KR100707830B1

KR100707830B1 - 유전자변형 벼에서 도입유전자를 검출하는 방법

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Publication number: KR100707830B1
Application number: KR1020050123356A
Authority: KR
Inventors: 김환묵; 정순천; 백인순; 육은수; 김창기; 윤원기; 이기훈
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-04-13

Abstract

본 발명은 유전자변형 벼에서 도입유전자를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 트레할로스가 축적되는 유전자변형 벼에서 트레할로스-6-포스페이트 신테아제/포스파타제 융합유전자를 정성 및 정량적으로 검출하여 유전자변형 벼의 혼입률을 분석하는 방법 및 그에 이용되는 조성물을 제공한다.

벼, 유전자 변형, LMO, GMO, TPSP

Description

유전자변형 벼에서 도입유전자를 검출하는 방법{Method for detection of inserted gene in living modified rice}

도 1a는 낙동벼와 LM-벼의 DNA를 SPS-derived probe로 Southern blots 결과이며,

1: HindIII로 절단한 LM-벼;

2: HindIII와 EcoRI으로 절단한 LM-벼;

3: EcoRI으로 절단한 LM-벼;

4: HindIII로 절단한 non LM-벼;

5: HindIII와 EcoRI으로 절단한 non LM-벼;

6: EcoRI으로 절단한 non LM-벼;

도 1b는 SPS 유전자의 카피수 분석을 위한 정량 Southern-blots 결과이고,

1: HindIII로 절단한 LM-벼;

2: SalI으로 절단한 SPS probe 플라스미드 10 카피;

3: SalI으로 절단한 SPS probe 플라스미드 2 카피;

4: SalI으로 절단한 SPS probe 플라스미드 1 카피;

도 2는 SPS 서열로부터 설계된 primers를 이용한 종특이성 시험결과 사진이고,

도 3a는 pSB-UTPSP 플라스미스로 낙동벼를 형질전환시키는 경우 상기 플라스미드가 삽입되는 위치의 오른쪽 경계면의 핵산서열을 나타내고, 도 3b는 왼쪽 경계면의 핵산서열을 나타내며, 도 3c는 pSB-UTPSP 플라스미스의 구조를 나타낸 그림이고,

도 4는 SPS 유전자를 내재유전자로 이용하여 도입유전자를 검출하는 Multiplex PCR 결과이고,

도 5a는 SPS 유전자의 TaqMan real-time PCR에 따른 증폭 그래프 및 정량 곡선을 나타낸 것이고, 도 5b는 TPSP 유전자의 TaqMan real-time PCR에 따른 증폭 그래프 및 정량 곡선을 나타낸 것이며,

도 6a은 낙동벼와 LM-벼의 DNA를 TPSP-derived probe로 Southern blots 결과이며,

1: HindIII로 절단된 LM-벼;

2: HindIII와 SacI로 절단된 LM-벼;

3: SacI로 절단된 LM-벼;

4: HindIII + XbaI로 절단된 LM-벼;

5: XbaI로 절단된 LM-벼;

6: XbaI로 절단된 non LM-벼;

도 6b는 TPSP의 카피수 분석을 위한 정량 Southern blots 결과이고,

1: XbaI로 절단한 LM-벼;

2: EcoRI으로 절단한 TPSP probe 플라스미드 10 카피;

3: EcoRI으로 절단한 TPSP probe 플라스미드 2 카피;

4: EcoRI으로 절단한 TPSP probe 플라스미드 1 카피;

도 7은 절대 검출한계와 절대 정량한계의 측정을 위해 6400, 1600, 400, 100, 25, 6.25 및 1.56 copies/5μl의 SPS 유전자의 초기 주형 카피수를 가지는 기준 시료에서 Ct값의 변동을 측정한 PCR 반복 시험 그래프이고,

도 8은 절대 검출한계와 절대 정량한계의 측정을 위해 6400, 1600, 400, 100, 25, 6.25 및 1.56 copies/5 μl의 TPSP 유전자의 초기 주형 카피수를 가지는 기준 시료에서 Ct값의 변동을 측정한 PCR 반복 시험 그래프이다.

본 발명은 유전자변형 벼에서 도입유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 트레할로스가 축적되는 유전자변형 벼에서 트레할로스-6-포스페이트 신테아제/포스파타제 융합유전자를 정성 및 정량적으로 검출하여 유전자변형 벼의 혼입률을 분석하는 방법 및 그에 이용되는 조성물을 제공한다.

유전공학적 기술을 바탕으로 한 유전자변형은 곤충 저항성(insect resistance), 제초제 내성(herbicide tolerance), 질병 저항성(disease resistance), 기후 내성(climatic tolerance) 등과 같은 향상된 특성을 가진 작물을 대량으로 쉽게 개발하게 하였고, 이로써 농업 분야에서는 새로운 미래를 예고하 고 있다. 그 중에서 유전공학기술을 응용한 형질전환 곡물의 종자가 차지하는 비중은 2000년 30억불에서 2010년 200억불로, 채소는 40억불로 상당 부분이 형질전환 작물로 대체될 것으로 추정된다.

국내 종자 시장은 2000년 경우 1400억원 (수출 1,600만불) 정도지만 2010년에는 3000억원 정도로 예상하며 이 중 20%에 해당하는 600억원 정도가 형질전환 종자로 대체될 것으로 예상된다.

하지만, 이러한 유전공학적 기술은 생물학적 자연법칙을 인위적으로 조작하는 기술이므로 유전자변형 산물(living modified organisms, LMO; genetically modified organisms, GMO)에 대한 잠재적인 우려의 목소리가 높고, 또한 이미 개발된 LMO의 일부는 실제로 건강에 해롭다는 것이 밝혀진 바 있다.

LMO의 창출과정에 따라 LMO에 의한 인체 및 환경위해성 문제가 국내외에서 제기되고 있는 것은 LMO의 태생적 한계로 볼 수 있다. 이에 대한 국민의 기본적인 알권리의 충족이라는 측면과 위해성 작물출현의 잠재적인 위험으로부터 환경과 식생활에 대한 안전을 도모하기 위한 기반기술의 확보란 면에서 LMO를 유전적으로 분석할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.

최근 몇 년간 전 세계적으로 여러 나라에서 수많은 LMO의 재배 및 상품화가 승인되고 있으며, 변형된 특징의 수 뿐만 아니라 경작면적이 증가하는 경향은 뚜렷해지고 있다 (Nap, JP et al., Plant J. 33:1-18 (2003).

한국을 포함하는 많은 나라들이 유전자변형 식품과 사료의 형질전환 결과에 대한 특이적인 검출 방법을 포함하는 허가 제도를 적용하고 있다. 식품 및 사료와 관련된 광범위한 범위에서 유전자 변형 식물의 파생물질이 증가하는 현상은 많은 나라들이 도입유전자 성분의 존재유무를 평가할 적절한 검출방법에 대한 수요를 창출하였다.

특히 한국, 일본 그리고 유럽연합은 GMO 식품이나 우발적으로 유입된 유전자변형 물질의 역치수준이 0.9~5%인 식품의 원료, 혹은 시장으로 유입된 GM식품에 대하여 의무적으로 표기를 하도록 규정해왔다. 이러한 엄격한 표기규정은 Bt maize나 Roundup Ready soybean과 같은 음식물이나 부가물에서 유전자변형 작물들을 정확하게 정량하는 기술의 개발과 적용에 따라 고무되었다.

