JP2004313073A - ミトコンドリアｄｎａ３２４３変異の検出法および定量法ならびにそのためのキット - Google Patents
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Abstract
【課題】ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を検出および定量する方法を提供する。
【解決手段】試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む。
【選択図】 図２
【解決手段】試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出法および定量法ならびにそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミトコンドリアＤＮＡ ３２４３部位のＡ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３）は日本人糖尿病患者の１％に存在する変異で、単一遺伝子異常による糖尿病の中で、最も高頻度である。ミトコンドリア遺伝子異常の特徴の一つは正常と異常のミトコンドリアＤＮＡが様々な割合で共存することであり、この状態をヘテロプラスミーと呼ぶ。ｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率と病状の進行度には相関があるといわれており、病状の進行度や治療効果の測定に用いることが出来るのではないかと考えられる。
【０００３】
ｍｔ３２４３変異は変異が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、ＰＣＲで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）で検出を行うことが出来る（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
ＰＣＲは数分子の鋳型から数１０億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。ＰＣＲ−ＲＦＬＰはＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことが考えられる。
【０００５】
さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため自動化が困難である。さらに、ＰＣＲ時に変性およびアニーリングを繰り返すため、正常型の配列と変異型の配列が間違って結合してしまう。このような産物は制限酵素によって認識されないため切断されない（二本鎖の両方が変異型の場合のみ制限酵素が切断する）。よってヘテロプラスミーの割合を定量しようとしたときに、本来の値よりも変異型の割合が低下する。
【０００６】
一方、アレル特異的増幅法として、ＭＡＳＡ（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれる方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。この方法では、一方のプライマーの３’末端が変異塩基になるように設定されたプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより変異アレルが特異的に増幅される。
【０００７】
また、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中の核酸を定量する方法（リアルタイム定量的ＰＣＲ）が知られている。この方法に従ってＭＡＳＡ法を行い、ＭＡＳＡ法による増幅産物を定量できる。
【０００８】
【非特許文献１】
臨床病理、１９９６年、第４４巻、第８号、ｐ．７７８−７８２
【非特許文献２】
関谷剛男他編、「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで」、１９９７年、共立出版（株）、ｐ．１４０−１４２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ｍｔ３２４３変異を検出および定量する方法ならびにそのためのキットを提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ミトコンドリアＤＮＡにおいてｍｔ３２４３変異を含む特定の領域に基づいてプライマー対を設計することにより、ＭＡＳＡ法によりｍｔ３２４３変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１１】
（１） 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む検出方法。
【００１２】
（２） ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（１）の方法。
【００１３】
（３） 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む定量方法。
【００１４】
（４） 定量的ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる（３）の方法。
【００１５】
（５）（ａ）（３）又は（４）に記載の方法により、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、
（ｂ）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法により、ミトコンドリアＤＮＡを定量し、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果から、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出する
ことを含む、試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率の測定方法。
【００１６】
（６） （ｂ）の工程で用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる（５）の方法。
【００１７】
（７） 系が、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブを含み、前記蛍光色素の蛍光が測定される（３）〜（６）のいずれかの方法。
【００１８】
（８） （１）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
【００１９】
（９） 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（８）のキット。
【００２０】
（１０） （３）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
【００２１】
（１１） 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（１０）のキット。
【００２２】
（１２） （５）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む第１のプライマーペア、および、ミトコンドリアＤＮＡ定量用の第２のプライマーペアを含む前記キット。
【００２３】
