ES2622885T3 - Cebadores polinucleótidos para detectar mutaciones PIK3CA - Google Patents

Cebadores polinucleótidos para detectar mutaciones PIK3CA Download PDF

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Abstract

Un método para la detección de la presencia o ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de: a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con un primer cebador y un segundo cebador y llevar a cabo PCR en la mezcla; y b) detectar hibridación del primer cebador con la muestra de ácido nucleico, en donde la hibridación indica la presencia de una mutación, en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante H1047R del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleótidos finales en el extremo 3' del primer cebador son idénticos a los seis nucleótidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO. 21, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante más fácilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la región de la que es complementario el primer cebador.

Description

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DESCRIPCION
Cebadores polinucleotidos para detectar mutaciones PIK3CA Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para la deteccion de la presencia o ausencia de mutaciones en un gen, un kit que comprende polinucleotidos y el uso del kit.
Antecedentes de la tecnica
Las fosfatidilinositol 3-cinasas (PI3K) son una gran familia de cinasas lipfdicas involucradas en la senalizacion celular. La v^a P13K-AKT es activada en varios tipos de tumores, lo que genera anomalfas de crecimiento, proliferacion y supervivencia celular (agregar referencia de 1 revision reciente). Recientemente, se han identificado mutaciones en la subunidad catalttica de la clase 1A P13K (PIK3CA) en canceres humanos[1]. La funcion exacta de estas mutaciones en la carcinogenesis aun debe definirse claramente, pero con los constantes desarrollos de varios inhibidores de P13K diana, la deteccion de las mutaciones sera cada vez mas importante para la seleccion de los pacientes. Los desaffos tecnicos en la deteccion de dichas mutaciones surgen debido a las limitaciones de las biopsias tumorales que solamente pueden contener pequenas cantidades de las secuencias mutadas. Ademas, el ADN que se extrae del tejido sumergido en parafina a menudo esta degradado y es de mala calidad. El nivel mmimo de ADN mutante necesario para la deteccion mediante secuenciacion es del 15-25 % y, por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar ensayos sensibles que puedan detectar pequenas cantidades de alelos mutados en una muestra heterogenea y los productos necesarios para llevar a cabo los ensayos.
La presente invencion intenta abordar esta necesidad.
Descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona analisis sensibles y solidos para las mutaciones de PIK3CA transmitidas por tumores.
En una realizacion, la invencion se refiere a un metodo para la deteccion de la presencia o ausencia de una mutacion en el gen PIK3CA que comprende las etapas de:
a) mezclar una muestra de acido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con un primer cebador y un segundo cebador y llevar a cabo PCR en la mezcla; y
b) detectar hibridacion del primer cebador con la muestra de acido nucleico, en donde la hibridacion indica la presencia de una mutacion,
en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante H1047R del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleotidos finales en el extremo 3' del primer cebador son identicos a los seis nucleotidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO. 21, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante mas facilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una region del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la region de la que es complementario el primer cebador.
Preferiblemente, el segundo cebador comprende una secuencia segun la SEQ ID NO. 35
Preferiblemente, el metodo comprende ademas la etapa de, antes de la etapa a), amplificar la cantidad de copias del fragmento del gen PIK3CA usando amplificacion de acidos nucleicos por ciclacion termica, preferiblemente PCR.
De manera ventajosa, la etapa b) comprende llevar a cabo polimerizacion de ADN usando el polinucleotido como un primer cebador y detectar el producto de extension de la polimerizacion.
Convenientemente, la etapa b) comprende la etapa de mezclar la muestra de acido nucleico y el polinucleotido con un segundo cebador que corresponde a una region del fragmento de la secuencia de PIK3CA corriente abajo de la region de la que es complementario el polinucleotido y llevar a cabo PCR en la mezcla.
De manera alternativa, el metodo comprende ademas la etapa de llevar a cabo PCR en la muestra usando cebadores de control y comparar la amplificacion del gen PIK3CA con la amplificacion usando el polinucleotido y el segundo cebador.
De manera ventajosa, los cebadores de control comprenden las SEQ ID NO 37 y 39.