벼(Oryza sativa L.)는 전 세계 거의 절반 인구의 주요 식량이다(Lu BR, Chinese Biodiversity 6: 63-72, 1998). 특히 아시아에서 벼는 소비적인 면과 문화적인 면에서 모두 최고의 농작물로 여겨지고 있다.

벼는 인류의 가장 초창기 경작물로써 외래 유전자를 도입하는 것에 관한 유전공학 기술이 벼의 유전적 개선을 위해 효율적으로 적용되어 왔다(Ajisaka H, Maruta Y and Kumashiro T, Proceedings of the 3rd International Symposium on Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 291-298, 1993; Yahiro Y et al., Proceedings of the 3rd International Symposium on the Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 23-36. 1993). 예를 들어 많은 양의 beta-carotene(provitamin A)을 함유하고 있다거나, 질병·곤충에 대한 저항성, 바이러스에 대한 저항성, 제초제에 대한 저항성, 염분에 대한 내성에 관여하는 단백질을 고농도로 함유하는 등의 특징을 가지는 LM-벼는 유전자변형 기술을 통하여 성공적으로 개발되어왔다(Matsuda T, Proceedings of the International Symposium on Novel Foods Regulation in the European Union - Integrity of The Process of Safety Evaluation, 311-314, 1998; Datta K et al., Abstracts of International Rice Congress, 44, 2002; Potrykus I, Abstracts of International Rice Congress, 46, 2002).

그러나 이러한 LM-벼의 육종과 품종이 실험적으로는 연구되어 왔으나, 상업적 생산을 목적으로 한 유전자이식 벼의 품종은 아직 공식적으로 환경으로 방출되지 않았다(Messeguer J et al., Theoretical and Applied Genetics 103: 1151-1159, 2001; Huang JK et al., Science 295: 674-677, 2002; Jia SR and Peng YF, Environmental Biosafety Research 1: 5-8, 2002).

많은 LM-벼의 종자들 가운데 트레할로스-6-포스페이트 신테아제와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 융합 유전자(trehalose -6-phosphate synthase/phosphatase, 이하 'TPSP')가 도입되어 과발현되는 벼는 다양한 비생물학적인 스트레스에 대한 보다 강한 내성으로 인하여 관심의 대상이 되고 있다. TPSP 융합 유전자를 과발현하는 LM-벼는 트레할로스의 생물학적 합성 과정에서 촉매활성이 증가되어 트레할로스가 축적되는 특징이 있다(Jang et al., Plant Physiology Vol. 131 pp. 516-524, 2003; Garg et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA. Vol. 99 pp. 15898-15903, 2003).

이러한 LM-벼의 상업화를 위해서는 LM-벼의 유통경로상이나 환경 모니터링에 서 LMO의 혼입률 분석이나 환경 모니터링을 위한 정성 및 정량 검출 키트의 제작이 선행되어야 한다. 또한 LM-벼에 대한 특이적 검출 키트는 도입유전자의 정보뿐만 아니라, 종 특이적 내재 대조유전자(이하 '내재유전자')의 정보를 필수적으로 사용하여야 할 필요가 있다.

이에, 본 발명은 SPS 유전자를 내재유전자로 하여 TPSP 융합 유전자가 도입된 LM-벼를 종 특이적으로 검출하기 위한 LM-벼의 유전자분석 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TPSP 융합 유전자가 도입된 LM-벼를 검출하는 방법을 제공한다. 이 때, SPS 유전자를 내재유전자로 이용하고 TPSP 도입유전자 특이 프라이머를 포함하는 조성물을 이용한 PCR을 통하여 LM-벼를 검출하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 TPSP 융합 유전자가 도입된 LM-벼의 혼입률을 분석하는 LM-벼의 정량 분석방법을 제공한다. 이 때, SPS 유전자를 내재유전자로 이용하여 SPS 특이 프라이머와 프루브 및 TPSP 융합 유전자 특이 프라이머와 프루브를 포함하는 조성물을 이용한 실시간 PCR을 통하여 LM-벼의 혼입률을 정량하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 LM-벼의 유전자분석에서 내재유전자로 이용가능한 SPS 유전자를 검출하기 위한 SPS 유전자 특이 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명에서 "내재 유전자"란 특정 작물의 게놈에 자연적으로 존재하고 전체 게놈중에 단일 카피(single copy)로 존재하여 특정작물의 유전자분석에서 특정 작물의 존재를 알려주는 양성 대조구로 이용될 수 있는 유전자이며, 또한 여타 근연종에는 존재하지 않는 종특이적 유전자로써 음성 대조구로 사용될 수 있는 유전자를 말한다.

콩에서는 렉틴(lectin) 유전자가, 옥수수에서는 제인(zein) 유전자 등이 내재유전자로 알려져 그 특성이 잘 구명되어 있으나, LM-벼의 유전자 분석에 사용될 수 있는 유전자는 많이 연구되어 있지 않은 실정이다.

현재까지 알려진 벼의 내재유전자 후보로는 딩 등에 의하여 sucrose phosphate synthase(SPS)가 알려진 바 있다(Ding, Jiang et al., J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 3372-3377). Ding 등은 SPS 유전자의 exon 부위를 이용하여 TaqMan 방법에 의한 GUS 유전자 형질전환 벼의 정성 및 정량 PCR 검출 방법을 개시한 바 있다.

그러나 Ding 등의 방법은 SPS 유전자가 벼 유전체에서 단일 카피로 존재하는지를 제한효소로 절단한 Southern blot 방법으로 제시하였으나, 정량적 Southern blot 방법으로 단일 카피인지를 확인하지 못한 문제점이 있다.

본 발명에서는 먼저 다섯 종의 후보 유전자 즉, UDP -glucose pyrophosphorylase, sucrose phosphate synthase(SPS), starch branching enzyme(RBE4), hexokinase I, 및 fructokinase I 유전자의 genomic DNA (gDNA) 염기서열(intron 포함)을 분석한 후, intron 부위를 포함하는 부분을 PCR 증폭하여 프루브를 만들고 이들 유전자 중 벼에서 단일 카피로 존재하는 유전자를 Southern blotting을 통하여 발굴한 결과, SPS 유전자가 단일 카피로 확인되었다.

구체적으로, SPS 유전자의 프루브는 벼 gDNA의 SPS 유전자 부위를 서열목록 1과 2의 핵산 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 낙동벼(Oryza sativa cv Nakdong)의 gDNA에서 PCR 증폭한 SPS-intron이라 명명된 DNA fragment를 사용하였다(서열목록 3 참조).

세 개의 restriction enzyme을 사용한 restriction fragment length polymorphism 분석에서 SPS는 단일카피로 존재함이 밝혀졌다(도 1a 참조).

SPS 유전자의 단일 카피 여부를 정량적으로 확정하고자 gDNA의 양과 SPS 유전자가 포함된 플라스미드(plasmid)의 정확히 계산한 카피수를 비교하는 정량 Southern blotting을 수행하였다.

