CN109994153A - 一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种筛选牛高原低氧适应特异分子标记的方法，并通过这一特异标记筛选适合高原低氧生存的牛品种或者个体。本发明针对牛品种高原低氧适应的遗传特性，从基因组进化、选择和适应的角度，选择分布于高、地海拔的地方牛品种，整合多种基因组选择信号和全基因组关联分析方法和策略，高效准确筛选适应高原低氧的关键基因和分子标记，方法设计合理，依据关键基因和标记设计的检测方法，具有准确性高、应用操作简便的特点，本发明通过对不同海拔牛品种进行分析发现了与高原低氧适应有关的基因ACSS2及其单倍型，并定位了该基因上受到最强选择信号的特异SNP，对于牛分子育种工作具有重要意义和实用价值。

Description

一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法及其应用
技术领域
本发明属于动物分子育种技术领域，具体涉及一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛位列“六畜”，我国古代人民用它来祭祀、占卜(肩胛骨)、耕田、拉车、骑乘和参战。我国对牛的驯养历史悠久。描写西周初至春秋中叶(前11世纪-前6世纪)的古诗歌《诗经.小雅.无羊》中记载“谁谓尔无牛，九十其犉”。现有的遗传学和考古学的证据可将牛的驯化可追溯至大约公元前1万年的新石器时代。现代牛起源于多个独立的驯化事件，其祖先是曾经广泛分布于西南亚和南亚的欧洲野牛(Bos primigenius)，分化成无肩峰的普通牛(Bos taurus)和有肩峰的瘤牛(Bos indicus)。普通牛于10000-8000年前在新月沃土被驯化，而瘤牛则于8000-6000年前在印度河谷被驯化(Loftus等，1994；Larson 等，2001)。我国科学家发现一种属于原牛和现代家牛的过渡种化石，确认中国东北地区 (哈尔滨附近)至少是人类驯化动物的重要起源地和家牛驯化的扩散中心之一(Zhang 等,2013)。自19世纪起，牛品种的形成和发展经历了人们基于对毛色和无角等的表型选择，剧烈的瓶颈效应，以及随后通过人工授精的品种扩张等过程。近50年来，基于数量遗传学，牛品种在奶和肉等生产性状方面取得了显著的遗传进展。因此，自然选择和人工选择、群体事件和渗入驱动着牛基因组的变化。它们的组合效应产生了具有丰富多彩的表型和适应当地环境的现代牛品种(Xu等，2015)。全球已有1019个牛品种，各具特质(FAO，2015)。我国分布有普通牛、水牛、牦牛和大额牛等丰富的遗传资源。我国拥有牛品种120个，其中地方品种94个(黄牛54个，水牛27个，牦牛12个，大额牛品种1个)。独特的种质已成为一种战略资源，其潜在的重要性和价值不言而喻。
全球气候变化，特别是诸如高原低氧、干旱、冷热等极端环境对畜禽的生产性能、繁殖和生存等有重大影响(Easterling等，2000；Yang等，2016)。而应用当地畜禽的全基因组信息分析“选择信号”，可以解析其遗传适应机制。迄今已有利用重测序、选择信号检测等技术研究牦牛(Qiu等，2012)、藏猪(Li等，2013)、藏獒(Gou等，2014)、藏鸡(Wang等，2015)、绵羊(Yang等，2016)对高原低氧的适应，并鉴定出一些经典的基因，例如高原低氧适应有关的基因EGLN1和EPAS1(Qiu等，2012；Gou等，2014) 等。牛驯化之后，经扩散并适应我国不同的农业生态环境。比如生活在高海拔的西藏牛 (Tibetan)、阿沛甲砸牛(Apeijiaza)和日喀则驼峰牛(Shigatse Humped)，诸如这些地方牛品种为解析动物对特殊环境快速适应的遗传机制提供了很好的模型。其中，西藏牛、阿沛甲砸牛、日喀则驼峰牛生活于平均海拔3500米的高原地区，均能很好地适应高海拔低压低氧环境和粗放的饲养管理，表现出体型小、心肺发达、觅食能力强、耐粗饲等特性。西藏牛形成的历史较早，1900多年前的藏文书籍中就有记载，但其起源和驯化的历史未知。据记载阿沛甲砸牛和日喀则驼峰牛是由80-100年前从印度、不丹、尼泊尔的瘤牛公牛与本地黄牛杂交选育而成(国家畜禽遗传资源委员会，2010)。
