ES2618211T3 - Evento de algodón MON 88913 y composiciones y procedimientos de detección del mismo - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN que comprende: (a) una construcción que comprende un primer casete de expresión que comprende el promotor del virus de mosaico Figwort construido como un elemento promotor quimérico con el promotor (At.Ef1α) de factor de elongación 1-alfa de Arabidopsis (FMV35S/Ef1α), operativamente unido a la secuencia líder de traducción y al intrón del factor de elongación 1-alfa de Arabidopsis, operativamente unido al péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, operativamente unido a 5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante al glifosato procedente de la cepa CP4 de Agrobacterium sp., operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y un segundo casete de expresión que comprende el promotor CaMV35S-Act8 que incluye el primer intrón del gen Act8, operativamente conectado a un péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, operativamente conectado a 5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante al glifosato procedente de la cepa CP4 de Agrobacterium sp., operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante y (b) la secuencia de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

Description

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superpone a la unión de ADN genómico flanqueante y de inserción. La estructura única de la sonda FRET da como resultado que la misma contiene la estructura secundaria que mantiene las fracciones fluorescentes y de desactivación en proximidad inmediata. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Tras el éxito de amplificación por PCR, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de las fracciones fluorescentes y de desactivación. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de inserción de transgén/flanqueante debido a la amplificación e hibridación exitosas.

Los kits de detección de ADN pueden desarrollarse utilizando las composiciones desveladas en la presente memoria y los procedimientos bien conocidos en la materia de detección de ADN. Los kits resultan útiles para la identificación del ADN del evento de algodón MON 88913 en una muestra y pueden aplicarse a procedimientos para el cultivo de plantas de algodón que contienen ADN de MON 88913. Los kits contienen secuencias de ADN que son útiles como cebadores o sondas y que son homólogas o complementarias a cualquier porción de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o a las secuencias de ADN homólogas o complementarias al ADN contenido en cualquiera de los elementos genéticos de transgén de pMON51915 que se han insertado en el ADN de MON 88913 (Figura 2). Estas secuencias de ADN pueden utilizarse en procedimientos de amplificación de ADN (PCR) o como sondas en procedimientos de hibridación de ácidos polinucleicos, es decir, análisis de Southern, análisis de Northern. Los elementos genéticos de transgén contenidos en el ADN de MON 88913 (Figura 2) incluyen un primer casete de expresión que comprende el promotor del virus de mosaico Figwort construido como un elemento promotor quimérico con el promotor (At.Eflα) de factor de elongación alfa-1 de Arabidopsis (FMV35S/Eflα, patente de Estados Unidos n.º 6.462.258, SEQ ID NO: 28), operativamente unido a la secuencia líder de traducción y al intrón del factor de elongación 1-alfa de Arabidopsis (número de acceso a Genbank X16430, como se describe en Axelos y col., Mol. Gen. Genet. 219:106112, 1989), operativamente unido al péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987), operativamente unido a 5-enol-piruvil-shikimato3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante al glifosato procedente de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium sp. (aroA:CP4, patente de Estados Unidos n.º 5.633.435), operativamente unido a la región de terminación 3’ de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante (T-Ps.RbcS2:E9, Coruzzi, y col., EMBO J. 3:1671-1679, 1984), y un segundo casete de expresión que comprende el promotor CaMV35S-Act8 que incluye el primer intrón del gen Act8 (SEQ ID NO: 29, patente de Estados Unidos n.º 6.462.258), operativamente conectado a un péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2), operativamente conectado a 5-enol-piruvil-shikimato3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante al glifosato procedente de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium sp. (aroA:CP4, patente de Estados Unidos n.º 5.633.435), operativamente unido a la región de terminación 3ʹ de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar los ejemplos de determinadas realizaciones preferentes de la invención. Los expertos en la materia han de apreciar que las técnicas desveladas en los ejemplos siguientes representan enfoques que los inventores han descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención, y por consiguiente, pueden considerarse para constituir ejemplos de modos preferentes para su práctica.