구체적으로 낙동벼 gDNA 의 일정량을 아가로스 겔의 한 레인에 로딩하고, 상기 서열목록 3의 핵산서열을 가지는 SPS intron을 T-easy vector에 삽입한 플라스미드(pT-SPS intron)를 동일량의 gDNA에 존재하는 카피수의 1X, 2X, 10X로 인접한 각각의 레인에 로딩하여 Southern blotting 한 후 상호 비교하여 카피수를 추정하였다. 그 결과 SPS 유전자가 벼에서 단일 카피임이 확실하였다(도 1b 참조). 따라서 SPS는 LM-벼의 유전자분석을 위한 내재유전자로 이용가능하다.

또한 본 발명은 TPSP 융합 유전자가 도입된 LM-벼를 검출하는 방법을 제공한다.

구체적으로 TPSP 융합유전자를 증폭하는 TPSP 특이 프라이머를 포함하는 조성물을 이용한 PCR을 통하여 LM-벼를 검출하는 것이 바람직하다.

또한 이 때 SPS 유전자를 내재 유전자로 이용하여 SPS 특이 프라이머와 TPSP 특이 프라이머를 포함하는 조성물을 이용하여 LM-벼를 검출하는 것이 더욱 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 서열목록 8과 9, 서열목록 10과 11, 또는 서열목록 12와 13의 핵산서열을 포함하는 어느 한 쌍의 프라이머를 포함하는 TPSP 특이 프라이머 쌍과 서열목록 4와 5 또는 서열목록 6과 7의 핵산서열을 포함하는 SPS 특이 프라이머 쌍을 함유하는 조성물을 이용한 PCR을 통하여 TPSP가 형질전환된 LM-벼를 검출하는 것이다.

본 발명에서 "LM-벼"이란 기존 작물 육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리하여 도입하도록 조작된 모든 벼를 의미한다.

또한 본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 적절한 조건에서 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 한다. 프라이머는 바람직하게는 단쇄 올리고데옥시라이보뉴클레오티드이다.

벼의 유전적변형 여부를 확인하는 방법으로 도입유전자를 특이적으로 증폭하 여 검출하는 PCR 방법이 이용되고 있으며, 이때 LM-벼와 non LM-벼에 존재하면서 여타 근연종에서는 PCR 증폭이 일어나지 않는 종 특이적 내재유전자 특이 프라이머를 고안하여 대조구로 사용하는 것이 필수적이다.

다시 말해, 만약 특정종의 존재를 알리는 양성대조구나 특정종의 비존재를 알리는 음성대조구로 작용하는 종특이적 내재유전자를 사용하지 않으면 도입유전자를 검출하는 것만으로 LM 벼의 일반적인 검출에는 사용될 수 있으나 이러한 방법은 도입유전자가 여러 작물계통에 독립적으로 형질전환된 경우에는 특이성이 없다.

SPS 유전자가 벼의 종 특이적 내재유전자인지 확인하기 위하여, 벼를 포함한 다양한 작물의 gDNA를 추출한 다음 서열목록 4와 5의 핵산서열을 포함하는 SPS 특이 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 PCR 산물을 분석하였다.

그 결과 SPS의 염기서열에서 고안된 상기 프라이머 쌍은 다양한 작물 중에서 벼 gDNA에서만 예측되는 PCR 산물을 증폭하였다(도 2 참조).

따라서 본 발명에 따른 SPS 유전자는 벼에서 종 특이적으로 존재하는 유전자임을 확인하였고, 이러한 SPS 유전자와 유전자변형 과정에서 혼입된 도입유전자를 동시에 검출함으로써 다양한 작물의 gDNA으로부터 유전자변형이 일어난 벼를 종특이적으로 확인가능하다.

바람직하게는, 서열목록 4와 5의 핵산서열을 포함하는 SPS 특이 프라이머 쌍과 TPSP 특이 프라이머 쌍을 함유하는 조성물을 이용한 PCR을 통하여 LM-벼를 검출한다.

본 발명에서는 내재유전자로 SPS를 이용하여 TPSP 형질전환 벼를 검출하는 방법을 제공한다.

많은 LM-벼의 종자들 가운데 TPSP 융합 유전자가 도입되어 과발현되는 벼는 다양한 비생물학적인 스트레스에 대한 보다 강한 내성으로 인하여 관심의 대상이 되고 있다. TPSP 융합 유전자를 과발현하는 LM-벼는 트레할로스의 생물학적 합성 과정에서 촉매활성이 증가되어 트레할로스가 축적되는 특징이 있다(Jang et al., Plant Physiology Vol. 131 pp. 516-524, 2003; Garg et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA. Vol. 99 pp. 15898-15903, 2003).

본 발명에서는 pSB-UTPSP 플라스미스(Jang et al., Plant Physiology Vol. 131 pp. 516-524, 2003)로 형질전환시킨 낙동벼를 LM-벼로 특정하고, 낙동벼와 상기 LM-벼의 gDNA를 주형으로 하여 multiplex PCR을 수행함으로써 LM-벼가 특이적으로 검출되는지 확인하였다.

이 때 프라이머는 하기 표 1에 표시된 프라이머 쌍을 이용하였다.

Multiplex PCR에 이용된 프라이머 쌍

주형	프라이머 특징 및 이름	염기서열
LB	upper, 645U(UP2), 서열목록 8	TTTCTGGCAGCTGGACTTCA
LB	lower, LIR1(LP2), 서열목록 9	CTACACGGCAATACGGCACG
TPSP	upper, TPS(F), 서열목록 10	AACCTCAGCGAACAGGACCT
TPSP	lower, TPS(R), 서열목록 11	TAATCCAGCCGTTCGACAGA
BAR	upper, 252U, 서열목록 12	AAGCACGGTCAACTTCCGTA
BAR	lower, 424lL, 서열목록 13	ACTCGGCCGTCCAGTCGTA
SPS	upper, 4504U, 서열목록 6	TAGTCTTCATGGTCTAGTTCGT
SPS	lower, 4708L, 서열목록 7	TTTCACCTGCAAGACATGAAAAA

서열목록 8과 9의 핵산서열을 포함하는 프라이머 쌍은 pSB-UTPSP 플라스미스가 벼에 이식되는 경우 left border (LB) 및 이와 인접한 gDNA 부위를 증폭하였고, SPS 유전자는 내부 양성대조군으로 사용되었다(도 3c 참조). 또한 pSB-UTPSP 플라스미스에서 도입된 TPSP와 bar 유전자 염기서열을 증폭하고, SPS 유전자는 내부 양성대조군으로 사용하는 방법도 제작되었다.

그 결과, 양성대조군으로 사용한 SPS는 non LM-벼와 LM-벼에서 모두 확인되었으나, 형질전환 event에 특이적인 PCR 산물은 LM-벼에서만 확인되었다(도 4 참조).

본 발명에 따른 TPSP 특이 프라이머 세 쌍을 사용한 multiplex PCR은 gDNA의 순수도에 관계없이 PCR 산물의 생성 여부를 명확히 할 수 있는 점에서 유용하다.

본 발명은 TPSP 융합유전자가 도입된 LM-벼의 혼입률을 분석하는 LM-벼의 정량 분석방법을 제공한다.

이 때, 내재유전자로 SPS 유전자를 이용하는 것이 바람직하다.