（１３） 第１のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる（１２）のキット。
【００２４】
（１４） 第２のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる（１２）のキット。
【００２５】
（１５） ５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブをさらに含む（１０）〜（１４）のいずれかのキット。
【００２６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００２７】
試料は、ミトコンドリアを含むものであれば特に限定されない。例としては、血液、口腔スワブ、組織等を挙げることができる。これらの試料から、ミトコンドリアＤＮＡが調製される条件での通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【００２８】
本発明検出方法におけるＰＣＲは、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、特定のプライマーを使用する他は、通常の、ＰＣＲの方法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明において用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む。すなわち、ＰＣＲで用いられるプライマーの一方が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーである。
【００３０】
このプライマーの３’末端はｍｔ３２４３変異の部位であり、従って、このプライマーがアニールした場合のみ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こるため、変異型の配列を有するＤＮＡが特異的に増幅される。従って、増幅産物の検出によりｍｔ３２４３変異を有するＤＮＡが検出されることになる。
【００３１】
ＰＣＲに用いるプライマーは、ＰＣＲが可能な領域内に設定され、かつ、上記のように３’末端がｍｔ３２４３変異の部位になるようにされたプライマーを含む他は、通常のＰＣＲにおけるプライマーペアの設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマーペアの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一であること（通常には、相違が２℃以内）が好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）により算出した値である。プライマーペアの例としては、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００３２】
上記の特定の領域におけるプライマーペアの設定は、ＰＣＲの条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プライマーペアの設定は、プライマー設定用のコンピュータープログラムに基づいて行うことができる。
【００３３】
ＰＣＲの条件は、通常の、ＰＣＲの方法に従って設定すればよい。本発明検出方法における代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００３４】
【表１】
ＤＮＡ断片 １０１〜１０８分子／反応
プライマー ２００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド 各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４〜９．０） ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ １０〜１００ｍＭ
グリセロール ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００３５】
また、本発明検出方法における代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１） 変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２） アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３） 伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００３６】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００３７】
本発明検出方法における増幅産物の検出は、通常の、増幅産物の検出方法に従って行うことができる。例えば、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に付して検出してもよいし、増幅産物に結合して蛍光が変化する物質（例えば、二本鎖ＤＮＡに結合し、結合により蛍光強度が変化する蛍光色素等）の存在下で蛍光を測定してもよい。
【００３８】
＜２＞本発明定量方法
本発明定量方法は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００３９】
試料からのＤＮＡの調製およびプライマーは、本発明検出方法に関し説明した通りである。
【００４０】
増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する定量的ＰＣＲは、公知の方法に従って行うことができる。このような方法の例としては、増幅産物にハイブリダイゼーションする、蛍光標識したプローブを用いる方法、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する試薬を用いる方法等が挙げられる。
【００４１】
蛍光標識したプローブの例としては、５’末端に蛍光色素が、３’末端にその蛍光色素の発するエネルギーを吸収する消光物質が結合したプローブ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（例えば、特開２００２−１１９２９１号公報参照）等が挙げられる。
【００４２】
以下、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）を例にして、本発明において使用できるプローブについて説明する。この態様では、消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計する。このように設計されたプローブの例としては、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有するものが挙げられる。
【００４３】
本発明における消光プローブは、上記のような塩基配列を有する他は、特開２００２−１１９２９１号公報に記載された消光プローブと同様でよい。本発明の使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号６〜１０に示すものが挙げられる。蛍光色素としては、特開２００２−１１９２９１号公報に記載されたものが使用できるが、具体例としては、ＦＡＭ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＢＯＤＩＰＹ（商標） ＦＬ等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報に記載の方法に従って行うことができる。
