KR20030081333A - 변형된 백시니아 앙카라 바이러스 변형체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변형된 백시니아 앙카라 바이러스로부터 유래되고, 인간 세포주 속에 재생산적으로 복제되는 능력이 상실되는 것을 특징으로 하는 독성 약독화된 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 상기 바이러스로부터 유래되는 재조합 바이러스 혹은 그의 재조합물을 의약품 혹은 백신으로 사용하는 것에 대해서도 기술한다. 또한, 면역부전 환자, 백신 바이러스에 대한 면역성 예후를 나타내는 환자 혹은 항바이러스 치료를 받고있는 환자 등에서도 면역반응을 유도하기 위한 방법도 발표한다.

Description

변형된 백시니아 앙카라 바이러스 변형체 {MODIFIED VACCINIA ANKARA VIRUS VARIANT}
변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스는 폭스바이라이데(Poxviridae)과 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus)속의 성분인 백시니아 바이러스에 관련된다. MVA 는 백시니아 바이러스의 앙카라 균주의 닭의 태아 섬유아세포(CVA) 상에서 516개의 연속경로에 의해 생성되었다. (Mayr, A., etal. Infection 3, 6-14 [1975] 참조) 이 장거리 경로의 결과로서 나온 MVA 바이러스는 약 31킬로바이스의 게놈서열을 소거했으며 따라서, 고숙주세포로 조류(avian) 세포에 한정되는 것으로 기술되었다 (Meyer, H.et al.,J.Gen.Virol. 72, 1031-1038 [1991]). 각종 동물모델에서 결과물 MVA 는 크게 독성이 없는 것으로 공지되었다 (Mayr, A.& Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:225-34). 또한, 이 MVA 균주는 인체 천연두에 대한 면역 백신으로서 임상실험에서 검사되었다.(MAYERet al.,Zbl.Bakt.Hyg.I, Abt. Org.B 167, 375-390 [1987], Stickletal., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]) 이 연구에는 위험도가 큰 환자를 포함 120,000명이 동원되었으며, 백시니아계 백신과 비교했을 때 MVA는 독성 혹은 감염성을 감소시키면서도 우수한 면역원성을 유지한 것으로 증명되었다.
그 뒤 수십년간 MVA는 재조합 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 혹은 혹은 재조합 백신으로 사용하기 위해 가공처리 해왔다. (Sutter, G.et al.[1994], 백신 12:1032-40)
이러한 측면에서, Mayr 등은 1970년대에 MVA가 인간 및 포유류에서 크게 희박해지고 독성이 약독화되었음을 발표하였음에도 불구하고, 일부 관찰 보고에 따르면 (Blanchardet al.,1998, J Gen Virol 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1977, Virology 238, 198-211; Altenberger, US Patent 5,185,146; Ambrosiniet al.,1999, J Neurosci Res 55(5), 569), MVA는 잔류 복제가 이들 세포에서 발생하기도 하므로 포유류 및 인간의 세포주 내에서 완전히 약독화되지 않는 것으로 입증되었다. 상기 논문들은 다양한 MVA 균주에 대해 얻은 결과이며 사용된 바이러스들은 본래 특히 다양한 세포주 내에서의 성장반응 측면에서 그들의 성질이 상이한 것들이다.
성장 형태는 바이러스 약독화를 가리키는 표시자로 알려져있다. 일반적으로,바이러스 균주는 능력을 잃거나 숙주세포 내에서 재생산적으로 복제되는 능력만 감소되었어도 약독화된 것으로 본다. 상술한 관찰결과, MVA는 인간 및 포유류의 세포 내에서 전혀 복제되지 않는 것은 아니므로 인간 백신 혹은 재조합 백신용 벡터로서 MVA의 절대 안전성에 대해 의문이 제기된다.
특히, 백신 및 재조합 백신에 있어서 백신 벡터 바이러스의 효능과 안전성 간의 균형이 절대적으로 중요하다.
본 발명은 변형된 백시니아 앙카라 바이러스로부터 유래된 인간 세포주 속에 재생산적으로 복제되는 능력이 상실되는 것을 특징으로 하는 약독화(attenuated) 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 상기 바이러스로부터 유래되는 재조합 바이러스 혹은 그의 재조합물을 의약품 혹은 백신으로 사용하는 것에 대해서도 기술한다. 또한, 심지어는 면역부전(immuno-compromised) 환자, 백신 바이러스에 대한 면역성예후(pre-existing immunity)를 나타내는 환자 혹은 항바이러스 치료를 받고있는 환자 등에서도 면역반응을 유도하기 위한 방법도 제공한다.
도 1은 상이한 세포주 내의 상이한 MVA 균주의 성장 속도를 도시한다.
(A)는 결과를 시험된 MVA 균주에 따라 그룹화 하고 (B)에서는 결과를 시험 세포주에 따라 그룹화한다. (B) 배양 4일후(D4)의 세포주로부터 회수된 바이러스의 양은 플라크 분석으로 측정했고 이를 1일(D1)의 초기 접종원에 대한 4일후 회수된 바이러스의 비로서 표현하였다.
도 2는 MVA-BN 혹은 MVA 575로 백신접종한 뒤의 백시니아의 치사 챌린지에 대한 예방능을 도시한다. 이 예방능은 표준 플라크 분석에 의해 4일후 챌린지에서 결정된 난소 역가의 감소로 측정한다.
도 3은 CTL 유도 및 여러 프라임-부스트 처방을 이용한 인플루엔자 챌린지에 대한 예방능을 도시한다.
3A: 뮤린 폴리토프를 엔코딩하는 DNA 혹은 MVA-BN 백신의 여러 조합물로 백신접종한 뒤의 4개의 상이한 H-2d제한 에피토프에 대한 CTL 반응의 유도를 도시한다. BALB/c 생쥐 (5마리/군)를 DNA (근육내) 혹은 MVA-BN (피하)로 백신접종하고 3주후 부스터 면역화 하였다. 백신에 의해 엔코드된 4개의 상이한 에피토프에 대한 CTL 반응 (TYQRTRALV, 인플루엔자; SYIPSAEKI,P. Berghei; YPHFMPTNL, 사이토메갈로바이러스; RPQASGVYM, LCV)을 부스터 면역화 2주후에 ELISPOT 분석으로 측정했다.
3B: 뮤린 폴리토프를 엔코딩하는 DNA 혹은 MVA-BN 백신의 여러 조합물로 백신접종한 뒤의 4개의 상이한 에피토프에 대한 CTL 반응의 유도를 도시한다. BALB/c 생쥐 (5마리/군)를 DNA (근육내) 혹은 MVA-BN (피하)로 백신접종하고 3주후 부스터 면역화 하였다. 백신에 의해 엔코드된 4개의 상이한 에피토프에 대한 CTL 반응 (TYQRTRALV, 인플루엔자; SYIPSAEKI,P. Berghei; YPHFMPTNL, 사이토메갈로바이러스; RPQASGVYM, LCV)을 부스터 면역화 2주후에 ELISPOT 분석으로 측정했다.
3C: 피하투여한 최적 투약량 (1 x 108TCID50)의 재조합 MVA-BN 을 이용한 상동성 프라임 부스트 후 펩티드 및 MVA 특이적 T 셀의 빈도수를 도시한다. 각각 8마리 생쥐로 이루어진 그룹을 도면에서 나타낸 바와 같이 조합물로 2회 백신접종하였다. 최종 백신접종한 뒤 2주후, 펩티드 특이적 스플레노사이트(splenocyte)의 수를 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 측정했다. 막대는 특이적 스폿수의 평균치 +/- 평균치로부터의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 MVA-BN nef 혹은 MVA-BN 으로 백신접종된 원숭이의 SIV 로드(load)를 도시한다.
도 5는 SIV 감염 후 백신접종된 원숭이의 생존율을 도시한다.
도 6은 MVA-BA에 대한 원숭이 혈청 항체 역가를 도시한다. 각 동물의 항체 역가는 상이한 형상을 가지는 것으로 나타나며 평균 역가는 1개의 실선 직삼각형으로 도시된다.
도 7은 tat를 엔코딩하는 MVA-BN으로 백신접종한 뒤 면역-부전성 원숭이의 SIV 레벨 (CD4 < 400ml 혈액)을 도시한다. 원숭이는 앞서서 MVA-BN 혹은 MVA-BN nef로 3차례 (0주, 8주, 16주) 백신접종했고 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었다 (22주). 100주, 102주 및 106주 (화살표로 표시됨)에 원숭이들은 MVA-BN tat 으로 백신접종되었다.
도 8은 항-레트로바이러스 치료 및 MVA-BN 을 이용한 치료적 백신접종을 받은 원숭이의 SIV 레벨을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들 (n=6)이 SIV로 감염되었고 매일 PMPA (검정색 선)으로 치료했다. 10주 및 16주째에 동물들을 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다 (화살표 참조).
도 9는 감염 및 재조합 MVA로 백신접종 뒤 SIV 에 대하여 일어난 체액성 반응을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들 (n=6)이 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었고 (0주) 그 뒤 이들을 항-레트로바이러스 치료했다 (PMPA; 굵은 선으로 표시됨). 10주 및 16주째에 원숭이를 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다. 표준 ELISA에서 항원으로 감염된 T세포 라이세이트를 이용하여 SIV에 대한 항체를 측정했다.
도 10은 항-레트로바이러스 치료를 받는 SIV 감염된 원숭이에서 MVA 에 대하여 일어난 체액성 반응을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들 (n=6)이 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었고 (0주) 그 뒤 이들을 항-레트로바이러스 치료했다 (PMPA; 굵은 선으로 표시됨). 10주 및 16주째에 원숭이를 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다. MVA 에 대한 표준 캡쳐 ELISA를 이용하여 MVA 에 대한 항체를 측정했다.
도 11은 여러 천연두 백신으로 생쥐를 백신접종한 뒤 MVA에 대한 항체의 유도를 도시한다. MVA-BN 으로 백신접종 (0주 및 4주)한 뒤 MVA 에 대해 일어난 항체의 레벨는 테일 난절법(tail scarification)을 이용하거나 (0주), 프리-Elstree 백신으로 제공된 MVA-BN 및 MVA 572를 이용하여 얻은 종래의 백시니아 균주, Elstree 및 Wyeth 와 비교했다. MVA 572는 유럽 동물세포 기탁기관에 ECACC V94012707로 기탁되었다. 역가는 캡쳐 ELISA를 이용하여 결정했고 그래프의 선형부를 이용하여 선형회귀법으로 계산하고 흡광도 0.3인 희석으로 정의하였다. (*MVA-BN : MVA-BN 은 MVA 572 : MVA 572 와 크게 다르다 (p > 0.05).