구체적으로 SPS 특이 프라이머와 프루브 및 TPSP 특이 프라이머와 프루브를 포함하는 조성물을 이용한 실시간 PCR을 통하여 LM-벼의 혼입률을 정량하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, "혼입률"이란 분석 시료(미지 시료)의 전체 양에서 유전자 변형 작물이 차지하는 양의 비율을 의미하는 것으로 백분율(%)로 나타낸다.

현재 유전자변형농산물에 대해 가장 널리 사용되는 정량분석중의 하나는 실시간 PCR 법을 이용하는 것으로, PCR의 매 사이클마다 형광값을 측정하여 사이클 대비 형광값으로 그래프를 완성한 후 지수 증식기 (exponential phase) 범위 내에서 분석하여 표준시료의 Ct (threshold cycle; 역치 싸이클) 값을 이용하여 표준곡선을 구한 후 미지시료의 Ct값을 대입하여 LMO 혼입률을 측정하는 것이다.

현재까지 개발된 실시간 PCR을 이용한 정량분석 방법에는 5' nuclease activity를 이용하여 PCR이 진행됨에 따라 5' 말단의 reporter fluorescent 염료가 quencher 염료로부터 분리되면서 내는 고유의 형광값을 읽는 방법인 TaqMan 프루브 방법(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA; Holland 등, (1991) PNAS 88:7276-7280), 루프 (loof) 부분은 표적에 특이적인 염기서열이고 양쪽 끝의 서로 상보적인 염기서열을 통하여 헤어핀 구조를 이루는 프루브가 PCR 과정에 따라 표적에 결합하면 양쪽 끝의 염료가 분리되면서 형광을 발산하는 Molecular beacon 방법 (Kramaer 등, (1996) Nature Biotech. 14:303-308), 그리고 업스트림 올리고 프루브의 3' 말단에 donor 염료가 결합되어 있고, 근접한 염기서열에 대한 다운스트림 올리고 프루브의 5' 말단에 acceptor 염료가 결합되어 있어서 PCR 과정에 따라 표적에 두 프루브가 모두 결합하면 두 염료가 가까워지면서 형광을 발산하는 하이브리다이제이션 프루브 방법 (Livak 등, (1995) PCR Methods Appl. 4:357-362), 유전자 특이 올리고뉴클레오타이드들에 부착된 Z 모양의 염기서열에 universal 헤어핀 프라이머 (UniprimerTM)가 부착하여 PCR 증폭산물에 결합하면 형광을 발하는 AmpliflourTM 보편적 증폭 및 검출 시스템 (AmpliflourTM Universal Amplification and Detection System) (Intergen Co. Purchase, NY, USA; Nazarenko 등, (1997) Nucleic Acid Research 25: 2516-2521), 통상적인 PCR에서와 같이 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하여 PCR 산물인 DNA의 이중나선에 염료가 특이적으로 삽입(intercalating)되어 형광을 발하는 SYBR Green I 염료의 특성을 이용하는 SYBR Green I 염료를 사용하는 방법 (Molecular Probes, OR, USA; Morrison 등, (1998) BioTechniques 24: 954-962) 등이 있으며, 가장 널리 사용되는 방법은 프라이머에 형광 염료를 부착시킨 서열에 특이적인 프루브를 사용하는 TaqMan 법이다.

본 발명에서는 내재유전자 SPS 유전자의 염기서열과 LM-벼의 TPSP 유전자의 염기서열에서 TaqMan 프루브를 제작하여 LM-벼와 낙동벼의 혼합물에서 LM-벼의 혼입률을 정량하는 방법을 개발하였다.

본 발명은 신뢰성 있는 결과를 도출하기 위하여 내재 유전자인 SPS 유전자를 내부 대조구로 사용한 것을 특징으로 하고, 구체적으로 서열번호 14와 15의 핵산 서열을 가지는 벼의 SPS 유전자 특이적 프라이머 쌍을 제공하고 서열번호 16의 핵산 서열을 가지는 SPS 유전자 특이 TaqMan 프루브를 제공한다.

또한 서열번호 17와 18의 핵산 서열을 가지는 벼의 TPSP 유전자 특이적 프라이머 쌍을 제공하고 서열번호 19의 핵산 서열을 가지는 TPSP 유전자 특이 TaqMan 프루브를 제공한다.

따라서 LM-벼의 gDNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 서열번호 14와 15의 핵산 서열을 가지는 벼의 SPS 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 16의 핵산 서열을 가지는 SPS 유전자 특이 TaqMan 프루브 및 서열번호 17와 18의 핵산 서열을 가지는 벼의 TPSP 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 19의 핵산 서열을 가지는 TPSP 유전자 특이 TaqMan 프루브를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 각 사이클의 연장반응 시기에 분석시료의 형광값을 판독하여 TPSP 유전자 Ct/SPS Ct 값을 측정하고 이를 표준곡선에 대입하여 LM-벼의 혼입률을 정량적으로 분석한다.

본 발명에서, "표준곡선"이란 혼입률 또는 게놈 copy 수을 알고 있는 표준시료로부터 동일한 프라이머를 이용해서 도입유전자 Ct/SPS Ct 값을 측정하고, 이 값을 회귀분석(regression analysis)하여 얻은 농도별 도입유전자 Ct/SPS Ct 값의 선형의 관련성을 나타내는 함수식을 의미하며, 일반적인 프로그램을 통하여 얻을 수 있다. 즉, IRMM (Institute of Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium) 같은 공인기관에서 표준시료 (certified reference materials)를 제공하는 경우에는 혼입률이 알려진 표준시료를 사용하여 표준곡선을 작성하나, 표준시료가 없은 본 발명의 경우에는 실험실에서 제작한 순도가 높은 gDNA를 순차적으로 묽혀서 표준시료를 제작하여 표준곡선을 작성한다.

상기 표준곡선은 단순회귀모형의 기울기와 절편은 n 개의 자료 쌍을 통하여 최소제곱법(method of least square)으로 추정될 수 있으며, 이런 방법으로 얻은 적합된 회귀식(fitted regression equation)에 미지의 (혼입률을 모르는) 분석시료의 도입유전자 Ct/SPS Ct 값을 대입함으로써, 분석시료의 혼입률을 계산할 수 있다.

따라서 본 발명에서는 혼입률을 알고 있는 표준시료를 사용하는 정량 방법과는 달리, 최근에 채택되고 있는 limit of detection (LOD)와 limit of quantification (LOQ) 개념(Berdal and Holst-Jensen (2001) Eur. Food Res. Technol. 213:432-438)을 채택하여 혼입률을 정량하는 방법을 제공한다.

LOD 및 LOQ에 의하여 정량하는 방법은, 우선 도입유전자의 카피수를 확인하고 다양한 카피수를 가진 기준시료로부터 PCR을 수행하여 도입유전자 Ct/SPS Ct 값을 얻는다. 이로부터 LOD 및 LOQ를 확인하고 분석시료로부터 PCR을 수행하여 얻은 도입유전자 Ct/SPS Ct 값이 LOD 및 LOQ에서 버림값이 아닌 경우 상기 기준시료의 도입유전자 Ct/SPS Ct 값과 비교하여 도입유전자의 카피수를 계산하여 혼입률을 추정한다.

