BRPI0407397B1 - métodos de produção de planta de algodão tolerante ao glifosato compreendendo evento mon 88913, de detecção de dna, de determinação de zigosidade de planta de algodão e de controle de ervas daninhas - Google Patents

Abstract

"evento de algodão mon 88913 e composições e métodos para sua detecção". a presente invenção refere-se a composições e semente do evento de planta de algodão mon 88913. são fornecidos também ensaios para detectar a presença do evento de planta de algodão mon 88913, baseados em uma seqüência de dna, e o uso desta seqüência de dna como um marcador molecular em um método de detecção de dna.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PLANTA DE ALGODÃO TOLERANTE AO GLIFOSATO COMPREENDENDO EVENTO MON 88913, DE DETECÇÃO DE DNA, DE DETERMINAÇÃO DE ZIGOSIDADE DE PLANTA DE ALGODÃO E DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS.

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente provisória n^o US 60/447.184, depositado em 12 de fevereiro de 2003, cujo teor é aqui inteiramente incorporado como referência. Campo Técnico da Invenção [002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a um evento de algodão tolerante a glifosato, MON 88913, e ensaios e métodos para detectar a presença do DNA do evento de algodão MON 88913 em uma amostra de planta, e suas composições.

Antecedentes da Invenção [003] O algodão é uma cultura de fibra importante em muitas áreas do mundo. Os métodos de biotecnologia foram aplicados ao algodão para melhorar os traços agronômicos e a qualidade do produto. O método para introduzir transgenes em plantas de algodão foi demonstrado na patente n^o US 5.004.863. Um desses traços agronômicos importantes na produção de algodão é a tolerância a herbicidas, particularmente a tolerância ao herbicida glifosato. Este traço foi introduzido em plantas de algodão e é um produto bemsucedido usado agora na produção de algodão. O atual evento (1445) de algodão Roundup Ready® comercial proporciona excelente tolerância a glifosato, o ingrediente ativo em Roundup®, até o estágio quadrifoliado (Nida et al., J. Agric. Food Chem. 44:1960-1966 (1996); Nida et al., J. Agric. Food Chem. 44:1967-1974 (1996)). Entretanto, a aplicação foliar depois do estágio quadrifoliado deve ser limitada devido

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2/42 à tolerância insuficiente em tecidos reprodutores masculinos em certas condições ambientais. Esta falta de tolerância de reprodutores masculinos parece ser resultado da expressão insuficiente de CP4 EPSPS em tecidos críticos, sensibilidade mais alta desses tecidos ao glifosato, e acúmulo de altas quantidades de glifosato nesses tecidos escoadores resistentes (Pline et al., Weed Sci. 50:438-447 (2002)). Há uma necessidade de se obter uma planta de algodão mais altamente tolerante a glifosato do que o algodão Roundup Ready ® 1445.

[004] Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de um evento específico, para determinar se a progênie de um cruzamento sexuado contém um transgene de interesse. Além disso, seria útil obter um método para detectar um evento específico para atender aos regulamentos que requerem aprovação antes da comercialização ou rotulação de alimentos derivados de plantas culturas recombinantes, por exemplo. É possível detectar a presença de um transgene por qualquer método bem conhecido de detecção de ácidos nucléicos, tal como a reação de polimerase em cadeia (PCR) ou hibridização de DNA, usando sondas de ácidos nucléicos. Estes métodos de detecção concentram-se genericamente em elementos genéticos usados frequentemente, tais como promotores, terminadores de transcrição 3', genes marcadores, etc. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA, a menos que a sequência do DNA genômico cromossômico adjacente ao DNA inserido (DNA genômico flanqueador) seja conhecida. Os métodos de detecção de DNA específico de evento para um evento de algodão tolerante a glifosato, 1445, foram descritos (documento n^o US 20020120964, aqui incorporado como referência em sua totalidade).

[005] A presente invenção refere-se a um evento de algodão tolerante a glifosato, MON 88913, composições contidas nele, e o

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3/42 método para a detecção da região de inserção genômica/transgene no evento de algodão MON 88913 e sua progênie.

Sumário da Invenção [006] A presente invenção refere-se ao evento de algodão transgênico designado MON 88913, que foi depositado junto American Type Culture Collection (ATCC) sob o N^o de Acesso PTA-4854. Outro aspecto da invenção compreende as plantas de progênie, ou sementes, ou partes regeneráveis das plantas e sementes do evento de algodão MON 88913. A invenção inclui também partes de plantas do evento de algodão MON 88913, que incluem, porém sem limitações, o pólen, óvulo, flores, casulos, lanugem, brotos, raízes, e folhas. A invenção refere-se a uma planta de algodão que tem um fenótipo tolerante a glifosato e as inusitadas composições genéticas de MON 88913.

[007] Um aspecto da invenção fornece composições de DNA e métodos para detectar a presença de uma região de junção genômica/transgene do evento de planta de algodão MON 88913. São fornecidas moléculas de DNA isoladas que compreendem pelo menos uma molécula de DNA de junção genômica/transgene, selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e seus complementos, onde a molécula de junção abrange o sítio de inserção que compreende uma DNA heterólogo inserido dentro do genoma do algodão e o DNA genômico da célula de algodão que flanqueia o sítio de inserção no evento de algodão MON 88913. Uma semente de algodão e seu material vegetal, que compreende essas moléculas, é um aspecto desta invenção.

[008] Fornece-se uma molécula de DNA inusitada, isolada, que é uma região genômica/transgene 5', SEQ ID NO: 3, ou o complemento dela, onde esta molécula de DNA é inusitada no evento de algodão MON 88913. Uma planta de algodão e a semente que compreende SEQ ID NO: 3 em seu genoma é um aspecto desta invenção. De acordo com

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4/42 outro aspecto da invenção, fornece-se uma molécula de DNA isolada que é uma região genômica/transgene 3', SEQ ID NO: 4, ou o complemento dela, onde esta molécula de DNA é inusitada no evento de algodão MON 88913. Uma planta de algodão e a semente que compreende SEQ ID NO: 4 em seu genoma é um aspecto desta invenção.

[009] De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidas duas moléculas de DNA para uso em um método de amplificação de DNA, onde a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer parte da região do transgene da molécula de DNA de SEQ ID NO: 3, e uma molécula de DNA com comprimento similar de qualquer parte de uma região de SEQ ID NO: 3, flanqueadora 5' do DNA genômico do algodão, onde estas moléculas de DNA, quando usadas em conjunto, são úteis como um conjunto de iniciadores em um método de amplificação de DNA, que produz um amplicon. O amplicon produzido usando o conjunto de iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para o evento de algodão MON 88913. Qualquer amplicon produzido a partir do DNA de MON 88913 por iniciadores de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer parte de SEQ ID NO: 3 é um aspecto da invenção.

[0010] De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidas duas moléculas de DNA para uso em um método de amplificação de DNA, onde a primeira molécula de DNA compreende pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos contíguos de qualquer parte da região do transgene da molécula de DNA de SEQ ID NO: 4, e uma molécula de DNA com comprimento similar de qualquer parte de uma região de SEQ ID NO: 4, flanqueadora 3' do DNA genômico do algodão, onde estas moléculas de DNA, quando usadas em conjunto, são úteis como um conjunto de iniciadores em um método de amplificação de DNA, que

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5/42 produz um amplicon. O amplicon produzido usando o conjunto de iniciadores de DNA no método de amplificação de DNA é diagnóstico para o evento de algodão MON 88913. Qualquer amplicon produzido a partir do DNA de MON 88913 por iniciadores de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer parte de SEQ ID NO: 4 é um aspecto da invenção.

[0011] De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos para detectar a presença de DNA que corresponde especificamente ao DNA do evento de DNA 88913, em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com um conjunto de iniciadores de DNA que, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácidos nucléicos com o DNA genômico do evento de algodão MON 88913, produz um amplicon que é diagnóstico para o evento de algodão MON 88913; (b) realizar uma reação de amplificação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o amplicon; e (c) detectar o amplicon.

[0012] De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos para detectar a presença de DNA que corresponde especificamente ao DNA do evento de DNA 88913, em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com uma sonda de DNA que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, que hibridizam sob condições de hibridização rigorosas com o DNA genômico do evento de algodão MON 88913 e não hibridizam sob as condições de hibridização rigorosas com um DNA de planta de algodão que serve de controle; submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas; e (c) detectar a hibridização da sonda para o DNA do evento de algodão 88913.

[0013] De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos para produzir uma planta de algodão que tolera a aplicação de glifosato, os quais compreendem as etapas de: (a) cruzar sexualmente

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6/42 um primeiro evento de algodão MON 88913 parental, que compreende as fitas de expressão da presente invenção, o qual confere tolerância à aplicação de glifosato, e uma segunda planta de algodão parental que carece de tolerância ao glifosato, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas progênitas; e (b) selecionar a planta progênita que tolera a aplicação de glifosato. Tais métodos podem compreender opcionalmente a etapa adicional de retrocruzar a planta progênita para a segunda planta de algodão parental e selecionar quanto à progênie tolerante ao glifosato, para produzir uma variedade de algodão de geração verdadeira que tolera a aplicação de glifosato.