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 백신 혹은 약제물 같은 안전한 제품의 개발을 위해 안전성이 개선된 신규의 바이러스 균주를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또다른 목적은 기존의 백신처방을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면 비-인간 세포 및 세포주 특히 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 햄스터 베이비의 신장 세포주 BHK (ECACC 85011433) 내에서의 재생산적 복제가 가능하나 인간의 세포주 내에서는 불가능한 새로운 백시니아 바이러스가 제공된다.
공지의 백시니아 균주는 적어도 인간 세포주 일부 특히, 각질 세포주 HaCat_ 내에서 재생산 복제된다. (Boukampet al., 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71). 세포주 HaCat 내의 복제는 in vivo 복제 특히 인간에게서의 in vivo 복제의 전조가 된다. 실질적으로, 실시예에서는 HaCat 내의 잔류형 생성 복제를 보여주는 모든 공지의 백시니아 균주 역시 in vivo 복제함을 증명한다. 따라서, 본 발명은 바람직하게 인간 세포주 HaCat 내에서 재생산적 복제되지 않는 백시니아 바이러스에 관한것이다. 더 바람직하게, 본 발명은 다음의 인간 세포주의 어느 것에서도 재생산적 복제가 불가능한 백시니아 바이러스 균주에 관계한다; 인간 자궁경부 아데노칼시노마 세포주 HeLa (ATCC No. CCL-2), 인간 태아 신장 세포주 293 (ECACC No. 85120602), 인간 골육종 세포주 143B (ECACC No. 91112502) 및 세포주 HaCat 등.
세포의 성장 형태 혹은 증식/복제는 통상으로 감염된 세포에서 생성된 바이러스(아웃풋) 대 첫번재 장소에 있는 세포 감염에 최초에 사용된 양(인풋)의 비율("증폭비")로 표현된다. 아웃풋과 인풋의 비 "1" 은 감염세포로부터 생성된 바이러스의 양이 세포 감염에 초기 사용된 양과 동일한 증폭상태를 규정한다. 이 상태는 감염세포가 바이러스 감염 및 바이러스 재생산을 허용한다는 사실을 시사하는 것이다.
1 미만의 증폭비 즉, 인풋 레벨 이하의 증폭감소는 재생산적 복제가 결핍됨을 따라서 바이러스 약독화를 가리키는 표시자이다. 따라서, 인간의 여러 세포주 특히 세포주 143B, HeLa, 293 및 HaCat 전체에서 1 미만의 증폭비를 나타내는 균주를 확인 및 최종으로 분리하는 것이 특별히 요구되었다.
따라서, "재생산적 복제 불가능"이라는 문장은 본 발명에 따른 바이러스가 본 명세서의 실시예 1에서 개략적으로 설명한 일부 특이 MVA 균주에 관련한 조건하에서 세포주 293(ECACC No. 85120602), 143B(ECACC No. 91112502), HeLa(ATCC No. CCL-2) 및 HaCat 등의 인간 세포주(Boukampet al.1988, J Cell Biol 106(3): 761-71)에서 1 미만의 증폭비를 나타낸다는 사실을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 바이러스의 증폭비는 상술한 인간 세포주 HeLa, HaCat 및 143B 각각에서0.8 혹은 그 이하이다. 실시예 1 및 표 1에서는 본 발명에 따른 바이러스가 세포주 143B, HeLa 및 HaCat 중의 어느 것에서 재생산적으로 복제되지 않음을 상세히 보여준다. 실시예에서 사용된 본 발명에 따른 특별한 균주는 기탁번호 V00093008 로서 유럽미생물 기탁기관에 기탁되었다. 이 균주를 본 명세서에서는 "MVA-BN" 이라고 한다. 공지의 MVA 균주는 시험된(도 1, 실시예 1) 적어도 하나의 인간 세포주 내에서 잔류 복제를 보여준다. 모든 공지의 백시니아 균주는 세포주 HaCat 내에서 적어도 일부의 복제를 보여주나, 본 발명에 따른 MVA 균주 특히, MVA-BN은 HaCat 세포 내에서 재생산적으로 복제하지 않는다. 더 상세히는, MVA-BN은 인간의 태아 신장 세포주 293 (ECACC No. 85120602) 내에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 보여준다. 인간의 골육종 세포주 143B (ECACC No. 91112502)에서, 상기 비는 0.0 내지 0.6의 범위이다. 인간의 자궁경부 아데노칼시노마 세포주 HeLa (ATCC No. CCL-2) 및 각질세포주 HaCat (Boukampet al.1988, J Cell Biol 106(3):761-71)에 있어서, 상기 증폭비는 각각 0.04 내지 0.8 및 0.02 내지 0.8의 범위이다. MVA-BN은 아프리칸 그린 멍키의 신장세포 내에서 0.01 내지 0.06의 증폭비를 갖는다 (CV1: ATCC No. CCL-70). 따라서, 본 발명에 따른 프로토타입 균주인 MVA-BN 는 시험된 인간 세포주의 어디에서도 재생산적 복제가 되지 않는다.
MVA-BN 의 증폭비는 닭의 태아 섬유아세포(CEF: 1차 배양물) 혹은 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK (ATCC No. CRL-1632)에서 1을 초과한다. 상술한 바와 같이, "1" 초과의 증폭비는 감염세포로부터 생성된 바이러스양이 세포 감염에 사용된 바이러스의 양보다 증가한 것이므로 재생산적 복제임을 가리킨다. 따라서, 바이러스는 CEF 1차 배양물 내에서 500 초과의 증폭비 혹은 BHK 세포 내에서 50 초과의 증폭비로 쉽게 번식 및 증폭될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 ECACC V0083008 로 기탁된 바이러스의 유도체에 관한 것이다. ECACC V0083008 로 기탁된 바이러스의 "유도체"란 본질적으로, 기탁된 균주와 같은 복제 특성을 나타내는 반면 그것의 게놈의 일부 혹은 여러 부분이 차이점을 나타내는 바이러스를 말한다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제특성"을 갖는 바이러스는 CEF 세포 내의 기탁 균주 및 세포주 BHK, HeLa, HaCat 및 143B 보다도 더 유사한 증폭비로서 복제되고 또한 AGR129형 형질전환 생쥐 내에서 측정된 것과 유사한 in vivo 복제를 보여주는 바이러스이다. (하기 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 백시니아 바이러스 균주 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 in vivo 복제의 실패가 특징이다. 본 명세서에서 "in vivo 복제의 실패" 란 인간 및 하기 기술되는 생쥐 모델에서 복제되지 않는 바이러스를 말한다. "in vivo 복제 실패"는 바람직하게는 성숙 B 및 T 세포를 생성할 수 없는 생쥐에게서 결정할 수 있다. 이러한 생쥐의 예는 형질전환 생쥐 모델 AGR129 (Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Switzerland 에서 구할 수 있음). 이 생쥐 균주는 IFN 수용체 I형 (IFN-α/β) 및 II형 (IFN-γ) 유전자 및RAG에서 유전자 타겟된 파괴를 갖는다. 이러한 파괴 때문에, 생쥐는 IFN 체계를 갖지 않고, 성숙 B 및 T세포를 생성할 수 없으며 또한 면역상의 심각한 타격을 입고 복제 바이러스의 영향을 받기 쉽다. AGR129 생쥐 대신, 성숙 B 및 T세포를 생성할 수 없고 또한 면역상의 심각한 타격을 입고 복제 바이러스의 영향을 받기 쉬운기타 다른 생쥐 균주를 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이러스는 생쥐에 107pfu 바이러스를 복강투여하여 감염시킨 후 적어도 45일의 시간 내에, 바람직하게는 적어도 60일, 가장 바람직하게는 90일 이내에 AGR129를 죽이지 않는다. 바람직하게, "in vivo 복제 실패"를 나타내는 바이러스는 생쥐에 107pfu 바이러스를 복강투여하여 감염시킨 후 45일, 바람직하게는 60일, 가장 바람직하게는 90일째에 ARG129 생쥐의 기관 혹은 조직으로부터 바이러스를 회수할 수 없는 것이 특징이다. AGR129 생쥐에 관한 감염 분석 및 바이러스가 감염 생쥐의 기관 및 조직으로부터 회수되는지 판단하는데 이용하는 분석법에 관한 상세한 내용은 실시예 부문에서 소개한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스 균주 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 치사량 챌린지 생쥐 모델에서 측정된 바와 같이 공지의 MVA 575에 비교하여 더 큰 면역원성을 특징으로 한다. 이 실험의 세부내용은 하기의 실시예 2에서 기술하였다. 요약하면, 백신접종(vaccination)되지 않은 생쥐 모델은 웨스턴 리저브 균주 L929 TK+ 혹은 IHD-J 같은 복제 능력을 가진 백시니아 바이러스로 감염된 후 죽는다. 복제능 백시니아 바이러스로 감염시키는 것을 상기 치사량 챌린지 모델에 관한 설명에서 "챌린지"라고 한다. 챌린지 4일후, 생쥐는 보통 죽게되며 난소 내의 바이러스 역가는 VERO 세포를 이용하는 표준 플라크 분석 (상세 내용은 실시예 부문을 참조)에 의해 결정된다. 바이러스 역가는 백신접종되지 않은 생쥐 및 본 발명에 따른 백시니아 바이러스로 백신접종된 생쥐에 대해 측정한다.더 구체적으로, 본 발명에 따른 바이러스는 이 시험에서 본 발명에 따른 102TCID50/ml 바이러스로 백신접종한 후의 난소 바이러스 역가가, 백신접종되지 않은 생쥐와 비교하여 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90% 감소하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 백신의 프라임(prime)/부스트(boost) 투여로 면역화 반응할 때 유용하다. MVA를 전달 백터로 사용하는 프라임/부스트 처방은 낮은 면역반응을 유도하며 DNA-프라임 MVA-부스트 처방보다 열등하다 (Schneideret al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402). 이들 모든 연구에서, 사용되어온 MVA 균주는 본 발명에 따른 백시니아 바이러스와는 다르다. 위의 낮은 면역반응을 설명하면, MVA 를 프라임 및 부스트 투여에 사용했을 경우 프라임-투여 과정에서 MVA에 발생한 항체는 2차 면역화 과정에서 제공된 MVA를 중화시키고 이에 따라, 면역 반응의 효과적 부스트가 방해되기 때문이다. 이와 대조적으로, DNA-프라임/MVA-부스트 처방은 고강도 반응을 일으키는데 탁월하며, 이는 상기 처방이 면역 반응을 효과적으로 프라임(prime) DNA의 능력과 또한 MVA에 대한 기존의 면역성이 결핍된 상태에서 상기 면역 반응을 촉진(boost)하는 MVA의 성질이 조합되기 때문이다. 분명히, MVA 및/또는 백시니아에 대한 면역성 예후는 면역 반응의 촉진을 방해하며 따라서 백신으로 혹은 치료제로서 MVA를 사용하는 것은 특히 천연두 예방접종을 한 개인에 있어서 효능을 제한하였을 것이다. 그러나, 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스 특히 MVA-BN 및 그의 유도체 또한 이에 상응하는 헤테로성 서열을 갖는 재조합 바이러스는 처리하지 않은 동물들 및 폭스 바이러스에 대한 면역성 예후를 갖는 동물들에 있어서 1차로 프라임을 효과적으로 수행하고 다음 면역반응을 촉진한다. 그러므로, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
만일, 다음의 두가지 분석법 ( "분석 1" 및 "분석 2") 중 어느 하나, 바람직하게는 양쪽 분석 모두에서 측정했을 때 CTL 반응이 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일하다면, 백시니아 바이러스는 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도하는 것으로 판단된다. 더 바람직하게는, DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스터 투여 후의 CTL 반응이 상기 분석 중 적어도 하나에서 더 높다. 가장 바람직하게는, CTL 반응이 다음 분석의 양쪽에서 더 높다.