医学上将海拔高度3000米以上的地域称为高原，高原地区气候稀薄，当长期居于平原地区的人和动物处于高原环境时，会出现头晕呕吐等缺氧现象。因此高寒低氧环境会对高原人和本土动物的机体产生一系列生理的、基因组水平上的改变以适应当地极端气候。随着基因组学以及生物信息学等的快速发展，基于全基因组的生物分析方法和工具也不断在完善，这为探索动物适应高海拔环境的分子基础提供了条件。在分子检测方面，已有筛选低氧适应性绵羊的方法(申请号：CN201510390288；申请号：CN201611055253)，以及筛选低氧适应性鸡的方法(申请号：CN201010503455)，这对高原土著动物的遗传改良和种质资源保护利用有重大意义。牛作为我国重要的畜牧资源，具有役用、肉用等经济价值。已有研究发现藏黄牛通过增加红细胞平均体积、红细胞平均血红蛋白含量和红细胞平均血红蛋白浓度来适应低氧环境(齐晓园等，2017)。发明人发现，分子生物学方面对国外居于高原的拉达克牛的研究发现HIF-1及其调节基因GLUT1、VEGF和HIK 在高原牛体内的表达增加(Preeti等,2018)，表明它们在维持高原低氧适应时细胞稳态以及分子调控的重要性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法及其应用，本发明从牛基因组进化、选择和适应的独特视角，通过采用牛777K高密度SNP芯片，整合FLK、hapFLK、XPEHH三种基因组选择信号分析方法以及GEMMA全基因组关联分析方法，筛选出适应高原低氧极端环境的基因及其分子标记，并建立相应检测方法。本发明为高原低氧特色牛品种的培育和筛选等分子育种工作奠定重要基础，并且提供切实可行的技术手段；同时对于牛遗传资源多样性的保护和评价也具重要意义和应用价值；另外对于人类高原医学也具有重要的借鉴意义。
本发明的目的之一在于提供一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法。
本发明的目的之二在于提供上述方法的应用。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法，所述方法至少包括：
基于SNP芯片检测分析不同海拔牛品种DNA样品；
基于FLK、hapFLK和XPEHH基因组选择信号分析方法和GEMMA全基因组关联分析方法进行分析；筛选受到显著正选择的单核苷酸多态SNPs以及候选基因，整合基因功能注释筛选高原低氧适应的SNP分子标记和单倍型。
进一步的，基于上述方法，本发明筛选鉴定出ACSS2基因为牛高原低氧适应性的关键基因，因此可作为牛高原低氧适应性分子标记；更进一步的，牛高原低氧适应性分子标记还包括位于该基因上7个单核苷酸多态位点：rs43717470,rs109140327，rs4371746,rs110793511,rs43717457,rs134087258,rs43708452；其中，单核苷酸多态位点rs110793511 选择信号最强。
同时，进一步通过单倍型分析，发现单倍型为AGAGTTC是高原低氧适应的单倍型，则该单倍型牛个体(群体、品系或品种)具有较佳的高原低氧适应性。
本发明的第二个方面，提供上述方法在筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)中的应用。
本发明的有益技术效果：
本发明的检测方法具有独创性，针对牛品种高原低氧适应的遗传特性，从基因组进化、选择和适应的角度，选择分布于高、地海拔的地方牛品种，整合多种基因组选择信号和全基因组关联分析方法和策略，高效准确筛选适应高原低氧的关键基因和分子标记，方法设计合理，依据关键基因和标记设计的检测方法，具有准确性高、应用操作简便的特点；
采用本发明方法可以有效筛选出具有高原低氧适应性强的个体，对高海拔地区牛品种的育种工作以及遗传改良具有重要意义。本发明是分子育种技术在生产实践上的一次很好应用，可为牛种质资源保护利用以及品种起源研究提供技术，大大节省育种的成本和特色种质培育的时间，产生很好的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明实施例1筛选牛高原低氧适应分子标记的方法流程图。
图2为本发明实施例1中采用FLK、hapFLK、XPEHH和GEMMA四种方法检测到的正选择基因及重叠基因数量。
图3为本发明实施例1中牛第13号染色体FLK检测结果及最强信号基因ACSS2及其基因组结构示意图。
其中，10个SNP位于ACSS2基因内，其中1个受到显著的选择。SNP(rs110793511, A>G)在基因组中位置信息。