[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, fornece-se um método para determinar a zigosidade da progênie do evento de algodão MON 88913, compreendendo: (a) colocar a amostra que compreende o DNA de algodão em contato com um conjunto de iniciadores, que compreende SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25, o qual, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácidos nucléicos com o DNA genômico do evento de algodão MON 88913, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para o evento de algodão MON 88913; e (b) realizar uma reação de amplificação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o amplicon; e (c) detectar primeiro o amplicon; e (d) colocar a amostra que compreende o DNA de algodão em contato com o dito conjunto de iniciadores, o qual, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácidos nucléicos com o DNA genômico de plantas de algodão, produz um segundo amplicon que compreende o DNA genômico nativo do algodão, homólogo à região genômica do algodão de uma inserção de transgene identificada como o evento de algodão MON 88913; e (e) realizar uma reação de amplificação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o segundo amplicon; e (f) detectar o segundo amplicon; e (g) comparar o primeiro e o segundo amplicons em uma amostra, onde

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7/42 a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica quanto à inserção do transgene.

[0015] Um método para determinar a zigosidade compreende colocar uma amostra de DNA de algodão em contato com iniciadores e sondas que compreendem SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25; usar uma condição de PCR terminal Taqman®; e detectar os produtos dos amplicons.

[0016] Um método para controlar ervas daninhas em uma cultura ou campo do evento de algodão MON 88913 compreende a etapa de aplicar uma quantidade herbicida eficaz de glifosato contendo herbicida ao algodoal de MON 88913.

[0017] Os aspectos precedentes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada que se segue e dos desenhos que a acompanham.

Breve Descrição dos Desenhos [0018] A Figura 1 é o mapa plasmídeo de pMON51915.

[0019] A Figura 2 é a organização genômica de inserção no evento de algodão MON 88913.

[0020] A Figura 3 é a sequência de junção 5' do DNA de MON 88913 (SEQ ID NO: 1) e a sequência de junção 3' do DNA de MON 88913 (SEQ ID NO: 2).

[0021] A Figura 4 é a região do DNA genômico/transgene 5' de

MON 88913 (SEQ ID NO: 3).

[0022] A Figura 5 é a região do DNA genômico/transgene 3' de

MON 88913 (SEQ ID NO: 4).

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas [0023] A presente invenção refere-se a um evento de algodão tolerante a glifosato, MON 88913, composições nele contidas, e o método para a detecção da região de inserção genômica/transgene no evento de algodão MON 88913 e na sua progênie. As definições e os

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8/42 métodos que se seguem são fornecidos para definir melhor a presente invenção e orientar os versados na técnica quanto à prática da presente invenção. A menos que diferentemente assinalado, os termos e abreviaturas devem ser entendidos de acordo com a utilização convencional pelos versados nas técnicas relevantes. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas também em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5^a edição, Springer-Verlag; New York, 1991; e em Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Utiliza-se a nomenclatura para as bases de DNA enunciadas em 37 CFR § 1.822.

[0024] Como aqui utilizado, o termo algodão significa Gossypium hirsutum e inclui todas variedades de plantas que podem ser criadas com o evento de algodão MON 88913. A planta da presente invenção é uma planta de algodão, mais especificamente a planta de algodão MON 88913.

[0025] Como aqui utilizado, o termo compreende significa inclui, porém sem limitações.

[0026] Como aqui utilizado, o termo cultura refere-se a plantas ou partes de plantas cultivadas, tais como são desenvolvidas em um campo, lote de terra, carreira, estufa, terreno ou recipiente.

[0027] Glifosato refere-se a N-fosfonometilglicina e seus sais. A Nfosfonometilglicina é um herbicida bem conhecido que tem atividade sobre um amplo espectro de espécies vegetais. O glifosato é o ingrediente ativo de Roundup® (Monsanto Co.), um herbicida seguro que tem uma meia-vida desejavelmente curta no meio ambiente. O glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Os tratamentos com o herbicida glifosato referem-se a tratamentos com o herbicida Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup Pro®, ou qualquer outra formulação herbicida que contém glifosato. Os exemplos de formulações de glifosato existentes no mercado incluem, sem restrição,

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9/42 aquelas comercializadas por Monsanto Company como os herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAX, ROUNDUP® WEATHERMAX, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP^® BIOACTIVE, ROUNDUP^® BIOFORCE, RODEO^®, POLARIS^®, SPARK^®, e ACCORD^®, todos os quais contêm glifosato como seu sal de isopropil-amônio; aqueles comercializados por Monsanto Company como os herbicidas ROUNDUP ® DRY e RIVAL®, que contêm glifosato como seu sal de amônio; aquele comercializado por Monsanto Company como ROUNDUP ® GEOFORCE, que contém glifosato como seu sal de sódio; e aquele comercializado por Syngenta Crop Protection como herbicida TOUCHDOWN®, que contém glifosato como seu sal de trimetil-sulfônio. Quando aplicado a uma superfície vegetal, o glifosato se move de maneira sistêmica através da planta. O glifosato é fitotóxico devido à sua inibição da via do ácido chiquímico, que fornece um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. O glifosato inibe a enzima 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintase (EPSPS), encontrada em plantas. A tolerância ao glifosato pode ser conseguida pela expressão de variantes bacterianas de EPSPS e variantes vegetais de EPSPS que têm afinidade mais baixa por glifosato, e portanto, retêm sua atividade catalítica na presença de glifosato (patentes US 5.633.435, 5.094.945, 4.535.060 e

6.040.497).

[0028] Um evento transgênico é produzido por transformação de uma célula vegetal com DNA heterólogo, como por exemplo, uma construção de ácido nucléico (pMON51915, Figura 1) que inclui um transgene de interesse; regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da célula vegetal, e seleção de uma planta específica caracterizada pela inserção em um local específico do genoma. O termo evento refere-se à planta transformante original e à progênie do transformante. que incluem o

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DNA heterólogo. O termo evento inclui também a progênie produzida por um heterocruzamento sexuado entre o evento e outra planta que na qual a progênie inclui o DNA heterólogo. Mesmo após retrocruzamentos repetidos para um genitor recorrente, o DNA inserido e o DNA genômico flanqueador do evento do genitor transformado estão presentes na progênie do cruzamento no mesmo local cromossômico. O termo evento refere-se também ao DNA do transformante original que compreende o DNA inserido, e a sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido, que se esperaria ser transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido que inclui o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexuado de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (como por exemplo, o transformante original e a progênie resultante de autopolinização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.

[0029] A expressão de genes estranhos em plantas é reconhecidamente influenciada por sua posição cromossômica, talvez devido à estrutura da cromatina (como por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade de elementos de regulação transcricional (como por exemplo, intensificadores) perto do sítio de integração (Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Por esta razão, frequentemente é necessário triar um grande número de eventos para identificar um evento caracterizado por ótima expressão de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, observou-se em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação nos níveis de expressão de um transgene introduzido entre eventos. Podem existir também diferenças nos padrões espaciais ou temporais de expressão, como por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que podem não corresponder aos padrões esperados dos elementos reguladores transcricionais presentes na construção do gene introduzido. Por esta razão, é comum produzir

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11/42 centenas de milhares de eventos diferentes e triar os eventos quanto a um único evento que tem os níveis e padrões desejados da expressão do transgene para propósitos comerciais. Um evento que tem os níveis ou padrões desejados da expressão do transgene é útil para a introgressão do transgene em outros antecedentes genéticos por cruzamento sexuado, usando métodos de criação convencionais. A progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar a expressão gênica confiável em inúmeras variedades que são bem adaptadas para condições de crescimento e demandas mercadológicas locais.

[0030] Uma planta de algodão tolerante a glifosato pode ser criada em primeiro lugar cruzando sexualmente uma primeira planta de algodão parental, consistindo em uma planta de algodão desenvolvida a partir da célula da planta de algodão transgênica derivada da transformação com as fitas de expressão vegetal contidas em pMON51915 e que tolera a aplicação do herbicida glifosato, com uma segunda planta de algodão parental que carece da tolerância ao herbicida glifosato, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de primeira progênie; e depois selecionando uma planta de primeira progênie que é tolerante ao herbicida glifosato; e efetuar a autopolinização da planta de primeira progênie, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e depois selecionar a partir das plantas de segunda progênie uma planta tolerante ao herbicida glifosato. Estas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da planta de primeira progênie tolerante a glifosato ou da planta de segunda progênie tolerante a glifosato para a segunda planta de algodão parental ou para uma terceira planta de algodão parental, produzindo desta forma uma planta de algodão que tolera a aplicação do herbicida glifosato. Na presente invenção, a planta de algodão

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12/42 transgênica é definida também como evento de algodão MON88913 e pode ser aqui referida como MON 88913.

[0031] Deve-se entender também que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser acasaladas para produzir descendentes que contêm dois genes exógenos adicionados independentemente segregantes. A autopolinização da progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigóticas quanto a ambos genes exógenos adicionados. O retrocruzamento para uma planta parental e o heterocruzamento com uma planta não-transgênica também são contemplados, como é a propagação vegetativa. As descrições de outros métodos de criação, que são usados comumente para diferentes traços e culturas, podem ser encontradas em uma entre várias referências, como por exemplo, em Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, editor Wicox, J., American Society of Agronomy, Madison, WI (1987).