본 발명에 따른 혼입률 분석방법이 실효성이 있는지 확인하기 위하여, 트레할로스-6-포스페이트 신테아제와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 융합 유전자인 TPSP를 도입유전자로 한 LM-벼의 혼입률을 정량하였다.

구체적으로, 우선 LM-벼의 잎 조직으로부터 순수하게 추출한 gDNA를 double stranded DNA에 특이적으로 결합하는 pico green dye를 이용하여 정확하게 정량하였다. LM-벼에 도입된 TPSP가 1 copy임을 확인하고 gDNA양에 따른 copy수를 계산하여 먼저 6400 copies/5 μl 기준 시료를 만든 후 연속적으로 4 배씩 희석하여 1600, 400, 100, 25, 6.25, 1.56 copies/5 μl까지 기준 시료를 만들었다. 벼 반수체 genome은 0.52 pg이므로 (Arumuganathan and Earle, Plant Molecular Biology Reporters, Vol. 9, pp 208-218, 1991), 1000 copies은 520 pg이며 1.56 copies는 0.81 pg의 DNA에 해당한다.

상기 기준 시료로 부터 real-time PCR은 하기 표 2의 프루브/프라이머 쌍을 이용하고, DNA 5 μl, ABI master mix 1X, Primer 0.5 μM, Probe 0.2 μM에 증류수(DW)를 첨가하여 총 25 μl의 반응 용액으로 4회분(4 well) 이상의 반응액을 만들어 95℃에서 10분, 95℃에서 30초 및 60℃에서 30초로 50 cycles로 수행하고 이를 반복하여 LOD 및 LOQ를 확인하였다.

내재유전자 SPS와 도입유전자 TPSP으로부터 제작한 TaqMan probes/primers.

주형	프라이머/프루브	서열
SPS	Forward, 서열목록 14	CGATAGATCGGCTAAATTGTCGTGT
	Reverse, 서열목록 15	TGAACACTCTGATCTTTTCTTGAAAGCA
	Probe, 서열목록 16	FAM-CCAACGGCCTGATCTAG-MGBNFQ
TPSP	Forward, 서열목록 17	CTGGACGCCGCTTTATTATTTGAA
	Reverse, 서열목록 18	TCCTGAGCAGCAACATACTCTTT
	Probe, 서열목록 19	FAM-CCAGGTTCATCCCGTCACGCAGTGGC-TAMRA

상기 프루브의 5'말단은 FAM으로 3'말단은 TAMRA 혹은 MGBNFQ로 라벨링하였다.

PCR 유효성을 확인하기 위하여, 상기 TaqMan probe/primer set의 표준곡선을 그려본 결과 SPS는 PCR efficiency가 90.1%이고, TPSP의 경우에는 PCR efficiency가 88.5%로써 정량에 적합함을 확인하였다(도 5a 및 5b 참조).

SPS와 TPSP의 LOD 및 LOQ를 측정한 결과, SPS 유전자에서 제작한 TaqMan probe/primer set의 LOD는 1.56 이하이며, LOQ는 표준편차 값에 따른 관찰된 ΔCt 값의 변이가 1 이하인 25과 6.25 사이에 있었다(도 7 및 표 6 참조). TPSP의 LOD는 1.56 이며, LOQ는 25과 6.25 사이에 있었다(도 8 및 표 7 참조).

LM-벼의 혼입률을 정량하기 위하여, LM-벼와 낙동벼의 gDNA를 섞어서 5개의 3% 시료를 만들어 위의 조건으로 정량분석을 한 결과 각각 3.45, 3.27, 3.18, 3.30, 및 3.10%의 값을 얻었다(표 8 참조). 평균값이 3.26%로써 본 발명의 정량분석 방법은 우리나라에서 적용되는 비의도적 혼입률 3%를 정량하기에 적합하다.

또한 7개의 1% 시료를 만들어 상기 조건으로 정량분석을 한 결과 1.01%의 평균 정량값을 얻었다(표 9 참조).

따라서 본 발명에 따른 LM-벼의 혼입률 정량방법은 유효함이 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> SPS 유전자 검출 probe 제작

SPS 유전자의 probe는 벼 gDNA의 SPS 유전자 부위를 서열목록 1과 2의 핵산서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하여 낙동벼의 gDNA에서 PCR 증폭한 서열목록 3의 핵산서열을 가지는 SPS-intron이라 명명된 DNA fragment를 사용하였다.

상기 SPS-intron은 SPS 유전자의 양쪽 끝에서 exon 부위와 연결되어 있는 intron의 서열을 포함하는 프루브이다. 서열중에서 16번부터 652번 염기까지가 인트론 서열이다.

<실시예 2> Southern blot analysis

낙동벼와 LM-벼로부터 얻은 잎은 막자와 막자사발을 이용하여 액체질소에서 부수었다. 그 후 벼의 gDNA는 사가이 마루프 등의 방법(Saghai Maroof et al., Proceedings of National Academy of Sciences, USA, Vol. 81 pp. 8014-8018, 1984)를 참고로 하여 분리하였다.

5 μg의 gDNA를 HindIII, HindIII + EcoRI 및 EcoRI로 이루어진 제한효소로 하루 동안 잘라서 0.8% agarose gel에서 분리한 후, Hybond N+ nylon membrane (Amersham Pharmacia)에 옮기고 biotin이 표지되어 있는 probe와 함께 반응시켰다.

SPS-intron DNA probe는 Nick Translation System (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조하였고, biotin이 표지된 DNA는 streptavidin alkaline phosphatase와 CDP-Star　 (Applied Biosystems, Bedford, MA)를 사용하여 화학발광에 의해 검출하였다. Hybridization과 membrane의 세척 그리고 검출은 제조사의 설명서에 따라서 수행되었다.

도 1a에서 확인할 수 있는 바와 같이, HindIII와 EcoRI으로 동시에 절단한 2 및 5 레인에서도 각각의 제한효소로 절단한 1, 4 및 3, 6 레인과 동일한 결과를 나타내어 SPS는 LM-벼 및 낙동벼에서 동일하게 단일 카피로 존재하는 것으로 추정하였다.

또한 SPS 유전자의 single copy 여부를 정량적으로 확정하고자 gDNA의 양과 SPS 유전자가 포함된 플라스미드의 정확히 계산한 copy수를 비교하는 정량 Southern blotting을 수행하였다.

Agarose gel의 한 레인에 로딩한 LM-벼 gDNA의 량은 5 μg이며, positive control plasmid는 서열목록 3의 핵산서열을 가지는 SPS-intron을 T-easy vector(Promega 사, 미국)로 삽입하여 제작하고, 이를 SalI으로 절단하여 특정 유전자가 벼 gDNA에 1 copy 만 존재할 때 5 μg gDNA에 존재하는 copy 수의 1X, 2X, 10X의 plasmid 수를 인접한 레인에 로딩하여 Southern blotting 한 후 상호 비교하여 copy 수를 추정하였다.

그 결과 도 1b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레인 1에 로딩한 LM-벼 gDNA는 1 카피를 로딩한 레인 4와 동일한 결과를 보여 SPS 유전자는 낙동벼에 단일 카피로 존재함을 나타내었다.