분석 1:백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여에 있어서, 6-8주 BALB/c (H-2d) 생쥐는 톰슨 등 (1988, J. Immunol. 160, 1717)이 기술한 바와 같은 뮤린(murine) 폴리토프를 발현하는 본 발명에 따른 107TCID50백시니아바이러스로 정맥투여하여 프라임-면역화하고 또한 동일량의 역시 동일한 바이러스로 부스트-면역화하고, 동일한 방식으로 3주 후에 투여한다. 이 과정이 끝나기 위해서는 상기 폴리토프를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 설계해야 한다. 상기 재조합 바이러스의 설계 방법은 당해 분야에서 공지된 바와 같으며 다음과 같이 상세 기술한다. DNA 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서, 프라임 백신접종은 생쥐에게 백시니아 바이러스와 동등한 항원을 표현하는 50㎍ DNA 를 근육내 주사하여실행하고; 백시니아 바이러스를 이용한 부스트 투여는 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여와 똑같은 방법으로 실행한다. 폴리토프를 발현하는 DNA 플라스미드 역시 톰슨 등의 공보에 기술되어 있다. 양쪽 처방에서, 에피토프 SYIPSAEKI, RPQASGVYM 및/또는 YPHFMPTNL에 대한 CTL 반응의 전개는 부스트 투여 뒤 2주 후에 결정한다. CTL 반응의 결정은 바람직하게는 Schneider 등(1998, Nat. Med. 4,397-402)이 설명하고 본 발명에 따른 하나의 특이적 바이러스에 대한 하기의 실시예 부문에서 개시된 ELISPOT 분석법을 이용하여 실행한다. 본 발명에 따른 바이러스는 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여에 의해 유도되는 상술한 에피토프에 대한 CTL 면역 반응이 실질적으로 또한 바람직하게, IFNγ 생성 세포의 수/106비장세포로 평가되는 바와 같이 DNA 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여에 의해 유도되는 것과 동일하다 (실시예 부문 참조).
분석 2: 이 분석은 기본적으로 분석 1에 상응한다. 그러나, 분석 1에서와 같이 정맥투여된 107TCID50백시니아 바이러스를 사용하는 대신에 본 분석에서는 본발명에 따른 108TCID50백시니아 바이러스를 프라임 면역화 및 부스트 면역화 용도로 피하투여한다. 본 발명에 따른 바이러스는 이 실험에서, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여에 의해 유도되는 상술한 에피토프에 대한 CTL 면역 반응이 실질적으로 또한 바람직하게, IFNγ 생성 세포의 수/106비장세포로 평가되는 바와 같이 DNA 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여에 의해 유도되는 것과 동일하다.
상기에서 보여준 양쪽 분석 중 하나에서 측정된 CTL 반응의 강도는 예방레벨에 상응한다.
따라서, 본 발명에 따른 바이러스는 특히 접종 목적에 적합하다.
요약하면, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 다음의 특성들 중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 한다:
(i) 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
(ii) in vivo 복제가 불가하고;
(iii) 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575 (ECACC V00120707)와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
(iv) DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 적어도 상술한 특성 중 2가지 더 바람직하게는 적어도 3가지를 가진다. 상술한 특성을 모두 가지는 백시니아 바이러스가 가장 바람직하다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 제1 유리병/용기 내에서 1차 접종 ("프라이밍 ") 및 제2 유리병/용기 내에서 2차 접종 ("부스팅")을 위한 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 키트에 관한 것이다. 이 바이러스는 비-재조합 백시니아 바이러스 즉, 헤테로성 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는 백시니아 바이러스일 수 있다. 이러한 백시니아 바이러스의 예로는 MVA-BN 및 그의 유도체이다. 별도로, 이 바이러스는 백시니아 바이러스에 대해 헤테로성인 또다른 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 백시니아 바이러스일 수도 있다. 본 명세서의 다른 부문에서 개시한 바와 같이, 헤테로성 서열은 면역계에 의해 반응을 유도하는 에피토프를 코딩할 수 있다. 따라서, 상기 에피토프를 포함하는 단백질 혹은 물질에 대해 백신접종하기 위하여 재조합 백시니아 바이러스를 사용할 수 있다. 바이러스는 다음의 상세한 기술과 같이 제형화 될 수 있다. 각 백신접종에 사용되는 바이러스의 양은 상기에서 정의된 바와 같다.
당해 분야의 지식을 가진 경우라면 다음의 특성중 적어도 하나를 가진 백시니아 바이러스를 수득하는 방법을 알 수 있다:
- 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
- in vivo 복제가 불가하고;
- 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
- DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
이러한 바이러스를 수득하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(i) 공지된 백시니아 바이러스 균주, 바람직하게는 MVA 574 나 575 (ECACC V00120707)를 바이러스가 재생산적으로 복제될 수 있는 인간을 제외한 세포에 도입하고 이때의 세포는 바람직하게는 CEF 세포 및 세포주 BHK 로부터 선택되는 단계;
(ii) 이들 세포로부터 바이러스 입자를 분리/농축하는 단계; 및
(iii) 수득된 바이러스가 상술한 생물학적 성질 중 적어도 하나를 갖는지를 분석하는 단계를 포함하고,
상기 단계들은 필요시 원하는 복제 특성을 갖는 바이러스가 수득될 때까지 반복될 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 이 방법에 의해 수득되는 바이러스에도 관계한다. 원하는 생물학적 특성을 결정하는 방법은 본 명세서의 다른 부문에서 기술한다.
이 방법을 적용함에 있어서, 본 발명자들은 MVA 분리물 경로 575 (MVA 575)로부터 출발하여 수회 반복하여 클론 정제함으로써 본 발명에 따른 균주를 확인 분리하였다. 상기 신규한 균주는 상술한 바와 같이 수탁번호 ECACC V0083008 의 균주에 상응한다.
본 발명에 따른 백시니아 바이러스의 성장 형태 특히, MVA-BN 의 성장 형태는 본 발명에 따른 균주가 인간 세포주 내에서 약독화되고 in vivo 복제가 불가한 MVA 분리물로 특징화된 지금까지의 다른 것들보다 훨씬 우수하다. 본 발명에 따른 균주는 따라서 하기에서 설명하는 백신 혹은 약제물 같은 안전한 생성물의 개발에 이상적인 대상물이다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 바이러스 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 천연두 같은 인간의 폭스 바이러스 질환에 대한 백신으로 사용된다. 또다른 구체예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 재조합 가능하며 예컨대, 헤테로성 유전자 즉 항원 혹은 바이러스에 대한 헤테로성을 갖는 에피토프를 표현할 수 있고 따라서 헤테로성 항원 혹은 에피토프에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신으로 유용하다.
"면역 반응" 이란 외부 물질 혹은 미생물이 생물체 내에 들어올 때의 면역계의 반응을 말한다. 이 정의에 따르면, 면역 반응은 특이적 및 비특이적 반응으로 구분되나 이들은 서로 밀접한 관계가 있다. 비특이적 면역 반응은 광범위한 외부 물질 및 감염 작용제에 대한 즉각적인 방어이다. 특이적 면역 반응은 생물체가 최초에 외부물질에 의해 챌린지 된지 일정 기간이 지난 뒤에 생기는 방어이다.
특이적 면역 반응은 큰 효과가 있으며 특이적 감염으로부터 회복되는 개체가 대상이 이 특이적 감염으로부터 예방되는 것에 관여한다. 따라서, 이미 이 물질에 대해 "면역성 예후"가 있으므로 동일한 혹은 매우 유사한 감염 작용제에 의한 2차감염에 훨씬 약한 증세를 보이거나 혹은 전혀 증세를 야기하지 않는다. 이러한 면역성 및 면역학적 기억은 각각 장기간 또는 일생동안 존재한다. 따라서, 면역학적 기억의 유도는 백신접종에 이용될 수 있다.
"면역계" 는 외부 물질 및 미생물에 대한 생물체의 방어에 수반되는 복합기관을 의미한다. 면역계는 몇몇 세포종류 예컨대, 임파구 및 백혈구로부터 유래되는 다른 세포들을 포함하는 세포부분과 또한 소형 펩티드류 및 보체(complement) 팩터를 포함하는 체액부분을 포함한다.
