ES2532225T3 - Cebadores de polinucleótidos para detectar mutaciones de PIK3CA - Google Patents

Cebadores de polinucleótidos para detectar mutaciones de PIK3CA Download PDF

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Abstract

Un método de PCR para detectar la presencia o la ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de: a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con una secuencia de polinucleótido cebador que consiste en la SEQ ID NO. 5, donde el polinucleótido se usa como cebador y el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia de PIK3CA por debajo de la región a la cual el polinucleótido es complementario, y llevar a cabo una PCR con la mezcla; y b) detectar la hibridación del polinucleótido con la muestra de ácido nucleico, donde la hibridación indica la presencia de una mutación.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
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05-03-2015
Región de exón 9
imagen4
Mutación
imagen5 Secuencia de cebador SEQ. ID. NO.
E542K-0
imagen6 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATTTT-3' 3
E542K-1
imagen7 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATTAT-3' 4
E542K-2
imagen8 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATTCT-3' 5
E542K-3
imagen9 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATTGT-3' 6
E542K-4
imagen10 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATATT-3' 7
E542K-5
imagen11 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATCTT-3' 8
E542K-6
imagen12 5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATGTT-3' 9
E545K-0
imagen13 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCTT-3' 10
E545K-1
imagen14 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCAT-3' 11
E545K-2
imagen15 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCCT-3' 12
E545K-3
imagen16 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCGT-3' 13
E545K-4
imagen17 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3' 14
E545K-5
imagen18 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGGTT-3' 15
E545K-6
imagen19 5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGTTT-3' 16
Scorpion exón 9
de Hex-CGCGCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCGCG-que-heg-CAATGAATTAAGGGAAAATGACA 17 y 18
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Región de exón 20
La región diana para las mutaciones H1047R y N1047L se muestra a continuación como la SEQ ID NO. 19 (las bases mutantes se muestran entre corchetes con la variante normal en primer lugar). Los cebadores directos para las mutaciones también se muestran a continuación (SEQ ID NOS. 20 a 33). Para potenciar la especificidad de dichas reacciones, se usaron discordancias de cebador adicionales cercanas al extremo 3' (mostradas subrayadas en las secuencias de cebador). Se usaron los cebadores óptimos (H1047R-1 y H1047L-1) para los experimentos descritos. El cebador Scorpions utilizable con las secuencias de cebador se muestra como las SEQ ID NO. 34 y 35. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran subrayadas o destacadas de forma idéntica.
imagen20
Mutación
imagen21 Secuencia de cebador SEQ. ID. NO.
H1047R-0
imagen22 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAC-3' 20
H1047R-1
imagen23 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCC-3' 21
H1047R-2
imagen24 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGC-3' 22
H1047R-3
imagen25 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGTC-3' 23
H1047R-4
imagen26 5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAC-3' 24
H1047R-5
imagen27 5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAC-3' 25
H1047R-6
imagen28 5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAC-3' 26
H1047L-0
imagen29 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAA-3' 27
H1047L-1
imagen30 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCA-3' 28
H1047L-2
imagen31 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGA-3' 29
H1047L-3
imagen32 5'-TGTTGTCCAGCCACCATGTA-3' 30
H1047L-4
imagen33 5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAA-3' 31
H104TL-5
imagen34 5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAA-3' 32
H1047L-6
imagen35 5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAA-3' 33
Scorpion exón 20
de Fam-CGCGGCATGAAATACTCCAAAGCCGCG-que-heg-CCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCA 34 y 35
5
10
15
20
25
30
35
40
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Cebadores de control
A continuación se muestran los cebadores de control. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran subrayadas o destacadas de forma idéntica.
imagen36
Mutación
imagen37 Secuencia de cebador SEQ. ID. NO.
Cebador control
de 5'-AGATGATCTCATTGTTCTGAAACAG-3' 37
Scorpion control
de Rox-CCGGCCAATTCAACCACAGTGGCCGG-que-heg-GGCTTGAAGAGTGTGTCGAATTA 38 y 39
Todos los cebadores fueron sintetizados y suministrados por Invitrogen. El tampón de PCR, la Taq y el magnesio fueron suministrados por Eurogentec y los dNTPS fueron adquiridos a Abgene Ltd. Los Scorpions fueron suministrados y sintetizados por ATDBio.