Ejemplos

Ejemplo 1

El evento del algodón transgénico MON 88913 se generó por una transformación mediada por Agrobacterium de células de algodón con un fragmento de ADN derivado de pMON51915 (Figura 1). La construcción de la transformación de la planta, pMON51915, se cruzó con Agrobacterium utilizando un procedimiento de cruzamiento triparental (Ditta y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7347-7351, 1980). La transformación de células de algodón con transgenes puede realizarse utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.º 5.004.863, en la patente de Estados Unidos n.º 5.159.135, y en la patente de Estados Unidos n.º 5.518.908. La transformación de algodón se realiza esencialmente como se describe en el documento WO/0036911 o como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 5.846.797. Una modificación de estos procedimientos puede incluir, entre otros, el siguiente ejemplo. 130 semillas Coker se esterilizan en la superficie y se germinan en la oscuridad. Los explantes de hipocótilo se cortan de las plantas de semillero germinadas en longitudes de aproximadamente 11,5 centímetros. La cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens transformada para contener pMON51915 se cultiva en caldo de Luria sin antibióticos durante 16 horas a 28 ºC, después se diluye a aproximadamente 2 x 108 bacterias/mililitro (ml). El explante de hipocólito se sumerge en el inóculo de Agrobacterium durante 2-5 minutos, después se cocultiva durante aproximadamente 45 horas en MS + 1,9 mg/l de KNO3 + glucosa al 3 % (TRM), 30 explantes por placa, 24 ºC, en la oscuridad. Los explantes se transfieren a TRM que contiene 150 mg/l de cefotaxima y 300 µM de glifosato durante cuatro periodos de cultivo, cada periodo de aproximadamente seis semanas. Los callos embriogénicos se segregan a partir del explante primario al final del 3er o 4º periodo de cultivo y se colocan en el mismo medio. Los callos embriogénicos se subcultivan una vez suspendiéndose brevemente en líquido TRM + glucosa al 3 %, seguido por el vertido de la suspensión en placas de ʺTRMʺ + 150 mg/l de cefotaxima

+ 300 µM de glifosato. Los embriones somáticos se cosechan de 3-8 semanas después del subcultivo del líquido, después se cultivan en medios Stewart y Hsu con glucosa al 0,5 %. Las plántulas derivadas de los embriones somáticos se maduran a aproximadamente 4-7 cm (hojas de 3-6) en cajas Magenta con Stewart y Hsu modificados con 40 mM de NO3/10 mM de NH4 + sacarosa al 2 %. Estas plantas se transplantan a continuación a tierra

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orgánica, macetas de 4", 100 % de humedad, 16 horas de luz por día, durante 4-6 días, seguido de un 50 % de humedad 5-10 días.

El fragmento de ADN de pMON51915 contiene dos casetes de expresión de transgén insertados en el genoma de MON 88913 (Figura 2) que confieren de manera colectiva tolerancia al glifosato a MON 88913 y progenie del mismo.

Las plantas y semillas de MON 88913 tienen partes regenerables. Las partes regenerables de la semilla incluyen, entre otros, embrión, cotiledón, y meristema de brote o raíz. Las partes de la planta regenerables incluyen, entre otros, hojas, pecíolo, hipocótilo, secciones de tallo, y meristemas de raíz y apicales. Las partes de plantas del evento de algodón MON 88913 pueden incluir, entre otros, polen, óvulos, flores, cápsulas, vainas, brotes, raíces, y hojas. Los componentes extraíbles de semilla MON 88913 pueden incluir, entre otros, proteínas, comida, harina, vainas, aceite, y línter.