【００４４】
本発明定量方法は、特定のプライマーペアを用いてミトコンドリアＤＮＡのｍｔ３２４３変異を含む領域を増幅することの他は、蛍光色素の蛍光を測定することによるリアルタイムＰＣＲ法に従って行うことができる。本発明定量方法においては、上記プローブの存在下で増幅を行うが、用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。
【００４５】
本発明定量方法における代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００４６】
【表２】
ＤＮＡ断片 １０１〜１０８分子／反応
プライマー ２００〜１０００ｎＭ
プローブ １００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド 各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４〜９．０） ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ １０〜１００ｍＭ
グリセロール ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００４７】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１） 変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２） アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３） 伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００４８】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００４９】
本発明定量方法においては、ＰＣＲを行いながら検出も行うため、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、ＰＣＲを行いながら検出も行うため、検出に必要な時間も大幅に短縮出来る。さらに、増幅に必要な機器と同じ機器で検出するため、容器を移動する必要がない。よって、自動化も容易である。さらに、制限酵素を使用しないため定量性にも優れている。
【００５０】
この方法は感度も良く、ヘテロプラスミーの比率が１％以下でも検出可能である。従って、上記定量方法により、ｍｔ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、また、全ミトコンドリアＤＮＡを定量し、それらの定量結果からｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出することができる。すなわち、本発明は、ｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率の測定方法を提供する。本発明測定方法は、（ａ）本発明定量方法により、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、（ｂ）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法により、ミトコンドリアＤＮＡを定量し、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果から、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出することを含むを特徴とする。
【００５１】
（ｂ）の工程は、プライマーを、ｍｔ３２４３変異にかかわらずミトコンドリアＤＮＡを増幅できるように設定する他は（ａ）の工程と同様にして行うことができる。
【００５２】
（ｂ）の工程におけるＰＣＲに用いるプライマーペアは、通常のＰＣＲにおけるプライマーペアの設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマーペアの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一であること（通常には、相違が２℃以内）が好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）により算出した値である。（ｂ）の工程で使用されるプライマーペアは、（ａ）の工程で使用されるプライマーペアと大部分で重複していることが好ましい。このようにすることによって、プライマーペアの相違の増幅効率に対する影響が少なくなり、正確なヘテロプラスミーの比率を求めることができる。プライマーペアの例としては、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００５３】
（ａ）の工程では、変異型ミトコンドリアＤＮＡの定量値、（ｂ）の工程では、全ミトコンドリアＤＮＡの定量値が得られるので、（ａ）の定量値を（ｂ）の定量値で除算することによりヘテロプラスミーの比率が算出される。（ａ）及び（ｂ）の工程の定量結果は（ｃ）の工程で使用されるので、（ａ）及び（ｂ）の工程は同時に行ってもよいし、いずれを先に行ってもよい。
【００５４】
＜３＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明検出方法に用いるためのキットである。このキットは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００５５】
プライマーについては、本発明検出方法に関し、上記に説明した通りである。
【００５６】
本発明検出キットにおいてプライマーは、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。
【００５７】
本発明検出キットは、プライマーの他に、ＰＣＲおよび／または増幅産物の検出を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【００５８】
＜４＞本発明定量キット
本発明定量キットは、本発明定量方法に用いるためのキットである。このキットは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００５９】
本発明定量キットは、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブを含むことが好ましい。
【００６０】
プライマーおよび消光プローブについては、本発明の定量方法に関し、上記に説明した通りである。
【００６１】
本発明定量キットは、消光プローブの他に、本発明の定量方法におけるＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。本発明の定量キットを、ヘテロプラスミーの比率の測定に用いる場合には、本発明定量キットは、（ｂ）の工程で使用されるプライマーペアは、（ａ）の工程で使用されるプライマーペアと大部分で重複していることが好ましい。
【００６２】
本発明定量キットにおいて消光プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００６３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６４】