Convenientemente, el polinucleotido comprende un grupo inactivador y un grupo fluoroforo y en donde la etapa b) comprende exponer la mezcla a la luz de una longitud de onda a la que responde el fluoroforo en ausencia del grupo inactivador y detectar la luz a la longitud de onda emitida por el grupo fluoroforo en ausencia del grupo inactivador.
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Es preferible que el gen PIK3CA sea la secuencia disponible como numero de acceso GenBank NM 006218, version numero NM 006218.2 Gl:54792081.
En la presente memoria descriptiva, "ARMS" es el sistema de mutacion refractario a la amplificacion descrito en, por ejemplo, EP-A-0332435.
Cuando se haga referencia en la presente memoria descriptiva a un porcentaje de un polinucleotido en comparacion con un polinucleotido de referencia, esto se puede determinar mediante los algoritmos conocidos en la tecnica.
Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando el algoritmo BLASTP, version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res, 25:3389-3402) usando los parametros por defecto.
La invencion se refiere a un kit que comprende al menos dos cebadores, en donde el primer cebador es un cebador directo, y en donde el segundo cebador es un cebador inverso, en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante H1047R del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleotidos finales en el extremo 3' del primer cebador son identicos a los seis nucleotidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO.21, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante mas facilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una region del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la region de la que el primer cebador es complementario.
Preferiblemente, el segundo cebador en el kit comprende una secuencia segun la SEQ ID NO. 35.
La invencion tambien se refiere al uso de un kit de acuerdo con la invencion para la deteccion de una mutacion en una muestra de acido nucleico que contiene al menos un fragmento del gen PIK3CA.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de llevar a cabo deteccion y secuenciacion Scorpions en muestras que contienen el gen PIK3CA mutannte.
Descripcion detallada
Las realizaciones de la presente invencion proporcionan cebadores de polinucleotidos que se pueden utilizar en ensayos para la deteccion de mutaciones del gen PIK3CA en una muestra que contiene acidos nucleicos.
En realizaciones espedficas, los cebadores de polinucleotidos son cebadores directos e inversos que se hibridan con el gen PIK3CA para permitir que ocurra una reaccion de amplificacion por PCR. Por lo tanto, el cebador directo se hibrida corriente arriba de y hacia la cadena opuesta del cebador inverso y los cebadores directos e inversos en conjunto definen una secuencia de amplicon que se amplifica durante la PCR. La secuencia del cebador directo se selecciona de manera de que no sea complementaria de la secuencia de tipo silvestre, pero pueda hibridarse con una secuencia de PIK3CA mutante.
A los efectos de detectar la presencia del gen PIK3CA mutante en la muestra, se mezclan los cebadores con la muestra. Luego, los agentes necesarios para la PCR (nucleotidos trifosfatos apropiados, enzima de polimerasa de ADN y una solucion amortiguadora) se agregan a la muestra y se lleva a cabo la PCR. Si la muestra contiene la secuencia mutante con la cual se puede hibridar el cebador directo, se amplifica el amplicon durante la PCR y, por lo tanto, se indica la presencia de la secuencia mutante en la muestra, si la muestra no contiene la secuencia mutante, el cebador directo se une a la secuencia de PIK3CA con baja eficacia y, por lo tanto, no se produce amplificacion, o muy poca, de la secuencia de amplicon.
A los efectos de detectar la mutacion H1047R, la secuencia de cebador directo es preferiblemente la SEQ ID NO. 21. Sin embargo, debe reconocerse que la secuencia exacta del cebador directo no necesariamente tiene que ser identica a esta secuencia, siempre que el cebador directo se hibride con la secuencia mutante mas facilmente que con la secuencia de tipo silvestre. En la secuencia que se establecio anteriormente, son los seis nucleotidos finales (es decir, los nucleotidos en el extremo 3') de los cebadores los que proporcionan la especificidad de union, por lo tanto, estos nucleotidos deben ser identicos a la secuencia proporcionada.
