ES2620289T3 - Cebadores polinucleótidos para detectar mutaciones PIK3CA - Google Patents

Cebadores polinucleótidos para detectar mutaciones PIK3CA Download PDF

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Abstract

Un método para la detección de la presencia o ausencia de una mutación en el gen PIK3CA que comprende las etapas de: a) mezclar una muestra de ácido nucleico que comprende al menos un fragmento del gen PIK3CA con un primer cebador y un segundo cebador y llevar a cabo PCR en la mezcla; y b) detectar hibridación del primer cebador con la muestra de ácido nucleico, en donde la hibridación indica la presencia de una mutación, en donde el primer cebador puede hibridarse con la secuencia mutante E545K del gen PIK3CA pero no es complementario de la secuencia de tipo silvestre y en donde los seis nucleótidos finales en el extremo 3' del primer cebador son idénticos a los seis nucleótidos finales en el extremo 3' de la SEQ ID NO. 14, en donde el cebador se hibrida con la secuencia mutante más fácilmente que con la secuencia de tipo silvestre y en donde el segundo cebador corresponde a una región del fragmento de la secuencia PIK3CA corriente abajo de la región de la que es complementario el primer cebador.

Description

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también se muestran a continuación (SEQ ID NOS. 3 a 16). Para potenciar la especificidad de estas reacciones, se utilizaron mal emparejamientos de cebadores adicionales cerca del extremo 3' (que se muestra subrayado en las secuencias cebadoras). Los cebadores óptimos (E542K-2 y E545K-4) se utilizaron para los experimentos descritos. El cebador Scorpions que se puede utilizar con las secuencias cebadoras se muestra como las SEQ ID NOS. 17 y
18. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o subrayadas de forma idéntica.
Región de exón 9
AACAG AG AATCT CCATTTT AG CACTTACCTGT GACTCCATAG AAAAT CTTTCTCC TG GT CAGT G ATTT (C/T)AG AGA.GAG GAT CT CG.TGTAG AAATTGGTTTG AGCT GTT CTTTGTCÁTTT~CCGTTAÁTTGATt STCTCTAS CTAGT CT GTTACT CT GTAAAAT A AAAI AATATCTTATÁTÁ (SEQ ID NO. 1)
AACAGAG AATCTCC ATTTTAG C ACTTACCTGTG ACT CCATAG AAAAT CTTT CTCC TGCTfCmAGTGATTTCAGAGAGAGGATCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCTGTT CTTT GT C AtTTTCGCTTAAJT GÁTT GTCTCTAG CT AGTCT GTTACT CT GTAAAATA AAAT AAT ÁT CTTATATA (SEQ ÍD NO. 2)
Mutación
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
E542K-0
S'-CI 1 ICICCIGCICAGIGAI 1 M-3' 3
E542K-1
5’ -CTTT CTCCTG CTC AGT GATTAT-3’ 4
E542K-2
5’ -CTTT CTCCTG CTC AGTG ATTCT-3’ 5
E542K-3
5' -CTTTCTCCTG CTC AGTG ATTGT-3' 6
E542K-4
5'-CmCTCCTGCTCAGTGATATT-3' 7
E542K-5
5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATCTT-3' 8
E542K-6
5'-CTTTCTCCTGCTCAGTGATGTT-3' 9
E545K-0
5’ -ACT CCAT AG AAAAT CTTT CTCCTG CTT-3' 10
E545 K-l
5’ -ACTCC AT AG AAAAT CTTT CTCCTG C AT-3’ 11
E545K-2
5’ -ACTCC AT AG AAAAT CTTT CTCCTG CCT-3’ 12
E545K-3
5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCGT-3' 13
E545K-4
5'-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3' 14
E545K-5
5'-ACTCCATAGAAAATCMCTCCTGGTT-3' 15
E545K-6
5' -ACT CCAT AG AAAAT CTTT CTCCT GTTT-3' 16
Scorpion de exón 9
Hex-CGCGCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCGCG; 17 y 18
Región de exón 20
La región diana para las mutaciones H1047R y H1047L se muestran a continuación como la SEQ ID NOS. 19 (las bases mutantes se muestran entre paréntesis con la variante normal en primer lugar). Los cebadores directos para las mutaciones también se muestran a continuación (SEQ ID NOS. 20 a 33). Para potenciar la especificidad de estas reacciones, se utilizaron mal emparejamientos de cebadores adicionales cerca del extremo 3' (que se muestra subrayado en las secuencias cebadoras). Los cebadores óptimos (H1047R-1 y H1047L-1) se utilizaron para los experimentos descritos. El cebador Scorpions que se puede utilizar con las secuencias cebadoras se muestra como las SEQ ID NOS. 34 y 35. Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o subrayadas de forma idéntica.