Ejemplo 2

El evento del algodón MON 88913 tolerante al glifosato se seleccionó entre muchos eventos transgénicos de algodón para la tolerancia a la lesión reproductiva y vegetativa del glifosato. La producción exitosa de un evento transgénico de calidad comercial requiere actualmente la producción de un gran número de eventos transgénicos. MON 88913 fue un evento entre aproximadamente 1.000 eventos R0 que habían sido transformados con diferentes construcciones de ADN que incluían pMON51915. El evento MON 88913 se seleccionó entre muchos eventos por una serie de análisis moleculares e identificaciones sistemáticas de tolerancia al glifosato.

Los eventos se identificaron de forma sistemática en un ensayo de tolerancia al glifosato en invernadero, las plantas se clasificaron para tolerancia vegetativa y reproductiva. Quince a veinticinco semillas R1 de cada evento se plantaron en bandejas de 15 células con medio de cultivo Metro-Mix 350, que contiene una combinación de turba, vermiculita, nutrientes, agentes humectantes, corteza y cenizas procesadas. Los fertilizantes adicionales incluidos en el medio fueron micronutrientes Osmocote 14-14-14, Osmocote Plus 15-9-12, y MicroMax. Todas las plantas se cultivaron en un invernadero. La temperatura media de día durante la temporada de crecimiento era de 32 grados Celsius (°C), mientras que la temperatura media de noche era de 24 ºC. El fotoperiodo se estableció en 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad, con intensidad de luz máxima. La humedad relativa promedia durante el ciclo de crecimiento era del 45 por ciento. Las plantas se pulverizaron en las etapas de 4 y 8 hojas secuencialmente con 48 oz/A (oz = onzas, A = acre) de Roundup Ultra® (herbicida que contiene glifosato). Siete días después de la aplicación de glifosato a la etapa de 4 hojas, se puntuaron las plantas para observar el daño vegetativo y la segregación del fenotipo tolerante al glifosato se recogió. Estos datos se utilizaron para confirmar que la inserción del transgén del evento se realizó como un único gen dominante, adhiriéndose a los modelos genéticos mendelianos. Los eventos de buena tolerancia vegetativa se trasplantaron posteriormente en macetas de 10 pulgadas con el mismo medio de cultivo Metro-Mix 350 descrito previamente y se cultivaron hasta la madurez. Las plantas se trataron con Pix Plus (BASF, Research Triangle Park, NC), cuando fuese necesario para regular la altura de la planta. A los tres meses post-plantación, las plantas se mapearon para la retención de las cápsulas en las primeras posiciones de frutos de los cinco primeros ramos de frutos. El valor máximo de retención para este mapeo de planta es 5 (cinco cápsulas retenidas). Esto proporcionó una medición rápida, indirecta de la fertilidad de la planta. Con esta identificación sistemática en invernadero, la media de retención para el evento comercial actual (algodón RR 1445) es inferior a 1,0. Los eventos con un valor medio de retención de cápsula superior o igual a dos tienen un valor como nuevas selecciones de plantas tolerantes al glifosato.

Los eventos que cumplieron con los criterios de tolerancia reproductiva y vegetativa de Roundup® Ultra se analizaron para determinar el número de copias a través del análisis de membrana de Southern. Los eventos de copia única que mostraron una buena tolerancia en los experimentos iniciales en invernadero se caracterizaron adicionalmente en 1) ensayos adicionales de tolerancia en invernadero en relaciones mayores de glifosato, 2) ensayos en campo replicados, y con 3) identificaciones sistemáticas moleculares adicionales. Los ensayos de tolerancia en invernadero se llevaron a cabo utilizando plantas homocigóticas. Todos los experimentos contenían el evento de algodón 1445 comercial actual de Roundup Ready® (norma comercial) para su comparación. Las semillas se plantaron en 15 bandejas de células y se trataron con 64 oz/A de Roundup Ultra® en la etapa de 4 hojas y 96 oz/A en la etapa de 8 hojas. Las plantas se trasplantaron a macetas de 10 pulgadas y se mapearon cuatro plantas a mitad de temporada en las primeras posiciones de frutos de los cinco primeros ramos de frutos. Asimismo se recogieron los datos del final de la temporada en todos los eventos e incluyeron el peso de las semillas de algodón, número de cápsulas, tamaño de cápsulas, y retención de cápsulas.