A los efectos de detectar la presencia de los amplicones formados en la muestra, el cebador inverso es un cebador denominado "Scorpions" en las realizaciones de la presente invencion. Se proporcionan detalles de los cebadores Scorpions en WO-A-99/066071. Un cebador Scorpions comprende una secuencia cebadora complementaria de una primera secuencia diana de un gen (en la presente invencion, PIK3CA) y una secuencia de cola que comprende una secuencia de sonda flanqueada por dos secuencias mutuamente complementarias. Se proporciona un resto de bloqueo de polimerasa de ADN (tal como el monomero hexetilenglicol (HEG)) entre la secuencia cebadora y la secuencia de cola. Se proporciona un grupo fluoroforo en un extremo de la secuencia de cola y se proporciona un grupo inactivador en el otro extremo de la secuencia de cola. En el uso, la secuencia cebadora del cebador Scorpions actua como un cebador inverso durante la PCR de la manera normal y, por lo tanto, todo el cebador
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Scorpions, incluida la secuencia de cola, se incorpora a cada amplicon. El resto de bloqueo de la polimerasa de ADN evita la duplicacion de la secuencia de cola. Por lo tanto, las secuencias mutuamente complementarias en la secuencia de cola tienen la tendencia a hibridarse entre sf, acercando el grupo fluoroforo y el grupo inactivador y evitando la emision del grupo fluoroforo. Sin embargo, si el amplicon contiene una segunda secuencia diana complementaria de la secuencia de sonda, la secuencia de sonda se une preferiblemente a la segunda secuencia diana, separando las secuencias mutuamente complementarias. Esto hace que el grupo fluoroforo y el grupo inactivador se separen en el espacio de manera que el grupo fluoroforo emita luz de una longitud de onda en respuesta a la luz incidente de otra longitud de onda. Por consiguiente, el cebador Scorpions permite la facil deteccion de amplicones y, ademas, evita los resultados falso positivos (provocados por dfmeros cebadores, por ejemplo) dado que solamente se genera una senal cuando el amplicon contiene la segunda secuencia diana.
El grupo fluoroforo puede ser Hex (4,7,2',4',5',7'-hexacloro-(3',6'-dipivaloilfluoresceinil)-6- carboxamidohexil]-1-0-(2- cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita), Fam ([(3',6'- dipivafoilfluoresceinil)-6-carboxamidohexil]-1-0-(2-cianoetil)- (N,N-disopropil)-fosforamidita) o Rox (5,6,-Carboxi-X-Rodamina). El grupo inactivador puede ser Dabcilo (5'- dimetoxitritiloxi-5-[(N-4-carboxi-4-(dimetilamino)-azobenceno)-aminohexil-3-acrilimido]-2-desoxiuridina-3-[(2- cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita).
En realizaciones de la presente invencion, se proporciona un cebador Scorpions para la deteccion de la mutacion H1047R, donde la secuencia cebadora es la sEq ID NO. 35.
Sin embargo, se debe reconocer que el uso de cebadores Scorpions no es esencial para la invencion y se pueden emplear otros metodos para detectar la smtesis de amplicones tal como la deteccion de producto TaqMan, como se describe en los numeros de patente US-A-5487972 y US-A-5210015
En algunas realizaciones, tambien se lleva a cabo un ensayo de control para detectar la concentracion total del gen PIK3CA en la muestra. Esto se logra realizando una reaccion de PCR por separado con cebadores directos e inversos de control que definen un amplicon en otra region del gen PIK3CA. Se prefiere que el cebador directo sea la SEQ ID NO. 37 y el cebador inverso sea un cebador Scorpions, donde la secuencia cebadora es la SEQ ID NO. 39 y la secuencia de sonda es la SEQ ID NO. 38. Luego, la cantidad de ciclos de PCR necesarios para generar una cantidad umbral de amplicones de control se compara con la cantidad de ciclos de PCR necesarios para generar la cantidad umbral de amplicones que contienen la secuencia mutante para evaluar la proporcion de copias mutantes del gen PIK3CA en la muestra. En general, dichos ensayos de control se llevan a cabo por separado de los ensayos de prueba.
Los ensayos de PCR se llevan a cabo, preferiblemente, como ensayos de PCR en tiempo real multiplexados.
