KR20210098411A

KR20210098411A - 신규한 황반변성 진단용 마커 및 황반변성 진단방법

Info

Publication number: KR20210098411A
Application number: KR1020210101393A
Authority: KR
Inventors: 이상섭; 장인진; 양재욱; 박규형; 우세준; 안지윤; 이이슬; 이금주; 이동주
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2021-08-10
Also published as: KR102314785B1; KR102313069B1; KR20160125155A

Abstract

본 발명은 신규한 황반변성 진단용 마커 및 황반변성 진단방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 C3 유전자의 H16Q 변이와 관련된 황반변성 진단용 조성물, 진단용 키트와 쟁거(Sanger) 시퀀싱, 멀티플렉스 파이로 시퀀싱 및 HRM 분석법과 같이 상기 유전자 변이를 신속하고도 정확하게 분석할 수 있는 신규한 황반변성 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황반변성 진단용 조성물, 진단용 키트 및 이를 진단하는 방법은, 황반변성을 효과적으로 진단할 수 있는 신규한 마커로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라, 신속하고 간편하게 분석할 수 있어, 황반변성 조기진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 황반변성 진단용 마커 및 황반변성 진단방법{A new marker for diagnosis of macular degeneration and a diagnostic method using the same}

본 발명은 신규한 황반변성 진단용 마커 및 황반변성 진단방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 C3 단백직의 H16Q 변이와 관련된 황반변성 진단용 조성물 및 진단용 마커와 쟁거(Sanger) 시퀀싱, 멀티플렉스 파이로 시퀀싱 및 HRM 분석법과 같이 상기 유전자 변이를 신속하고도 정확하게 분석할 수 있는 신규한 황반변성 진단방법에 관한 것이다.

눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직을 황반이라고 하는데, 빛 자극에 반응하는 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 연령관련 황반변성(AMD: Age-related Macular Degeneration)은 황반의 망막색소 상피와 부르크막 및 맥락막모세혈관의 변성을 특징으로 하는 만성 질환이다. 해부학적으로 감각신경망막은 망막색소 상피의 앞쪽에 위치하며 영양, 지지, 재순환 및 노폐물의 처리를 망막색소 상피에 의존한다. 브루크막은 5층으로 된 구조물로 맥락막과 망막색소 상피 사이에 끼어 있다. 가장 안쪽 층은 망막색소 상피의 기저막이고 가장 바깥쪽은 맥락막 모세혈관 내피세포의 기저막이다. 즉, 망막색소 상피와 부르크막 및 맥락막 모세혈관 복합체에 발생한 변성 질환이다.

이 질환은 50세 이상의 연령층에서 주로 발생하는데, 이미 서구에서는 60세 이상의 인구에서 실명의 가장 주된 원인이며 우리나라에서도 점점 증가하는 추세이다. 연령관련 황반변성의 원인에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 위험인자로 알려져 있는 것은 나이(특히 75세 이후 가파른 증가를 보인다), 가장 주목받는 환경적 요인인 흡연 외에도 고혈압, 비만, 유전적 소인, 과도한 자외선 노출, 낮은 혈중 항산화제 농도 등이 있다.

황반변성에는 건성(비삼출성) 황반변성과 습성(삼출성) 황반변성의 두 유형이 있다. 건성 황반변성(Dry AMD, Nonexudative AMD, Nonneovascular AMD)은 노폐물이 망막하에 드루젠(Drusen)이라는 황색 침전물을 형성하여 쌓이게 되는 것으로 이것이 커지게 되면 망막 특히 황반으로의 혈류를 방해하고 시야를 가리게 되어 시력에 장애가 오기 시작한다. 건성 황반변성은 급격한 시력 상실을 유발하지는 않지만 습성 황반변성으로 진행할 수 있다. 망막의 아래에는 섬유조직 내에 파묻힌 혈관 집합을 포함하는 맥락막 및 맥락막층을 덮고 있는 색소상피가 있다. 습성 황반변성(Wet AMD, Exudative AMD, Neovascular AMD)은 망막 아래 맥락막 부분에서 신생혈관이 자라서 생긴다. 이러한 약한 신생혈관이 터져서 출혈이 발생하고 삼출을 일으켜서 망막의 황반영역에 변성을 일으켜 시력장애가 발생하는 것이다. 습성 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수주 안에 시력이 급속히 나빠지기도 하고 2개월~3년 사이에 실명을 초래하기도 하는 것으로 알려져 있다.