[0032] Uma sonda é um ácido nucléico isolado ao qual se fixa um marcador detectável ou molécula-repórter convencional, como por exemplo, um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimioluminescente, ou uma enzima. Tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico-alvo, no caso da presente invenção, a um filamento do DNA genômico de MON 88913, seja de uma planta MON 88913 ou de uma planta que inclui o DNA de MON 88913. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente os ácidos desoxirribonucléico ou ribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais de sondas que se ligam especificamente a uma sequência de DNA-alvo e podem ser usados para detectar a presença dessa sequência de DNA-alvo.

[0033] Os iniciadores de DNA são ácidos poliácidos nucléicos que são anelados a um filamento de DNA-alvo complementar por hibridização de ácido nucléico, para formar um híbrido entre o iniciador

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13/42 e o filamento de DNA-alvo. depois estendido ao longo do filamento de DNA-alvo por uma polimerase, como por exemplo, uma DNA polimerase. Um par de iniciadores de DNA ou um conjunto de iniciadores de DNA da presente invenção referem-se a pelo menos duas moléculas de iniciadores de DNA úteis para amplificação de uma sequência de DNA-alvo, como por exemplo, pela reação de polimerase em cadeia (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácidos nucléicos.

[0034] As sondas e iniciadores têm genericamente um comprimento de 11 ou mais polinucleotídeos, frequentemente 18 polinucleotídeos ou mais, 24 polinucleotídeos ou mais, ou 30 polinucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores são selecionados para terem um comprimento suficiente para hibridizar especificamente para uma sequência-alvo sob condições de hibridização de alta severidade. De preferência, as sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm completa similaridade de sequências com a sequência-alvo, embora as sondas que difiram da sequência-alvo e que retenham a capacidade de hibridizar para as sequências-alvo possam ser desenhadas por métodos convencionais.

[0035] Os métodos para preparar e usar sondas e iniciadores estão descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a edição, volumes 1-3, editores Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (aqui doravante, Sambrook et al., 1989); Current Protocols in Molecular Biology, editores Ausubel et al., Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (aqui doravante, Ausubel et al., 1992); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990. Os pares de iniciadores de DNA para PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, como por exemplo, usando programas de computador

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14/42 intencionados para este propósito, tal como o Primer (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

[0036] Os iniciadores e sondas baseadas em DNA genômico flanqueador e sequências de inserção de transgenes descritos neste caso para confirmar (e, caso necessário, corrigir) as sequências de DNA descritas por métodos convencionais, como por exemplo, por isolamento do DNA genômico de MON 88913, clonando mais uma vez as regiões genômicas/transgene e sequenciando tais moléculas de DNA.

[0037] As sondas e iniciadores de ácidos nucléicos da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas para uma molécula de DNA-alvo. Qualquer método convencional de hibridização ou amplificação de ácidos nucléicos pode ser usado para identificar a presença de DNA a partir de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de poliácidos nucléicos e seus fragmentos são capazes de hibridizar especificamente para outras moléculas de ácidos nucléicos sob certas circunstâncias. Como aqui utilizado, duas moléculas de poliácidos nucléicos são ditas como sendo capazes de hibridizar especificamente para uma outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico antiparalela de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucléico é dita como sendo o complemento de outra molécula de ácido nucléico se elas apresentam complementaridade completa. Como aqui utilizado, as moléculas são ditas como apresentando complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas como sendo minimamente complementares se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si sob condições convencionais de pelo menos baixa severidade. Similarmente, as moléculas são ditas como sendo complementares se

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15/42 elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si sob condições convencionais de alta severidade. As condições convencio nais de severidade estão descritas por Sambrook et al., 1989, e Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Distanciamentos da complementaridade completa são portanto permissíveis, desde que tais distanciamentos não obstem completamente a capacidade de as moléculas formarem uma estrutura de filamento duplo. Para que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda ela precisa ser apenas suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura estável de filamento duplo sob as concentrações de solventes e sais específicas empregadas.

[0038] Como aqui utilizado, uma sequência de DNA substancialmente homóloga é a sequência de uma molécula de DNA que hibridiza específica para o complemento de uma molécula de DNAalvo com a qual ela está sendo comparada sob condições de alta severidade. As condições apropriadas de severidade que promovem a hibridização de DNA, como por exemplo, 6,0 cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ^oC, e em seguida, uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 ^oC, são conhecidas pelos versados na técnica, ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada entre uma baixa severidade de cerca de 2,0 x SSC a 50 ^oC até uma alta severidade de cerca de 0,2 x SSC a 50 ^oC. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa severidade à temperatura ambiente, cerca de 22 ^oC, até condições de alta severidade a cerca de 65 ^oC. A temperatura e também o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração do sal pode ser mantida constante,

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16/42 enquanto que a outra variável é alterada. Em uma modalidade preferida, um poliácido nucléico da presente invenção deve hibridizar especificamente para uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos enunciadas em SEQ ID NO: 3 ou 4, ou seus complementos ou fragmentos de qualquer uma das duas sob condições moderadamente severas, como por exemplo, a 2,0 x SSC e cerca de 65 ^oC. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção deve hibridizar especificamente para uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos enunciadas em SEQ ID NO: 3 ou 4 ou complementos ou fragmentos de qualquer uma delas sob condições de alta severidade. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção tem a sequência de ácidos nucléicos enunciada em SEQ ID NO: 1 ou 2 ou seus complementos ou fragmentos de qualquer uma delas. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha uma parte substancial de sua identidade de sequência com a sequência de ácidos nucléicos enunciada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou seu complemento ou fragmentos de qualquer uma delas, onde a identidade de sequência é entre 80% e 100% ou 90% e 100%. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência enunciada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou seu complemento ou fragmentos de qualquer uma delas. SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 podem ser usadas como marcadores em métodos de criação de plantas para identificar a progênie de cruzamentos similares aos métodos descritos para a análise de marcadores de DNA com repetição de sequências simples, em DNA markers: Protocols, applications, and overviews, 1997, 173-185, editores Cregan etal., Wiley-Liss, NY, aqui incorporado como referência

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17/42 em sua totalidade. A hibridização da sonda para a molécula de DNAalvo pode ser detectada por qualquer um dos métodos conhecidos pelos versados na técnica, e eles podem incluir, porém sem limitações, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, marcadores baseados em anticorpos, e marcadores quimioluminescentes.

[0039] Quanto à amplificação de uma sequência-alvo de ácidos nucléicos (como por exemplo, por PCR), usando um par de iniciadores de amplificação específicos, as condições severas são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize apenas para a sequênciaalvo de ácidos nucléicos à qual um iniciador que tem a sequência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria, e de preferência, para produzir um produto de amplificação singular, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.

[0040] O termo específico para (uma sequência-alvo) indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização severas apenas para a sequência-alvo em uma amostra que compreende a sequência-alvo.

[0041] Como aqui utilizado, o termo DNA amplificado ou amplicon refere-se ao produto do método de amplificação de ácidos nucléicos direcionado para uma molécula-alvo de poliácido nucléico que é parte de um modelo de poliácido nucléico. Por exemplo, para determinar se uma planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém o DNA genômico do evento transgênico da planta do evento de algodão MON 88913 da presente invenção, o DNA que é extraído de uma amostra de tecido da planta de algodão pode ser submetido a um método de amplificação de poliácidos nucléicos, usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da sequência de DNA no genoma da planta MON 88913, adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido (DNA transgênico) e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido, para produzir

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18/42 um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA do evento MON 88913. O amplicon diagnóstico tem um comprimento e uma sequência de DNA que também são diagnósticos para o evento. O amplicon pode ter um comprimento na faixa entre o comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeos, de preferência mais cerca de cinquenta pares de bases de nucleotídeos (pbs), mais preferivelmente, mais cerca de duzentos e cinquenta pares de bases de nucleotídeos, e ainda mais preferivelmente, mais cerca de quatrocentos e cinquenta pares de bases de nucleotídeos ou mais. Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência genômica em ambos lados do DNA heterólogo inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui a sequência de polinucleotídeos inteira da inserção (como por exemplo, um iniciador de avanço isolado a partir da parte genômica de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso isolado a partir da parte genômica de SEQ ID NO: 4, que amplifica uma molécula de DNA que compreende as duas fitas de expressão do fragmento de DNA pMON51915 que foi inserido no genoma de MON 88913, sendo que a inserção compreende cerca de 8.512 pbs da inserção, Figura 2). Um membro de um par de iniciadores derivados da sequência genômica da planta pode ficar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida, e esta distância pode ficar na faixa entre um par de bases de nucleotídeos e cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo amplicon exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA.