Se utilizó el ensayo en campo para seleccionar el evento que mostró mejores relaciones de crecimiento, retención de fruto, y rendimiento. Los ensayos en campo se dispusieron en un diseño de parcelas divididas al azar con tres replicaciones y tres tratamientos. Los eventos se plantaron en dos filas, parcelas de 30 pies. Los tratamientos consistieron en 64 oz/A (1,5 lb de ae/A) de Roundup Ultra® en las etapas de 4, 6, 10, 14 nodos y 96 oz/A (2,25 lb de ae/A) de Roundup Ultra® en las etapas de 4, 6, 10, 14 nodos sin pulverizar. Un mapeo de la planta a mitad de temporada se completó en diez plantas por maceta. Se recogieron los datos de retención de cápsulas para las primeras y segundas posiciones de frutos de los primeros cinco nodos de frutos que proporcionan una escala de valor de retención de cápsulas de 0-10. Una planta con un valor de retención de cápsulas igual o superior a 3 en la escala de 0-10 tiene un valor como nueva selección de planta tolerante al glifosato.

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durante 25 segundos, 67 ºC durante 3 minutos; 1 ciclo de 67 ºC durante 7 minutos. Todas las amplificaciones posteriores se llevaron a cabo con las siguientes condiciones: 7 ciclos de 94 ºC durante 2 segundos, 72 ºC durante 4 minutos; 37 ciclos de 94 ºC durante 2 segundos, 67 ºC durante 4 minutos; 1 ciclo de 67 ºC durante 7 minutos. Todos los amplicones se visualizaron en geles de agarosa al 0,8 % teñidos con bromuro de etidio. El ADN se preparó para la secuenciación ya sea mediante la purificación de las muestras de PCR directamente con el kit de purificación por PCR QIAquick (cat. n.º 28104, Qiagen Inc.) o mediante la extracción del fragmento apropiado del gel y utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (cat. n.º 28704, Qiagen Inc.).

Se diseñó una serie de cebadores de ADN para secuenciar la inserción transgénica y las regiones genómicas flanqueantes adyacentes de MON 88913. Se diseñaron cebadores de ADN que permitieron la amplificación de las regiones del transgén y genómicas flanqueantes completas mediante cinco fragmentos superpuestos. Se diseñaron cebadores únicos para permitir la amplificación de cada región de EPSPS-CTP2/aroA-CP4/RbcS2:E9 por separado. Para todos los fragmentos utilizados en la secuenciación, las amplificaciones se realizaron por triplicado. Las combinaciones del par de cebadores de ADN se utilizaron como cebadores de secuenciación para la región transgén/genómica 5' (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15), región transgén/genómica 3' (SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17) y elementos genéticos de inserción (SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 11). Se utilizó ADN genómico total de todas las reacciones por PCR. Todos los amplicones se visualizaron en geles de agarosa al 0,8 % teñidos con bromuro de etidio. El ADN se preparó para la secuenciación ya sea mediante la purificación de las muestras de PCR directamente con el kit de purificación por PCR QIAquick o mediante la extracción del fragmento apropiado del gel y utilizando el kit de extracción de gel QIAquick. La secuencia de ADN se produjo utilizando el equipo de análisis de secuencia de ADN (ABI Prism™ 377, PE Biosystems, Foster City, CA) y el software de análisis de secuencia DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI).

Los fragmentos de ADN de las regiones flanqueantes de la inserción transgén/genómica de MON 88913 se subclonaron utilizaron un kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen). La secuencia de ADN de la región transgén/genómica 5' se muestra en la Figura 4 y la secuencia de ADN de la región transgén/genómica 3' se muestra en la Figura 5. En la secuencia de ADN mostrada en las Figuras 4 y 5, la secuencia de inserción del transgén está en cursiva.