【実施例１】
ヒトミトコンドリア３２４３Ａ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３変異）の部位を含む塩基配列（配列番号２、塩基番号２４３がミトコンドリア遺伝子３２４３位に相当）に基づき、ｍｔ３２４３変異を含む部分を増幅できるように表３に示すプライマーを設計した。表３中、位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
次に、表４に示す、末端部にＣを有するプローブを設計した。表４中、位置は、配列番号１または２に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、ｍｔ３２４３変異の部位を示し、３’末端の（Ｐ）は、リン酸化されていることを示す。ＢＯＤＩＰＹ（商標） ＦＬによる標識は、常法に従って行った。
【００６７】
【表４】
【００６８】
ｍｔ３２４３変異周辺領域を組み込んだプラスミドをサンプルとし、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイム解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ４９０ｎｍ及び５３０ｎｍであった。
【００６９】
【表５】
反応液組成
１．正常型配列及び変異型配列の両方の定量の系（全ミトコンドリア数定量の系）
Ｈ２Ｏ １７．５７５μＬ
１０×Ｇｅｎｅ Ｔａｑバッファー ２．５μＬ
４０％ グリセロール １．８７５μＬ
１０ｍＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ ０．５μＬ
２Ｕ／μＬ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ ０．０５μＬ
５μＭ プローブ １μＬ
１００μＭ プライマーＦ−２４ ０．１２５μＬ
１００μＭ プライマーＲ−１９ ０．２５μＬ
５Ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ０．１２５μＬ
サンプル １μＬ
合計 ２５μＬ
２．変異型配列定量の系（変異を有するミトコンドリアの数の定量の系）
Ｈ２Ｏ １８．８２５μＬ
１０×Ｇｅｎｅ Ｔａｑバッファー ２．５μＬ
４０％ グリセロール ０．６２５μＬ
１０ｍＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ ０．５μＬ
２Ｕ／μＬ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ ０．０５μＬ
５μＭ プローブ １μＬ
１００μＭ プライマーＦ−２４ ０．１２５μＬ
１００μＭ プライマーＲ−ｍｔ−１６ ０．２５μＬ
５Ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ０．１２５μＬ
サンプル １μＬ
合計 ２５μＬ
【００７０】
【表６】
反応条件
５０℃，２ｍｉｎ
↓
９５℃，２ｍｉｎ
↓
９５℃，１０ｓｅｃ
５６℃，３０ｓｅｃ （５０サイクル）
【００７１】
サンプルとして、種々のコピー数で、正常型配列を有するプラスミドを含むサンプルを調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記１の系で定量を行った。結果を図１に示す。図から明らかなように、定量が可能なことが確認された。
【００７２】
サンプルとして、種々のコピー数で、変異型配列を有するプラスミドを含むサンプルを調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記２の系で定量を行った。結果を図２に示す。図から明らかなように、定量が可能なことが確認された。
【００７３】
サンプルとして、種々の比率で、変異型配列を有するプラスミドと正常型配列を有するプラスミドを含むサンプルとの混合物を調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記２の系で定量を行った。結果を図３に示す。同じサンプルを上記１の系で定量し、変異型配列の比率を算出すると、サンプルの調製時の比率と一致した結果が得られた。
【００７４】
プローブとして、プローブ５ＦＬ−１−２４、５ＦＬ−１−２６、５ＦＬ−１−２８及び５ＦＬ−ｍｕｔ−５−２３を用いた場合も同様の結果が得られた。
【００７５】
なお、図１〜３において、縦軸は、反応開始時を１００％としたときの蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数である。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を検出および定量する方法ならびにそのためのキットが提供される。
【００７７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−１９使用）による配列全体の定量の結果を示す。
【図２】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−ｍｔ−１６使用）による変異型配列の定量の結果を示す。
【図３】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−ｍｔ−１６使用）による変異遺伝子の割合の異なる試料における定量の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異の検出法および定量法ならびにそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミトコンドリアＤＮＡ ３２４３部位のＡ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３）は日本人糖尿病患者の１％に存在する変異で、単一遺伝子異常による糖尿病の中で、最も高頻度である。ミトコンドリア遺伝子異常の特徴の一つは正常と異常のミトコンドリアＤＮＡが様々な割合で共存することであり、この状態をヘテロプラスミーと呼ぶ。ｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率と病状の進行度には相関があるといわれており、病状の進行度や治療効果の測定に用いることが出来るのではないかと考えられる。
【０００３】
ｍｔ３２４３変異は変異が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、ＰＣＲで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）で検出を行うことが出来る（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
ＰＣＲは数分子の鋳型から数１０億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。ＰＣＲ−ＲＦＬＰはＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことが考えられる。
【０００５】
さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため自動化が困難である。さらに、ＰＣＲ時に変性およびアニーリングを繰り返すため、正常型の配列と変異型の配列が間違って結合してしまう。このような産物は制限酵素によって認識されないため切断されない（二本鎖の両方が変異型の場合のみ制限酵素が切断する）。よってヘテロプラスミーの割合を定量しようとしたときに、本来の値よりも変異型の割合が低下する。