AGTG CAGTGTGG AAT CCAG AGT GAG CTTTC ATTTT CT CAGTTAT CTTTT C AGTTC AAT GCAT G CT GTTT A ATT GTGTGG AAGATCCAAT CC ATTTTT GTT GT CCAG CCAC CATGAfT/C/A'iGTGCATCATTCATTTGTTTCATGAAATAüTCCAAAGCCTCTTGCTC AGTTTTATCTÁ AGGCTAG GiGT CTTT C G AATGTAT G C AAT GT C AT C AAAAG ATT GT
AGTT CTGGCÁTT CCAGAG CC AAGCATC ATT GAG AAAAGATTT AT G AAGAG ATT G GCATGCTGTCGAATAGCTAGATAAGCCTT {SEQ ID NO. 19)
Mutación
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
H1047R-0
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAC-3' 20
H1047R-1
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCC-3' 21
H1047R-2
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGC-3' 22
H1047R-3
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGTC-3' 23
H1047R-4
5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAC-3' 24
H1047R-5
5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAC-3' 25
H1047R-6
5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAC-3' 26
H1047L-0
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGAA-3' 27
H1047L-1
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGCA-3' 28
H1047L-2
5'-TGTTGTCCAGCCACCATGGA-3' 29
H1047L-3
5' -TGTTGT CC AG CC ACC AT GTA-3' 30
H1047L-4
5'-TGTTGTCCAGCCACCATAAA-3' 31
H1047L-5
5'-TGTTGTCCAGCCACCATCAA-3' 32
H1047L-6
5'-TGTTGTCCAGCCACCATTAA-3' 33
Scorpion de exón 20
Fam-CGCGGCATGAAATACTCCAAAGCCGCG-que-heg-CCCTAG CGTTÁG ATAA AACTGAG CAA 34 y 35
Cebadores de control
5 Los cebadores de control se muestran a continuación: Las regiones de correspondencia entre el cebador Scorpions y las regiones diana se muestran resaltadas o subrayadas de forma idéntica.
AGGCTTGAAGAGTGfGGÁÁlTÁTGTCCTCTGCAAAAAGGCCACTGTGGTTGAAT TGGGAGÁÁCCCÁGÁCÁfcÁfGTCAGAGTTACTGTTTCAGAACAATGAGATCATC TTTAAAAATGGGGATGG {SEQ ID NO. 36)
Mutación
Secuencia cebadora SEQ ID NO.
Cebador de control
5 '-AG AT G AT CT CATT GTT CT G AAAC AG-3' 37
Scorpion de control
Rox-CCGGCCAATTCAACCACAGTGGCCGG-que-heg-GGClTGAAGAGTG“GGMTTA 38 y 39
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Todos los cebadores fueron sintetizados y suministrados por Invitrogen. Amortiguador PCR, Taq y magnesio fueron suministrados por Eurogentec y dNTPS fueron adquiridos de Abgene Ltd. Scorpions fueron sintetizados y suministrados por ATDBio.
Los ensayos fueron multiplexados en 2 reacciones que contenían un ensayo de control y 2 ensayos de ARMS (1 x
15 exón 9 y 1 x exón 20). Los ensayos fueron realizados en 25 ul de volumen de reacción que contenía amortiguador 1x PCR, 4,0 mM de MgCl2, 200 uM de mezcla de dNTP, 0,25 uM de cada cebador (cebador de control y 2 cebadores ARMS) y 0,25 uM de cada scorpion (scorpion de control (SEQ ID NOS. 38 y 39), scorpion de exón 20 (SEQ ID NOS. 34 y 35), scorpion de exón 9 (SEQ ID NOS. 17 y 18)). Se agregaron 2,5 ul de plantilla de ADN a cada reacción. Los cebadores H1047R y E542K se multiplexaron con 2,5 de unidades de polimerasa Taq por
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reacción. Los cebadores H1047L y E545K se multiplexaron con 3,0 de unidades de polimerasa Taq por reacción. El cebador E542K utilizado fue E542K-2 (SEQ ID NO. 5). El cebador E545K utilizado fue E545K-4 (SEQ ID NO. 14). El cebador H1047R utilizado fue H1047R-1 (SEQ ID NO. 21). El cebador H1047L utilizado fue H1047L-1 (SEQ ID NO. 28).
En todos los casos, las reacciones se amplificaron en un Stratagene Mx3000P en las siguientes condiciones: 95 ºC durante 10 minutos, seguido por 45 ciclos de 90 ºC durante 30 segundos y 60 ºC durante 1 minuto.
Se construyeron casetes de ADN con mutaciones puntuales para utilizarlos como controles positivos en función de un método descrito por Higuchi et ál.[2]. En resumen, se utilizaron cebadores exteriores y de mutámero correspondientes para generar casetes medios con extremos complementarios, donde cada casete medio contiene una base mutante. Estos productos de PCR se mezclaron y amplificaron con cebadores anidados interiores. El autocebado de los casetes medios complementarios y la posterior amplificación crearon un producto final con una base mutada. Los productos se secuenciaron para garantizar que se haya creado la secuencia correcta. Este proceso se repitió para cada mutación de interés. El casete de ADN se mezcló con una cantidad igual de ADN genómico para crear un control positivo 100 %.