Ejemplo 4

Los pares de cebadores del evento de ADN se utilizan para producir un amplicón diagnóstico del genoma del evento de algodón MON 88913. Los amplicones diagnósticos del genoma MON 88913 comprenden al menos una secuencia de unión, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Los pares de cebadores del evento que producirán un amplicón diagnóstico para MON 88913, en los cuales los pares de cebadores incluyen, entre otros, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 para la secuencia de amplicón 5’, y SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para el amplicón 3’ cuando se utiliza en el protocolo indicado en la Tabla 2. Además de estos pares de cebadores, puede utilizarse cualquier par de cebadores, homólogo o complementario a la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, que en una reacción de amplificación de ADN produce un amplicón diagnóstico del genoma MON 88913. Se puede utilizar cualquier molécula de cebador de polinucleótido de ADN aislado único que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 3, o su complemento que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico de MON 88913. Se puede utilizar cualquier molécula de cebador de polinucleótido de ADN aislado único que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, o su complemento que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico de MON 88913. Un ejemplo de las condiciones de amplificación para este análisis se ilustra en la Tabla 2 y en la Tabla 3, no obstante, cualquier modificación de estos procedimientos que utilizan cebadores de ADN homólogos o complementarios a la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o secuencias de ADN de los elementos genéticos contenidos en la inserción del transgén de MON 88913 que producen un amplicón diagnóstico de MON 88913, está dentro de la capacidad ordinaria de la materia. Un amplicón diagnóstico comprende una molécula de ADN homóloga o complementaria a al menos un ADN de unión transgén/genómico (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) o porción sustancial del mismo.

Un análisis para la muestra de tejido vegetal del evento MON 88913 ha de incluir un control de tejido positivo del evento MON 88913, un control negativo de una planta de algodón que no sea un evento MON 88913, y un control negativo que no contenga ADN genómico de algodón. Las secuencias de cebadores adicionales pueden seleccionarse entre la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 por los expertos en la materia de los procedimientos de amplificación de ADN, y las condiciones seleccionadas para la producción de un amplicón por los procedimientos mostrados en la Tabla 2 y en la Tabla 3 pueden diferir, pero dan como resultado un amplicón diagnóstico del evento MON 88913. Las secuencias de cebadores de ADN con modificaciones en los procedimientos de la Tabla 2 y 3 pueden utilizarse. El amplicón producido por al menos una secuencia de cebadores de ADN derivada de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que es diagnóstico de MON 88913 puede utilizarse.

Los kits de detección de ADN que contienen al menos un cebador de ADN derivado de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que cuando se utiliza en un procedimiento de amplificación de ADN produce un amplicón diagnóstico para MON 88913 pueden utilizarse. Se puede utilizar el amplicón producido por al menos una secuencia de cebadores derivada de cualquiera de los elementos genéticos de pMON51915 que es diagnóstico de MON 88913. Puede obtenerse una planta o semilla de algodón, en la que su genoma producirá un amplicón que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 cuando se ensaya en un procedimiento de amplificación de ADN. El ensayo para el amplicón de MON 88913 puede realizarse utilizando un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador

Eppendorf Mastercycler Gradient como se muestra en la Tabla 3, o mediante los procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la materia.

Tabla 2. Procedimiento de PCR y condiciones de mezcla de reacción para la identificación de la región de unión de inserción/genómica del transgén 5ʹ de MON 88913.

Tabla 3. Parámetros de PCR sugeridos para diferentes termocicladores.