La muestra de prueba de acido nucleico es convenientemente una muestra de sangre, heces, esputo, lavaje colonico, lavaje bronquial u otro fluido corporal, o tejido obtenido de un individuo. Convenientemente, el individuo es humano, preferentemente, Homo sapiens. Se reconocera que la muestra de prueba igualmente puede ser una secuencia de acido nucleico que corresponde a la secuencia en la muestra de prueba. Es decir que la totalidad o una parte de la region en el acido nucleico de muestra se puede amplificar en primer lugar usando cualquier tecnica conveniente, tal como amplificacion de acido nucleico por ciclacion termica, en particular, PCR, o amplificacion total del genoma (WGA) antes del uso en el metodo de la invencion.
Se puede utilizar cualquier enzima conveniente para la polimerizacion, siempre que no afecte la capacidad de la polimerasa de ADN de distinguir entre las secuencias de plantilla normal y mutante hasta algun grado significativo. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen enzimas termoestables que no presentan actividad de exonucleasa 3'5' significativa, por ejemplo, polimerasa de ADN Taq, particularmente, polimerasa de ADN "Ampli Taq Gold"" (PE Applied Biosystems), fragmento Stoffel, u otras modificaciones adecuadamente eliminadas de extremo N de polimerasas de ADN Taq o Tth (Thermus thermophilus).
EJEMPLOS
Materiales y metodos
Se disenaron cebadores contra las 4 mutaciones mas comunes en el gen PIK3CA (numero de acceso: NM_006218). Se disenaron cebadores ARMS para detectar 2 mutaciones en el exon 20: H1047R y H1047L; y 2 mutaciones en el exon 9: E452K y E454K. Se diseno un cebador de control en la posicion de ADNc 2450 en el gen PIK3CA.
Tambien se disenaron Scorpions. Para permitir la multiplexacion de diversos ensayos en cada reaccion, se etiquetaron los tres cebadores scorpion con distintos fluoroforos.
Diseno de cebadores
Se disenaron diversos cebadores ARMS espedficos para cada region diana. La region diana para las mutaciones E542K y E545K se muestran a continuacion como las SEQ ID NOS. 1 y 2, respectivamente (las bases mutantes se muestran entre parentesis con la variante normal en primer lugar). Los cebadores directos para las mutaciones
tambien se muestran a continuacion (SEQ ID NOS. 3 a 16). Para potenciar la especificidad de estas reacciones, se utilizaron mal emparejamientos de cebadores adicionales cerca del extremo 3' (que se muestra subrayado en las secuencias cebadoras). Los cebadores optimos (E542K-2 y E545K-4) se utilizaron para los experimentos descritos. El cebador Scorpions que se puede utilizar con las secuencias cebadoras se muestra como las SEQ ID NOS. 17 y 5 18. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o
subrayadas de forma identica.
Region de exon 9
AACAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCC TGCTCAGTGATTTfGmAGAGAGAG GATCTCGT GT AGAAATT GCTTTGAGCT GTT Cl rGTCATTT~'CCCTtAATtCATTGT2TCTAGCTAC7CTGTTAC~GTGTAAAAIA AAATMTATCTTATATA (SEQ ID NO. 1)
AACAGAGAATCTC C ATTTTAG CACTTACCTGTGACTCCATASAAAATCTTTCTCC TGCTfcmAGTGATTTCAGAGAGAGGATCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCTGTT CTTtGTeAT1ffTCGCftMW(fAffGTCTCTAGCTAGTCTGTTACTCTGTAAAATA AAATAATATCTTATATA (SEQ ID NO. 2}
Mutacion
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
E542K-0
S'-CI 1 ICICCIGCICAGIGAI 1 M-3' 3
E542K-1
5' -CTTT CTCCTG CTC AGT GATTAT-3' 4
E542K-2
5' -CTTT CTCCTG CTC AGTG ATTCT-3' 5
E542K-3
5' -CTTTCTCCTG CTC AGTG ATTGT-3' 6
E542K-4
5'-CmCTCCTGCTCAGTGATATT-3' 7
E542K-5
5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATCTT-3' 8
E542K-6
5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATGTT-3' 9