"백신접종" 이란 생물체가 감염 작용제에 의해 챌린지되는 즉, 상기 감염 물질의 약독화 혹은 비활성화된 형태에서 특이적 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 백신접종은 또한 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스 특히, 바이러스에 대해 헤테로성인 항원 혹은 에피토프를 표현하는 재조합 MVA-BN 및 그의 유도체를 이용하는 생물체의 챌린지를 포함한다. 이러한 에피토프의 예는 본 명세서의 다른 부문에 나와 있으며 또한 뎅기열(Dengue) 바이러스, C형 간염 바이러스, HIV 등의 다른 바이러스에서 유래되는 단백질로부터 나온 에피토프, 종양 및 암의 발생에 관련되는 단백질로부터 유래되는 에피토프를 포함한다. 몸에 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 에피토프는 발현 및 면역계에 발현되고 프레젠트 되며 이들 에피토프에 대한 특이적 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 생물체는 재조합 백시니아 바이러스에 의해 엔코드되는 에피토프를 함유하는 물질/단백질에 대해 면역화된다.
"면역성" 은 감염 물질에 의한 선행 감염을 완전히 제거함으로써 감염 물질에 의해 유발되는 질환으로부터 생물체를 부분적 혹은 완전히 예방하는 것 혹은 그러한 특징적인 부분을 의미한다. 면역성은 면역계 내의 특정 세포들의 존재, 유도 및 활성화에 근거한다.
본 발명의 구체예에서 상기 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 특히 재조합 MVA-BN 및 그의 유도체는 적어도 하나의 헤테로성 핵산 서열을 함유한다. "헤테로성" 이란 여기에서, 사실상 통상적으로 바이러스와 밀접한 관계가 없는 핵산 서열의 조합물을 말하며 이러한 바이러스를 소위 "재조합 바이러스" 라고 한다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면 헤테로 서열은 바람직하게, 비-백시니아 공급원으로부터 선택되는 항원성 에피토프이다. 가장 바람직하게는, 상기 재조합 바이러스가 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 미코박테리아, 인플루엔자 바이러스로부터 나온 하나 이상의 항원성 에피토프; 플라비바이러스(Flaviviruse), 파라믹소바이러스(Paramyxoviruse), 간염 바이러스, 인간 면역결핍성 바이러스로부터 나온 하나 이상의 항원성 에피토프; 혹은 한타바이러스나 필로바이러스 예컨대, 에볼라나 마르버그 바이러스 같은 출혈열을 일으키는 바이러스로부터 나온 하나 이상의 항원성 에피토프 등을 표현한다.
또한 상술한 항원성 에피토프 이외에도 본 발명의 또다른 구체예에서, 헤테로성 서열은 또다른 폭스바이러스 혹은 백시니아 공급원으로부터 선택할 수 있다. 이들 바이러스 서열은 숙주 스펙트럼 혹은 바이러스의 면역원성을 변형시키는데 사용할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 치료 화합물을 표현하는 헤테로성 유전자/핵산을 코드할 수 있다. 바이러스 내의 헤테로성 핵산에 의해 엔코드되는 "치료 화합물"은 예컨대, 안티센스(antisense) 핵산 같은 치료성 핵산 혹은 원하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드나 단백질일 수 있다.
또다른 바람직한 구체예에 따르면, 헤테로성 핵산 서열의 발현은 바람직하게 그러나 비독점적으로 폭스바이러스 프로모터 더 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터의 전사적 제어를 받는다.
그 밖에도 본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 헤테로성 핵산 서열은 바람직하게 바이러스 게놈의 비필수적인 지역에 삽입된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 따르면, 헤테로성 핵산 서열은 MVA 게놈의 자연 발생적 결여 위치 (PCT/EP96/02926 에 개시된)에 삽입된다. 헤테로성 서열을 폭스바이러스 게놈에 삽입하는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다.
또다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 바이러스의 게놈, 이의 재조합물 혹은 기능부를 포함한다. 이러한 바이러스형 서열은 예컨대, PCR, 하이브리드법을 이용하거나 또는 ELISA 분석법을 실시하여 바이러스 혹은 그의 재조합물을 확인 혹은 분리하는데 사용할 수 있다. 또한, 이러한 바이러스형 서열은 엔코드된 단백질 혹은 펩티드를 생성하기 위해 발현 벡터로부터 발현될 수 있으며 따라서 발현벡터 내에 존재하는 바이러스 서열이 결핍된 바이러스의 결실 돌연변이물을 보충할 수 있다.
바이러스성 게놈의 "기능부"란 완전 게놈형 서열의 일부를 의미하며, 단백질, 단백질 도메인, 단백질의 에피토프 같은 물리적 실재물을 엔코드하는 부분이다. 바이러스형 게놈의 기능부는 또한 프로모터, 인핸서, 시스- 또는 트랜스-액팅 요소 등과 같이, 개별화 활성으로 조절요소들 또는 그런 요소의 일부를 코드화하는 완전 게놈형 서열의 일부를 말한다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스는 헤테로성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는데 사용할 수 있으며, 상기 서열은 타겟 세포에 대해 상동성 혹은 헤테로성이다. 헤테로성 핵산 서열의 타겟 세포 내의 도입은 헤테로성 펩티드 혹은 폴리펩티드를in vitro생성하고 및/또는 상기 서열에 의해 엔코드된 바이러스를 종결하는데 이용하기도 한다. 이 방법은 재조합 MVA에 의한 숙주세포의 감염, 감염된 숙주세포의 적절한 조건하의 배양, 또한 상기 숙주세포에 의해 생성된 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 분리 및/또는 농축을 포함한다.
더욱 더, 세포에 대한 상동성 혹은 헤테로성 서열의 도입 방법은in vitro및 바람직하게는in vivo치료에 적용할 수 있다.in vitro치료에서, 이미 바이러스에 의해 (ex vivo)감염된 분리 세포를 면역 반응을 유도할 살아있는 동물 체내에 투여된다.in vivo치료의 경우, 바이러스 혹은 그의 재조합물이 면역 반응 유도를 위한 살아있는 동물 체내에 직접 투여된다. 이 경우, 접종원 범위를 둘러싸는 세포들은 본 발명에 따른 바이러스 혹은 그의 재조합물에 의해 직접in vivo감염된다.
본 발명에 따른 바이러스는 인간 및 원숭이 세포에서 크게 성장 제한되므로 결국 크게 약독화되기 때문에, 인간을 포함하여 광범위한 포유류를 치료하는데 이상적이다. 따라서, 본 발명은 즉, 인간을 포함하여 살아있는 동물 체내에서 면역반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 본 발명의 바이러스는 또한 다른 유전자 치료 프로토콜에서 안전하다.
약제학적 조성물은 일반적으로, 하나 이상의 약제학적 수용가능한 및/또는 허가승인을 받은 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 보조제, 희석제 및/또는 안정화제를 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 보조물질은 물, 염산, 글리세롤, 에탄올, 습식 혹은 유화제, pH 완충물질 등이 될 수 있다. 적절한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜릴산, 폴리머릭 아미노산, 아미노산 폴리머, 지질 응집물 등과 같이 크기가 크고, 물질대사 속도가 느린 분자들이다.
백신 제조에 있어서, 본 발명에 따른 바이러스 혹은 재조합물은 생리학적으로 수용가능한 형태로 전환된다. 이것은 천연두 백신접종에 사용된 폭스바이러스 백신의 제조에서 얻은 경험에 근거하여 실행할 수 있다 (Stickl, H.et al.[1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 예를 들어, 정제된 바이러스를 약 10mM 트리스, 140mM NaCl pH7.4 내에 제형화된 역가 5x108TCID50/ml 로서 -80℃ 에서 보관한다. 백신 쇼츠(shots) 제조시, 예컨대 102-108바이러스 입자를 앰플 바람직하게는 유리앰플 1개당 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재하에서 100ml 의 인산완충염수(PBS)에서 건조시킨다. 이와 별도로, 백신 쇼츠는 제형내의 바이러스의 단계적 동결건조로 제조할 수도 있다. 이 제형은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토오스 혹은 폴리비닐 피롤리돈 같은 또다른 첨가제나 혹은 항산화제나 불활성 기체, 안정화제 혹은in vivo투여에 적절한 재조합 단백질 (예, 인간 혈청 알부민) 같은 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 그 뒤, 유리앰플을 밀봉하고 4℃ 내지 실온 범위에서 수개월간 보관할 수 있다. 그러나, 필요한 경우가 아니라면 앰플은 -20℃ 이하의 온도에서 보관하는 것이 바람직하다.
백신접종 혹은 치료시, 건조물은 0.1 내지 0.5ml의 수용액, 바람직하게는 생리학적 염수나 트리스 완충액에 용해하여 전신적 혹은 국소적으로, 즉, 비경구적, 근육내 혹은 의사들이 알고있는 기타 다른 투여경로를 통하여 투여할 수 있다. 투여 방식, 약량, 투여횟수는 당해 분야의 지식을 가진 인간들이라면 최적화 할 수 있다.
또한, 또다른 구체예에 있어서 본 발명에 따른 바이러스는 특히 면역-부전 동물들 예, SIV 감염된 원숭이 (CD4 < 400 ㎕ 혈액) 혹은 면역-부전의 인간에게서 면역 반응을 유도하는데 유용하다. "면역-부전" 이란 불완전한 면역 반응을 보이는 혹은 감염 작용제에 대한 방어 효능이 떨어지는 개인의 면역계 상태를 말한다. 또다른 관심대상인 구체예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 이들 동물 혹은 인간의 폭스바이러스에 대한 면역성 예후의 존재하에서도 면역-부전 동물 혹은 인간에게세 면역 반응을 부스트(boost;촉진)할 수 있다. 특히 관심을 끄는 것은 본 발명의 바이러스가 항-바이러스 치료 예컨대, 항-레트로바이러스 치료를 받는 동물이나 인간에서도 면역 반응을 부스트 할 수 있다는 점이다. "항-바이러스 치료" 란 예컨대, (i) 뉴클레오티드 유사물의 응용, (ii) 바이러스성 효소활성 혹은 바이러스성 집합물 형성에 대한 저해제의 응용, 혹은 (iii) 숙주의 면역 반응에 영향을 미칠 사이토킨의 응용을 포함한 바이러스 감염을 제거 혹은 억제하기 위한 치료개념을 포함한다.
그 외의 또다른 구체예에 따르면 백신은 특별히 그러나 비제한적으로, 예컨대 동물 폭스 감염에 대한 면역화 등의 가축분야에 적용할 수 있다. 작은 동물들에서 면역 접종은 바람직하게는 비경구적 혹은 비강을 통해 시행되며 반면 큰 동물들 혹은 인간의 경우 피하내, 근육내 혹은 경구 접종이 바람직하다.