图4为本发明实施例1中受选择的候选基因ACSS2单倍型在不同牛品种、不同海拔牛、不同牛属(普通牛、瘤牛、牦牛)中的频率及其分布规律。
注：B.t.taurus–普通牛；B.t.indicus-瘤牛；B.grunniens-牦牛；Low-altitude-低海拔牛；High-altitude-高海拔牛
图5为本发明实施例1中ACSS2基因PCR产物直接测序结果。
图6为本发明实施例1高原低氧适应基因ACSS2的SNP(rs110793511,A>G)的 PCR-RFLP检测结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
目前关于地方牛高原低氧适应的分子生物学研究较少，尚未有筛选高原低氧适应性地方牛的方法。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法，所述方法至少包括：
基于SNP芯片检测分析不同海拔牛品种DNA样品；
基于FLK、hapFLK和XPEHH基因组选择信号分析方法和GEMMA全基因组关联分析方法进行分析；筛选受到显著正选择的单核苷酸多态SNPs以及候选基因，整合基因功能注释筛选高原低氧适应的SNP分子标记和单倍型。
本发明的又一具体实施方式中，所述一种筛选牛高原低氧适应分子标记方法包括：
S1.不同海拔牛品种样品的采集及DNA提取；
S2.SNP芯片检测分析；
S3.FLK、hapFLK基因组选择信号分析；
S4.XPEHH基因组选择信号分析；
S5.GEMMA全基因组关联分析；
S6.基于候选基因的筛选策略筛选候选基因；
S7.鉴定位于候选基因内受选择的SNPs；构建位于候选基因内受选择SNPs的单倍型。
其中，步骤S3至S5没有先后顺序之分，因此步序可以是S3-S4-S5；S3-S5-S4； S4-S3-S5；S4-S5-S3；S5-S4-S3或S5-S3-S4；
本发明的又一具体实施方式中，步骤S1具体方法包括：
S1.1选择国内外不同海拔普通牛、瘤牛品种，普通牛和瘤牛的混合品种、以及牦牛；
S1.2采集牛的血液，提取血液组织中的DNA。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S2具体方法包括：
S2.1使用SNP芯片对样品进行分析，并进行基因分型；
S2.2对SNP数据进行过滤，对剩余符合要求的SNP做进一步分析；
S2.3为每条染色体构建单倍型；
S2.4将构建的单倍型数据估计成对SNP间的R2值。
S2.5使用Four Gamete规则定义区块，构建候选区域中的块模式以进行选择特征分析。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S3具体方法包括：
S3.1选择信号FLK和hapFLK基因组扫描和局部进化树的构建：对牛品种获得的所有数据进行hapFLK分析，将国外的Nelore牛品种作为远源群体；
S3.2利用hapFLK的分析结果，使用Python和R脚本为选定区域构建全基因组和局部进化树；并通过在R脚本中拟合全基因组的标准正态分布来计算hapFLK的P值。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S4具体方法包括：
S4.1估算高海拔和低海拔牛品种之间的XPEHH值；
S4.2在牛基因组中使用1Mb≈1cM定义物理距离与遗传距离的关系；
S4.3基于recode–fastphase构建单倍型。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S5具体方法包括：
S5.1采用GEMMA单变量线性混合模型，将海拔高低作为GWAS分析的因变量，将每个品种来自瘤牛的基因组成份作为协变量；
S5.2基于Benjamini和Hochberg校正方法计算显著性的P值；
S5.3生成GWAS分析的曼哈顿图；
S5.4SNP注释在BIM或者MAP文件中以及NCBI的dbsnp数据库中检索。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S6具体方法包括：
S6.1选择具有FLK、hapFLK或XPEHH中有强选择信号和最显著P值的SNPs；
S6.2使用UCSC基因组浏览器检索由SNP定义的每个选定区域内的带注释的Refseq基因；