【０００６】
一方、アレル特異的増幅法として、ＭＡＳＡ（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれる方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。この方法では、一方のプライマーの３’末端が変異塩基になるように設定されたプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより変異アレルが特異的に増幅される。
【０００７】
また、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中の核酸を定量する方法（リアルタイム定量的ＰＣＲ）が知られている。この方法に従ってＭＡＳＡ法を行い、ＭＡＳＡ法による増幅産物を定量できる。
【０００８】
【非特許文献１】
臨床病理、１９９６年、第４４巻、第８号、ｐ．７７８−７８２
【非特許文献２】
関谷剛男他編、「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで」、１９９７年、共立出版（株）、ｐ．１４０−１４２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ｍｔ３２４３変異を検出および定量する方法ならびにそのためのキットを提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ミトコンドリアＤＮＡにおいてｍｔ３２４３変異を含む特定の領域に基づいてプライマー対を設計することにより、ＭＡＳＡ法によりｍｔ３２４３変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１１】
（１） 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む検出方法。
【００１２】
（２） ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（１）の方法。
【００１３】
（３） 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む定量方法。
【００１４】
（４） 定量的ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる（３）の方法。
【００１５】
（５）（ａ）（３）又は（４）に記載の方法により、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、
（ｂ）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法により、ミトコンドリアＤＮＡを定量し、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果から、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出する
ことを含む、試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率の測定方法。
【００１６】
（６） （ｂ）の工程で用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる（５）の方法。
【００１７】
（７） 系が、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブを含み、前記蛍光色素の蛍光が測定される（３）〜（６）のいずれかの方法。
【００１８】
（８） （１）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
【００１９】
（９） 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（８）のキット。
【００２０】
（１０） （３）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
【００２１】
（１１） 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む（１０）のキット。
【００２２】
（１２） （５）の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む第１のプライマーペア、および、ミトコンドリアＤＮＡ定量用の第２のプライマーペアを含む前記キット。
【００２３】
（１３） 第１のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる（１２）のキット。
【００２４】
（１４） 第２のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる（１２）のキット。
【００２５】
（１５） ５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブをさらに含む（１０）〜（１４）のいずれかのキット。
【００２６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００２７】
試料は、ミトコンドリアを含むものであれば特に限定されない。例としては、血液、口腔スワブ、組織等を挙げることができる。これらの試料から、ミトコンドリアＤＮＡが調製される条件での通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。
【００２８】
本発明検出方法におけるＰＣＲは、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、特定のプライマーを使用する他は、通常の、ＰＣＲの方法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明において用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む。すなわち、ＰＣＲで用いられるプライマーの一方が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーである。
【００３０】
このプライマーの３’末端はｍｔ３２４３変異の部位であり、従って、このプライマーがアニールした場合のみ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こるため、変異型の配列を有するＤＮＡが特異的に増幅される。従って、増幅産物の検出によりｍｔ３２４３変異を有するＤＮＡが検出されることになる。
【００３１】
ＰＣＲに用いるプライマーは、ＰＣＲが可能な領域内に設定され、かつ、上記のように３’末端がｍｔ３２４３変異の部位になるようにされたプライマーを含む他は、通常のＰＣＲにおけるプライマーペアの設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマーペアの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一であること（通常には、相違が２℃以内）が好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）により算出した値である。プライマーペアの例としては、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００３２】