본 발명자들은 이미 유효량인 단지 102TCID50(조직 배양 감염량)의 본 발명에 따른 바이러스를 함유하는 백신 쇼츠가 생쥐의 야생형 백시니아 바이러스 챌린지에 대한 완전 면역성을 유도하기에 충분함을 알아내었다. 이는 본 발명에 따른 바이러스의 약독화도가 클 경우 부정적인 영향을 예기하며 따라서 면역원성을 감소시키므로 특히 놀라운 발견이다. 이러한 예상은 면역 반응 유도에서 항원성 에피토프가 면역계 내에 충분한 양으로 존재하여야 한다고 믿어온 사실에 근거한 것이다. 크게 약독화되고 따라서 복제되지 않는 바이러스는 스스로 결합할 수 있는 만큼의 극소량의 항원 에피토프만 존재한다. 바이러스 입자들에 의해 수용된 항원의 양은 잠재적 면역 반응의 유도에 충분한 것으로 여겨지지 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 바이러스는 단 102TCID50의 극히 적은 양만으로도 생쥐/백시니아 챌린지 모델 내의 잠재적 및 예방성 면역 반응을 자극한다. 본 발명에 따른 바이러스는 따라서 지금까지 특징화된 다른 MVA 균주와 비교하여 예상치못한 큰 면역원성을 보여준다. 이 고면역원성 때문에 본 발명에 따른 바이러스 및 이로부터 유래된 백신은 면역-부전 동물 혹은 인간에게 응용하기에 특히 유리하게 된다.
그 외에 본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 바이러스는 보조제로서 사용된다. 여기서의 "보조제"는 백신 내의 특이 면역 반응의 인핸서를 말한다. "바이러스를 보조제로 사용" 하는 것은 백신 수용 환자의 면역계를 추가로 자극하기 위해 기존 백신에 바이러스를 포함시키는 것을 말한다. 대부분의 백신에서 항원 에피토프의 면역 효과는 소위 보조제를 첨가함으로써 향상되는 경우가 자주 있다. 보조제는 백신의 항원 에피토프에 대한 더 강한 특이적 면역 반응을 일으켜 면역계를 공동-자극시킨다. 이러한 자극은 인터페론 및 인터루킨 같은 비특이적 면역계의 인자들에 의해 조절될 수 있다.
그러므로 본 발명의 또다른 구체예에서, 바이러스는 인간을 포함한 포유류에서 면역계를 활성화, 지지 혹은 억제하기 위해 사용하고 바람직하게는, 항원성 결정물에 대한 면역 반응을 활성화시키는데 사용한다. 바이러스는 또한 스트레스 같은 감염되기 쉬운 조건에서 면역계를 지지하는데 사용하기도 한다.
보조제로 사용되는 바이러스는 예컨대, 게놈 내에 헤테로성 DNA를 함유하지 않는 바이러스 등의 비-재조합 바이러스이다. 이러한 바이러스 종류의 예는 MVA-BN 이다. 별도로, 보조제로 사용되는 바이러스는 바이러스 게놈에 자연적으로는 존재하지 않는 헤테로성 DNA 서열을 게놈 내에 함유하는 재조합 바이러스이다. 보조제로 사용함에 있어서, 바이러스의 재조합 바이러스 DNA는 인터루킨 같은 면역 자극성 펩티드 혹은 단백질을 코드하는 유전자를 함유 및 발현한다.
또다른 구체예에 다르면, 바이러스는 보조제로 사용하거나 또다른 백신에 첨가할 경우 비활성화되는 것이 바람직하다. 바이러스의 비활성화는 예를 들어, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 열이나 화학물질에 의해 수행된다. 바람직하게, 바이러스는 β-프로프리올락톤에 의해 비활성화 된다. 본 발명의 이 구체예에 따르면, 비활성화된 바이러스는 다수 감염성 혹은 증식성 질환에 대한 백신에 이 질환을 가진 환자의 면역 반응을 증가시키기 위해 첨가되기도 한다.
본 발명은 특히, 다음을 단독으로 혹은 조합하여 포함한다:
다음 특성 중 적어도 하나를 갖는 백시니아 바이러스:
- 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
- in vivo 복제가 불가하고;
- 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
- DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
상술한 바이러스는 다음의 인간 세포주의 어느 것에서도 재생산적인 복제능력을 갖지 않는다: 태아 신장세포주 293, 골육종 세포주 143B 및 자궁경부 아데노칼시노마 세포주 HeLa.
상술한 바이러스는 유럽 세포 배양물 기탁기관 (ECACC)(Salisbury, UK)에V00083008 로 기탁된 것과 그의 유도체를 들 수 있다.
상술한 바이러스는 적어도 하나의 헤테로성 핵산 서열을 포함한다.
상술한 바이러스에서 상기 헤테로성 핵산 서열은 적어도 하나의 항원, 항원성 에피토프 및/또는 치료 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택된다.
상기 정의된 바이러스로부터 유래된 게놈 혹은 기능부가 포함된다.
약제학적 조성물은 상술한 바이러스 및/또는 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부 또한 약제학적 수용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함한다.
백신은 상술한 바이러스 및/또는 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부를 포함한다.
상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부, 상기 정의된 조성물 혹은 상기 정의된 백신은 인간을 포함하여 살아있는 동물에게서 면역학적 반응에 영향을 미치고 바람직하게는 이를 유도하는 약물로서 이용된다.
상술한 바이러스, 상기 정의된 약제학적 조성물, 상기 정의된 백신 혹은 상기 정의된 바이러스에서 이들 바이러스, 조성물 혹은 백신은 1차 접종 ("프라임(초기) 접종") 및 2차 접종 ("부스팅(촉진) 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여된다.
상술한 바이러스, 및/또는 상기 정의된 게놈은 의약품 혹은 백신의 제조에 사용된다.
상동성 및/또는 헤테로성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는 방법은 타겟 세포를 상기 정의된 헤테로성 서열을 포함하는 바이러스로 감염 혹은 타겟 세포를 상기 정의된 게놈으로 트랜스펙션 하는 것을 포함한다.
펩티드, 단백질 및/또는 바이러스를 생성하는 방법은,
- 숙주세포를 상술한 바이러스로 감염시키고,
- 감염된 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양하고, 및
- 상기 숙주세포로부터 생산된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 분리 및/또는 농축하는 단계들을 포함한다.
인간을 포함하여 살아있는 동물의 체내에서 면역학적 반응에 영향을 미치고, 바람직하게는 이를 유도하는 방법은 상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부, 상기 정의된 조성물 혹은 상기 정의된 백신을 대상 동물 혹은 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
상술한 방법은 적어도 102TCID50(조직 배양 감염량)의 바이러스를 투여하는 것을 포함한다.
상술한 방법에서 바이러스, 조성물 혹은 백신은 1차 접종 ("프라임 접종") 및 2차 접종 ("부스팅 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여된다.
상술한 방법에서 동물은 면역-부전성이다.
상술한 방법에서 동물은 폭스바이러스에 대한 기존의 면역성을 갖는다.
상술한 방법에서 동물은 항-바이러스 치료 중이다.
상술한 방법에서 동물은 항-바이러스 치료 중이며 항-바이러스 치료는 항-레트로바이러스 치료이다.
상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부는 보조제로서 사용된다.
백신 내에 포함된 항원 및/또는 항원성 에피토프에 대한 특이적 면역 반응을 향상시키는 방법은 상술한 바이러스 혹은 상기 정의된 게놈을 인간을 포함하여 백신치료 대상인 살아있는 동물의 몸에 보조제로서 투여하는 것을 포함한다.
상술한 바이러스 혹은 상기 정의된 게놈을 보조제로 사용한다.
세포, 바람직하게는 상술한 바이러스 또는 상기 정의된 게놈이나 기능부를 함유하는 인간의 세포를 포함한다.
상술한 백시니아 바이러스를 수득하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
- 시판하는 백시니아 바이러스 균주, 바람직하게는 MVA 575를 바이러스가 재생산적으로 복제될 수 있는 인간 이외의 세포에 도입하고 이때의 세포는 바람직하게는 CEF 세포 및 세포주 BHK 로부터 선택되는 단계;
- 이들 세포로부터 바이러스 입자물을 분리/농축하는 단계; 및
- 수득된 바이러스가 상술한 생물학적 성질 중 적어도 하나를 갖는지를 분석하는 단계를 포함하고,
상기 단계들은 필요시 원하는 복제 특성을 갖는 바이러스가 수득될 때까지 반복될 수 있는 것을 특징으로 한다.
프라임/부스트 면역화 키트는 상술한 바이러스, 상술한 백신 혹은 제1 유리병/용기 내에서 1차 접종 ("프라이밍 접종") 및 제2 유리병/용기 내에서 2차 접종 ("부스팅 접종")을 위한 상기 정의된 약물로서의 바이러스를 포함한다.
상술한 바이러스, 상기 정의된 조성물 및/또는 백신 제조를 위해 상기 정의된 백신을 사용하는 방법에서, 이 바이러스, 조성물 혹은 백신은 프라임 접종에서 투여되며 동일한 바이러스 혹은 백신이 부스트 접종에서 투여된다.
다음의 실시예에서 본 발명을 상세히 기술한다. 당해분야의 지식을 가진 경우라면 여기에 제시된 실시예가 본 발명의 기술의 응용분야를 한정하지 않음을 이해할 것이다.
실시예 1
선별된 세포주 내의 신규한 MVA 균주의 성장 속도 및 in vivo 복제
(i) 세포주 내의 성장 속도:
신규하게 분리된 본 발명에 따른 균주를 특징화 하기 위하여 (이하 MVA-BN 이라고 함), 이 신규한 균주의 성장 속도를 이미 특징화된 다른 MVA 균주의 것과 비교했다.