S6.3选用每种分析方法所得出的信号值排名前3％的SNP标记定位受选择的SNPs，将基因限定在每个显著SNP上下游50K bp以内，定位受正选择的基因；筛选出同时在至少有3种或4种分析方法同时鉴定到的基因，并且至少在一种分析方法中，其选择信号值或者显著性检验的P值排名前10，作为重要的候选基因(例如ACSS2基因)；
S6.4应用DVAID对筛选到的候选基因进行功能分析，并应用Benjamini-Hochberg进行多重校正，分析基因富集在哪些特定的分子功能以及细胞成分或者生物学通路中。
本发明的又一具体实施方式中，步骤S7具体方法包括：
S7.1确定候选基因，鉴定出位于候选基因受选择的SNPs；
S7.2对位于候选基因内受选择SNPs，利用S2.3～S2.5的方法构建单倍型，鉴定出牛高原低氧适应的单倍型。
本发明的又一具体实施方式中，提供基于上述方法鉴定获得的牛高原低氧适应性的分子标记，具体的，ACSS2基因为牛高原低氧适应性的关键基因，可作为牛高原低氧适应性分子标记；同时，牛高原低氧适应性分子标记还包括位于该基因上7个单核苷酸多态位点：rs43717470,rs109140327，rs4371746,rs110793511,rs43717457,rs134087258,rs43708452；其中，单核苷酸多态位点rs110793511选择信号最强，因此最为适合作为牛高原低氧适应性分子标记；同时筛选鉴定获得牛高原低氧适应单倍型为AGAGTTC。
本发明的又一具体实施方式中，提供用于检测上述分子标记的试剂盒，该试剂盒可用于筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)；更具体的，所述试剂盒包括用于检测单核苷酸多态位点的引物；所述单核苷酸多态位点包括rs43717470, rs109140327，rs4371746,rs110793511,rs43717457,rs134087258和rs43708452中的任意一个或多个；
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测单核苷酸多态位点rs110793511 的试剂盒，所述试剂盒至少包括如下引物和Vsp I限制性内切酶；
F:5‘-CCTCTGTGGCTTGGGAGTTTAGTAG-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5‘-CCACATTCCTGCCTCTGCTTATTAA-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明基于单核苷酸多态位点rs110793511设计上述引物，通过在下游引物中引入两个突变加入酶切位点Vsp I，则Vsp I限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段；从而区分野生纯合型个体、杂合型个体和纯合突变型个体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述应用方式具体为：
提取不同牛个体的血液DNA；
利用检测上述分子标记的试剂盒，通过PCR-RFLP的方法鉴定标记的基因型，识别带有高原低氧适应特异分子标记的个体。
本发明的又一具体实施方式中，所述分子标记为单核苷酸多态位点rs110793511；此时所述试剂盒至少包括如下引物和Vsp I限制性内切酶；
F:5‘-CCTCTGTGGCTTGGGAGTTTAGTAG-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5‘-CCACATTCCTGCCTCTGCTTATTAA-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明实际上建立了一种利用基因组直接测序技术筛选高原低氧适应性地方牛的方法。本发明通过对不同品种地方牛进行高密度SNP芯片分析，结合选择信号分析方法，发现了与高原低氧有关的特异SNP位点，可通过验证单一SNP位点或SNP位点的组合判断牛的高原低氧适应性。这对高原地区牛的分子育种发展有着重要意义。
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1
1、地方牛样品的采集