Etapa

Reactivo Cantidad Comentarios

1

agua exenta de nucleasa añadir hasta un volumen final de 20 µl -

2

10X tampón de reacción (con MgCI2) 2,0 µl 1X concentración final de tampón, 1,5 mM de concentración final de MgCI2

3

10 mM de solución de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP 0,4 µl 200 µM de concentración final de cada dNTP

4

Cebador del evento (SEQ ID NO: 14 (resuspendido 1X en tampón TE o agua exenta de nucleasa a una concentración de 10 µM 0,4 µl 0,2 µM de concentración final

5

Cebador del evento (SEQ ID NO: 15 (resuspendido 1X en tampón TE o agua exenta de nucleasa a una concentración de 10 µM 0,4 µl 0,2 µM de concentración final

6

RNasa, libre de NDasa (500 ng/µl) 0,1 µl 50 ng/reacción

7

ADN polimerasa REDTaq (1 unidad/µl) 1,0 µl (recomendado para cambiar pipetas antes de la siguiente etapa) 1 unidad/reacción

8

ADN extraído (molde) • Muestras a analizar *hojas individuales *hojas agrupadas (máximo de 50 hojas/grupo) • Control negativo • Control negativo • Control positivo • 10-200 ng de ADN genómico • 200 ng de ADN genómico • 50 ng de ADN genómico de algodón (sin MON 88913) • Sin ADN molde • 50 ng de ADN genómico MON 88913

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Mezclar suavemente y añadir 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción

Continuar con la amplificación de ADN en un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient utilizando los siguientes parámetros de ciclación. El MJ Engine o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient debe funcionar en el modo calculado. Hacer funcionar el termociclador Perkin

10 Elmer 9700 con la velocidad de rampa fijada al máximo.

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Ejemplo 6

Los procedimientos utilizados para identificar la progenie de algodón heterocigoto a homocigoto que contiene el evento MON 88913 se describen en un ensayo de zigosidad para el que los ejemplos de las condiciones se describen en la Tabla 4 y en la Tabla 5. Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo de zigosidad son el cebador

5 SQ1099 (SEQ ID NO: 21), SQ1100 (SEQ ID NO: 22), SQ1353 (SEQ ID NO: 23), cebador marcado 6FAM™ (SEQ ID NO: 24), y cebador marcado VIC™ (SEQ ID NO: 25), 6FAM y VIC son productos de colorante fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) fijados al cebador de ADN.

Las SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 cuando se utilizan en estos procedimientos de reacción producen un amplicón de ADN para el algodón no transgénico, dos amplicones de ADN para el algodón heterocigoto 10 que contiene el evento MON 88913, y un amplicón de ADN para el algodón homocigoto de MON 88913 que es distinto de cualquier otro algodón no MON 88913. Los controles para este análisis han de incluir un control positivo del algodón homocigoto y heterocigoto que contiene el ADN del evento MON 88913, un control negativo de algodón no transgénico, y un control negativo que no contiene ningún ADN molde. Este ensayo se optimiza para su uso con un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient. Otros

15 procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la materia que producen amplicones que identifican la zigosidad de la progenie de los cruzamientos realizados con plantas de algodón MON 88913 están dentro de la capacidad de la materia.

Tabla 4. Soluciones de reacción del ensayo de zigosidad

Etapa

Reactivo Cantidad Comentarios

1

agua exenta de nucleasa añadir hasta un volumen final de 10 µl -

2

2X mezcla maestra universal (Applied Biosystems cat. n.º 4304437) 5 µl 1X concentración final

3

Cebadores SQ1099, SQ1100, SQ1353 (resuspendidos en agua exenta de nucleasa a una concentración de 20 µM) 0,5 µl 0,25 µM de concentración final

4

Cebador 6FAM™ (resuspendido en agua exenta de nucleasa a una concentración de 10 µM) 0,2 µl 0,4 µM de concentración final

5

Cebador VIC™ (resuspendido en agua exenta de nucleasa a una concentración de 10 µM) 0,2 µl 0,15 µM de concentración final

6

ADN polimerasa REDTaq (1 unidad/µl) 1,0 µl (recomendado para cambiar pipetas antes de la siguiente etapa) 1 unidad/reacción

7

ADN extraído (molde) • Muestras a analizar (hojas individuales) • Control negativo • Control negativo • Control positivo 3,0 µl • 4-80 ng de ADN genómico • 4 ng de ADN genómico de algodón no transgénico • Sin ADN molde (solución en la que se volvió a suspender el ADN) • 4 ng de ADN genómico de algodón heterocigoto del evento MON 88913 conocido diluido en agua