실험은 다음에 열거된 1차 세포 및 세포주 내의 바이러스들의 성장 속도를 서로 비교하여 실행했다:
MVA-BN (바이러스 군체 #23, 18, 02, 99 원료, 2.0 x 107TCID50/ml 에서 적정함);
MVA 는 알텐버거 (미국 특허 5,185,146)에 의해 특징화 되었으며 이하 MVA-HLR 라 하고;
MVA (경로 575) 는 안톤 메이어 (Mayr, A.,et al. [1975] Infection 3;6-14)에 의해 특징화 되었으며 이하 MVA-575 (ECACC VOO120707) 라 하고; 및
MVA-Vero 는 국제 특허출원 PCT/EP01/02703 (W0 01/68820)에서 특징화 되었다 (바이러스 군체, 경로 49, #20, 22.03.99 원료, 4.2 x 107TCID50/ml 에서 적정함).
사용된 1차 세포 및 세포주는:
CEF닭 태아 섬유아세포 (SPF 달걀로부터 새로 제조함);
HeLa인간 자궁경부 아데노칼시노마 (상피), ATCC No. CCL-2;
143B인간 골육종 TK-, ECACC No. 91112502;
HaCaT인간 각질세포주, Boukampet al.1988, J Cell Biol 106(3):761-771;
BHK베이비 햄스터 신장, ECACC 85011433;
Vero아프리칸 그린 멍키 신장 섬유아세포, ECACC 85020299;
CV1 아프리칸 그린 멍키 신장 섬유아세포, ECACC 87032605
감염에 관련하여, 상이한 세포들을 6-웰 플레이트에 5 x 105세포/웰 의 농도로 시드하고 37℃, DMEM 내의 5% CO2(Gibco, Cat.No. 61965-026) 및 2% FCS 의 조건에서 하룻밤 배양했다. 세포 배양 배지를 제거하고 세포를 약 moi 0.05 에서 1시간 동안 37℃, 5% CO2에서 감염시켰다 (감염시 세포수가 하룻밤 사이에 2배로 증가할 것으로 예측함). 상이한 세포 종류 각각의 감염에 사용된 바이러스의 양은 5.0 x 104TCID50이었고 이것을 앞으로 인풋(input) 이라고 한다. 다시, 세포를 3회 DMEM으로 세척하고 마지막으로는 1ml DMEM, 2% FCS를 첨가하고 플레이트를 그대로 두어 37℃, 5% CO2에서 96시간(4일) 동안 배양했다. 이 감염은 적정분석을 위해 플레이트를 -80℃ 로 동결하여 중지시켰다.
적정 분석 (백시니아 바이러스 특이적 항체에 의한 면역염색)
바이러스 양의 적정을 위해 시험 세포(CEF)를 RPMI (Gibco, Cat. No. 61870-010), 7% FCS, 1% 항생제/항마이코틱제 (Gibco, Cat. No 15240-062)에 담긴 96-웰 플레이트상에 1 x 104세포/웰 의 농도로 시드하고 37℃, 5% CO2에서 배양했다. 감염 시험물을 함유하는 6-웰 플레이트는 3회 동결/해동을 반목했고 RPMI 성장 배지를 사용하여 10-1내지 10-12의 희석물을 제조했다. 바이러스 희석물을 시험세포 상에 분배하고 37℃, 5% CO2에서 5일간 배양하여 CPE (세포 변형 효과)를 전개시켰다. 시험세포는 10분간 고정시키고 (아세톤/메탄올 1:1) PBS로 세척했고, 배양 완충액 내의 1:1000 희석농도에서 폴리클로날 백시니아 바이러스 특이적 항체 (Quartett Berlin, Cat. No. 9503-2057)로 RT 에서 1시간동안 배양했다. PBS (Gibco, Cat.No. 20012-019)로 2회 세척한 후 HPR-결합 항-토끼 항체 (Promega Mannheim, Cat. No. W4011)를 배양 완충액 (3% FCS 함유 PBS) 내의 1:1000 희석농도로 RT에서 1시간 동안 첨가했다. 세포를 다시 PBS로 2회 세척하고 갈색 스폿이 가시화 될 때까지 (2시간) 염색용액 (100ml PBS + 100% 에탄올 + 15㎕ H2O2에 용해한 200㎕ o-디아니시딘 포화 용액)으로 배양했다. 염색용액을 제거하고 PBS를 염색반응이 중지될 때까지 첨가했다. 갈색 스폿이 나타난 모든 웰을 CPE 양성으로 표시했고 Kaerber식 (TCID50기초 분석)을 이용하여 역가를 계산했다 (Kaerber, G. 1931. Arch. Exp. Patho. Pharmakol. 162,480).
바이러스를 예컨대, 0.05 감염유닛/세포 (5 x 104TCID50)의 낮은 감염중복도에서 한편으로는 MVA에 대한 허용성이 있는 것으로 예상한 CEF 및 BHK, 또다른 한편으로는 MVA에 대한 허용성이 없는 것으로 예상한 CV-1, Vero, Hela, 143B 및 HaCat 의 2중 세트를 감염시키는데 사용했다. 그 뒤, 바이러스 접종원을 제거했고 세포를 3회 세척하여 잔류하는 미흡수된 바이러스를 제거했다. 바이러스 추출물이 제조되고 그 뒤 CEF 세포 상에서 적정하는 총 4일간 계속 감염상태로 두었다. 표 1및 도 1은 4일간 감염 후 생성된 바이러의 총량으로 값을 표시한 적정 분석의 결과를 도시한다.
모든 MVA 에 대한 허용성이 있는 세포주이므로 예상대로 CEF 셀 (닭 태아 섬유아세포) 내에서 모든 바이러스가 증폭된 것으로 나타났다. 또한, BHK (햄스터 신장 세포주) 내에서도 모든 바이러스가 증폭되었다. MVA-Vero는 BHK 가 허용성 세포주이므로 가장 양호하게 실행되었다.
Vero 세포(원숭이 신장 세포주)의 복제에 관련하여, MVA-Vero는 예상대로 인풋보다 1000배 증폭했다. MVA-HLR 및 MVA-575 는 인풋보다 각각 33배와 10배 증가했다. 다른 것들과 비교할 때 MVA-BN 만은 인풋보다 2배 증가한 것에 불과하여 그다지 크게 증폭하지 않은 것으로 나타났다.
또한, CV1 세포 (원숭이 신장 세포주)의 복제에 관련하여, MVA-BN은 이 세포주 내에서 크게 약독화되는 것으로 나타났다. 인풋 보다 200배 감소하였다. 또한, MVA-575는 인풋 레벨 보다 증폭하지 않았으며 즉, 인풋보다 16배 감소함으로서, 다소 음성의 증폭을 보였다. MVA-HLR은 인풋보다 30배 증가함으로써 가장 양호하게 증폭하였고 MVA-Vero 는 인풋보다 5배 증가하였다.
가장 관심을 끄는 것은 인간 세포주 내의 다양한 바이러스의 성장 속도를 비교하는 것이다. 143 세포 (인간 골육암 세포주)의 재생산적 복제에 관련하여, MVA-Vero는 인풋보다 증폭되는 현상을 보인 유일한 것이다. (3배 증가). 기타 다른 바이러스들은 인풋보다 증폭되지 않고 MVA-HLR 및 MVA-BN 와 MVA-575 간의 큰 차이가 있었다. MVA-HLR 는 "경계선" (인풋보다 1배 감소) 이었고 MVA-BN이 가장 큰 약독화 (인풋보다 300배 감소)를 그 뒤가 MVA-575 (인풋보다 59배 감소) 이었다. 요약하면, MVA-BN은 인간 143B 세포에서의 약독화 현상에 관련하여 탁월하다.
더욱더, HeLa 세포 (인간 자궁경부암 세포) 에서의 복제에 있어서는 MVA-HLR 이 이 세포주 내에서 잘 증폭하였으며 허용성 BHK 세포 (Hela = 인풋보다 125배 증가; BHK = 인풋보다 88배 증가) 보다도 우수했고 MVA-Vero 역시 이 세포주 내에서 증폭했다 (인풋보다 27배 증가). 그러나, MVA-BN 및 이보다는 덜하지만 MVA-575 상기 세포주에서 약독화되었다 (MVA-BN = 인풋보다 29배 감소 및 MVA-575 = 인풋보다 6배 감소).
HaCat 세포 (인간 각질세포주) 에서의 복제에 관련하여, MVA-HLR는 이 세포주 내에서 잘 증폭하였다 (인풋보다 55배 증가). 순응된 MVA-Vero 및 MVA-575도 이 세포주 내에서 증폭하였다 (인풋보다 각각 1.2배 및 1.1배 증가). 그러나, MVA-BN은 유일하게 약독화현상을 보였다 (인풋보다 5배 감소).
결론적으로, MVA-BN 이 상기 바이러스 그룹에서 가장 큰 약독화된 바이러스이다; MVA-BN은 인간 태아 신장세포 (293: ECACC No. 85120602) (표 1에 데이타 수록되지 않음)에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 보임으로써 인간 세포주 내에서 극단적으로 약독화되는 모습을 보이며, 또한 143B 세포에서 약 0.0의 증폭비를 나타낸다; HeLa 세포에서는 약 0.04의 증폭비를; 또한 HaCat 세포에서는 약 0.22의 증폭비를 나타낸다. 또한, MVA-BN 은 CV1 세포에서 약 0.0의 증폭비를 보인다. Vero 세포에서만 BHK 및 CEF 같은 허용성 세포주에서와 동일하지 않은 증폭비 (2.33)를 관찰할 수 있었다 (표 1 비교). 따라서, MVA-BN은 모든 인간 세포주 143B, Hela,HaCat 및 293에서 1보다 낮은 증폭비를 보이는 유일한 공지의 MVA 균주이다.
MVA-575 는 MVA-BN과 유사한 프로파일을 나타내나 MVA-BN 처럼 약독화되지는 않는다.
MVA-HLR은 시험 세포주 모두에서 잘 증폭되었고 (143B 세포만 제외), 따라서 143B 세포를 제외한 모든 시험 세포주에서 복제능을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 어떤 경우, 이것은 허용성 세포주(BHK) 보다 인간 세포주(HeLa)에서 더 크게 증폭되기도 한다.
MVA-Vero 는 모든 세포주에서 증폭현상을 보이나 MVA-HLR (143B의 결과는 무시하고) 에서 나타난 것보다는 강도가 약하다. 그럼에도, 약독화 측면에서 MVA-BN 혹은 MVA-575 에서와 동일한 "종류"에 속하는 것으로 판단할 수는 없다.