选择42个牛品种(其中国内25个不同海拔的地方牛品种和17个国外的牛品种)，共580头，包含普通牛、瘤牛、及其普通牛和瘤牛的混合种，分别提取血液DNA。其中，分布在海拔低于1500米的牛品种组成低海拔组，分布在海拔1800米以上地区的牛品种组成高海拔组。另外抽样了3个牦牛品种共44个个体，用于分析等位基因的起来源。牛品种及分组信息具体如下：
2、采用Illumina BovineHD 777KSNP芯片进行基因分型
芯片共有777,962个SNP标记，从数据中除去X，Y和线粒体染色体上的40,497 个SNP以及未独特定位到UMD3.1的SNP。使用Plink1.9软件对SNP数据进行过滤，过滤后，对剩余702,622个常染色体SNP进行后续的分析。
3、使用fastPHASE中的默认选项为每个染色体重构单倍型
将重构的单倍型上传到HAPLOVIEW v4.1中以估计成对SNP的R2值。使用FourGamete规则定义块，构建候选区域中的块模式以进行选择特征分析。
4、FLK、hapFLK基因组选择信号分析
应用FLK和hapFLk全基因组选择信号分析方法，比较高海拔和低海拔组的选择信号值。FLK分析中，将Nelore定义为远源群体，并设K＝18和nFit＝20。使用hapFLK 结果以及两个Python和R脚本为选定区域构建整个基因组和局部进化树。并通过拟合R 中全基因组的标准正态分布，计算了hapFLK值的p值。
5、XPEHH基因组选择信号分析
在Selscan软件中应用XPEHH来估计高海拔和低海拔品种之间的XPEHH值。 XPEHH值在每组对比中都是标准化的，从而具有均值和单位平方差。我们在牛基因组中使用了1Mb≈1cM的亲缘关系。并在plink1.9和fastPHASE1.4中使用ReqDel-FAST进行单倍型构建。
6、GEMMA全基因组关联分析(GWAS)
GWAS分析采用GEMMA单变量线性混合模型。将海拔高低作为GWAS分析的因变量，将组成瘤牛的全基因组成份作为协变量，该独特的分析策略可显著提高分析的准确性和可靠性。使用Benjamini和Hochberg方法计算R.Genes的P值。R.Gene共50kbp，包含了被认为是潜在候选基因的所有显著SNP。使用qqman R软件包生成GWAS分析的曼哈顿图。SNP注释可在BIM或者MAP文件中以及NCBI的dbsnp中检索到。
7、受正选择遗传变异和候选基因的筛选
(1)利用FLK、hapFLK、XPEHH选择信号分析方法以及GEMMA全基因组关联分析方法比较高海拔和低海拔牛群，筛选受到高度选择的前3％的SNPs，共筛选到261 个在高海拔适应性中受到正向选择的候选基因，见图2。
(2)FLK检测结果显示，SNP(rs110793511,A>G)的选择信号最强，它位于ACSS2 基因内。共有10个SNPs位于ACSS2基因内，其中有7个SNPs(rs43717470A>G, rs109140327A>G,rs4371746A>C,rs110793511A>G,rs43717457T>C, rs134087258T>C,rs43708452T>C)受到显著的正选择(见图3)。进一步通过单倍型分析，发现单倍型AGAGTTC是高原低氧适应的单倍型(见图4)，通过分析发现该单倍型源自牦牛基因组，并通过渗入南方瘤牛品种进入高海拔地方牛品种，进而在高原低氧适应中发挥重要的作用。
8、高原低氧适应基因ACSS2的SNP测序鉴定方法
(1)选择高海拔牛10头，低海拔牛10头，提取血液DNA。
(2)设计包含该SNP(rs.110793511)位点处的一对PCR扩增引物。
F:5‘-GTGCTGATCGTTGGGTGGTC-3’(SEQ ID NO.3)
R:5‘-GTTCAGAGCCCCAGATTCGC-3’(SEQ ID NO.4)
(3)进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，包括上游引物0.5μL(10μmol/L)，下游引物0.5μL(10μmol/L)，DNA模板1μL(～30μmol/L)，ddH2O 10.5μL，2×Taq PCR Master Mix12.5μL，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤进行35个循环，最后72℃延伸10min，目的片段长度457bp。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)对扩增产物进行直接测序，根据NCBI公布的牛ACSS2基因序列进行分析比对，发生A>G突变的个体，即基因型为GG的个体属于高原低氧适应牛(见图5)。