E545K-0
5' - ACT CCAT AG AAAAT CTTT CTCCTG CTT-3' 10
E545 K-l
5' - ACTCC AT AG AAAAT CTTT CTCCTG C AT-3' 11
E545K-2
5' - ACTCC AT AG AAAAT CTTT CTCCTG CCT-3' 12
E545K-3
5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCGT-3' 13
E545K-4
5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3' 14
E545K-5
5'-ACTCCATAGAAAATCMCTCCTGGTT-3' 15
E545K-6
5' - ACT CCAT AG AAAAT CTTT CTCCT GTTT-3' 16
Scorpion de exon 9
Hex-CGCGCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCGCG- 17 y 18
10
Region de exon 20
La region diana para las mutaciones H1047R y H1047L se muestran a continuacion como la SEQ ID NOS. 19 (las bases mutantes se muestran entre parentesis con la variante normal en primer lugar). Los cebadores directos para las mutaciones tambien se muestran a continuacion (SEQ ID NOS. 20 a 33). Para potenciar la especificidad de 15 estas reacciones, se utilizaron mal emparejamientos de cebadores adicionales cerca del extremo 3' (que se muestra subrayado en las secuencias cebadoras). Los cebadores optimos (H1047R-1 y H1047L-1) se utilizaron para los experimentos descritos. El cebador Scorpions que se puede utilizar con las secuencias cebadoras se muestra como las SEQ ID NOS. 34 y 35. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o subrayadas de forma identica.
AGTGCAGTGTGGMTCCAGAGTGAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTTTTCAGTTC
AATGGATGCTGTTTAATTGTGTGGAAGATCCAATCCATrnTGTTGTCCAGCCAC
CATGAfT/C/AIGTGCATCATTCATTTGTTTCATGAAATACTCCAAAGCCTCTFGCTC
AGTTTTATCTAAGGCTAGGGTCTTTCGAATGT'AIGCAATGTCATCAAAAGATTGT
AGTTCTGGCATTCCAGAGCCAAGCATCATTGAGAAAAGATTTATGAAGAGATTG
GCATGCTGTCGAATAGCTAGATAAGCCTT (SEQ ID NO. 10)
Mutacion
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
H1047R-0
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAC-3' 20
H1047R-1
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCC-3' 21
H1047R-2
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGC-3' 22
H1047R-3
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGTC-3' 23
H1047R-4
5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAC-3' 24
H1047R-5
5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAC-3' 25
H1047R-6
5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAC-3' 26
H1047L-0
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAA-3' 27
H1047L-1
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCA-3' 28
H1047L-2
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGA-3' 29
H1047L-3
5' -TGTTGT CC AG CC ACC AT GTA-3' 30
H1047L-4
5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAA-3' 31
H1047L-5
5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAA-3' 32
H1047L-6
5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAA-3' 33
Scorpion de exon 20
Fam-CGCGGCATGAAATACTCCAAAGCCGCG-que-heg-CCCTAG cgttAg ataa aactgag caa 34 y 35
Cebadores de control
Los cebadores de control se muestran a continuacion: Las regiones de correspondencia entre el cebador 5 Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o subrayadas de forma identica.
AGGCTTGAAGAGTGTGGAATfATGTCCTCTGCAAAAAGGCCACTGTGGTTGAAT TGGGAGAACCCAGACAfcAfGTCAGAGTTACTGTTTCAGAACAATGAGATCATC TTTAAAAATGGGGATGG (SEQ ID NO. 36)
Mutacion
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
Cebador de control
5 '-AG AT G AT CT CATT GTT CT G AAAC AG-3' 37
Scorpion de control
Rox-CCGGCCAATTCAACCACAGTGGCCGG-que-heg- GGCTTGAAGAGTGTCGAATTA 38 y 39
Todos los cebadores fueron sintetizados y suministrados por Invitrogen. Amortiguador PCR, Taq y magnesio fueron suministrados por Eurogentec y dNTPS fueron adquiridos de Abgene Ltd. Scorpions fueron sintetizados y 10 suministrados por ATDBio.