<실시예 3> SPS 특이 프라이머를 이용한 정성 PCR에 의한 종특이성 확인

LM-벼, 낙동벼, 7개 종(오이, 토마토, 들깨, 고추, 콩, 밀, 보리)의 gDNA를 사가이 마루프 등의 CTAB방법으로 10g의 잎으로부터 분리하였다. DNA의 농도는 분광광도계 SmartSpecTM 3000(Bio-Rad Inc., USA)을 사용하여 정량하였고, gDNA는 multiplex PCR 증폭에 사용하였다.

PCR은 25 μl로 반응하였으며, 100 ng gDNA, 10X PCR buffer(100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 9.0) 2.5 μl , 0.2 mM dNTP, SPS 특이, Actin 특이 10 uM primer 각 2 μl, Taq polymerase (Bioneer, Korea) 1.2 units 그리고 탈 이온수가 포함되었다.

SPS를 위한 프로그램에 따라서 PTC DNA EngineTM Systems (MJ research, USA)이 사용되었고, 94℃에서 2분간 반응시키고, 변성(denaturation)은 94℃에서 30초, 어닐링(annealing)은 54℃에서 30초, 연장반응은 68℃에서 1분간으로 36회 반복되었다.

Primer의 sequence는 하기 표 3과 같이 고안되었다.

종 특이성 확인을 위한 SPS 특이 프라이머.

주형	프라이머 특징 및 이름	염기서열
SPS	Forward Primer, 서열목록 4	AATTTAGTTTCTCGTGCTCTC
SPS	Reverse Primer, 서열목록 5	TGCCATACTTTCTTCTTTCC
Actin	Forward Primer	TGGACTCTGGTGATGGTGTC
Actin	Reverse Primer	CCTCCAATCCAAACACTGTA

PCR 산물들은 0.1 μg/ml ethidium bromide를 포함하는 2%(w/v) agarose gel에서 전기영동하였다.

그 결과, 도 2와 같은 전기영동 결과를 얻었으며 이는 SPS가 벼에서만 종특이적으로 존재함을 확인하였다.

<실시예 4> SPS 유전자 특이 프라이머를 이용한 Multiplex PCR에 의한 도입유전자의 확인

(4-1) 도입유전자의 특정

많은 LM 벼의 종자들 가운데 TPSP 융합 유전자가 도입되어 과발현되는 벼는 다양한 비생물학적인 스트레스에 대한 보다 강한 내성으로 인하여 관심의 대상이 되고 있다. TPSP 융합 유전자를 과발현하는 LM-벼는 두단계에 거친 트레할로스의 생물학적 합성 과정에서 촉매활성이 증가되어 트레할로스가 축척되는 특징이 있다.

명지대학교 김주곤 교수로부터 입수한 pSB-UTPSP 플라스미드로 형질전환된 낙동벼(Jang et al., Plant Physiology Vol. 131 pp. 516-524, 2003)를 LM-벼로 특정하고, pSB-UTPSP에 기초하여 하기 표 4의 프라이머 쌍을 고안하였다.

TPSP 증폭용 프라이머

프라이머 특징 및 이름	핵산서열
IRR222L	TCCTTTAGACCATGTCTAACTGT
IRR352L	ATCCCTAAATGGATGTACTAATAA
IRR410U	AGCCTCTAAATTAAGAAAACAAAAA
IRR510U	ACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAA
iLB724L	AAATTCGGGGTCATCAGATC
iLB838U	ACATGTAATGCATGAAGGCG
iLB636L	ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA
iLB925U	AAATATAGCGCGCAAACTAG

LM-벼와 상기 프라이머를 이용한 inverse PCR을 수행하여 벼의 gDNA로 도입된 발현카세트의 염기서열과 flanking gDNA sequence를 확인하였다.

구체적으로, LM-벼 1-5 μg의 gDNA를 right border(RB)의 inverse PCR을 위해 BglII를 사용하여 digestion 하였고, 슈퍼벼의 LB의 inverse PCR을 위해 도입 vector의 말단 부위에 restriction site가 없는 HinfI을 사용하여 digestion하여 gDNA를 절단하였다. Digested DNA는 phenol-chloroform (24:1) 용액으로 정제되었고, 이중 0.2 μg DNA은 T4 DNA ligase (Promega, USA)를 사용하여 16℃에서 16시간 이상 반응시켜 intramolecular ligation (총 반응 부피 50 μl)을 수행하였다.

1차 PCR은 위의 ligation mixture 3 μl, 0.1 mM dNTPs, 1 unit Elongase(Promega, USA), 1×Elongase buffer 및 1 μM primers를 포함하도록 하여 50 μl로 반응시켰다. 1차 PCR 프로그램은 처음에 94℃에서 2분간 반응하였고, 94℃에서 변성 30초, 58℃에서 어닐링 30초, 68℃에서 연장반응 5분간의 반응을 25 cycle 반응하였다. 2차 PCR (nested PCR)은 1차 PCR 산물 1μl, 0.1mM dNTPs, 1 unit Elongase(Promega, USA), 5×Elongase buffer 그리고 20 pmol RB 또는 LB primers로 구성된 혼합물로 수행하였으며, 처음 94℃에서 2분간 반응하였고, 94℃에서 denaturation 30초, 58℃에서 annealing 30초, 68℃에서 extension 5분간 수행되었다.

오른쪽 측면 서열의 증폭을 위하여 1차 PCR에는 IRR222L과 IRR352L가 사용되었고, 2차 PCR에는 IRR410U와 IRR510U가 각각 사용되었다. 왼쪽 측면과 연결되어있는 서열은 다음 2개의 primer set에 의해 증폭되었는데, iLB724L과 iLB838U 그리고 iLB636L과 iLB925U가 각각 1차 PCR과 2차 PCR에 사용되었다.

Nested PCR산물은 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 클로닝하여 전체의 염기서열을 확인하였다.

그 결과, 서열목록 20과 21의 핵산서열은 상기 벡터가 삽입된 부위의 양쪽 말단을 정확히 나타내는 DNA 절편의 핵산서열을 나타내고 있다(도 3a 및 도 3b 참조). inverse PCR 산물의 sequence 분석에 따르면 도입유전자 성분이 벼의 genome에 삽입될 때, pSB-UTPSP의 오른쪽 경계면은 nucleotide 위치 6215에 왼쪽 경계면은 nucleotide 위치 102에 삽입된 것을 확인하였다. 이것은 TPSP fusion 유전자와 bar 유전자를 포함하는 완전한 발현 cassette를 나타내는 것이다(도 3c).

오른쪽 경계면과 연결되어있는 1690 bp의 gDNA sequence(도 3a의 이탤릭부분)와 왼쪽 경계면과 연결되어있는 222 bp(도 3b의 이탤릭 부분)의 gDNA sequence는 GeneBank database에 대한 BLAST 분석을 통하여 이루어졌으며, gDNA sequence가 bacterial artificial clone OSJNBa0035J16와 OSJNBb0006J12에 위치한다는 것이 밝혀져 전체의 염기서열이 확인되었다. The Institute for Genomic Research (http://www.tigr.org/) database를 이용한 in silico 지도화(mapping)는 변형유전자 성분이 OSJNBa0035J16에서 분자적 표지 C2784와 S3758사이의 5번 chromosome 75cM position에 위치하는 것을 찾도록 하였다.