Los ensayos fueron multiplexados en 2 reacciones que contenían un ensayo de control y 2 ensayos ARMS (1 x exón 9 y 1 x exón 20). Los ensayos fueron llevados a cabo en un volumen de reacción de 25 µL que contenía 1 x tampón de PCR, 4,0 mM de MgCl2, 200 µM de mezcla de dNTPs, 0,25 µM de cada uno de los cebadores (cebador de control y 2 cebadores ARMS) y 0,25 µM de cada Scorpion (Scorpion de control (SEQ ID NO. 38 y 39), Scorpion de exón 20 (SEQ ID NO. 34 y 35) y Scorpion de exón 9 (SEQ ID NO. 17 y 18)). Se añadieron 2,5 µL de plantilla de ADN a cada reacción. Los cebadores H1047R y E542K fueron multiplexados con 2,5 unidades de polimerasa Taq por reacción. Los cebadores H1047L y E545K fueron multiplexados con 3,0 unidades de polimerasa Taq por reacción. El cebador E542K usado fue el E542K-2 (SEQ ID NO. 5). El cebador E545K usado fue el E545K-4 (SEQ ID NO. 14). El cebador H1047R usado fue el H1047R-1 (SEQ ID NO. 21). El cebador H1047L usado fue el H1047L-1 (SEQ ID NO. 28).
En todos los casos las reacciones fueron amplificadas en un Stratagene Mx3000P en las condiciones siguientes: 95°C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos de 90ºC durante 30 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
Las casetes de ADN que albergan mutaciones puntuales que se emplean como controles positivos fueron construidas en base a un método descrito por Higuchi et al.[2]. Resumidamente, se usaron cebadores exteriores y mutámeros correspondientes para generar medias casetes con extremos complementarios, conteniendo cada media casete una base mutante. Dichos productos de PCR fueron mezclados y amplificados con cebadores anidados interiores. El auto-cebado de las medias casetes complementarias y la amplificación posterior crearon un producto final con una base mutada. Los productos fueron secuenciados para asegurar que se había creado la secuencia correcta. Este proceso se repitió para cada mutación de interés. La casete de ADN se mezcló con una cantidad igual de ADN genómico para crear un control 100% positivo.
Ejemplo 1
Para determinar la especificidad de las reacciones y los cebadores se llevó a cabo cada ensayo con 5-50 ng de ADN genómico por reacción para determinar la señal de rotura producida por la extensión de cebador no coincidente. Para cada reacción se definió un valor ΔCt (Ct de control -Ct de mutación) (Ct = ciclo umbral, del inglés "threshold cycle"). Las reacciones se llevaron a cabo seis veces para cada concentración de ADN y se repitieron por triplicado en momentos diferentes para definir un valor de ΔCt de corte por debajo del cual se puede decir que cualquier amplificación es debida a la presencia de secuencia mutante y que no es debida a una señal de rotura. Se determinó que el valor de ΔCt de corte era 1 Ct inferior al menor valor de ΔCt observado en todas las reacciones de cada ensayo. Para los ensayos de H1047R y H1047L, se definió el corte de ΔCt como 12, para el ensayo de E542K el valor de corte de ΔCt fue de 9 y para el ensayo de E545K el corte de ΔCt fue 8.
Ejemplo 2
Para determinar la sensibilidad del ensayo, se diluyeron 5 copias de ADN mutante en concentraciones variables de ADN genómico para producir concentraciones finales de 5, 2, 1, 0,5 y 0,1 % de ADN mutante respecto al natural. La Tabla 1 ilustra la sensibilidad de los 4 ensayos ARMS. La tabla muestra los valores de ΔCt para concentraciones reducidas de ADN mutante dentro de un fondo de ADN natural. Los ΔCts de corte predefinidos se ilustran en la columna final. Los ensayos de exón 20 fueron capaces de detectar 5 copias de ADN mutante cuando éstas
5
10
15
20
25
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35
40
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constituían únicamente un 0,1% del ADN total (dentro del ΔCt de corte definido previamente). Los ensayos de exón 9 fueron capaces de detectar 5 copias de ADN a una concentración del 1% con un ΔCt dentro de los valores de corte predefinidos (Tabla 1).