Los ensayos fueron multiplexados en 2 reacciones que conteman un ensayo de control y 2 ensayos de ARMS (1 x exon 9 y 1 x exon 20). Los ensayos fueron realizados en 25 ul de volumen de reaccion que contema amortiguador
5
10
15
20
25
30
35
1x PCR, 4,0 mM de MgCl2, 200 uM de mezcla de dNTP, 0,25 uM de cada cebador (cebador de control y 2 cebadores ARMS) y 0,25 uM de cada scorpion (scorpion de control (SEQ ID NOS. 38 y 39), scorpion de exon 20 (SEQ ID NOS. 34 y 35), scorpion de exon 9 (sEq iD NOS. 17 y 18)). Se agregaron 2,5 ul de plantilla de ADN a cada reaccion. Los cebadores H1047R y E542K se multiplexaron con 2,5 de unidades de polimerasa Taq por reaccion. Los cebadores H1047L y E545K se multiplexaron con 3,0 de unidades de polimerasa Taq por reaccion. El cebador E542K utilizado fue E542K-2 (SEQ ID NO. 5). El cebador E545K utilizado fue E545K- 4 (SEQ ID NO. 14). El cebador H1047R utilizado fue H1047R-1 (SEQ ID NO. 21). El cebador H1047L utilizado fue H1047L-1 (SEQ ID NO. 28).
En todos los casos, las reacciones se amplificaron en un Stratagene Mx3000P en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 minutos, seguido por 45 ciclos de 90 °C durante 30 segundos y 60 °C durante 1 minuto.
Se construyeron casetes de ADN con mutaciones puntuales para utilizarlos como controles positivos en funcion de un metodo descrito por Higuchi et al.[2]. En resumen, se utilizaron cebadores exteriores y de mutamero correspondientes para generar casetes medios con extremos complementarios, donde cada casete medio contiene una base mutante. Estos productos de PCR se mezclaron y amplificaron con cebadores anidados interiores. El autocebado de los casetes medios complementarios y la posterior amplificacion crearon un producto final con una base mutada. Los productos se secuenciaron para garantizar que se haya creado la secuencia correcta. Este proceso se repitio para cada mutacion de interes. El casete de ADN se mezclo con una cantidad igual de ADN genomico para crear un control positivo 100 %.
Ejemplo 1
Para determinar la especificidad de las reacciones y los cebadores, cada ensayo se realizo con 5- 50 ng de ADN genomico por reaccion para evaluar la senal de avance provocado por extension del cebador no emparejado. Para cada reaccion, se definio un valor de ACt (Ct de control - mutacion Ct) (Ct = ciclo umbral). Las reacciones se realizaron seis veces para cada concentracion de ADN y se repitieron por triplicado en distintas ocasiones para definir un valor de ACt de corte por debajo del cual puede decirse que cualquier amplificacion se debe a la presencia de una secuencia mutante y no a una senal de avance. Se determino que el valor de ACt de corte era de 1 Ct por debajo del valor de ACt mas bajo observado en todas las reacciones para cada ensayo. Para los ensayos de H1047R y H1047L, el ACt de corte se definio como 12, para el ensayo de e542K, el ACt de corte fue de 9 y para el ensayo de E545K, el ACt de corte fue de 8.
Ejemplo 2
Para evaluar la sensibilidad del ensayo, se diluyeron 5 copias de ADN mutante en diversas concentraciones de ADN genomico para proporcionar concentraciones finales de 5, 2, 1, 0,5 y 0,1 % de ADN mutante con respecto al tipo silvestre. La Tabla 1 ilustra la sensibilidad de los 4 ensayos ARMS. La tabla muestra los valores de ACt para la reduccion de las concentraciones de ADN mutante en un entorno de ADN de tipo silvestre. Los ACt de corte predefinidos se ilustran en la columna final. Los ensayos de exon 20 pudieron detectar 5 copias de ADN mutante cuando este comprendfa solamente 0,1 % del ADN total (dentro del ACt de corte definido previamente). Los ensayos de exon 9 pudieron detectar 5 copias de ADN en una concentracion de 1 % con un ACt dentro de los valores de corte predefinidos (Tabla 1).