上記の特定の領域におけるプライマーペアの設定は、ＰＣＲの条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プライマーペアの設定は、プライマー設定用のコンピュータープログラムに基づいて行うことができる。
【００３３】
ＰＣＲの条件は、通常の、ＰＣＲの方法に従って設定すればよい。本発明検出方法における代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００３４】
【表１】
ＤＮＡ断片 １０１〜１０８分子／反応
プライマー ２００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド 各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４〜９．０） ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ １０〜１００ｍＭ
グリセロール ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００３５】
また、本発明検出方法における代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１） 変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２） アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３） 伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００３６】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００３７】
本発明検出方法における増幅産物の検出は、通常の、増幅産物の検出方法に従って行うことができる。例えば、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に付して検出してもよいし、増幅産物に結合して蛍光が変化する物質（例えば、二本鎖ＤＮＡに結合し、結合により蛍光強度が変化する蛍光色素等）の存在下で蛍光を測定してもよい。
【００３８】
＜２＞本発明定量方法
本発明定量方法は、試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００３９】
試料からのＤＮＡの調製およびプライマーは、本発明検出方法に関し説明した通りである。
【００４０】
増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する定量的ＰＣＲは、公知の方法に従って行うことができる。このような方法の例としては、増幅産物にハイブリダイゼーションする、蛍光標識したプローブを用いる方法、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する試薬を用いる方法等が挙げられる。
【００４１】
蛍光標識したプローブの例としては、５’末端に蛍光色素が、３’末端にその蛍光色素の発するエネルギーを吸収する消光物質が結合したプローブ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（例えば、特開２００２−１１９２９１号公報参照）等が挙げられる。
【００４２】
以下、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）を例にして、本発明において使用できるプローブについて説明する。この態様では、消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計する。このように設計されたプローブの例としては、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有するものが挙げられる。
【００４３】
本発明における消光プローブは、上記のような塩基配列を有する他は、特開２００２−１１９２９１号公報に記載された消光プローブと同様でよい。本発明の使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号６〜１０に示すものが挙げられる。蛍光色素としては、特開２００２−１１９２９１号公報に記載されたものが使用できるが、具体例としては、ＦＡＭ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＢＯＤＩＰＹ（商標） ＦＬ等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報に記載の方法に従って行うことができる。
【００４４】
本発明定量方法は、特定のプライマーペアを用いてミトコンドリアＤＮＡのｍｔ３２４３変異を含む領域を増幅することの他は、蛍光色素の蛍光を測定することによるリアルタイムＰＣＲ法に従って行うことができる。本発明定量方法においては、上記プローブの存在下で増幅を行うが、用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。
【００４５】
本発明定量方法における代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００４６】
【表２】
ＤＮＡ断片 １０１〜１０８分子／反応
プライマー ２００〜１０００ｎＭ
プローブ １００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド 各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４〜９．０） ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ １０〜１００ｍＭ
グリセロール ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００４７】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１） 変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２） アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３） 伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００４８】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００４９】
本発明定量方法においては、ＰＣＲを行いながら検出も行うため、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、ＰＣＲを行いながら検出も行うため、検出に必要な時間も大幅に短縮出来る。さらに、増幅に必要な機器と同じ機器で検出するため、容器を移動する必要がない。よって、自動化も容易である。さらに、制限酵素を使用しないため定量性にも優れている。
【００５０】