[0042] A amplificação de poliácidos nucléicos pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de poliácidos nucléicos conhecidos nessas técnicas, incluindo a reação de polimerase em cadeia (PCR). Os métodos de amplificação são conhecidos nessas técnicas e estão descritos, entre outros, nas patentes n— US 4.683.195 e 4.683.202, e em PCR Protocols: A Guide to Methods and

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Applications, editores Inis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Foram desenvolvidos métodos de amplificação por PCR para amplificar até 22 kb (quilobase) de DNA genômico e até 42 kb de DNA bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos nessas técnicas de amplificação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência da inserção do DNA heterólogo ou a sequência de DNA genômico flanqueadora de MON 88913 pode ser verificada (e corrigida, caso necessário) amplificando tais moléculas de DNA a partir de sementes ou plantas de MON 88913 desenvolvidas a partir da semente depositada junto à ATCC com n^o de acesso PTA-4854, usando iniciadores derivados das sequências aqui fornecidas, e em seguida, pelo sequenciamento-padrão do DNA do amplicon da PCR ou dos seus fragmentos de DNA clonados. Os kits de detecção de DNA, que se baseiam em métodos de amplificação de DNA, contêm iniciadores de DNA que amplificam especificamente um amplicon diagnóstico. O kit pode fornecer um método de detecção baseado em gel de agarose, Taqman® terminal, ou qualquer um entre inúmeros métodos para detectar o amplicon diagnóstico conhecidos nessas técnicas. Um kit que contém iniciadores de DNA homólogos ou complementares a qualquer parte de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 é um objeto da invenção. [0043] O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Um desses métodos é a Análise de Bits Genéticos (Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22:4167-4175, 1994), onde é desenhado um oligonucleotídeo de DNA que se sobrepõe à sequência do DNA genômico flanqueadora adjacente e também à sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microtitulação. Após a PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto da PCR com

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20/42 um único filamento pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e serve como um modelo para uma reação de extensão de uma única base, usando DNA polimerase e trifosfatos de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados específicos para próxima base esperada. A leitura pode ser fluorescente ou baseada em ELISA. Um sinal indica a presença da sequência genômica/transgênica devido à amplificação, hibridização e extensão de uma única base, bem-sucedida.

[0044] Outro método é a técnica de Pirossequenciamento descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, desenha-se um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao DNA genômico e à junção do DNA de inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto da PCR de filamento único a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, 5'-fosfossulfato de adenosina e luciferina. Os trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs) são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência genômica/transgênica devido à amplificação, hibridização ou extensão de uma única base, bem-sucedida.

[0045] A Polarização sob Fluorescência, descrita por Chen et al.

(Genome Res. 9:492-498, 1999), é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando este método, desenha-se um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao flanqueamento genômico e à junção do DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto da PCR de filamento único a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência do DNA genômico flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de uma única base resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida

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21/42 como uma mudança na polarização usando um fluorímetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência genômica/transgênica devido à amplificação, hibridização ou extensão de uma única base, bem-sucedida.

[0046] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA e é completamente entendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, desenha-se a sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe ao flanqueamento genômico e à junção do DNA inserido. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador no DNA inserido e um na sequência do DNA genômico flanqueadora) são submetidos a um ciclo na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem de liberação do grupamento fluorescente para fora da porção interruptora na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica/transgênica devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.

[0047] Foram descritas molecular beacons (moléculas que emitem luz quando determinadas reações químicas ocorrem) Balizas (beacons) Moleculares para uso na detecção de sequências, como descrito por Tyangi et al. (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Resumidamente, desenha-se uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe ao flanqueamento genômico e à junção do DNA inserido. A estrutura singular da sonda FRET resulta na inclusão de uma estrutura secundária que mantém os grupamentos fluorescente e interruptor em íntima proximidade. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador no DNA inserido e um na sequência do DNA genômico flanqueadora) são submetidos a um ciclo na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação exitosa por PCR, a hibridização da sonda FRET para a sequência-alvo resulta na

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22/42 remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial dos grupamentos fluorescente e interruptor. Resulta um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência da sequência da inserção flanqueadora/transgênica devido à amplificação e hibridização exitosas.

[0048] Os kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições aqui descritas e os métodos bem conhecidos nas técnicas de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do DNA do evento de algodão MON 88913 em uma amostra, e podem ser aplicados a métodos para cultivar plantas de algodão que contêm o DNA de MON 88913. Os kits contêm sequências de DNA que são úteis como iniciadores ou sondas e que são homólogas ou complementares a qualquer parte de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou às sequências de DNA homólogas ou complementares ao DNA contido em qualquer um dos elementos genéticos transgênicos de pMON51915 que foram inseridos no DNA de MON 88913 (Figura 2). Estas sequências de DNA podem ser usadas em métodos de amplificação de DNA (PCR) ou como sondas em métodos de hibridização de poliácidos nucléicos, isto é, análise de Southern, análise Northern. Os elementos genéticos transgênicos contidos no DNA de MON 88913 (Figura 2) incluem um primeiro cassete de expressão que compreende o promotor do mosaico de escrofulária, construído como um elemento promotor quimérico com o promotor do fator alfa-1 de alongamento de Arabidopsis (At.Ef1a) (FMV35S/Ef1a, patente n° US 6.462.258, SEQ ID NO: 28, aqui incorporada como referência em sua totalidade), ligado operacionalmente ao líder e íntron translacional do fator alfa 1 de alongamento de Arabidopsis (número de acesso do Genebank X16430, como descrito em Axelos et al., Mol. Gen. Genet. 219:106-112, 1989), ligado operacionalmente ao peptídeo de trânsito de cloroplastos EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee et al., Mol. Gen. Genet.

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210:47-442, 1987), ligado operacionalmente à 5-enol-piruvilchiquimato3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium sp. tolerante ao glifosato (aroA:CP4, patente n^o 5.633.435), ligado operacionalmente à região de terminação 3' da ribulose de ervilha 1,5-bifosfato carboxilase E9 (T-Ps.RbcS2:E29, Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1679, 1984), e um segundo cassete de expressão que compreende o promotor CaMV35SAct8, incluindo o primeiro íntron do gene Act8 (SEQ ID NO: 29, patente n° US 6.462.258) conectado operacionalmente a um peptídeo de trânsito de cloroplastos EPSPS de Arabidopsis (TS.At.EPSPS:CTP2), conectado operacionalmente a uma 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium sp. tolerante ao glifosato (aroA:CP4, patente n^o 5.633.435, aqui incorporada como referência em sua totalidade), ligado operacionalmente à região de terminação 3' da ribulose de ervilha 1,5-bifosfato carboxilase E9.

[0049] Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar exemplos de certas modalidades preferidas da invenção. Os versados na técnica devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores descobriram funcionarem bem na prática da invenção, e assim sendo, podem ser considerados como constituindo exemplos de modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados na técnica devem avaliar que, à luz do presente relatório descritivo, muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e do âmbito da invenção. Exemplos

Exemplo 1 [0050] O evento de algodão transgênico MON 88913 foi gerado por uma transformação de células de algodão, mediada por Agrobacterium, com um fragmento de DNA derivado de pMON51915 (Figura 1). A construção da transformação da planta, pMON51915, foi acasalada em

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Agrobacterium usando um procedimento de acasalamento triparental (Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7347-7351, 1980). A transformação da célula de algodão com transgenes pode ser realizada usando os métodos descritos, por exemplo, nas patentes n^os US 5.004.863, US 5.159.135, e US 5.518.908, aqui incorporadas como referência em sua totalidade. A transformação do algodão é realizada essencialmente como descrito no documento n^o WO/0036911, ou como descrito na patente n^o US 5.846.797, aqui incorporados como referência em sua totalidade. Uma modificação destes métodos pode incluir, porém sem limitações, o exemplo que se segue. A semente Coker 130 é esterilizada superficialmente e germinada no escuro. Explantes de hipocótilos são cortados das mudas germinadas em comprimentos de cerca de 1 a 1,5 cm. A cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens, transformada para conter pMON51915, é cultivada em caldo Luria sem antibióticos por 16 h a 28 ^oC, e depois diluída até aproximadamente 2 x 10⁸ bactérias por mililitro (mL). O explante de hipocótilos é submergido no inóculo de Agrobacterium por 2 a 5 min, e depois co-cultivado por cerca de 45 h em MS + 1,9 mg/L de KNO3 +m 3% de glicose (TRM), 30 explantes por placa, a 24 ^oC, no escuro. Os explantes são transferidos para TRM contendo 150 mg/mL de cefotaxima e 300 EM de glifosato durante quatro períodos de cultura, cada período por aproximadamente seis semanas. Os calos embriogênicos são segregados do explante primário no final do 3^o ou 4^o período de cultura e colocados sobre o mesmo meio. Os calos embriogênicos são subcultivados uma vez colocando brevemente em suspensão TRM líquido + 3% de glicose, e em seguida, vertendo a suspensão sobre placas com TRM + 150 mg/mL de cefotaxima + glifosato 300 μM. Os embriões somáticos são colhidos 3 a 8 semanas depois da subcultura líquida, e depois cultivados em meio Stewart & Hsu com 0,5% de glicose. As plantinhas derivadas dos embriões somáticos são maturadas até 4 a 7 cm (3 a 6 folhas) em caixas

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Magenta com meio Steart & Hsu modificado com NO3 40 mM/NH4 10 mM + 2% de sacarose. Estas plantas são então transplantadas para terra em vasos de 10 cm (4 polegadas), 100% de umidade, 16 horas de luz por dia, por 4 a 6 dias, e em seguida, 50% de umidade por 5 a 10 dias.

[0051] O fragmento do DNA de pMON51915 contém dois cassetes de expressão de transgenes inseridos no genoma de MON 88913 (figura 2) que conferem coletivamente tolerância a glifosato ao MON 88913 e sua progênie.

[0052] A planta MON 88913 e a semente têm partes regeneráveis.

As partes regeneráveis da semente incluem, porém sem limitações, o embrião, o cotilédone, e o meristema do broto ou da raiz. As partes regeneráveis da planta incluem, porém sem limitações, as folhas, o pecíolo, o hipocótilo, seções de ramos, e meristemas apicais ou da raiz. A invenção inclui também partes de plantas do evento de algodão MON 88913, que incluem, porém sem limitações, o pólen, óvulo, flores, casulos, lanugem, brotos, raízes e folhas. A invenção inclui também componentes extraíveis da semente de MON 88913, que incluem, porém sem limitações, proteína, farelo, farinha, cascas, óleo e lanugem de fibras curtas.