Tabla 1:
ADN WT/reaccion (copias)
ADN MUT /reaccion (copias)) % relativo de alelos MUT ACT
H1047L
H1047R E542K E545K ACt de corte
100
5 5% 5,9 4,3 5,1 5,8
250
5 2% 7,2 6,7 7,2 6,4 H1047L 12
500
5 1% 8,3 7,6 8,4 7,0 H1047R 12
1000
5 0.5% 9,3 9,0 10,2 8,1 E542K 9
5000
5 0.1% 11,5 10,5 12,1 10,1 E545K 8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 3
Se usaron mezclas de lmeas celulares que conteman la mutacion H1047R (HCT-116) y E545K (MCF-7) para comparar las sensibilidades relativas de los ensayos ARMS con la secuenciacion. Ambas lmeas celulares fueron heterocigotas para la mutacion. La secuenciacion se realizo usando cebadores y condiciones de ciclacion por PCR, como lo describen Samuels et al[1], los ensayos ARMS y la secuenciacion se realizaron en concentraciones del gen mutante de 100 %, 50 %, 30 %, 10 % y 1 % de la mezcla total. Los resultados se muestran en la Figura 1 donde los resultados bajo el tftulo "Scorpions" muestran el aumento de la cantidad de copias de amplicon despues de rondas sucesivas de PCR (los resultados que usan cebadores de control y cebadores mutantes se muestran como lmeas separadas). Bajo el tftulo "secuenciacion de ADN" se muestran los resultados de secuenciacion de la cadena inversa del gen en la mezcla. La secuenciacion no pudo detectar la presencia de H1047R mutante cuando se encontraba presente en menos del 50 % de la mezcla total y no pudo detectar la presencia de E545K mutante cuando se encontraba presente en menos del 30 % de la mezcla total. Los ensayos que usan los cebadores de la invencion, por el contrario, pudieron detectar la presencia de mutantes en una concentracion %.
Ejemplo 4
Este ensayo se aplico a ADN extrafdo de tejido recientemente congelado de diversos tipos de tumor que se evaluaron para determinar la presencia de mutaciones de PIK3CA usando el ensayo ARMS/Scorpion. En total, habfa ADN disponible de 279 muestras de tumor. El ensayo registro mutaciones en 5 de 49 (10,2 %) muestras de cancer colorrectal, 19 de 49 (38,7 %) muestras de cancer de mama, 1 de 51 (1,9 %) muestras de cancer de pulmon, y 1 de 34 (2,9 %) muestras de melanoma. No se detectaron mutaciones en 50 muestras de cancer de prostata o 46 muestras de cancer de ovario. De las muestras colorrectales positivas para las mutaciones de PIK3CA, 3 fueron H1047R,
1 fue H1047L y 1 fue E542K; de las muestras de cancer de mama positivas para PIK3CA, 15 fueron H1047R, 1 fue H1047L y 3 fueron E545K; ambas mutaciones en la muestra de cancer de pulmon y muestra de melanoma positivas para las mutaciones de PIK3CA fueron H1047R. La secuenciacion identifico solamente 14 del total de 26 (53 %) de mutaciones detectadas. La secuenciacion detecto una mutacion en una muestra de cancer de mama que el ensayo ARMS no estaba disenado para detectar (aprox. 1634 A>G; p E545G). Esta no es una mutacion novedosa y se ha descrito anteriormente en canceres de mama y colorrectal[3"5].
La incidencia de mutaciones de PIK3CA en las muestras analizadas fue coherente con los estudios anteriores con excepcion de cancer de ovario[1, 3"9] Las mutaciones de PIK3CA se han descrito anteriormente en canceres de ovario pero se ha sugerido que puede haber una asociacion con los canceres de endometrio y celulas claras [8,10]. Todos los canceres de ovario analizados en este estudio fueron adenocarcinomas serosos que pueden explicar la ausencia de cualquier mutacion de PIK3CA.