この方法は感度も良く、ヘテロプラスミーの比率が１％以下でも検出可能である。従って、上記定量方法により、ｍｔ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、また、全ミトコンドリアＤＮＡを定量し、それらの定量結果からｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出することができる。すなわち、本発明は、ｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率の測定方法を提供する。本発明測定方法は、（ａ）本発明定量方法により、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、（ｂ）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法により、ミトコンドリアＤＮＡを定量し、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果から、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出することを含むを特徴とする。
【００５１】
（ｂ）の工程は、プライマーを、ｍｔ３２４３変異にかかわらずミトコンドリアＤＮＡを増幅できるように設定する他は（ａ）の工程と同様にして行うことができる。
【００５２】
（ｂ）の工程におけるＰＣＲに用いるプライマーペアは、通常のＰＣＲにおけるプライマーペアの設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマーペアの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一であること（通常には、相違が２℃以内）が好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）により算出した値である。（ｂ）の工程で使用されるプライマーペアは、（ａ）の工程で使用されるプライマーペアと大部分で重複していることが好ましい。このようにすることによって、プライマーペアの相違の増幅効率に対する影響が少なくなり、正確なヘテロプラスミーの比率を求めることができる。プライマーペアの例としては、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００５３】
（ａ）の工程では、変異型ミトコンドリアＤＮＡの定量値、（ｂ）の工程では、全ミトコンドリアＤＮＡの定量値が得られるので、（ａ）の定量値を（ｂ）の定量値で除算することによりヘテロプラスミーの比率が算出される。（ａ）及び（ｂ）の工程の定量結果は（ｃ）の工程で使用されるので、（ａ）及び（ｂ）の工程は同時に行ってもよいし、いずれを先に行ってもよい。
【００５４】
＜３＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明検出方法に用いるためのキットである。このキットは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００５５】
プライマーについては、本発明検出方法に関し、上記に説明した通りである。
【００５６】
本発明検出キットにおいてプライマーは、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。
【００５７】
本発明検出キットは、プライマーの他に、ＰＣＲおよび／または増幅産物の検出を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
【００５８】
＜４＞本発明定量キット
本発明定量キットは、本発明定量方法に用いるためのキットである。このキットは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことを特徴とする。
【００５９】
本発明定量キットは、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブを含むことが好ましい。
【００６０】
プライマーおよび消光プローブについては、本発明の定量方法に関し、上記に説明した通りである。
【００６１】
本発明定量キットは、消光プローブの他に、本発明の定量方法におけるＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。本発明の定量キットを、ヘテロプラスミーの比率の測定に用いる場合には、本発明定量キットは、（ｂ）の工程で使用されるプライマーペアは、（ａ）の工程で使用されるプライマーペアと大部分で重複していることが好ましい。
【００６２】
本発明定量キットにおいて消光プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００６３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６４】
【実施例１】
ヒトミトコンドリア３２４３Ａ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３変異）の部位を含む塩基配列（配列番号２、塩基番号２４３がミトコンドリア遺伝子３２４３位に相当）に基づき、ｍｔ３２４３変異を含む部分を増幅できるように表３に示すプライマーを設計した。表３中、位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００６５】
【表３】
次に、表４に示す、末端部にＣを有するプローブを設計した。表４中、位置は、配列番号１または２に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、ｍｔ３２４３変異の部位を示し、３’末端の（Ｐ）は、リン酸化されていることを示す。ＢＯＤＩＰＹ（商標） ＦＬによる標識は、常法に従って行った。
【００６７】
【表４】
ｍｔ３２４３変異周辺領域を組み込んだプラスミドをサンプルとし、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイム解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ４９０ｎｍ及び５３０ｎｍであった。
【００６９】
【表５】
反応液組成
１．正常型配列及び変異型配列の両方の定量の系（全ミトコンドリア数定量の系）
Ｈ２Ｏ １７．５７５μＬ
１０×Ｇｅｎｅ Ｔａｑバッファー ２．５μＬ
４０％ グリセロール １．８７５μＬ
１０ｍＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ ０．５μＬ
２Ｕ／μＬ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ ０．０５μＬ
５μＭ プローブ １μＬ
１００μＭ プライマーＦ−２４ ０．１２５μＬ
１００μＭ プライマーＲ−１９ ０．２５μＬ
５Ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ０．１２５μＬ
サンプル １μＬ
合計 ２５μＬ
２．変異型配列定量の系（変異を有するミトコンドリアの数の定量の系）
Ｈ２Ｏ １８．８２５μＬ
１０×Ｇｅｎｅ Ｔａｑバッファー ２．５μＬ
４０％ グリセロール ０．６２５μＬ
１０ｍＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ ０．５μＬ
２Ｕ／μＬ ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ ０．０５μＬ
５μＭ プローブ １μＬ