Exemplo 2 [0053] O evento de algodão tolerante ao glifosato, MON88913, foi selecionado entre muitos eventos de algodão transgênicos quanto a lesões vegetativas e reprodutivas por glifosato. A produção exitosa de um evento transgênico com qualidade comercial requer atualmente produzir um grande número de eventos. Na presente invenção, MON 88913 foi um evento dentre aproximadamente 1.000 eventos R0 que tinham sido transformados com muitas constrições de DNA diferentes que incluíam pMON51915. O evento MON 88913 foi selecionado entre os muitos eventos por uma série análises moleculares e triagens de

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26/42 tolerância ao glifosato.

[0054] Os eventos foram triados em um teste de tolerância ao glifosato em estufa, sendo as plantas triadas quanto à tolerância vegetativa e reprodutiva. Quinze a vinte e cinco sementes R1 de cada evento foram plantadas em bandejas de 15 compartimentos com meio de crescimento Metro-Mix, que contém uma combinação de turfa, vermiculita, nutrientes, agentes umectantes, e xaxim e cinza processados. Os fertilizantes adicionais incluídos no meio foram Osmocote 14-14-14, Osmocote Plus 15-9-12, e micronutrientes MicroMax. Todas plantas foram desenvolvidas em uma estufa. A temperatura média de dia durante a estação de crescimento foi de 32 graus Celsius (^oC), enquanto que a temperatura média à noite foi de 24 ^oC. O fotoperíodo foi ajustado em 16 horas de luz e oito horas de escuridão, com máxima intensidade de luminosidade. A umidade relativa média durante o ciclo de crescimento foi de 45 por cento. As plantas foram então aspergidas nos estágios de 4 e 8 folhas, sequencialmente, com 3,50 litros (L) por hectare (ha) (48 onças por acre) de Roundup Ultra® (herbicida que contém glifosato). Sete dias depois da aplicação de glifosato no estágio de 4 folhas, as plantas foram classificadas quanto à lesão vegetativa, e a segregação do fenótipo tolerante ao glifosato foi coletada. Estes dados foram usados para confirmar que a inserção do transgênica do evento estava se comportando como um único gene dominante, consoante os modelos genéticos mendelianos. Os eventos com boa tolerância vegetativa foram subsequentemente transplantados em vaso de 25 cm (10 in) com o mesmo meio de crescimento Metro-Mix descrito acima, e cultivados até a maturidade. As plantas foram tratadas com Pix Plus (BASF, Research Triangle Park, NC) conforme necessário, para regular a altura da planta. Três meses depois de plantar, as plantas foram mapeadas quanto à retenção de casulos nas primeiras posições de frutificação dos

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27/42 cinco primeiros ramos de frutificação. O valor máximo da retenção para este mapa vegetal é de 5 (cinco casulos retidos). Isto forneceu uma medida indireta rápida da fertilidade da planta. Com esta triagem na estufa, a retenção média para o evento comercial corrente (algodão RR 1445) é menor do que 1,0. Os eventos com um valor médio de retenção de casulos maior ou igual a três foram colhidos e avançados para seleção adicional de eventos. Os eventos que têm valores de retenção de casulos maiores ou iguais a dois têm valor como novas seleções de plantas tolerantes ao glifosato.

[0055] Os eventos que atenderam aos critérios de tolerância vegetativa e reprodutiva ao Roundup® Ultra foram analisados quanto ao número de cópias por intermédio da análise Southern blot. Os eventos de cópia única, que apresentavam boa tolerância em experimentos iniciais na estufa foram caracterizados adicionalmente em (1) testes adicionais de tolerância na estufa com proporções mais altas de glifosato, (2) experiências de campo replicadas, e (3) triagens moleculares adicionais. Os testes de tolerância na estufa foram conduzidos usando plantas homozigóticas. Todos experimentos continham o evento de algodão 1445 Roundup Ready^® comercializado atualmente (padrão comercial) para comparação. As sementes foram plantadas em bandejas com 15 compartimentos e tratadas com 4,7 L/ha (64 onças/acre) de Roundup Ultra® no estágio de 4 folhas e 7,0 L/ha (96 onças/acre) no estágio de 8 folhas. As plantas foram então transplantadas para vasos de 25 cm (10 polegadas) e quatro plantas foram mapeadas na meia-estação nas primeiras posições de frutificação dos cinco primeiros ramos de frutificação. Os dados no final da estação também foram coletados em todos eventos e incluíram peso de algodão por semente, número de casulos, tamanho dos casulos, e retenção de casulos.

[0056] Os testes no campo foram usados para selecionar o evento

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28/42 que apresentava melhores taxas de crescimento, retenção de frutos, e produção. Os testes no campo foram arranjados em um traçado de lotes divididos aleatoriamente com três replicações e três tratamentos. Os eventos foram plantados em lotes de duas fileiras, e 9,1 metros (30 pés). Os tratamentos consistiram em 4,7 L/ha (64 onças/acre ou 1,5 libra de equivalente ácido por acre) de Roundup Ultra® nos estágios de 4, 6, 10 e 14 nodos, e 7,0 L/ha (96 onças/acre ou 2,25 libras de equivalente ácido/acre) de Roundup Ultra® nos estágios de 4, 6, 10 e 14 nodos. Um mapa de plantas de meia-estação foi completado em dez plantas por lote. Os dados de retenção de casulos foram coletados para as primeira e segunda posições dos cinco primeiros nodos de frutificação, o que fornece uma escala de valores de retenção de casulos de 0 a 10. Uma planta com um valor de retenção de casulos igual ou maior do que 3 na escala de 0 a 10 tem valor como uma nova seleção de planta tolerante a glifosato.

[0057] Os testes de campo (10 locais), comparando a produção de lanugem de algodão em kg/ha (libra de equivalente ácido/acre) de MON 88913 e algodão RR 1445, indicaram que MON 88913 proporcionou proteção substancial contra os efeitos de glifosato sobre a produção (Tabela 1). A produção é uma medida da retenção de casulos, plantas de algodão produzidas por engenharia genética quanto à tolerância ao glifosato, que retêm um número substancial de casulos nas primeira e segunda posições de frutificação, devem manter uma vantagem de produção sobre as plantas de algodão que não são tão tolerantes ao glifosato. Uma dose eficaz de um herbicida que contém glifosato para controlar ervas daninhas em um campo de MON 88913 compreende cerca de 0,29 L/ha (4 onças/acre) e pode exceder 9,3 L/ha (128 onças/acre), dependendo da espécie de erva daninha a ser controlada e do estágio do desenvolvimento da erva daninha. O glifosato pode ser misturado com outros herbicidas para intensificar a atividade herbicida

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29/42 contra certas espécies de ervas daninhas.

T abela 1

Comparação da Produção de Lanugem de MON 88913 e 1445 Depois do Tratamento com Glifosato

	Produção em kg/ha (lb/acre) de 10 Locais
Tratamento com glifosato	0 kg ea*/ha (0 libra ea/acre)	1,68 kg ea*/ha (1,5 libra ea/acre)	2,52 kg ea*/ha (2,25 libra ea/acre)
1445	2.714,41 (2.421,84)	1.170,33 (1.044,19)	932,08 (831,47)
MON 88913	2.860,32 (2.551,58)	2.900,71 (2.587,61)	2.704,19 (2.412,3)

*ea = equivalente ácido

Exemplo 3 [0058] O DNA genômico do algodão para todas reações de PCR e análises Southern blot foi isolado usando um procedimento CTAB (Rogers et al., Plant Mol. Biol. 5:69-76, 1985) ou Dneasy® 96 Plant Kit (n° do catálogo 69181, Qiagen, Inc., Valencia, CA), seguindo as instruções dos fabricantes. O tecido foliar foi coletado de plantas no estágio de 2 a 4 folhas. As folhas verdadeiras menores foram coletadas de cada planta e congeladas imediatamente sobre gelo seco. O DNA foi extraído usando, por exemplo, o método que se segue. O tecido foi moído usando pérolas de plástico com nitrogênio líquido. Cinco mililitros do tampão de extração foram adicionados a 0,75 g de tecido e incubados a 55 ^oC por 45 min. O tampão de extração CTAB consistiu em Tris 100 mM pH 8,0, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, 2% de CTAB com a adição de 5 μL de beta-mercaptoetanol, 5 μL de RNase e 1% de PVPP. As amostras foram então extraídas com um volume igual de clorofórmio (5 mL) e depois centrifugadas a 3.700 rpm por 15 min à temperatura ambiente. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e o DNA foi precipitado com um volume igual de isopropanol. Depois de centrifugar a 3.700 rpm por 15 min, os péletes foram lavados com etanol a 70%, secados ao ar, e recolocados em suspensão em 250 μL de água.