9、高原低氧适应基因ACSS2的SNP(rs110793511,A>G)基因检测方法：
(1)选择不同牛品种，提取血液DNA。
(2)针对特异SNP(rs110793511,A>G)位点设计引物，通过在下游引物中引入两个突变加入酶切位点Vsp I，因此，Vsp I限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段。
F:5‘-CCTCTGTGGCTTGGGAGTTTAGTAG-3’(SEQ ID NO.1)
R:5‘-CCACATTCCTGCCTCTGCTTATTAA-3’(SEQ ID NO.2)
PCR-RFLP扩增及基因型分析：进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，包括上游引物0.5μL(10μmol/L)，下游引物0.5μL(10μmol/L)，DNA模板1μL(～30μmol/L)，ddH2O 10.5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤进行35个循环，最后72℃延伸10min，目的片段长度260bp。
利用限制性内切酶Vsp I对PCR产物进行酶切后经3％琼脂糖凝胶电泳检测，野生纯合型个体可分离出三个条带157bp、77bp、26bp，其中由于26bp片段较小，所以在凝胶中只显示两条带即157bp和77bp)；杂合型个体可分离出四条带157bp、103bp、77bp、26bp，其中，由于26bp片段较小，所以在凝胶中显示3条带157bp、103bp和77bp；纯合突变型个体可分离出两条带157bp、103bp。具体检测结果见图6。
其次，本实施例中还公开了包含上述引物以及酶的试剂盒。
所述试剂盒还包括PCR扩增反应试剂、酶切反应剂。
具体的，PCR扩增反应试剂包括dNTP(25mM each)、MgCl2(25mM)、PCR Bμffer、ddH2O等；
酶切反应剂包括ddH2O、Vsp I酶Buffer、Vsp酶(1U/μl)。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心；山东奥克斯畜牧种业有限公司
<120> 一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cctctgtggc ttgggagttt agtag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccacattcct gcctctgctt attaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cctctgtggc ttgggagttt agtag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccacattcct gcctctgctt attaa 25

Claims (10)

1.一种筛选牛高原低氧适应分子标记的方法，其特征在于，所述方法至少包括：
基于SNP芯片检测分析不同海拔牛品种DNA样品；
基于FLK、hapFLK和XPEHH基因组选择信号分析方法和GEMMA全基因组关联分析方法进行分析；筛选受到显著正选择的单核苷酸多态SNPs以及候选基因，整合基因功能注释筛选高原低氧适应的SNP分子标记和单倍型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选牛高原低氧适应分子标记方法包括：
S1.不同海拔牛品种样品的采集及DNA提取；
S2.SNP芯片检测分析；
S3.FLK、hapFLK基因组选择信号分析；
S4.XPEHH基因组选择信号分析；
S5.GEMMA全基因组关联分析；
S6.基于候选基因的筛选策略筛选候选基因；
S7.鉴定位于候选基因内受选择的SNPs；构建位于候选基因内受选择SNPs的单倍型；
其中，步骤S3至S5没有先后顺序之分。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体方法包括：
S1.1选择国内外不同海拔普通牛、瘤牛品种，普通牛和瘤牛的混合品种、以及牦牛；