El ensayo ARMS identifico significativamente mas mutaciones en las muestras clmicas que lo que se observo mediante secuenciacion directa. Las mezclas de lmeas celulares confirman que este ensayo es mas sensible que la secuenciacion para detectar las mutaciones de PI3KCA de interes. Es probable que la heterogeneidad de las muestras clmicas que contendran tejido normal y tumoral signifique que, en algunos casos, la incidencia de la mutacion se encontrara por debajo de lo detectable por medio de los metodos de secuenciacion y, por lo tanto, el ensayo ARMS es mas adecuado para la aplicacion clmica. El obstaculo es que solamente se detectaran determinadas mutaciones espedficas de ARMS. Sin embargo, en esta serie de 279 muestras, solamente se detecto una unica mutacion en el exon 9 o 20 del gen PI3KCA que el ensayo ARMS no estaba disenado para detectar.
En resumen, los ejemplos muestran que la presente invencion proporciona un ensayo sensible y de alto rendimiento para la deteccion de las 4 mutaciones mas comunes en el gen PIK3CA. Este ensayo se puede aplicar a pequenas cantidades de ADN y puede detectar niveles bajos de PIK3CA mutante dentro de una muestra.
Texto libre de listado de secuencias
<210 1
<223> region diana E542K <21 0>2 <223> region diana E545K <210>3
<223> cebador directo E542K-0 <210 4 <223> cebador directo E542K-1 <210> 5 <223> cebador directo E542K-2 <213>6
5
10
15
20
25
30
35
<223> cebador directo E542K-3 <210 7 <223> cebador directo E542K-4 <210> 8 <223> cebador directo E542K-5 <210 9
<223> cebador directo E542K-6 <210> 10 <223> cebador directo E545K-0 <210> 11 <223> cebador directo E545K-1 <210> 12
<223> cebador directo E545K-2 <210 13 <223> cebador directo E545K-3 <210 14 <223> cebador directo E459-K-4 <210> 15
<223> cebador directo E545K-5 <210 16 <223> cebador directo E545K-6 <210> 17
<223> Scorpion de exon 9 <210> 18 <213> Scorpion de exon 9 2 <210> 19 <223> regiones diana H1047R y H1047L <210> 20 <223> cebador directo H1047R-0 <210> 21 <223> cebador directo H1047R-1 <210> 22 <223> cebador directo H1047R-2 <210> 23 <223> cebador directo H1047R-3 <210> 24 <223> cebador directo H1047R-4 <290> 25 <223> cebador directo H1047R-5 <210> 26 <223> cebador directo H1047R-6 <210> 27 <223> cebador directo H1047L O <210> 28 <223> cebador directo H1047L-1 <210> 29
<223> cebador directo H1047L-3 <210> 30 <223> cebador directo H1047-3 <210> 31
<223> cebador directo H1047L-4 <210> 32 <223> cebador directo H1047L-5 <210> 33
<223> cebador directo H10471-6 <210> 34
<223> Scorpion de exon 20 <210> 35

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la deteccion de la presencia o ausencia de una mutacion en el gen PIK3CA que comprende las etapas de:
    a) mezclar una muestra de acido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con un primer cebador y un segundo cebador y llevar a cabo PCR en la mezcla; y
    b) detectar hibridacion del primer cebador con la muestra de acido nucleico, en donde la hibridacion indica la presencia de una mutacion,
    en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante H1047R del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleotidos finales en el extremo 3' del primer cebador son identicos a los seis nucleotidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO. 21, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante mas facilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una region del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la region de la que es complementario el primer cebador.
  2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde el segundo cebador comprende una secuencia segun la SEQ ID NO: 35.
  3. 3. Un kit que comprende al menos dos cebadores, en donde el primer cebador es un cebador directo, y en donde el segundo cebador es un cebador inverso, en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante H1047R del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleotidos finales en el extremo 3' del primer cebador son identicos a los seis nucleotidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO.21, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante mas facilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una region del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la region de la que el primer cebador es complementario.
  4. 4. Un kit segun la reivindicacion 3, en donde el segundo cebador comprende una secuencia segun la SEQ ID NO: 35.
  5. 5. El uso de un kit segun la reivindicacion 3 para la deteccion de una mutacion en una muestra de acido nucleico que contiene al menos un fragmento del gen PIK3CA.
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