2. in vivo 복제
MVA 균주가In vitro복제를 뚜렷히 보이는 것에 있어서, 다양한 MVA 균주의 능력을 형질변환 생쥐 모델 AGR 129를 이용하여in vivo복제에 대해 시험했다. 이 생쥐 균주는 IFN 수용체 I종 (IFN-α/β) 및 II종 (IFN-γ) 유전자 및RAB내에서 유전자 타겟된 파괴를 갖는다. 이들 파괴물 때문에 생쥐는 IFN 계를 갖지 않으며 성숙 B 및 T 셀을 생성할 수 없어 심각한 면역 부전 현상을 보이고 또한 복제 바이러스의 영향을 받기 쉽다. 6마리로 된 그룹을 MVA-BN, MVA-HLR 혹은 MVA 572(독일에서 120,000명에 사용된) 107pfu 로 면역화하고(복강내 투여), 매일 임상징후를 관찰했다. MVA HLR 혹은 MVA 572를 백신접종한 모든 생쥐가 각각 28 및 60일 이내에 죽었다. 해부시, 다수 기관 내에 심각한 바이러스 감염 징후가 있었으며 표준 플라크 분석으로 MVA(108pfu)가 난소로부터 회수되었다. 대조적으로, 동일한 양의 MVA-BN (기탁된 균주 ECACC V00083008에 상응하는)으로 백신접종한 생쥐는 90일 이상으로 생존했으나 MVA는 기관 혹은 조직으로부터 회수되지 않았다.
in vitro및in vivo연구에서 얻은 데이타를 함께 고찰할 때 MVA-BN 이 모게이면서 상용화된 MVA-HLR 균주보다 훨씬 크게 약독화되는 모습을 뚜렷이 확인할 수 있다.
실시예 2
면역학적 및 in vivo 데이타
이 실험은 다른 MVA와 비교되는 MVA-BN의 상이한 약량 및 백신접종 처방을 비교하기 위하여 실시한 것이다.
2.1. 여러 MVA 균주들은 면역 반응을 자극하는 능력이 상이하다.
백시니아의 복제능 균주는 생쥐에게서 잠재적 면역 반응을 유도하고 고용량에서는 치명적이다. MVA 가 크게 약독화되고 포유류 세포 상에서의 복제능력 감소를 나타내어도 상이한 MVA 균주들 간에 약독화현상은 서로 차이가 있다. 실제로, MVA BN 은 다른 MVA 균주보다 더 약독화되는 것으로 나타나며 심지어는 모계 균주 MVA 575 도 그러하다. 이 약독화현상의 차이가 예방성 면역 반응을 유도하기 위한 MVA의 효능에 영향을 미치는지를 결정하기 위해서, 상이한 약량의 MVA BN 및 MVA 575를 치사 백시니아 챌린지 모델에서 비교했다. 예방 레벨은 챌린지 뒤 4일후 결정된 난소 백시니아 역가의 감소에 의해 측정되었고, 이는 상이한 약량 및 MVA 균주들의 정량적 평가를 가능하게 한다.
치사 챌린지 모델
특이 병원성이 없는 6-8주의 암컷 BALB/c (H-2d) 생쥐 (n=5)를 상이한 약량 (102, 104혹은 106TCID50/ml)의 MVA BN 혹은 MVA 575로 면역화했다 (복강투여). MVA BN 및 MVA-575는 CEF 세포 상에 증식되었고 트리스 pH 7.4에서 슈크로스 정제 및 제형화되었다. 3주후 생쥐는 동일한 약량 및 MVA 균주의 부스트를 수용하였고 이어서, 백시니아의 복제능 균주로 2주후 치사 챌린지 (복강내) 했다. 복제능 백시니아 바이러스 ("rVV"로 약칭함)로서, 균주 WR-L929 TK + 혹은 균주 IHD-J를 사용했다. 대조부 생쥐는 플라시보 백신을 수용했다. 표준 플라크 분석에 의해 챌린지 뒤 4일후 결정된 난소 역가의 감소로서 예방력을 측정했다. 이를 위하여, 챌린지 뒤 4일후 생쥐를 희생시키고 난소를 분리하여 PBS (1ml)로 균질화 한 후 VERO 세포를 이용하는 표준 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 결정했다 (Thomsonet al., 1998, J. Immuno. 160:1717).
104혹은 106TCID50/ml 의 MVA-BN 혹은 MVA-575로 2회 면역화 하여 백신접종한 생쥐는 챌린지 뒤 4일후의 난소 rVV 역가가 100% 감소한 것으로 판단되어 완전 예방되었다 (도 2). 챌린지 바이러스가 사라졌다. 그러나, MVA-BN 혹은 MVA-575에 의해 제공된 예방 레벨의 차이는 더 낮은 용량에서 관찰되었다. 104혹은 106TCID50/ml 의 MVA-575로 2회 면역화한 생쥐는 고 난소 rVV 역가 (평균 3.7 x 107pfu +/- 2.11 x 107)로 판단됨으로써 예방에 실패하였다. 이와 대조적으로, 동일한 용량의 MVA-BN으로 백신접종한 생쥐는 난소 rVV 역가의 현저한 감소(96%)(평균 0.21 x 107pfu +/- 0.287 x 107)를 유도하였다. 플라시보 백신을 수용한 대조부 생쥐는 평균 5.11 x 107pfu (+/- 3.59 x 107)를 나타내었다 (도 2 참조).
양쪽 MVA 균주는 치사 rVV 챌린지에 대해 생쥐에게서 예방적 면역 반응을 유도한다. 양쪽 MVA 균주 모두 고용량에서는 동등한 효과를 나타내지만 최적량 이하에서는 효능의 차이가 현저하다. MVA-BN은 치사 rVV 챌린지에 대한 예방성 면역 반응을 유도함에 있어서 모계 균주 MVA-575 보다 훨씬 우수한 능력을 가지며 이것은 MVA-575와 비교할 때 MVA-BN의 약독화 증대 현상에 관계한다.
2.2 프라임-부스트 백신접종 처방의 MVA-BN
2.2.1.: 상이한 천연두 백신을 이용한 생쥐의 백신접종에 따른 MVA에 대한 항체 유도
MVA-BN의 효능을 다른 MVA 및 과거 천연두 박멸에 사용했던 백시니아 균주와 비교했다. 이것은 CEF 세포 내에 생성되고 또한 꼬리 방혈 및 과거에 독일의 천연두 박멸 프로그램에서 사용했던 MVA 572를 이용한 면역화 방법을 통해 수득된 Elstree 및 Wyeth 백시니아 균주를 사용한 단일 면역화 방법을 포함했다. 또한, MVA-BN 및 MVA-572 는 먼저 프리-백신으로 비교한 뒤 방혈을 통한 Elstree를 실시했다. 각 그룹에서 8마리의 BALB/c 생쥐를 사용했고 MVA 백신접종 (1 x 107TCID50)은 모두 0주 및 3주째에 피하투여했다. 부스트 투여 뒤 2주후, 생쥐를 백시니아 (IHD-J)로 챌린지 했고 난소내의 역가를 챌린지 뒤 4일후에 결정했다. 모든 백신 및 처방에서 100% 예방을 유도했다.
이들 상이한 백신 혹은 처방을 이용하여 유도한 면역 반응은 챌린지에 앞서서 동물로부터 측정했다. 중화용 항체의 레벨을 측정하는 분석법, T셀 증식, 사이토킨 생성 (IFN-γ 대 IL-4) 및 T셀에 의한 IFN-γ 생성 등을 이용했다. MVA-BN에 의해 유도된 T셀 반응의 레벨은 ELIspot 분석으로 측정시 생물학적 등가성을 나타내는 다른 MVA 및 백시니아 바이러스와 대체로 동등했다. 각종 백신접종 처방에 뒤이은 MVA에 대한 항체 역가의 주간 분석에서, MVA-BN 을 이용한 백신접종은 다른 백신접종 처방과 비교할 대 항체 반응 속도 및 강도를 크게 향상시킨 것으로 나타났다 (도 11). 사실상, MVA 572로 백신접종한 생쥐와 비교하여 MVA-BN 으로 백신접종되었을 때, MVA에 대한 항체 역가는 2주, 4주 및 5주 (4주째의 부스트 처리뒤 1주후)에서 현저히 높았다 (p>0.05). 4주째 부스트 백신접종한 뒤, 항체 역가는 또한 백시니아 균주 ELstree 혹은 Wyeth 어느 것의 단일 백신접종을 수용한 생쥐와 비교할 때 MVA-BN 그룹에서 훨씬 높은 값으로 나타났다. 이들 결과는 MVA-BN을 이용한 2회의 백신접종시 종래의 백시니아 균주 (ELstree 및 Wyeth)에 의한 전통적인 단일 백신접종보다 더 우수한 항체반응을 유도했다는 것을 명확히 입증하며 또한 앞의 단락 1.5에서의 발견 즉, MVA-BN 이 다른 MVA 균주보다 더욱 면역성이 크다는사실을 확인시켜 주는 것이다.
2.2.2. MVA-프라임 및 부스트 처방은 인플루엔자 챌린지 모델에서 DNA-프라임 MVA-부스트 처방과 동등한 예방 레벨을 생성한다.
고강도 CTL 반응을 일으키는 MVA 프라임-부스트 처방의 효능을 평가하고 이를 이미 우수한 효과를 갖는 것으로 공지된 DNA 프라임/MVA 부스트 처방과 비교했다. 상이한 처방들을 DNA 벡터 혹은 MVA-BN에 의해 엔코드된 뮤린 폴리토프 구성물을 사용하여 평가했고 CTL 유도 레벨을 ELISPOT과 비교하였으며 한편, 반응 강도는 인플루엔자 챌린지 뒤에 얻어진 예방 정도로써 측정되었다.
구성물(construct)
뮤린 폴리토프를 엔코드하는 DNA 플라스미드 (인플루엔자, 오발무민 함유 10 CTL 에피토프)는 이미 소개되었다 (Thomsonet al.,1998, J. Immunol. 160:1717). 이들 뮤린 폴리토프는 MVA-BN의 결실부위 II 속으로 삽입, CEF 세포상에서 증식 및 Tris pH 7.4 에서 슈크로스 정제 및 제형화 되었다.