S1.2采集牛的血液，提取血液组织中的DNA。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体方法包括：
S2.1使用SNP芯片对样品进行分析，并进行基因分型；
S2.2对SNP数据进行过滤，对剩余符合要求的SNP做进一步分析；
S2.3为每条染色体构建单倍型；
S2.4将构建的单倍型数据估计成对SNP间的R2值；
S2.5使用Four Gamete规则定义区块，构建候选区域中的块模式以进行选择特征分析。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3具体方法包括：
S3.1选择信号FLK和hapFLK基因组扫描和局部进化树的构建：对牛品种获得的所有数据进行hapFLK分析，将国外的Nelore牛品种作为远源群体；
S3.2利用hapFLK的分析结果，使用Python和R脚本为选定区域构建全基因组和局部进化树；并通过在R脚本中拟合全基因组的标准正态分布来计算hapFLK的P值。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S4具体方法包括：
S4.1估算高海拔和低海拔牛品种之间的XPEHH值；
S4.2在牛基因组中使用1Mb≈1cM定义物理距离与遗传距离的关系；
S4.3基于recode–fastphase构建单倍型。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5具体方法包括：
S5.1采用GEMMA单变量线性混合模型，将海拔高低作为GWAS分析的因变量，将每个品种来自瘤牛的基因组成份作为协变量；
S5.2基于Benjamini和Hochberg校正方法计算显著性的P值；
S5.3生成GWAS分析的曼哈顿图；
S5.4SNP注释在BIM或者MAP文件中以及NCBI的dbsnp数据库中检索。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S6具体方法包括：
S6.1选择具有FLK、hapFLK或XPEHH中有强选择信号和最显著P值的SNPs；
S6.2使用UCSC基因组浏览器检索由SNP定义的每个选定区域内的带注释的Refseq基因；
S6.3选用每种分析方法所得出的信号值排名前3％的SNP标记定位受选择的SNPs，将基因限定在每个显著SNP上下游50Kbp以内，定位受正选择的基因；筛选出同时在至少有3种或4种分析方法同时鉴定到的基因，并且至少在一种分析方法中，其选择信号值或者显著性检验的P值排名前10，作为候选基因；
S6.4应用DVAID对筛选到的候选基因进行功能分析，并应用Benjamini-Hochberg进行多重校正，分析基因富集在哪些特定的分子功能以及细胞成分或者生物学通路中。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S7具体方法包括：
S7.1确定候选基因，鉴定出位于候选基因受选择的SNPs；
S7.2对位于候选基因内受选择SNPs，利用S2.3～S2.5的方法构建单倍型，鉴定出牛高原低氧适应的单倍型；
优选的，基于所述方法鉴定获得的牛高原低氧适应性的分子标记，所述分子标记包括ACSS2基因以及位于该基因上的单核苷酸多态位点，所述单核苷酸多态位点包括rs43717470,rs109140327，rs4371746,rs110793511,rs43717457,rs134087258和rs43708452；牛高原低氧适应单倍型为AGAGTTC。
10.权利要求1-9任一项所述方法在筛选适合高原低氧生存的牛个体(群体、品系或品种)中的应用；
优选的，所述应用方式具体为：
提取不同牛个体的血液DNA；
利用检测上述分子标记的试剂盒，通过PCR-RFLP的方法鉴定标记的基因型，识别带有高原低氧适应特异分子标记的个体；
进一步优选的，所述分子标记为单核苷酸多态位点rs110793511；
此时，所述试剂盒至少包括如下引物和Vsp I限制性内切酶；
F:5‘-CCTCTGTGGCTTGGGAGTTTAGTAG-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5‘-CCACATTCCTGCCTCTGCTTATTAA-3’(SEQ ID NO.2)。
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