Tabla 1:
ADN MUT /reacción (copias)
ADN MUT (copias) /reacción % relativo de alelos MUT ACT imagen38 imagen39 imagen40
imagen41
imagen42 imagen43 H1047L H1047R E542K E545K ΔCt CORTE de
100
5 imagen44 5% 5,9 4,3 5,1 5,8 imagen45 imagen46
250
5 imagen47 2% 7,2 6,7 7,2 6,4 H1047L 12
500
5 imagen48 1% 8,3 7,6 8,4 7,0 H1047R 12
1000
5 imagen49 0,5% 9,3 9,0 10,2 8,1 E542K 9
5,000
5 imagen50 0,1% 11,5 10,5 12,1 10,1 E545K 8
Ejemplo 3
Las mezclas de líneas celulares que contiene la mutación H1047R (HCT-116) y la E545K (MCF-7) se usaron para comparar las sensibilidades relativas de los ensayos ARMS en comparación con el secuenciamiento. Ambas líneas celulares eran heterocigotas para la mutación. El secuenciamiento se llevó a cabo usando los cebadores y las condiciones de ciclos de PCR descritas por Samuels et al[1]. Los ensayos de ARMS y el secuenciamiento se llevaron a cabo en concentraciones del gen mutante de 100%, 50%, 30%, 10% y 1% de la mezcla total. Los resultados se muestran en la Figura 1 en la que los resultados bajo el título "Scorpions" muestran el aumento del número de copias de amplicón tras rondas sucesivas de PCR (los resultados obtenidos usando cebadores de control y cebadores mutantes se muestran como líneas separadas). Bajo el título de "Secuenciamiento de ADN" se muestran los resultados del secuenciamiento de la cadena inversa del gen de la mezcla. El secuenciamiento no fue capaz de detectar la presencia de mutante H1047R cuando estaba presente en menos del 50% de la mezcla total, y fue incapaz de detectar la presencia del mutante E545K cuando estaba presente en menos del 30% de la mezcla total. Los ensayos que usan los cebadores de la invención, por el contrario, fueron capaces de detectar la presencia de mutantes en una concentración del 1%.
Ejemplo 4
Este ensayo se aplicó a ADN extraído de tejido congelado fresco procedente de una variedad de tipos tumorales que fueron evaluados para determinar la presencia de mutaciones PIK3CA usando el ensayo ARMS/Scorpion. En total se disponía de ADN de 279 muestras de tumores. El ensayo evidenció mutaciones en 5 de 49 (10,2%) de las muestras de cáncer colorrectal, en 19 de 49 (38,7%) de las muestras de cáncer de mama, en 1 de 51 (1,9%) de las muestras de cáncer de pulmón, y en 1 de 34 (2,9%) de las muestras de melanoma. No se detectaron mutaciones en 50 muestras de cáncer de próstata ni en 46 muestras de cáncer de ovario. De las muestras colorrectales positivas para mutaciones de PIK3CA, 3 fueron H1047R, 1 fue H1047L y 1 fue E542K; de las muestras de cáncer de mama positivas para PIK3CA, 15 fueron H1047R, 1 fue H1047L y 3 fueron E545K; tanto las mutaciones en muestras de cáncer de pulmón como de melanoma positivas para mutaciones PIK3CA fueron H1047R. El secuenciamiento solo identificó 14 del total de 26 (53%) de mutaciones detectadas. El secuenciamiento detectó una mutación en un espécimen de cáncer de mama que el ensayo ARMS no estaba diseñado para detectar (c.1634 A>G; p E545G). Ésta no es una mutación nueva y ha sido descrita previamente en cánceres de mama y colorrectales [3-5].
La incidencia de mutaciones PIK3CA en las muestras analizadas fue consistente con los estudios previos, excepto para el cáncer de ovario [1,3, -9]. Las mutaciones PIK3CA han sido descritas previamente en cánceres de ovario pero se ha sugerido que puede haber una asociación con cánceres de células endometroides y claras [8,10]. Todos los cánceres de ovario evaluados en este estudio fueron adenocarcinomas serosos, lo que puede explicar la ausencia de mutaciones PIK3CA.
El ensayo ARMS identificó significativamente más mutaciones en las muestras clínicas que las observadas mediante secuenciamiento directo. Las mezclas de líneas celulares confirman que este ensayo es más sensible que la secuenciación en la detección de las mutaciones de PI3KCA de interés, es probable que la heterogeneidad de las
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muestras clínicas que contienen tanto el tumor como el tejido normal darán lugar a que en algunos casos la incidencia de la mutación esté por debajo de lo detectable por métodos de secuenciación y como tal el ensayo de ARMS es más adecuado para aplicaciones clínicas. La desventaja es que solo se detectan determinadas mutaciones específicas de ARMS. Sin embargo, en esta serie de 279 muestras solo se detectó una única mutación en el exón 9 ó 20 del gen PI3KCA para cuya detección el ensayo ARMS no estaba diseñado.
En resumen, los ejemplos demuestran que la presente invención proporciona un ensayo sensible de alta capacidad para la detección de las 4 mutaciones más comunes del gen PIK3CA. Dicho ensayo puede aplicarse a cantidades pequeñas de ADN y puede detectar niveles bajos de PIK3CA mutante en una muestra.
imagen51
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Claims (1)

  1. imagen1
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