진행성 황반변성 발생의 70%는 유전적 특성(CFH, ARMS2 등)에 의해 결정되고, 나머지 30%는 흡연, 습관과 같은 환경적 요인에 의해 결정된다고 알려져 있는데, 황반변성의 발생 위험과 관련성이 임상적으로 검증된 주요 위험유전자로 CFH, HTRA1, ARMS2, C2, C3, CFB등의 유전자가 보고되어 있다(Nat Genet. 2013 Apr;45(4):433-9, Nat Genet. 2013 Nov;45(11):1371-4). 그러나, 이러한 유전자 변이는 서구인을 대상으로 연구된 것으로, 아시아인(한국인, 일본인, 중국인 등)을 대상으로 한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다. 따라서 극동 아시아인에서 황반변성 질환의 발병과 관련되거나 안전성을 예측할 수 있는 추가적인 다형성의 확인을 이용하고자 하는 요구가 늘고 있다.

한편, 차세대 시퀀싱(NGS)은 DNA 염기서열을 모두 읽어내는 기술 방법으로 2007년 Solexa가 Illumina 사에 합병되면서 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)이라는 용어가 사용되기 시작하였고, 현재는 2세대에 해당하며, NGS 기술의 발달에 힘입어 대용량 염기서열 정보를 전통적인 방법들에 비해 보다 쉽고 저렴한 비용으로 분석할 수 있게 되었다.

이러한 차세대 시퀀싱을 통해 분석된 DNA 염기서열 정보는 개인차 및 민족적 특성을 파악하거나 유전자 이상과 관련된 질환에서 염색체 이상을 포함한 선천성 원인의 규명, 그리고 황반변성, 당뇨병, 고혈압과 같은 복합질병을 억제하는 유전자의 결함을 손쉽게 찾을 수 있으며, 또한 유전자 발현, 유전자 다양성 및 그 상호작용 등의 정보들을 분자 진단과 치료의 영역에서 폭넓게 활용할 수 있어 매우 중요하다 할 것이다.

이에 본 발명자들은 황반변성 질환에 대한 관련있는 유전자 세트를 차세대 시퀀싱을 통해 분석하여 황반변성 위험도 예측과 관련된 신규 변이 유전자 8종(CFH Y56C, CFH L77S, CFH D798E, CFH F176L, CFB G208S, CFB V716L, C3 R1134Q, CFI M204R)과 질환 유전자 변이 3종(CFH G1110A, C3 A636S, C3 H16Q)을 발굴하였고, 이렇게 발굴된 11종 유전자 변이는 유전자 분석(HRM, Taq-man assays) 방법을 통하여 질환군에서만 발견되는 변이임을 다시한번 확인하였다.

