，有效等位基因数(Ne)为1.90，多态信息含量(PIC) 分别为0.36，属于中度多态(0.25<PIC<0.5)。

表4绵羊PPARα基因遗传变异参数

注：PIC>0.05高度多态；0.25<PIC<0.5中度多态；PIC<0.25低度多态。

2.2PPARα基因多态性与血红蛋白总量和血氧饱和度的相关性分析

藏绵羊PPARα基因intron3-intron4区各基因型与其血红蛋白总量及血氧饱和度的相关性分析表明(表5)，BB基因型与藏绵羊血红蛋白总量和血氧饱和度均具有相关性，且显著高于AA和AB基因型(P<0.05)，在3个基因型对血红蛋白总量和血样饱和度的影响上是一致的，排序为BB>AB>AA，说明选留BB基因型的个体，可以显著提高藏绵羊的血红蛋白总量和血样饱和度，从而为机体提供更多的氧气，可以提高藏绵羊的高原低氧的适应性。

通过各等位基因的存在/缺失对藏绵羊PPARα基因高原低氧适应性的影响分析表明(表 4)，等位基因A的存在/缺失与藏绵羊血红蛋白总量和血氧饱和度关联性均显著(P<0.05)，存在等位基因A的个体平均值显著(P<0.05)低于缺失A的个体，而存在等位基因B的个体均值高于缺失等位基因B的个体，但对藏绵羊血红蛋白总量和血氧饱和度关联性均不显著 (P>0.05)，表明，等位基因A和B对藏绵羊的高原低氧适应性的影响程度不显著，但存在等位基因B的个体血红蛋白总量和血氧饱和度的值均高于等位基因缺失的个体，表明，选留携带等位基因B的个体，淘汰携带等位基因A的个体，可提高藏绵羊的高原低氧适应能力。

表5藏绵羊PPARα基因基因型与血红蛋白总量和血氧饱和度的关联性

注：数值为平均值±标准误差；n代表样本数量；同列中数据后不同字母尾标表示差异显著(P<0.05)；相同字母及无字母表示性状差异不显著(P>0.05)。

3结论

在藏绵羊PPARα基因intron3-intron4区检测到3种基因型和2个SNPs，且2个SNPs均位于第3内含子。经对2个群体的基因型和等位基因频率统计，推测携带基因型AB和BB以及等位基因B的个体可能更有利于适应高原低氧环境，可作为藏绵羊低氧适应选育的分子标记。

实施例2

本发明的PCR-SSCR试剂盒包括：

1、引物对

上游引物：P1-up:ATGTTCGCCCACAGTTTGAC

下游引物：P1-dn:TGCTACGACTCTAGCTGACG。

2、PCR反应体系

20μL PCR反应体系为：Taq预混酶10μL(南京诺唯赞生物科技有限公司)，去离子水(ddH₂O)7.6μL，上、下游引物和DNA模板各0.8μL。

3、SSCP上样变性缓冲液(包括98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTApH 8.0)

4、标准样

标准样A：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；

标准样B：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2。

该试剂盒的使用方法参照实施例1。

将待测样本的SSCP电泳带型图与标准样的SSCP电泳带型图进行对比，对待测样本的高原低氧适应性进行判断。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> DNA

<213> 人工序列(peroxisome proliferator activated-receptors)

<400> 1

atgttcgccc acagtttgac ccatagtgtg aactttccct gcagctgtta gtcatcactc 60

cccattatgc ccttcgtttc tctgttttcc atgattccat gtctcccctc cgacccccag 120

cgattcgttt tggacgaatg ccaagatctg aaaaagcaaa attgaaggca gaaatcctta 180

cgtgtgaaca tgacctagaa gattccgaaa ccgcagatct caagtctctg gccaagagga 240

tttatgaggc ctacttgaag aacttcaaca tgaacaaggt caaggcccgg gtcatccttg 300

ccgggaagac caacaacaat ccggtgggtg gctctgctct gtttgttacg gtctgacagg 360

ctccctgggc aacccgtcag ctagagtcgt agca 394

<210> 2

<211> 394

<212> DNA

<213> 人工序列(peroxisome proliferator activated-receptors)

<400> 2

atgttcgccc acagtttgac ccatagtgtg aactttccct gcagctgtta gtcatcactc 60

cccattatgc ccttcgtttc tctgttttcc atgattccgt gtctcccctc tgacccccag 120

cgattcgttt tggacgaatg ccaagatctg aaaaagcaaa attgaaggca gaaatcctta 180

cgtgtgaaca tgacctagaa gattccgaaa ccgcagatct caagtctctg gccaagagga 240

tttatgaggc ctacttgaag aacttcaaca tgaacaaggt caaggcccgg gtcatccttg 300

ccgggaagac caacaacaat ccggtgggtg gctctgctct gtttgttacg gtctgacagg 360

ctccctgggc aacccgtcag ctagagtcgt agca 394

Claims

1.与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记，其特征在于：其位于PPARα基因上，具体核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，当等位基因为A时，藏绵羊高原低氧适应性差；当等位基因为B时，藏绵羊高原低氧适应性良好；

2.用于检测权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：P1-up:ATGTTCGCCCACAGTTTGAC

下游引物：P1-dn:TGCTACGACTCTAGCTGACG。

3.权利要求1所述的与藏绵羊高原低氧适应性相关的遗传标记在鉴定藏绵羊高原低氧适应性中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；

(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增时的扩增体系以20μl计为：Taq预混酶10μL，去离子水7.6μL，上、下游引物和DNA模板各0.8μL。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃终延伸7min；4℃保存备用。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述检测PCR扩增产物是采用SSCP检测，同时设置标准样，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和标准样结果对待测藏绵羊的高原低氧适应性进行判断。

7.含有权利要求2所述引物对的用于检测藏绵羊高原低氧适应性的试剂盒。

8.权利要求1所述的与藏绵羊的高原低氧适应性相关的遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。