(4-2) Multiplex PCR

본 발명에 따른 primer sets가 유효하게 LM-벼를 특이적으로 검출하는지 확인하기 위하여, SPS 특이 primer set와 도입융합유전자 TPSP 특이 primer set, 및 도입유전자 인접 gDNA 염기서열을 이용한 multiplex PCR을 수행하였다. 사용한 PCR primer은 상기 표 1에서 기술한 바와 같다.

낙동벼와 LM-벼의 gDNA의 준비와 PCR 조건은 Actin 특이 primer을 사용하는 것 대신 SPS 특이 primer을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 3>과 동일하다.

그 결과, LM-벼에서만 형질전환 event에 특이적인 PCR 산물이 확인되었다(도 4 참조).

<실시예 5> TaqMan probe를 이용한 LM-벼의 혼입률 분석

(5-1) 도입유전자 카피수 확인

두 개 이상의 제한효소를 사용하여 restriction fragment의 개수의 변화를 관찰하여 copy 수를 정하는 Southern blotting을 수행하였는데, TPSP 유전자의 LB쪽을 증폭하는 primer 쌍(bar 24U과 nos 235L)을 사용하여 제작한 probe로 분석한 결과 도입유전자가 1 copy 존재함을 확인하였다(도 6a 참조). 또한 도입유전자의 copy 수의 분석을 gDNA와 양성 대조 plasmid insert의 정확한 copy 수의 계산을 미리 수행하여 정량 Southern blotting을 TPSP에서 Primer 쌍(TPP U과 TPP L)를 사용하여 제작한 probe를 사용하여 1 copy 임을 증명하였다(도 6b 참조).

TPSP 카피수 분석을 위한 프라이머

증폭산물	프라이머 특징 및 이름	서열
gDNA TPSP	bar 24U	ACG ACG CCC GGC CGA CAT
gDNA TPSP	nos 235L	AAT TTA TCC TAG TTT GCG CGC T
TPSP 프루브	TPP U	TGG ATC GTG CAT TGA CTA T
TPSP 프루브	TPP L	ATA CTG AGC GAT GAC TGT AT

(5-2) SPS 유전자와 도입유전자의 LOQ 및 LOD 확인

LM-벼의 잎 조직으로부터 순수하게 추출한 gDNA를 double stranded DNA에 특이적으로 결합하는 Pico green dye를 이용하여 정확하게 정량하였다.

LM-벼에 도입된 TPSP가 1 copy이므로 gDNA양에 따른 copy수를 계산하여 먼저 6400 copies/5 μl 기준 시료를 만든 후 연속적으로 4 배씩 희석하여 1600, 400, 100, 25, 6.25, 1.56 copies/5 μl까지 기준 시료를 만들었다.

상기 기준 시료로 부터 Real-time PCR은 상기 표 2의 프루브/프라이머 쌍을 이용하고, DNA 5 μl, ABI master mix 1X, Primer 0.5 μM, Probe 0.2 μM에 DW를 첨가하여 총 25 μl의 반응 용액으로 4회분(4 well) 이상의 반응액을 만들어 95℃에서 10분, 95℃에서 30초 및 60℃에서 30초로 50 cycles로 PCR 수행하고 각 연장반응 시기에 형광값을 판독하여 Ct값을 얻었다.

도 5a 및 5b의 표준 곡선에서 확인할 수 있는 바와 같이, SPS 유전자의 PCR 효율(efficiency, E)는 90.1%이고 TPSP의 경우에는 PCR 효율이 88.5%로써 정량에 적합하였다.

또한 SPS 유전자 및 TPSP 유전자의 LOQ 및 LOD를 결정하기 위하여 PCR 반응을 반복하고 그 증폭 결과를 표 6과 도 7 및 표 7과 도 8에 정리하였다.

초기 계산된 주형 카피수에 기초한 LM-벼의 TPSP 카피수별 기준시료에서 SPS 유전자의 Ct 값

Estimated no of template molecules	6400	1600	400	100	25	6.25	1.56
Signal rate (number of positives)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	2/4
Mean Ct-value (of positives)	26.11	28.06	29.90	32.39	34.69	36.65	38.51
SD of observed Ct-values	0.06	0.20	0.17	0.17	0.35	0.54	1.44
ΔCt	NA	1.95	1.84	2.49	2.3	1.96	1.86

초기 계산된 주형 카피수에 기초한 LM-벼의 TPSP 카피수별 기준시료에서 TPSP 유전자의 Ct 값

Estimated no of template molecules	6400	1600	400	100	25	6.25	1.56
Signal rate (number of positives)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4
Mean Ct-value (of positives)	36.47	28.52	30.66	33.06	35.14	37.82	38.88
SD of observed Ct-values	0.21	0.27	0.18	0.48	0.37	1.09	1.80
ΔCt	NA	2.05	2.14	2.40	2.08	2.68	1.06

그 결과 PCR을 반복 수행함에 따라 정량 곡선의 변이(fluctuation)가 적은 카피수의 시료에서 나타나기 시작하였고, SPS 유전자의 경우 25과 6.25 copies 사이에서 Ct값의 표준편차의 측정치에 기초한 변이가 1 이상으로 나타나 LOQ를 25과 6.25 copies 사이로 결정하였고, 1.56 copies에서 두개의 시료에서 검출시그널이 나타나지 않은 경우가 발생하여 LOD를 1.56 copies/5 μl 이하로 결정하였다.

TPSP 유전자의 경우 LOQ는 25과 6.25 copies/5 μl 사이로, LOD는 1.56 이하로 결정되었다.

(5-3) 미지시료의 혼입률 분석

LM-벼와 낙동벼의 총 25 ng의 gDNA에 낙동벼 47500 copies와 LM-벼 1500 copies 상당의 DNA를 섞은 5개의 3% 시료를 만들어 상기 조건으로 PCR을 수행하여 정량한 결과 하기 표 8과 같은 결과를 얻었다. 각 시료는 세번씩 정량하였다.

미지시료(3%)로부터 얻은 정량 데이터.

Standard Copy 수	TPSP Mean starting quantity	Mean Ct	SD of Ct	SPS Mean starting quantity	Mean Ct	SD of Ct	% of LM-Rice
125	1.25E+02	37.07	0.09	1.25E+02	35.66	0.09
500	5.00E+02	34.38	0.18	5.00E+02	33.09	0.23
2000	2.00E+03	32.25	0.13	2.00E+03	30.69	0.04
8000	8.00E+03	29.73	0.01	8.00E+03	28.38	0.10
32000	3.20E+04	27.64	0.03	3.20E+04	26.39	0.12
128000	1.28E+05	25.20	0.10	1.28E+05	23.94	0.08
Unknown sample 1 (3%)	1.47E+03	32.57	0.11	4.72E+04	25.57	0.12	3.45
Unknown sample 2 (3%)	1.44E+03	32.70	0.14	4.62E+04	25.61	0.01	3.27
Unknown sample 3 (3%)	1.48E+03	32.70	0.11	4.74E+04	25.56	0.06	3.18
Unknown sample 4 (3%)	1.49E+03	32.65	0.38	4.78E+04	25.55	0.10	3.30
Unknown sample 5 (3%)	1.66E+03	32.55	0.11	5.32E+04	25.37	0.06	3.10

그 결과 상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 각각 3.45, 3.27, 3.18, 3.30, 3.10%의 값을 얻었고, 평균값이 3.26% 이었다. 8.6% 오차범위는 혼입률 측정시 허용오차범위인 25% 보다 상당히 낮은 수치이다(식품의약품안전청, 유전자재조합식품등의 표시기준, 식품의약품안전청 고시 제2001-43호).