1. Nat Genet. 2013 Apr;45(4):433-9. 2. Nat Genet. 2013 Nov;45(11):1371-4.

따라서 본 발명의 목적은 황반변성 발생 위험도를 예측하고, 그 예후 및 치료 경과를 추정할 수 있는 황반변성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 진단용 조성물을 포함하는 황반변성 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 황반변성의 신속하고 정확한 분석을 위하여 황반변성 위험도와 관련된 유전자의 변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 황반변성 특이적 돌연변이 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 C3 단백질의 H16Q 돌연변이와 이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 황반변성 진단용 조성물에 대해 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 14의 조합으로 구성된 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 황반변성 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RT-PCR 키트는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 14로 구성된 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 칩 키트는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 황반변성 진단용 조성물, 진단용 키트 및 이를 진단하는 방법은, 황반변성을 효과적으로 진단할 수 있는 신규한 마커로서, 민감도가 우수할 뿐만 아니라, 신속하고 간편하게 분석할 수 있어, 황반변성 조기진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 CFH Y56C, CFH L77S, CFH D798E, CFH G1110A, CFH F176L, C3 H16Q, C3 A636S, C3 R1134Q, CFB G208S, CFB V716L, CFI M204R, CFB G208S, CFB V716L, CFI M204R의 Sanger 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 CFH 56YY, CFH 77LL 타입의 멀티플렉스 파이로 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 CFH 56YY, CFH 77LS 타입의 멀티플렉스 파이로 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CFH 56YC, CFH 77LL 타입의 멀티플렉스 파이로 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 CFH 1110 GG 타입(붉은색), CFH 1110 GA 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 6은 CFH 176 FF 타입(붉은색), CFH 176FL 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 7은 C3 16HH 타입(붉은색), C3 16HQ 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 8은 C3 636AA 타입(붉은색), C3 636AS 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 9는 C3 1134RR 타입(붉은색), C3 1134RQ 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 10은 CFB 208GG 타입(붉은색), CFB 208GS 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 11은 CFB 716VV 타입(붉은색), CFB 716VL 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.
도 12는 CFI 204MM 타입(붉은색), CFI 204MR 타입(푸른색)의 Aligned Melt Curve 와 Difference Plot 을 HRM assay로 분석한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어의 정의는 다음과 같다.

'유전적 다형성(Genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다. SNP에 의한 염기서열의 변이가 아미노산의 변화를 초래하는 경우를 Nonsynonymous SNP라고 하고, 아미노산의 변화를 일으키지 않는 경우를 Silent SNP 또는 Synonymous SNP라 한다.

'다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, Y402H CFH는 CFH 유전자 중 아미노산 위치 402가 티로신(Y)과 히스티딘(H) 사이에서 변화됨을 나타낸다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다(예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용 가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database(dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다.

'유전자형'이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다. 상기 예에서, CC, CT 또는 TT가 Y402H CFH 다형성에서의 가능한 유전자형이다

'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물(예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

'핵산'은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 '핵산'이라는 용어와 '뉴클레오티드'가 병용하여 쓰이고 있다.

'프라이머'는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

'다형성과 연관된 질환 및 상태'는 다양한 질환 또는 상태, 즉 하나 이상의 대립유전자의 동일화에 근거한 피험체에서 표시될 수 있는 감수성을 나타낸다.

'위험'은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

'표현형'은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(Alleles)을 말한다.

'대상' 또는 '환자'는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

'조직 또는 세포 샘플'은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

'유효량'은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

'치료하는'이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

본 발명에서 기술된 HRM assay는 Real time PCR 실험 기법 중 하나로 Tm 값의 차이를 이용하여, 소량의 게놈 DNA로도 Genotyping 유전형 분석이 가능한 방법이다. HRM assay는 실험 비용이 저렴하고, 프라이머 디자인이 프로브에 비해 간단하며, 분석시간이 단축되는 분석방법으로, 샘플의 양이 방대한 스크리닝 등에 활용될 수 있다. HRM assay에 사용되는 dsDNA intercalating dyes로는 SYBR^® GREEN, SYTO9^®, LCGreen^®, EvaGreen 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 SYTO9^® 사용할 수 있다.

HEM assay는 PCR과 다른 분석법으로, PCR이 완료된 후 dsDNA에서 유전자 변이가 있는지 판별하기 위한 Post-PCR 분석방법으로 활용될 수 있다. 즉, DNA 증폭이 아닌 유전자 변이 유무의 판별을 목적으로 활용될 수 있으며, dsDNA에 결합하는 형광물질을 PCR 반응시 첨가하면 PCR 과정에서 형광감지가 가능하여 제한효소 처리 후 전기영동이나 Sanger 시퀀싱 같은 추가 과정 없이 빠른 시간 내 유전자 변이 유무를 확인할 수 있다.

차세대 시퀀싱은 DNA 서열분석 방법의 하나로 개인유전체를 분석하여 변이(Variants)들을 발굴하는 기술로, 시퀀싱 반응을 동시에 엄청난 양으로 진행하기 때문에 빠른 시간에 30억 개가 넘는 유전체에 대한 정보를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 황반변성 환자 298명과 대조군 188명에 대해 차세대 시퀀싱 분석을 하여 황반변성에서만 발현되는 신규한 변이 11증을 발견하였다.