Ejemplo 1
Para determinar la especificidad de las reacciones y los cebadores, cada ensayo se realizó con 5-50 ng de ADN genómico por reacción para evaluar la señal de avance provocado por extensión del cebador no emparejado. Para cada reacción, se definió un valor de ACt (Ct de control -mutación Ct) (Ct = ciclo umbral). Las reacciones se realizaron seis veces para cada concentración de ADN y se repitieron por triplicado en distintas ocasiones para definir un valor de ACt de corte por debajo del cual puede decirse que cualquier amplificación se debe a la presencia de una secuencia mutante y no a una señal de avance. Se determinó que el valor de ACt de corte era de 1 Ct por debajo del valor de ACt más bajo observado en todas las reacciones para cada ensayo. Para los ensayos de H1047R y H1047L, el ACt de corte se definió como 12, para el ensayo de E542K, el ACt de corte fue de 9 y para el ensayo de E545K, el ACt de corte fue de 8.
Ejemplo 2
Para evaluar la sensibilidad del ensayo, se diluyeron 5 copias de ADN mutante en diversas concentraciones de ADN genómico para proporcionar concentraciones finales de 5, 2, 1, 0,5 y 0,1 % de ADN mutante con respecto al tipo silvestre. La Tabla 1 ilustra la sensibilidad de los 4 ensayos ARMS. La tabla muestra los valores de ACt para la reducción de las concentraciones de ADN mutante en un entorno de ADN de tipo silvestre. Los ACt de corte predefinidos se ilustran en la columna final. Los ensayos de exón 20 pudieron detectar 5 copias de ADN mutante cuando este comprendía solamente 0,1 % del ADN total (dentro del ACt de corte definido previamente). Los ensayos de exón 9 pudieron detectar 5 copias de ADN en una concentración de 1 % con un ACt dentro de los valores de corte predefinidos (Tabla 1).
Tabla 1:
imagen4
Ejemplo 3
Se usaron mezclas de líneas celulares que contenían la mutación H1047R (HCT-116) y E545K (MCF-7) para comparar las sensibilidades relativas de los ensayos ARMS con la secuenciación. Ambas líneas celulares fueron heterocigotas para la mutación. La secuenciación se realizó usando cebadores y condiciones de ciclación por PCR, como lo describen Samuels et ál[1], los ensayos ARMS y la secuenciación se realizaron en concentraciones del gen mutante de 100 %, 50 %, 30 %, 10 % y 1 % de la mezcla total. Los resultados se muestran en la Figura 1 donde los
imagen5
<223> cebador directo E542K-6 <210> 10
<223> cebador directo E545K-0 <210> 11
<223> cebador directo E545K-1
<210> 12 5 <223> cebador directo E545K-2 <210 13
<223> cebador directo E545K-3 <210 14
<223> cebador directo E459-K-4
<210> 15
<223> cebador directo E545K-5 <210 16 10 <223> cebador directo E545K-6
<210> 17
<223> Scorpion de exón 9 <210> 18
<213> Scorpion de exón 9 2 <210> 19
<223> regiones diana H1047R y H1047L <210> 20 15 <223> cebador directo H1047R-0 <210> 21
<223> cebador directo H1047R-1 <210> 22
<223> cebador directo H1047R-2 <210> 23
<223> cebador directo H1047R-3 <210> 24
<223> cebador directo H1047R-4 <290> 25 20 <223> cebador directo H1047R-5 <210> 26
<223> cebador directo H1047R-6 <210> 27
<223> cebador directo H1047L O <210> 28
<223> cebador directo H1047L-1
<210> 29 25 <223> cebador directo H1047L-3 <210> 30
<223> cebador directo H1047-3
<210> 31
<223> cebador directo H1047L-4 <210> 32
<223> cebador directo H1047L-5 30 <210> 33
<223> cebador directo H10471-6
<210> 34
<223> Scorpion de exón 20 <210> 35
<223> Scorpion de exón 20 2 <210> 36 35 <223> región diana de control <210> 37
<223> cebador de control <210> 38
<223> Scorpion de control

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  1. imagen1
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