• Control positivo

• 4 ng de ADN genómico de algodón homocigoto del evento MON 88913 conocido

8

Mezclar suavemente, añadir 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción

20 Continuar con la amplificación de ADN en un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient utilizando los siguientes parámetros de ciclación. Cuando se hace funcionar la PCR en Eppendorf Mastercycler Gradient o MJ Engine, el termociclador ha de funcionar en el modo calculado. Cuando se hace funcionar la PCR en Perkin-Elmer 9700, hacer funcionar el termociclador con la velocidad de rampa

fijada al máximo.

Tabla 5. Condiciones del termociclador del ensayo de zigosidad

Ciclo n.º

Ajustes: Stratagene Robocycler

1

94 ºC 3 minutos

38

94 ºC 1 minuto 60 ºC 1 minuto 72 ºC 1 minuto y 30 segundos

1

72 ºC 10 minutos

Ciclo n.º

Ajustes: MJ Engine o Perkin-Elmer 9700

1

94 ºC 3 minutos

38

94 ºC 30 segundos 60 ºC 30 segundos 72 ºC 1 minuto y 30 segundos

1

72 ºC 10 minutos

Ciclo n.º

Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient

1

94 ºC 3 minutos

38

94 ºC 15 segundos 60 ºC 15 segundos 72 ºC 1 minuto y 30 segundos

1

72 ºC 10 minutos

Ejemplo 7

5 El análisis de las muestras de ADN de algodón genómico se llevó a cabo utilizando un procedimiento de valoración Taqman®. La producción de amplicones diagnóstico de ADN genómico de MON 88913 se produjo utilizando un conjunto de cebadores A que incluía los cebadores del evento: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, y sonda 6-FAM SEQ ID NO: 24; y un conjunto de cebadores B que incluía los cebadores del evento: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, y sonda 6-FAM SEQ ID NO: 28. El procedimiento utiliza un formato de 96 pocillos o 384 pocillos y un sistema por

10 PCR Applied Biosystems GeneAmp 9700 o MJ Research DNA Engine PT-225. El ADN extraído de las muestras de tejido de algodón, como se ha descrito previamente, debe estar dentro del intervalo de 5-10 ng por reacción de PCR. Cada reacción contiene un volumen final de 10 μl que consiste en 0,5 μl de concentración idéntica de los cebadores del evento (20 μM), 5,0 μl de 2X mezcla maestra universal, 0,2 μl de la sonda 6-FAM (10 μM), 3 μl de la muestra de ADN (5-10 ng) y agua a 10 μl. Los parámetros del ciclador térmico son 1 ciclo a 50 ºC durante 2 minutos, 1 ciclo a

15 95 ºC durante 10 minutos, 10 ciclos a 95 ºC durante 15 segundos, 64 ºC durante 1 minuto después -1 ºC/ciclo, 30 ciclos a 95 ºC durante 15 segundos, 54 ºC durante 1 minuto, después se mantiene a 10 ºC. La producción de amplicón se determinó mediante un lector de microplacas, por ejemplo, un TECAN Safire (Durham, NC) utilizando las condiciones descritas por el fabricante. Se utilizó un programa de análisis de datos (TaqPro™) para puntuar la producción del amplicón etiquetado. Otro equipo y procedimientos de análisis conocidos en la materia de detección

20 de ADN pueden utilizarse para detectar los amplicones que se han descrito previamente.

Se ha hecho un depósito de semillas de algodón MON 88913 de Monsanto Technology LLC, desvelado previamente y mencionado en las reivindicaciones, conforme al Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (CACT), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso ante CACT es PTA-4854. El depósito se mantendrá en el depositario durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la última petición, o

25 durante la vida efectiva de la patente, optando siempre por el periodo más extenso, y se reemplazará según sea necesario durante ese periodo.

Claims (1)

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