실시예 1: 차세대 시퀀싱(NGS)을 이용한 변이 유전자 발굴

질환군과 대조군의 피험자의 혈액을 채혈한 후, Qiagen사의 Genomic DNA 분리 키트를 사용하여 DNA를 분리하였다.

Illumina HiSeq.시퀀싱 기기로 DNA 염기서열을 분석하였다. 분석 결과, 황반변성 질환군에서만 신규 변이 유전자 8종(CFH Y56C, CFH L77S, CFH D798E, CFH F176L, CFB G208S, CFB V716L, C3 R1134Q, CFI M204R,)과 변이 유전자 3종(CFH G1110A, C3 A636S, C3 H16Q)이 확인되었다. 이러한 유전자는 Sanger 시퀀싱을 통해 유전자 변위의 진위를 확인하였다.

차세대 시퀀싱-targeted NGS는 특정 부분의 유전자 혹은 유전체 영역에 집중해서 시퀀싱하는 방법으로, 특정 영역을 Capture 할 수 있는 특정 Kit를 제작하여 Capture한 후 Amplification(증폭)한 후 시퀀싱을 수행하여 Raw 데이터를 얻어서 분석한다.

아래와 같이 각 유전자 별로 보았을 때, CFH는 20X 이상의 Coverage는 평균 99.7%, 100X이상의 Coverage는 평균 94.3%이고, CFB는 20X 이상의 Coverage는 평균 100%, 100X 이상의 Coverage는 평균 95.4%, C3는 20X 이상의 Coverage는 평균 98.1%, 100X 이상의 Coverage는 평균 62.7%로 나타나, 각 유전자의 뎁스(Depth)에 따른 차세대 시퀀싱 평균 커버리지 결과는 하기 표 1과 같고, Sanger 시퀀싱 확인 결과는 도 1과 같다.

유전자	Coverage
유전자	1X	5X	10X	20X	30X	40X	50X	100X
CFH	100.0	100.0	99.9	99.7	99.4	99.0	98.4	94.3
CFB	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	99.9	99.7	95.4
C3	100.0	100.0	99.8	98.1	94.2	89.9	85.6	62.7

실시예 2: 신규변이유전자의 고속변이 유전형 분석법 구축

질환군 변이 11종(CFH Y56C, CFH L77S, CFH D798E, CFH G1110A, CFH F176L, CFB G208S, CFB V716L, CFI M204R, C3 R1134Q, C3 A636S, C3 H16Q)의 전체 염기 서열을 자동 염기서열 분석기와 차세대 시퀀싱 분석기를 이용하여 확인하였다. 한편, 질환군 예측을 위한 주요 변이 SNP에 대한 고속변이 유전형 분석법을 개발하였다. 자세하게는 CFH 유전자 2종- CFH Y56C, CFH L77S -의 multiplex-pyrosequencing 방법을 실시하였고, CFH 변이 유전자 2종(CFH F176L, CFH G1110A), CFB 2종(CFB G208S, CFB V716L), C3 변이 유전자 3종(C3 H16Q, C3 A636S, C3 R1134Q), CFI M204R 에 대해서 HRM assay를 수행하였다.

실시예 2-1: Multiplex-pyrosequencing을 이용한 변이유전자의 고속 검사법

Primer 이름	Primer 서열 (5'~3')	서열번호	크기 (bp)
CFH_Y56C/L77S_F	TCC AGA AGG CAC CCA GGC TA	서열번호 1	338
CFH_Y56C/L77S_BR*	CCA GGC GAT AGA GGG AGA CT	서열번호 2	338

(*: 5' 말단에 Biotin을 붙혀서 제작한 것이다.)