또한, LM-벼와 낙동벼의 총 25 ng의 gDNA에 낙동벼 50000 copies와 LM-벼 500 copies 상당의 DNA를 섞은 5개의 1% 시료를 만들어 상기 조건으로 PCR을 수행하여 정량한 결과 하기 표 9과 같은 결과를 얻었다. 각 시료는 세번씩 정량하였다.

미지시료(1%)로부터 얻은 정량 데이터

Standard Copy 수	TPSP Mean starting quantity	Mean Ct	SD of Ct	SPS Mean starting quantity	Mean Ct	SD of Ct	% of LM-Rice
125	1.25E+02	37.28	0.16	1.25E+02	34.89	0.12
500	5.00E+02	35.76	0.35	5.00E+02	32.44	0.07
2000	2.00E+03	33.55	0.06	2.00E+03	30.12	0.18
8000	8.00E+03	31.44	0.14	8.00E+03	27.77	0.03
32000	3.20E+04	29.09	0.20	3.20E+04	25.81	0.04
128000	1.28E+05	26.90	0.12	1.28E+05	23.33	0.13
Unknown sample 1 (3%)	4.86E+02	35.57	0.27	5.10E+04	24.86	0.12	0.95
Unknown sample 2 (3%)	5.42E+02	35.40	0.26	4.80E+04	24.97	0.26	1.13
Unknown sample 3 (3%)	5.64E+02	35.36	0.42	5.04E+04	24.88	0.08	1.12
Unknown sample 4 (3%)	5.30E+02	35.42	0.04	5.46E+04	24.75	0.12	0.97
Unknown sample 5 (3%)	4.66E+02	35.65	0.40	5.40E+04	24.77	0.09	0.86

그 결과 상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 각각 0.95, 1.13, 1.12, 0.97, 0.86%의 값을 얻었고, 평균값이 1.01% 이었다. 1% 오차범위는 혼입률 측정시 허용오차범위인 25% 보다 상당히 낮은 수치이다(식품의약품안전청 고시 제2001-43호).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 정성 및 정량분석 방법은 TPSP가 도입된 LM-벼를 종특이적으로 검출하거나 LM-벼의 혼입률을 정량하는데 유용하게 이용될 수 있으며, 본 발명에 따른 프라이머/프루브를 이용하여 LM-벼의 검출용 키트 또는 LM-벼의 혼입률 분석용 키트를 제공할 수 있다. 또한 SPS 유전자는 LM-벼의 유전자분석에서 내재유전자로 유용하게 이용될 수 있다.

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서열목록 8과 9, 서열목록 10과 11 및 서열목록 12와 13의 핵산서열로 구성된 트레할로스-6-포스페이트 신테아제와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 융합 유전자(TPSP 유전자) 특이 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머쌍을 포함하는 유전자변형 벼의 검출용 조성물.
서열목록 8과 9, 서열목록 10과 11 및 서열목록 12와 13의 핵산서열로 구성된 트레할로스-6-포스페이트 신테아제와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제의 융합 유전자(TPSP 유전자) 특이 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 유전자변형 벼의 검출용 조성물.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기에 더하여 서열목록 4와 5 또는 서열목록 6와 7의 핵산서열로 구성된 수크로스 포스페이트 합성효소(SPS) 유전자 특이 프라이머 쌍을 포함하는 유전자변형 벼의 검출용 조성물.
(1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;

(2) 서열목록 8과 9, 서열목록 10과 11 및 서열목록 12와 13의 핵산서열로 구성된 TPSP 유전자 특이 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머쌍을 포함하고, 서열목록 4와 5 또는 서열목록 6과 7의 핵산서열로 구성된 포스페이트 합성효소(SPS) 유전자 특이 프라이머쌍을 포함하는 유전자변형 벼의 검출용 조성물을 이용하여 상기 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

(3) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 이미 크기(bp)를 알고 있는 마커와 PCR산물의 크기를 비교함으로써 SPS 유전자와 TPSP 유전자를 모두 함유하는 시료를 검출하여 유전자변형 벼를 확인하는 단계를 포함하는 유전자변형 벼의 정성분석 방법.
(1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;

(2) 서열목록 8과 9, 서열목록 10과 11 및 서열목록 12와 13의 핵산서열로 구성된 TPSP 유전자 특이 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머쌍을 포함하고, 서열목록 4와 5 또는 서열목록 6과 7의 핵산서열로 구성된 포스페이트 합성효소(SPS) 유전자 특이 프라이머쌍을 포함하는 유전자변형 벼의 검출용 조성물을 이용하여 상기 DNA로부터 Multiplex PCR을 수행하는 단계; 및

(3) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 이미 크기(bp)를 알고 있는 마커와 PCR산물의 크기를 비교함으로써 SPS 유전자와 TPSP 유전자를 모두 함유하는 시료를 검출하여 유전자변형 벼를 확인하는 단계를 포함하는 유전자변형 벼의 정성분석 방법.
서열번호 17과 18의 핵산 서열로 구성된 TPSP 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 19의 핵산 서열로 구성된 TPSP 유전자 특이 TaqMan 프루브를 포함하고, 서열번호 14와 15의 핵산 서열로 구성된 SPS 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 16의 핵산 서열로 구성된 SPS 유전자 특이 TaqMan 프루브를 포함하는 유전자변형 벼의 혼입률 정량분석용 실시간 PCR 조성물.
(1) 서열번호 17과 18의 핵산 서열로 구성된 TPSP 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 19의 핵산 서열로 구성된 TPSP 유전자 특이 TaqMan 프루브와 서열번호 14와 15의 핵산 서열로 구성된 SPS 유전자 특이적 프라이머 쌍과 서열번호 16의 핵산 서열로 구성된 SPS 유전자 특이 TaqMan 프루브를 준비하고 프루브를 라벨링하는 단계;

(2) 분석시료 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 수행하는 단계;

(3) 각 사이클의 연장반응 시기에 분석시료의 형광값을 판독하고 도입유전자 역치싸이클 값(Ct 값)/SPS Ct 값을 측정하는 단계;

(4) 표준시료의 TPSP 유전자 Ct/SPS Ct 값을 이용하여 얻은 정량곡선에 분석 시료의 TPSP 유전자 Ct/SPS Ct 값을 대입하여 유전자 변형 함량을 계산하는 단계를 포함하는 TPSP 도입 유전자변형 벼의 혼입률 정량분석 방법.
제7 항에 있어서, 표준시료는 유전자변형 벼의 혼입률을 알고 있거나 도입유전자 카피수를 미리 알고 있는 시료인 유전자변형 벼의 혼입률 정량분석 방법.
서열목록 20의 핵산서열로 구성된 TPSP 도입 유전자변형 벼의 DNA.
서열목록 21의 핵산서열로 구성된 TPSP 도입 유전자변형 벼의 DNA.
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