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30/42 [0059] O DNA genômico do algodão adjacente à inserção transgênica foi obtido para o evento MON 88913, utilizando TAIL-PCR (Liu et al., Plant Journal 8:457-463, 1995). A extensão do DNA genômico foi conduzida usando o kit GenomeWalker (CloneTech Laboratories, Palo Alto, CA), seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, o DNA (~5 p.g), isolado utilizando o protocolo CTAB descrito anteriormente, foi digerido com várias endonucleases de restrição (EcoRV, Sca1) a 37 ^oC de um dia para o outro, em um volume total de 100 gL. As endonucleases de restrição foram removidas com colunas de purificação de PCR QIAquick (n^o de catálogo 28104, Qiagen, Inc.). A ligação de moléculas adaptadoras foi a descrita no protocolo do fabricante. O DNA foi amplificado usando o iniciador FMV-1 (SEQ ID NO: 5) com o iniciador API (CloneTech Laboratories) para a reação primária e o iniciador FMV-2 aninhado (SEQ ID NO: 6) com o iniciador AP2 (CloneTech Laboratories) para a reação secundária.

[0060] O DNA genômico/transgênico 3' do MON 88913 foi isolado utilizando PCR inversa. O DNA genômico total (~10 gg) foi digerido com três enzimas de restrição: BclI, NcoI e HindIII. Foram usadas colunas de Purificação de PCR QIAquick para purificar o DNA depois de digerir de um dia para o outro a 37 ^oC. O DNA foi eluído das colunas com 50 gL de água e depois diluído até 1 mL. O eluído diluído (85 gL) foi combinado com 10 gL de tampão (10X) e 5 gL T4 ligase para recircular os fragmentos. Depois de uma incubação durante a noite inteira a 16 ^oC, a ligase foi inativada por calor a 70 ^oC. As amostras foram amplificadas por PCR com uma série de iniciadores aninhados. As combinações de iniciadores para a PCR incluíram: o par de iniciadores 8099-E9-1/E9-2 (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8) para as amostras com BclI e NcoI e o par de iniciadores 8099-E9-1/Act8 rev (SEQ ID NO:7/SEQ ID NO: 9) para a amostra com HindIII; o par de iniciadores 8099-E9-2/E9-1 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11) para as amostras com BclI e NcoI; o par de

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31/42 iniciadores 8099-E9-2/Act8 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 12) para a amostra com HindIII; o par de iniciadores 8099-E9-3/E9-1 (SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 11) para as amostras com BclI e NcoI e o par de iniciadores 8099-E9-3/Act8 (SEQ ID NO:13/SEQ ID NO: 12) para a amostra com HindIII. As condições para a PCR incluíram: PCR primária = 7 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 72 ^oC por 10 min; 37 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 67 ^oC por 10 min; 1 ciclo de 67 ^oC por 10 min; PCR secundária e terciária = 5 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 72 ^oC por 10 min; 24 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 67 ^oC por 10 min; 1 ciclo de 67 ^oC por 10 min.

[0061] Alternativamente, a amplificação do DNA por PCR da extremidade 3' do evento MON 88913 pode ser realizada com condições que incluem: 7 ciclos de 94 ^oC por 25 segundos, 72 ^oC por 3 min; 37 ciclos de 94 ^oC por 25 segundos, 67 ^oC por 3 min; 1 ciclo de 67 ^oC por 7 min. Todas amplificações subsequentes foram conduzidas com as seguintes condições: 7 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 72 ^oC por 4 min; 37 ciclos de 94 ^oC por 2 segundos, 67 ^oC por 4 min; 1 ciclo de 67 ^oC por 7 min. Todos amplicons são visualizados em géis de agarose a 0,8% corados com brometo de etídio. O DNA é preparado para o sequenciamento purificando as amostras da PCR diretamente com o kit de Purificação de PCR QIAquick (n^o do catálogo 28104, Qiagen, Inc.) ou extraindo o fragmento apropriado do gel, e usando o kit de Extração de Gel QIAquick (n^o do catálogo 28704, Qiagen, Inc.).

[0062] Uma série de iniciadores de DNA foi desenhada para sequenciar a inserção do transgene e as regiões genômicas flanqueadoras do MON 88913. Foram desenhados iniciadores de DNA que permitiam a amplificação do transgene inteiro e das regiões genômicas flanqueadoras em cinco fragmentos sobrepostos. Iniciadores singulares foram desenhados para permitir a amplificação de cada região EPSPS-CTP2/aroA-CP4/RbcS2:E9 separadamente.

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Para todos fragmentos usados no sequenciamento, as amplificações foram realizadas em triplicata. As combinações de pares de iniciadores de DNA, usadas como iniciadores do sequenciamento para a região transgene/genômica 5'(SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15), região transgene/genômica 3' (SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17) e elementos genéticos de inserção (SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 11). O DNA genômico total foi usado para todas reações de PCR. Todos amplicons são visualizados em géis de agarose a 0,8% corados com brometo de etídio. O DNA é preparado para o sequenciamento purificando as amostras da PCR diretamente com o kit de Purificação de PCR QIAquick, ou extraindo o fragmento apropriado do gel, e usando o kit de Extração de Gel QIAquick. A sequência do DNA foi produzida usando um equipamento de análise de sequências de DNA (ABI Prism® 377, PE Biosystems, Foster City, CA) e o software de análises de sequências DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

[0063] Os fragmentos de DNA da regiões flanqueadoras da inserção transgene/genômica de MON 88913 foram subclonados usando um kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen). A sequência do DNA da região do transgene/genômica 5' está ilustrada na Figura 4 e a sequência do DNA da região do transgene/genômica 3' está ilustrada na Figura 5. Na sequência de DNA ilustrada nas Figuras 4 e 5, a sequência da inserção do transgene está em letra itálica.

Exemplo 4 [0064] Pares de iniciadores do evento de DNA são usados para produzir um amplicon diagnóstico para o genoma do evento MON 88913. Os amplicons diagnósticos para o genoma de MON 88913 compreendem pelo menos uma sequência de junção, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Os pares de iniciadores do evento, que produzirão um amplicon diagnóstico para MON 88913, onde os pares de iniciadores

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33/42 incluem, porém sem limitações, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 para a sequência 5' do amplicon, e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17 para o amplicon 3', quando usados no protocolo delineado na Tabela 2. Além destes pares de iniciadores, qualquer par de iniciadores, homólogo ou complementar a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, que em uma reação de amplificação de DNA produz um amplicon diagnóstico para o genoma de MON 88913, é um aspecto da presente invenção. Qualquer única molécula de polinucleotídeo iniciadora de DNA, isolada, compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 4, ou seu complemento, que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON 88913, é um aspecto da invenção. Qualquer única molécula de polinucleotídeo iniciadora de DNA, isolada, compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3, ou seu complemento, que é útil em um método de amplificação de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para MON 88913, é um aspecto da invenção. Um exemplo das condições de amplificação para esta análise está ilustrado na Tabela 2 e na Tabela 3, entretanto, qualquer modificação destes métodos que usam iniciadores de DNA homólogos ou complementares a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou sequências de DNA dos elementos genéticos contidos na inserção do transgene de MON 88913, que produzem um amplicon diagnóstico para MON 88913, está dentro do conhecimento dos versados na técnica. Um amplicon diagnóstico compreende uma molécula de DNA homóloga ou complementar a pelo menos uma sequência de DNA de junção do transgene/genômica (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) ou parte substancial dela.

[0065] Uma análise da amostra de tecido vegetal do evento MON

88913 deve incluir um controle tecidual positivo para o evento MON 88913, um controle negativo de uma planta de algodão que não é o evento 88913, e um controle negativo que não contém qualquer DNA

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34/42 genômica de algodão. Sequências de iniciadores adicionais podem ser selecionadas entre SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 pelos versados na técnica de métodos de amplificação de DNA, e as condições selecionadas para a produção de um amplicon pelos métodos indicados na T abela 2 e na T abela 3 podem diferir, porém resultar em um amplicon diagnóstico para o evento MON 88913. O uso destas sequências de iniciadores de DNA com modificações nos métodos das Tabelas 2 e 3 estão dentro do âmbito da invenção. O amplicon produzido por pelo menos uma sequência do iniciador de DNA, derivada de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, que é diagnóstico para MON 88913, é um aspecto da invenção.

[0066] Os kits de detecção de DNA, que contêm pelo menos um iniciador de DNA derivado de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, o qual, quando usado em um método de amplificação de DNA, produz um amplicon diagnóstico para MON 88913, é um aspecto da invenção. O amplicon produzido por pelo menos uma sequência iniciadora derivada de qualquer um dos elementos genéticos de pMON51915, que é diagnóstico para MON 88913, é um aspecto da invenção. Uma planta ou semente de algodão, onde seu genoma produzirá um amplicon que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, quando testada em um método de amplificação de DNA, é um aspecto da presente invenção. O ensaio para o amplicon de MON 88913 pode ser realizado usando um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler, como indicado na Tabela 3, ou por métodos e aparelhos conhecidos pelos versados na técnica.