PCR product	반응조건
CFH_Y56C/L778	94℃ 5분, (94℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72℃30초) 35 cycles, 72℃ 5분

Primer 이름	Primer 서열 (5'~3')	서열번호
CFH_Y56C_SF	CTA TAA ATG CCG CCC TGG AT	서열번호 3
CFH_L77S_SF	AGA ATG GGT TGC TCT TAA TC	서열번호 4

실시예 2-2: HRM assay를 이용한 변이유전자의 고속 검사법

HRM assay는 Real time PCR 실험 기법 중 하나로 Tm 값의 차이를 이용하여 소량의 게놈 DNA(100pg~10ng)만으로도 Genotyping 유전형 분석이 가능한 방법으로, 본 발명에서는 하기와 같은 프라이머와 PCR 조건에 따라 HRM assay를 진행하였다.

Primer 이름	Primer 서열 (5'~3')	서열번호	크기 (bp)
CFH_G1110A_F	AGT GCT GTG TTT GCG TTT GC	서열번호 5	178
CFH_G1110A_R	CAA CTG ATG AAG CTG GAG CA	서열번호 6	178
CFH_F176L _F	CCA GTG ACA GCA CCA GAG AA	서열번호 7	156
CFH_F176L _R	ACT CCA AAA ACC ATC GTC TGA	서열번호 8	156
CFB_G208S_F	TTG CTC TCT ACC TTG CTC ACG	서열번호 9	309
CFB_G208S_R	GAG GTG GGG AGA GAA GAC AGT	서열번호 10	309
CFB_V716L_F	TGT CTT GCC TGC GTG TGT CA	서열번호 11	234
CFB_V716L_R	TGT GAA AGT CTC GGG CGT GA	서열번호 12	234
C3_H16Q_F	GCT GCT CCT GCT ACT AAC CC	서열번호 13	187
C3_H16Q_R	CCA AAT GTC TGC TTC CAC CC	서열번호 14	187
C3_A636S _F	GGT GGA GAA GGC AGA CAT CG	서열번호 15	95
C3_A636S _R	CAC TGC TGC TCG TGA AGG TCA	서열번호 16	95
C3_R1134Q_F	CCA TCC TTG CTT TCT GCT CT	서열번호 17	173
C3_R1134Q_R	GCA TCG GGT AAG GTA GGG TA	서열번호 18	173
CFI_M204R_F	CAT TGC CGA GGA TTA GAG ACC	서열번호 19	116
CFI_M204R_R	CTC CAC CAA CCT GCT TTC TG	서열번호 20	116

조성	부피(ul/sample)
2X buffer	10
MeltDoctor™	1
Forward primer(5pmol/ul)	1
Reverse primer(5pmol/ul)	1
genomic DNA(20ng/ul)	2
ultra pure D.W	5
합계	20

PCR product	반응조건
CFH_G1110A	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
CFH 176L	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
CFB_G208S	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
CFB_V716L	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
C3_H16Q	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
C3_A636S	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
C3_R1134Q	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초
CFI_M204R	95℃ 10분, (95℃ 15초, 60 ℃ 15초, 72℃15초) 35 cycles, 95℃ 10초, 60℃ 1분, 95℃ 15초, 60℃ 15초