１００μＭ プライマーＦ−２４ ０．１２５μＬ
１００μＭ プライマーＲ−ｍｔ−１６ ０．２５μＬ
５Ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ０．１２５μＬ
サンプル １μＬ
合計 ２５μＬ
【００７０】
【表６】
反応条件
５０℃，２ｍｉｎ
↓
９５℃，２ｍｉｎ
↓
９５℃，１０ｓｅｃ
５６℃，３０ｓｅｃ （５０サイクル）
【００７１】
サンプルとして、種々のコピー数で、正常型配列を有するプラスミドを含むサンプルを調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記１の系で定量を行った。結果を図１に示す。図から明らかなように、定量が可能なことが確認された。
【００７２】
サンプルとして、種々のコピー数で、変異型配列を有するプラスミドを含むサンプルを調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記２の系で定量を行った。結果を図２に示す。図から明らかなように、定量が可能なことが確認された。
【００７３】
サンプルとして、種々の比率で、変異型配列を有するプラスミドと正常型配列を有するプラスミドを含むサンプルとの混合物を調製し、プローブとして、プローブ５ＦＬ−３−３０を用いて、上記２の系で定量を行った。結果を図３に示す。同じサンプルを上記１の系で定量し、変異型配列の比率を算出すると、サンプルの調製時の比率と一致した結果が得られた。
【００７４】
プローブとして、プローブ５ＦＬ−１−２４、５ＦＬ−１−２６、５ＦＬ−１−２８及び５ＦＬ−ｍｕｔ−５−２３を用いた場合も同様の結果が得られた。
【００７５】
なお、図１〜３において、縦軸は、反応開始時を１００％としたときの蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数である。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を検出および定量する方法ならびにそのためのキットが提供される。
【００７７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−１９使用）による配列全体の定量の結果を示す。
【図２】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−ｍｔ−１６使用）による変異型配列の定量の結果を示す。
【図３】実施例１の方法（プライマーＦ−２４及びＲ−ｍｔ−１６使用）による変異遺伝子の割合の異なる試料における定量の結果を示す。
Claims (15)
- 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの検出方法であって、ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む検出方法。
- ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む請求項１に記載の方法。
- 試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法であり、定量的ＰＣＲで用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む定量方法。
- 定量的ＰＣＲで用いられるプライマーが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる請求項３に記載の方法。
- （ａ）請求項３または４に記載の方法により、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異を有するＤＮＡを定量し、
（ｂ）試料から得られるＤＮＡを鋳型として用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅産物を定量することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの定量方法であって、定量的ＰＣＲは、増幅産物の量に依存して蛍光が変化する系を用いて、蛍光の測定によりＰＣＲにおける増幅産物の定量をリアルタイムに行い、その結果に基づいてサンプル中のＤＮＡを定量する方法により、ミトコンドリアＤＮＡを定量し、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果から、ミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率を算出する
ことを含む、試料に含まれるミトコンドリアＤＮＡ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率の測定方法。 - （ｂ）の工程で用いられるプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる請求項５に記載の方法。
- 系が、５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブを含み、前記蛍光色素の蛍光が測定される請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１記載の検出方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
- 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む請求項８に記載のキット。
- 請求項３記載の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む前記キット。
- 配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーを含む請求項１０に記載のキット。
- 請求項５記載の方法のためのキットであって、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２４３から始まる１２〜３０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む第１のプライマーペア、および、ミトコンドリアＤＮＡ定量用の第２のプライマーペアを含む前記キット。
- 第１のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号５に示す塩基配列を示すプライマーからなる請求項１２に記載のキット。
- 第２のプライマーペアが、配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列を示すプライマーからなる請求項１２に記載のキット。
- ５’末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２１２もしくは２１５から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列または配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２２２から始まる１５〜４０塩基長の塩基配列を有する核酸プローブをさらに含む請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキット。
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