T abela 2

Procedimento de PCR e Condições de Mistura da Reação para a Identificação da Região de Junção Inserção de Transgene/Genômica 5' de MON 88913

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Etapa	Reagente	Quantidade	Comentários
1	água isenta de nuclease	adicionar até um volume final de 20 pL	-
2	10X tampão de reação (com MgCl2)	2,0 pL	1X concentração final de tampão, concentração final de MgCl2 1,5 mM
3	solução 10 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP	0,4 pL	concentração final 200 pM de cada dNTP
4	iniciador do evento (SEQ ID NO: 14) (recolocado em suspensão em 1X tampão TE ou água isenta de nucleases até uma concentração 10 pM)	0,4 pL	concentração final 0,2 pM
5	iniciador do evento (SEQ ID NO: 15) (recolocado em suspensão em 1X tampão TE ou água isenta de nucleases até uma concentração 10 pM)	0,4 pL	concentração final 0,2 pM
6	RNase, isenta de DNase (500 ng/pL)	0,1 pL	50 ng/reação
7	REDTaq DNA polimerase (1 unidade/pL)	1,0 pL (recomendado trocar pipetas antes da etapa seguinte)	1 unidade/reação
8	DNA extraído (modelo): - Amostras a serem analisadas * folhas individuais * folhas coletadas (máximo de 50 folhas/seleção) - Controle negativo - Controle negativo - Controle positivo	- 10-200 ng de DNA genômico - 20 ng de DNA genômico - 50 ng de DNA genômico de algodão (não MON 88913) - nenhum DNA-modelo - 50 ng do DNA genômico de MON 88913
9	Misturar suavemente e adicionar 1-2 gotas de óleo mineral sobre o topo de cada reação.

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T abela 3

Parâmetros Sugeridos da PCR para Diferentes Aparelhos de Reciclagem Térmica [0067] Prossegue-se com a amplificação do DNA em um

Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler, usando os parâmetros dos ciclos que se seguem. O MJ Engine ou o Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler devem ser operados no modo calculado. Opera-se o Thermocycler Perkin-Elmer 9700 com a velocidade de ascensão ajustada no máximo.

N de Ciclos	Ajustes: Stratagene Robocycler
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 1 minuto 60 oC, 1 minuto 72 oC, 1 minuto e 30 segundos
1	72 oC, 10 minutos

N de Ciclos	Ajustes: MJ Engine ou Perkin-Elmer 9700
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 10 segundos 60 oC, 30 segundos 72 oC, 1 minuto
1	72 oC, 10 minutos

N de Ciclos	Ajustes: Eppendorf Matercycler Gradient
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 15 segundos 60 oC, 15 segundos 72 oC, 1 minuto e 30 segundos
1	72 oC, 10 minutos

Exemplo 5 [0068] O DNA genômico de MON 88913 e o DNA genômico de

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37/42 algodão do controle (~15 μg de cada) são digeridos com várias enzimas de restrição (140 U) em um volume total de 150 gL, incluindo 15 μL do tampão correspondente do fabricante (NEB, Beverely, MA). As endonucleases de restrição, como por exemplo, BgII, BamHI, NcoI, HindIII, e BcII, são usadas na análise Southern de MON 88913. As digestões com as endonucleases são realizadas na temperatura apropriada por pelo menos 6 horas. Depois de incubar, o DNA é precipitado com acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol. Subsequentemente, o DNA é lavado com etanol a 70%, secado, e recolocados em suspensão em 40 gL de TBE. O tampão de carregamento (0,2x) é adicionado às amostras e depois a eletroforese é conduzida em géis de agarose (0,8%) por 16-18 h a 30 volts. Os géis são corados com brometo de etídio, e depois tratados com uma solução de despurinização (HCl 0,125 N) por 10 min, e com uma solução desnaturante (hidróxido de sódio 0,5 M, cloreto de sódio 1,5 M) por 30 min, e finalmente, com uma solução neutralizadora (base Trizma 0,5 M, cloreto de sódio 1,5 M) por 30 min. O DNA é transferido para uma membrana Hybond-M (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra), usando um Turboblotter (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemanha) por 4-6 horas e depois fixado à membrana usando uma luz UV. [0069] As membranas são pré-hibridizadas com 20 mL de solução

DIG Easy Hyb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; n^o do catálogo 1603558) por 2-4 horas a 45 ^oC. Sondas de DNA radiativas (³²P dCTP) homólogas ou complementares a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, ou uma porção delas, são preparadas usando um kit de Marcação de DNA Radprime (Invitrogen, Carlsbad, CA; n° do catálogo 18428-011). Os nucleotídeos não incorporados são removidos usando colunas Sephadex G-50 (Invitrogen). A solução de pré-hibridização é substituída por 10 mL de solução DIG Easy Hyb preaquecida, contendo a sonda desnaturada até

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38/42 uma concentração final de 1 milhão de contagens por mL. As manchas são hibridizadas a 45 ^oC por 16-18 h.

[0070] As manchas são lavadas com uma solução de baixa severidade (5X SSC, 0,1X SDS) a 45 ^oC então repetidamente lavada com uma solução de alta severidade (0,1X SSC, 0,1% SDS) a 65°C. As manchas são expostas a uma triagem com fósforo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por > 2 h e a exposição é lida usando uma máquina Data Storm 860 (Amersham Biosciences).

Exemplo 6 [0071] Os métodos usados para identificar a progênie de algodão heterozigótica da homozigótica que contém o evento MON 88913 estão descritos em um ensaio de zigosidade, cujos exemplos de condições estão descritos na Tabela 4 e na Tabela 5. Os iniciadores de DNA usados no teste de zigosidade são os desencadeadores SQ1099 (SEQ IS NO: 21), SQ1100 (SEQ ID NO: 22), SQ1353 (SEQ I D NO: 23), iniciador marcado 6FAM® (SEQ ID NO: 24), e iniciador marcado VIC® (SEQ ID NO: 25); 6FAM e VIC são produtos corantes fluorescentes da Applied Biosystems (Foster City, CA) afixados ao iniciador de DNA.

[0072] SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, quando usados nesses métodos de reação, produzem um amplicon de DNA para algodão não transgênico, dois amplicons de DNA para algodão heterozigótico que contém o evento MON 88913, e um amplicon de DNA para algodão MON 88913 homozigótico que é distinto de qualquer outro algodão não-MON 88913. Os controles para esta análise devem incluir um controle positivo de algodão homozigótico e heterozigótico contendo o DNA do evento MON 88913, um controle negativo de algodão nãotransgênico, e um controle negativo que não contém qualquer DNAmodelo. Este ensaio é otimizado para uso com um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler. Outros métodos e aparelhos conhecidos pelos

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39/42 versados na técnica, que produzem amplicons que identificam a zigosidade da progênie de cruzamentos feitos com plantas de algodão MON 88913, estão dentro dos conhecimentos dos versados na técnica. T abela 4

Soluções de Reação do Ensaio de Zigosidade

Etapa	Reagente	Quantidade	Comentários
1	água isenta de nuclease	adicionar até um volume final de 10 μL	-
2	2X Universal Master Mix (Applied Biosystems, no do catálogo 4304437)	5 μL	1X concentração final
3	iniciadores SQ1099, SQ1100, SQ1353 (recolocados em suspensão em água isenta de nucleases até uma concentração 20 μM)	0,5 μL	concentração final 0,25 μM
4	iniciador 6FAM® (recolocado em suspensão em água isenta de nucleases até uma concentração 10 μM)	0,2 μL	concentração final 0,4 μM
5	iniciador VIC® (recolocado em suspensão em água isenta de nucleases até uma concentração 10 μM)	0,2 μL	concentração final 0,15 μM

Continuação...

Etapa	Reagente	Quantidade	Comentários
6	REDTaq DNA polimerase (1 unidade^L)	1,0 μL (recomendado trocar pipetas antes da etapa seguinte)	1 unidade/reação
7	DNA extraído (modelo): - Amostras a serem analisadas (folhas individuais) - Controle negativo	3,0 μL - 4-80 ng de DNA genômico - 4 ng de DNA genômico de algodão

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	- Controle negativo - Controle positivo - Controle positivo	não-transgênico - nenhum modelo de DNA (solução na qual o DNA foi recolocado em suspensão) - 4 ng do DNA genômico do algodão heterozigótico MON 88913 conhecido - 4 ng do DNA do algodão homozigótico MON 88913
8	Misturar suavemente e adicionar 1-2 gotas de óleo mineral sobre o topo de cada reação.

T abela 5

Condições do Thermocycler do Ensaio de Zigosidade [0073] Prossegue-se com a amplificação do DNA em um

Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler, usando os parâmetros dos ciclos que se seguem. Quando a PCR é operada no Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler ou no MJ Engine, o Thermocycler deve ser operado no modo calculado. Quando a PCR é operada no Perkin-Elmer 9700, o Thermocycler deve ser operado com a velocidade de ascensão ajustada no máximo.