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> A new marker for diagnosis of macular degeneration and a diagnostic method using the same <130> PN1501-031 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH Y56C/L77S PCR forward primer <400> 1 tccagaaggc acccaggcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH Y56C/L77S PCR reverse primer <400> 2 ccaggcgata gagggagact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH Y56C sequencing primer <400> 3 ctataaatgc cgccctggat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH L77S sequencing primer <400> 4 agaatgggtt gctcttaatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH G1110A PCR forward primer <400> 5 agtgctgtgt ttgcgtttgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH G1110A PCR reverse primer <400> 6 caactgatga agctggagca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH F176L PCR forward primer <400> 7 ccagtgacag caccagagaa 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH F176L PCR reverse primer <400> 8 actccaaaaa ccatcgtctg a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB G208S PCR forward primer <400> 9 ttgctctcta ccttgctcac g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB G208S PCR reverse primer <400> 10 gaggtgggga gagaagacag t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB V716L PCR forward primer <400> 11 tgtcttgcct gcgtgtgtca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB V716L PCR reverse primer <400> 12 tgtgaaagtc tcgggcgtga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 H16Q PCR forward primer <400> 13 gctgctcctg ctactaaccc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 H16Q PCR reverse primer <400> 14 ccaaatgtct gcttccaccc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 A636S PCR forward primer <400> 15 ggtggagaag gcagacatcg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 A636S PCR reverse primer <400> 16 cactgctgct cgtgaaggtc a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 R1134Q PCR forward primer <400> 17 ccatccttgc tttctgctct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 R1134Q PCR reverse primer <400> 18 gcatcgggta aggtagggta 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFI M204R PCR forward primer <400> 19 cattgccgag gattagagac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFI M204R PCR reverse primer <400> 20 ctccaccaac ctgctttctg 20 <210> 21 <211> 1231 <212> PRT <213> Homo sapiens CFH amino acids sequence <400> 21 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His 930 935 940 Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe 945 950 955 960 Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu 965 970 975 Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu 980 985 990 Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr 995 1000 1005 Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met 1010 1015 1020 Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn 1045 1050 1055 Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg 1060 1065 1070 Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu 1075 1080 1085 Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp 1090 1095 1100 Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr 1125 1130 1135 Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys 1140 1145 1150 Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1155 1160 1165 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr 1170 1175 1180 Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr 1205 1210 1215 Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1220 1225 1230 <210> 22 <211> 764 <212> PRT <213> Homo sapiens CFB amino acids sequence <400> 22 Met Gly Ser Asn Leu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Met Pro Phe Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Ser Gly Gly Val Thr Thr Thr Pro Trp 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taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040 ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100 tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160 gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220 cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280 cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340 tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400 gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460 cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520 gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580 ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640 attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700 tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760 agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820 gttgtagctc 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gtgcagaacc cccgagcaga agacctggtg 960 gggaagtctt tgtacgtgtc tgccaccgtc atcttgcact caggcagtga catggtgcag 1020 gcagagcgca gcgggatccc catcgtgacc tctccctacc agatccactt caccaagaca 1080 cccaagtact tcaaaccagg aatgcccttt gacctcatgg tgttcgtgac gaaccctgat 1140 ggctctccag cctaccgagt ccccgtggca gtccagggcg aggacactgt gcagtctcta 1200 acccagggag atggcgtggc caaactcagc atcaacacac accccagcca gaagcccttg 1260 agcatcacgg tgcgcacgaa gaagcaggag ctctcggagg cagagcaggc taccaggacc 1320 atgcaggctc tgccctacag caccgtgggc aactccaaca attacctgca tctctcagtg 1380 ctacgtacag agctcagacc cggggagacc ctcaacgtca acttcctcct gcgaatggac 1440 cgcgcccacg aggccaagat ccgctactac acctacctga tcatgaacaa gggcaggctg 1500 ttgaaggcgg gacgccaggt gcgagagccc ggccaggacc tggtggtgct gcccctgtcc 1560 atcaccaccg acttcatccc ttccttccgc ctggtggcgt actacacgct gatcggtgcc 1620 agcggccaga gggaggtggt ggccgactcc gtgtgggtgg acgtcaagga ctcctgcgtg 1680 ggctcgctgg tggtaaaaag cggccagtca gaagaccggc agcctgtacc tgggcagcag 1740 atgaccctga agatagaggg tgaccacggg 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gccttctgca gcctggccac caccaagagg 2640 cgtcaccagc agaccgtaac catccccccc aagtcctcgt tgtccgttcc atatgtcatc 2700 gtgccgctaa agaccggcct gcaggaagtg gaagtcaagg ctgctgtcta ccatcatttc 2760 atcagtgacg gtgtcaggaa gtccctgaag gtcgtgccgg aaggaatcag aatgaacaaa 2820 actgtggctg ttcgcaccct ggatccagaa cgcctgggcc gtgaaggagt gcagaaagag 2880 gacatcccac ctgcagacct cagtgaccaa gtcccggaca ccgagtctga gaccagaatt 2940 ctcctgcaag ggaccccagt ggcccagatg acagaggatg ccgtcgacgc ggaacggctg 3000 aagcacctca ttgtgacccc ctcgggctgc ggggaacaga acatgatcgg catgacgccc 3060 acggtcatcg ctgtgcatta cctggatgaa acggagcagt gggagaagtt cggcctagag 3120 aagcggcagg gggccttgga gctcatcaag aaggggtaca cccagcagct ggccttcaga 3180 caacccagct ctgcctttgc ggccttcgtg aaacgggcac ccagcacctg gctgaccgcc 3240 tacgtggtca aggtcttctc tctggctgtc aacctcatcg ccatcgactc ccaagtcctc 3300 tgcggggctg ttaaatggct gatcctggag aagcagaagc ccgacggggt cttccaggag 3360 gatgcgcccg tgatacacca agaaatgatt ggtggattac ggaacaacaa cgagaaagac 3420 atggccctca cggcctttgt tctcatctcg 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ctcaagagga tctggtggag aaaaagtgct tagcaaaaaa atatactcac 120 ctctcctgcg ataaagtctt ctgccagcca tggcagagat gcattgaggg cacctgtgtt 180 tgtaaactac cgtatcagtg cccaaagaat ggcactgcag tgtgtgcaac taacaggaga 240 agcttcccaa catactgtca acaaaagagt ttggaatgtc ttcatccagg gacaaagttt 300 ttaaataacg gaacatgcac agccgaagga aagtttagtg tttccttgaa gcatggaaat 360 acagattcag agggaatagt tgaagtaaaa cttgtggacc aagataagac aatgttcata 420 tgcaaaagca gctggagcat gagggaagcc aacgtggcct gccttgacct tgggtttcaa 480 caaggtgctg atactcaaag aaggtttaag ttgtctgatc tctctataaa ttccactgaa 540 tgtctacatg tgcattgccg aggattagag accagtttgg ctgaatgtac ttttactaag 600 agaagaacta tgggttacca ggatttcgct gatgtggttt gttatacaca gaaagcagat 660 tctccaatgg atgacttctt tcagtgtgtg aatgggaaat acatttctca gatgaaagcc 720 tgtgatggta tcaatgattg tggagaccaa agtgatgaac tgtgttgtaa agcatgccaa 780 ggcaaaggct tccattgcaa atcgggtgtt tgcattccaa gccagtatca atgcaatggt 840 gaggtggact gcattacagg ggaagatgaa gttggctgtg caggctttgc atctgtggct 900 caagaagaaa cagaaatttt gactgctgac atggatgcag aaagaagacg gataaaatca 960 ttattaccta aactatcttg tggagttaaa aacagaatgc acattcgaag gaaacgaatt 1020 gtgggaggaa agcgagcaca actgggagac ctcccatggc aggtggcaat taaggatgcc 1080 agtggaatca cctgtggggg aatttatatt ggtggctgtt ggattctgac tgctgcacat 1140 tgtctcagag ccagtaaaac tcatcgttac caaatatgga caacagtagt agactggata 1200 caccccgacc ttaaacgtat agtaattgaa tacgtggata gaattatttt ccatgaaaac 1260 tacaatgcag gcacttacca aaatgacatc gctttgattg aaatgaaaaa agacggaaac 1320 aaaaaagatt gtgagctgcc tcgttccatc cctgcctgtg tcccctggtc tccttaccta 1380 ttccaaccta atgatacatg catcgtttct ggctggggac gagaaaaaga taacgaaaga 1440 gtcttttcac ttcagtgggg tgaagttaaa ctaataagca actgctctaa gttttacgga 1500 aatcgtttct atgaaaaaga aatggaatgt gcaggtacat atgatggttc catcgatgcc 1560 tgtaaagggg actctggagg ccccttagtc tgtatggatg ccaacaatgt gacttatgtc 1620 tggggtgttg tgagttgggg ggaaaactgt ggaaaaccag agttcccagg tgtttacacc 1680 aaagtggcca attattttga ctggattagc taccatgtag gaaggccttt tatttctcag 1740 tacaatgtat aa 1752

Claims

C3 단백질의 H16Q 돌연변이와 이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 14의 조합으로 구성된 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 황반변성 진단용 키트.
제5항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 RT-PCR 키트가 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 키트.
제7항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 13 및 14로 구성된 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 마이크로어레이 칩 키트가 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 단백질 칩 키트가 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 황반변성 진단용 키트.