N de Ciclos	Ajustes: Stratagene Robocycler
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 1 minuto 60 oC, 1 minuto 72 oC, 1 minuto e 30 segundos
1	72 oC, 10 minutos

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N de Ciclos	Ajustes: MJ Engine ou Perkin-Elmer 9700
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 30 segundos 60 oC, 30 segundos 72 oC, 1 minuto e 30 segundos
1	72 oC, 10 minutos

N de Ciclos	Ajustes: Eppendorf Matercycler Gradient
1	94 oC, 3 minutos
38	94 oC, 15 segundos 60 oC, 15 segundos 72 oC, 1 minuto e 30 segundos
1	72 oC, 10 minutos

Exemplo 7 [0074] A análise das amostras de DNA genômico do algodão foi conduzida usando um método Taqman® de terminação. A produção de amplicons diagnósticos para o DNA genômico de MON 88913 foi feita usando um conjunto de iniciadores A que incluiu os iniciadores do evento: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, e a sonda 6-FAM SEQ ID NO: 24; e um conjunto de iniciadores B que incluiu os iniciadores do evento: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, e a sonda 6-FAM SEQ ID NO: 28. O método usa um formato com 96 cavidades ou 384 poços e um Sistema de PCR GeneAmp 9700 da Applied Biosystems, ou a Máquina de DNA PT-225 da MJ Research. O DNA extraído das amostras de tecidos de algodão, como descrito anteriormente, devem ficar na faixa entre 5 e 10 ng por reação PCR. Cada reação contém um volume final de 10 gL, consistindo em 0,5 gL de concentração igual dos iniciadores do evento (20 gM), 5,0 gL de 2X Universal Master Mix, 0,2 gL da sonda 6-FAM (10 gM), 3 gL da amostra de DNA (5-10 ng) e água até 10 gL. Os parâmetros dos ciclos térmicos são 1 ciclo de 50 ^oC por 2 minutos, 1 ciclo de 95 ^oC por 10 min; 10 ciclos de 95 ^oC por 15 segundos, 64 ^oC por 1 min; e

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42/42 depois, -1 ^oC/ciclo, 30 ciclos de 95 ^oC por 15 segundos; 54 ^oC por 1 minuto, e depois manter a 10 ^oC. A produção de amplicons foi determinada por uma leitora de microplacas, como por exemplo, TECAN Safire (Durham, NC), usando as condições descritas pelo fabricante. O programa de análise de dados (TaqPro®) foi usado para pontuar a produção do amplicon marcado. Outros equipamentos e métodos de análise conhecidos nessas técnicas de detecção de DNA podem ser utilizados para detectar os amplicons da presente invenção.

[0075] Um depósito da Monsanto Technology LLC, a semente de algodão MON 88913, descrita acima e enunciada nas reivindicações, foi feito conforme o Tratado de Budapeste junto à American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Universitiy Boulevard, Manassas, Va 20110. O número de acesso é PTA-4854. O depósito será mantido na depositária por um período de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação, ou durante a validade efetiva da patente, seja qual for o mais longo, e será substituído conforme necessário durante esse período.

[0076] Tendo sidos ilustrados e descritos os princípios de presente invenção, deve ficar evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser modificada no arranjo e detalhe sem fugir de tais princípios. Reivindicam-se todas modificações que estejam dentro do espírito e do âmbito das reivindicações apensadas.

[0077] Todas publicações e documentos de patentes publicados citados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referência até o mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual tivesse sido especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado como referência.

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para produzir uma planta de algodão que tolera a aplicação do herbicida glifosato compreendendo o evento de algodão MON 88913, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) cruzar sexualmente uma primeira planta reprodutora de algodão tolerante ao glifosato compreendendo o evento de algodão MON 88913, que compreende SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e uma segunda planta reprodutora de algodão que carece de tolerância ao herbicida glifosato, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de primeira progênie;

   (b) selecionar uma planta de primeira progênie que é tolerante a glifosato;

   (c) efetuar a autopolinização da referida planta de primeira progênie, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e (d) selecionar entre as referidas plantas de segunda progênie uma planta tolerante a glifosato, em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854, em que as plantas progênie tolerantes a glifosato das etapas (b) e (d) compreendem o evento MON 88913 compreendendo SEQ ID NOs: 1 e 2.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de retrocruzar a planta de primeira progênie que é tolerante a glifosato ou a planta de segunda progênie que é tolerante a glifosato para a planta reprodutora de segundo grau ou uma planta reprodutora de terceiro grau, produzindo desta forma uma planta que tolera a aplicação de glifosato em que a planta de primeira progênie e a planta de segunda progênie tolerante a

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   2/7 glifosato compreendem o evento MON 88913 compreendendo SEQ ID NOs: 1 e 2.
3. 3. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento de algodão MON 88913, que compreende SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com um conjunto de moléculas iniciadoras de DNA que compreende:

   (i) uma primeira molécula iniciadora que compreende pelo menos 11 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3 que contém a região flanqueadora 5' do DNA genômico do algodão, que flanqueia o sítio de inserção no evento de algodão MON 88913 ou seu complemento completo ou de SEQ ID NO: 4 que contém a região flanqueadora 3' do DNA genômico do algodão, que flanqueia o sítio de inserção no evento de algodão MON 88913 ou seu complemento completo; e (ii) uma segunda molécula iniciadora que compreende pelo menos 11 nucleotídeos contíguos da região do transgene de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e em que o conjunto de moléculas iniciadoras de DNA produz um amplicon diagnóstico, que compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com uma amostra contendo DNA genômico, que compreende o evento de algodão MON 88913;

   (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico , produzindo desta forma um amplicon diagnóstico; e (c) detectar e analisar o amplicon diagnóstico para determinar se o amplicon diagnóstico compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2;

   em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American

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   Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido conjunto de iniciadores compreende as SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido conjunto de iniciadores compreende as SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28.
6. 6. Método para detectar a presença do DNA correspondente ao evento de algodão MON 88913 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) colocar a amostra que compreende DNA em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas de 0,2 x SSC a 50 °C com o DNA do evento de algodão MON 88913 compreendendo SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e não hibridiza sob as condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de planta de algodão de controle, em que a referida sonda é homóloga ou complementar a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2;

   (b) submeter a amostra e a sonda à condições de hibridização rigorosas; e (c) detectar a hibridização da sonda para o DNA;

   em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
7. 7. Método para determinar a zigosidade de uma planta de algodão compreendendo o evento de algodão MON 88913, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) colocar uma amostra que compreende o DNA da referida planta de algodão em contato com um conjunto de iniciadores compreendendo as SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, o qual, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico

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   4/7 com o DNA genômico compreendendo o evento de algodão MON 88913, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para o evento de algodão MON 88913;

   (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico , produzindo desta forma o primeiro amplicon;

   (c) detectar o primeiro o amplicon;

   (d) colocar a amostra que compreende o DNA do algodão em contato com o referido conjunto de iniciadores, o qual, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com o DNA genômico de plantas de algodão, produz um segundo amplicon que compreende o DNA genômico nativo do algodão, homólogo à região genômica do algodão de uma inserção de transgene identificada como o evento de algodão MON 88913;

   (e) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico , produzindo desta forma o segundo amplicon;

   (f) detectar o segundo amplicon; e (g) comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica quanto à inserção do transgene;

   em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
8. 8. Método para determinar a zigosidade de uma planta de algodão compreendendo o evento de algodão MON 88913, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) colocar uma amostra que compreende o DNA da referida planta de algodão em contato com um conjunto de iniciadores compreendendo as SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25;

   (b) realizar uma reação de amplificação de ácidos nucléicos;

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   5/7 e

   (c) detectar os produtos da reação;

   em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
9. 9. Método para controlar ervas daninhas em uma cultura de algodão que compreende o evento MON 88913 compreendendo SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de aplicar uma dose eficaz de herbicida que contém glifosato à referida cultura de algodão;

   em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende partes de planta de algodão contendo o DNA selecionadas do grupo que consiste em pólen, óvulos, flores, cápsulas da planta de algodão, ramos, raízes, folhas ou sementes.
11. 11. Método de cultivo de algodão, caracterizado pelo fato de que compreende desenvolver uma planta de algodão compreendendo o evento MON 88913, em que a semente de algodão representativa compreendendo o evento MON 88913 está depositada junto à American Type Culture Collection (ATCC) com o N^o de Acesso PTA-4854.
12. 12. Método para produzir uma planta de algodão que tolera a aplicação do herbicida glifosato compreendendo o evento de algodão MON 88913, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) cruzar sexualmente uma primeira planta reprodutora de algodão tolerante ao glifosato que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e um inserto de DNA codificando EPSPS, com uma segunda planta reprodutora de algodão que carece de tolerância ao herbicida

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    6/7 glifosato, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de primeira progênie;

    (b) selecionar uma planta de primeira progênie que é tolerante a glifosato;

    (c) efetuar a autopolinização da referida planta de primeira progênie, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e (d) selecionar entre as referidas plantas de segunda progênie uma planta tolerante a glifosato, em que o referido inserto de DNA têm junções 5' e 3' com o DNA genômico do algodão, que são compreendidas de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, em que as plantas progênie tolerantes a glifosato das etapas (b) e (d) compreendem o evento MON 88913 compreendendo SEQ ID NOs: 1 e 2.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de retrocruzar a planta de primeira progênie que é tolerante a glifosato ou a planta de segunda progênie que é tolerante a glifosato para a planta reprodutora de segundo grau ou uma planta reprodutora de terceiro grau, produzindo desta forma uma planta que tolera a aplicação de glifosato, em que a planta de primeira progênie e a planta de segunda progênie tolerante a glifosato compreendem o evento MON 88913 compreendendo SEQ ID NOs: 1 e 2.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as junções 5' e 3' do inserto de DNA com o DNA genômico do algodão são ainda compreendidas de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 12 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das

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    7/7 etapas de seleção (b) e (d) compreende a análise para a presença de pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-4.
16. 16. Método para controlar ervas daninhas em uma cultura de plantas de algodão tolerantes a glifosato, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de aplicar uma dose eficaz de um herbicida contendo glifosato à referida cultura de plantas de algodão;

    em que as plantas de algodão compreendem um inserto de DNA codificando EPSPS e o DNA tem sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, e em que o inserto de DNA têm junções 5' e 3' com o DNA genômico do algodão que são compreendidas de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.