백신접종 프로토콜
이 연구에서, 특이적 병원성이 없는 6-8주의 암컷 BALB/c (H-2d) 생쥐를 사용했다. 5마리로 된 그룹을 ELISPOT 분석에 사용했고 인플루엔자 챌린지 시험에서는 그룹당 6마리를 사용했다. 생쥐는, 결과부에서 상세히 기술한 바와 같이, 뮤린 폴리토프를 엔코드할 MVA 혹은 DNA를 이용하는 상이한 프라임-부스트 처방으로 백신접종했다. DNA에 의한 면역화에서, 생쥐를 마취시킨후 마취상태에서 4겹 근육 내에 50㎍ 엔도톡신 무함유 플라스미드 DNA (50㎕의 PBS에 용해된)를 1회 주사하였다. MVA를 이용하는 1차 면역화는 생쥐 1마리당 107pfu MVA-BN을 정맥투여하거나 혹은, 생쥐 1마리당 107pfu 또는 108pfu MVA-BN을 피하투여함으로써 실시하였다. 부스트 면역화는 1차 면역화 뒤 3주후에 실시했다. DNA를 이용한 1차 면역화와 동일한 방식으로 플라스미드 DNA를 이용한 부스팅을 실시했다 (상기 참조). CTL 반응을 달성하기 위해, 표준 ELISPOT 분석 (Schneideret al., 1998 Nat. Med. 4; 397-402)를 인플루엔자 CTL 에피토프 펩티드 (TYQRTRALV), P.Berghei 에피토프 펩티드 (SYIPSAEKI), 시아토메갈로바이러스 펩티드 에피토프(YPHFMPTNL) 및/또는 LCV 펩티드 에피토프 (RPQASGVYM)을 사용하여 최종 부스터 면역화 처리뒤 2주후에 스플레노사이트 상에서 실행하였다.
챌린지 시험에서, 생쥐를 마취시킨후 휴지상태의 인플루엔자 바이러스 Mem71를 치사량 이하의 약량 (50ml PBS 내에 용해된 4.5 x 105pfu )으로 비강투여하여 감염시켰다. 감염 5일후, 폐를 절제하고 바이러스 역가를 표준 인플루엔자 플라크 분석을 이용하여 Madin-Darby 개의 신장 세포주 상에서 중복으로 측정하였다.
결과:
DNA 백신만을 단독 사용하면 뮤린 폴리토프에 의해 엔코드된 4H-2d에피토프의 유도 효과가 낮고P.Berghei(SYIPSAEKI) 및 임파구 융막성뇌막염 바이러스 (RPQASGVYM)를 위한 2개의 에피토프에서 약한 반응만 검출될 수 있었다. 대조적으로, DNA 프라임 MVA 부스트 처방 (107pfu MVA-BN의 피하주사)을 이용하면 SLY (8배증가) 및 RPQ (3배 증가)에 대한 CTL 유도가 훨씬 컸으며 또한 뮤린 사이토메갈로바이러스 (YPHFMPTNL)에 대한 제3 에피토프에서 반응을 관찰하였다 (도 3A). 그러나, 상동성 프라임 부스트 처방에서 107pfu MVA-BN의 피하주사시 DNA와 뒤이어 MVA-BN 를 이용한 것과 유사한 반응 레벨을 유도하였다 (도 3A). 놀라운 것은, MVA-BN (107TCID50)을 이용한 1회 면역화 수행시 3개의 에피토프에 대하여 유도된 CTL 숫자는 크게 차이가 없었다는 사실로서 이는 MVA-BN 을 이용한 2차 면역화가 CTL 반응을 현저히 촉진하지 않았다는 것을 가리킨다.
107pfu MVA의 피하투여는 특히, 정맥경로를 통한 면역화와 비교할 때, 과거에 가장 비효율적인 경로라고 알려져 왔으며 백신접종을 위한 바이러스 농축시엔 다른 MVA 균주들을 사용했다. (Schneider et al 1998). 최적의 면역화 처방을 규정하기 위해, 바이러스의 양 혹은 투여 방식을 변경하면서 상술한 실험을 반복했다. 한가지 실험에서, 107pfu MVA-BN 백신접종은 정맥 경로로 수행되었다 (도 3B). 또다른 실험에서는 108pfu MVA-BN 을 피하투여하였다 (도 3C). 이들 실험에서 MVA-BN 프라임-부스트 면역화는 DNA 프라임 MVA 부스트 처방과 비교할 때, 3가지 모든 에피토프에 대해 높은 평균 CTL수치를 유도했다. 또한 107pfu MVA-BN 을 피하투여한 것과 달리 107pfu MVA-BN 을 정맥내 투여한 면역화 및 108pfu MVA-BN 을 피하투여한 면역화는 CTL 반응을 크게 촉진하였고 이 결과는 MVA-BN 이 벡터에 대한 면역성 예후가 있는 곳에서 CTL 반응을 촉진할 수 있음을 가리킨다.
2.2.3: SIV 감염된 레수스 원숭이에서의 MVA-BN nef 백신의 효능
NVA-BN nef 백신의 효능을 결정하기 위하여, SIV의 유독성 1차 분리물을 이용한 챌린지 뒤 바이러스 로드 및 질병을 평가하였다. 또한 이 연구는 MVA에 대한 면역성 예후를 가진 면역-부전 원숭이에 대하여 면역 반응을 안전하게 촉진할 수 있는지를 결정하게 된다.
백신접종 프로토콜
2개 그룹 (n=6)의 레수스 원숭이 (Mccaca mulalta)를 NVA-BN 단독 혹은 재조합 MVA-BN nef을 이용하여 0주, 8주 및 16주에 환약형 근육내 주사함으로써 백신접종하였다. 22주에 모든 원숭이에게 본래의, 무배양된 레수스 원숭이 PBMC로부터 얻은 50 MID50의 병원성 세포 관련 SIV 군체 (1XC)를 정맥경로로 챌린지하였다. 동물의 임상적 상태를 충분히 관찰하고 바이러스 감염, 면역 파라미터, 전체 혈액학 및 혈액 임상적 화학 파라미터 등의 측정을 위해 정상의 혈액시료를 취하였다. 발병된 AIDS 유사 질환을 가진 동물을 희생시켰고 살아남은 원숭이들은 백신접종 뒤 99주동안 관찰하였다. 100주에, 생존한 원숭이를 모두 MVA-BN tat를 근육내 투여하여 면역화 시켰고 또한 102주 및 106주에 동일한 MVA-BN tat으로 추가로 면역화 처리했다.
MVA-BN 혹은 MVA-BN nef 을 이용한 백신접종 뒤에는 부작용이 관찰되지 않았다. SIV로 원숭이를 감염시킨 뒤 바이러스 감염 레벨은 현저히 증가했으며 감염 2주후에는 피크점에 올랐다 (도 4). 그룹 내에서에도 표준 편차가 컸기 때문에 MVA-BN nef 혹은 MVA-BN 으로 백신접종한 그룹간에 SIV 의 평균레벨은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 대체로 NVA-BN nef 로 백신접종한 그룹에서의 SIV 로드가 대조부 그룹(MVA-BN)보다 10배 정도 더 낮았다. 또한, 감염 뒤 35주 후 (초기관찰기간), MVA-BN nef 로 백신접종한 6마리 중 1마리의 원숭이만 질환이 심각해져 안락사 시켰으며 이는 대조부의 경우 6마리 중 4마리가 안락사 한 것과 대조된다. 질병의 진행은 고바이러스 로드와 상관관계가 있음이 명백하며 이는 감염뒤 또다시 29주후에 동물을 관찰한 바에서도 확인되었다. 대조부와 비교하여, MVA-BN nef 백신은 질병의 진행을 지체시키는 것으로 나타났으며 또한 46주 후에는 6마리의 NVA-BN nef 동물 중 5마리가 살아남았다 (도 5). 그러나, 감염뒤 59주 후에는, nef 백신접종된 그룹 중 추가로 2마리가 더 안락사되어 5마리만 생존하였다. (MVA-BN nef 그룹 중 3마리 및 MVA-BN 백신접종 그룹 중 2마리). 이들 12마리의 원숭이에게서 MVA-BN 에 대하여 발생한 항체 역가의 시험결과, MVA-BN 은 MVA에 대한 면역성 예후의 존재하에서도 면역 반응을 촉진할 수 있음이 확실히 입증되었다 (도 6). MVA-BN 혹은 MVA-BN nef 을 이용한 1차 면역화에 따르면, 모든 원숭이에게서 평균 1000의 역가로 MVA에 대한 항체 반응을 발생하였다. 이 항체 반응은 2차 변역화 처리후에는 현저히 촉진되었으며 따라서, MVA가 건강한 원숭이의 프라임-부스트 면역 반응에 사용될 수 있음을 확실히 증명해준다. 이들 항체 역가는 점차 감소하나 면역화 처리뒤 49주 후에는 역가치가 일정하게 되고 99주째에는 평균 역가가 2000이었다.
5마리의 생존 원숭이는 SIV에 감염되고 400/㎕ 혈액 이하의 CD4 카운트에 의해 면역-부전화 되었다. MVA-BN이 면역-부전 원숭이에게 미치는 영향을 조사하기 위하여, 5마리에게 초기 백신접종 뒤 100주, 102주 및 106주째에 MVA-BN tat를 3회 백신접종했다. MVA-BN tat을 이용한 1차 면역화는 이들 면역-부전화 원숭이에게서 MVA에 대한 항체반응을 크게 촉진시켰으며 다시또 6주후에 3차 면역화 처리를 행함으로써 더욱더 촉진하였다 (도 6). 이 결과는 다시 MVA-BN이 MVA에 대한 현저한 면역성 예후의 존재하에서 면역-부전 원숭이까지도 면역 반응을 촉진할 수 있음을 증명한다. 원숭이 면역 반응은 MVA-BN tat을 이용한 면역화 처리 뒤에 촉진되었으나 SIV 레벨은 여전히 안정한 상태로 남아있으므로, MVA-BN을 이용한 면역화 처리가 안전하며 또한 면역-부전 원숭이의 SIV 레벨에 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다 (도 7).
이 연구에서는, MVA-BN 이 면역-부전 레수스 원숭이에 잇어서 면역 반응을 프라임-부스트 할 수 있고 또한 MVA-BN 면역화 처리가 안전하며 또한 SIV 감염 동물의 바이러스 감염 레벨에 영향을 미치지 않는다는 사실을 증명해 주었다. MVA-BN nef 백신으로 백신접종한 동물에게서 AIDS 유사 질환의 진행이 지체되는 사실은 면역 반응이 nef에 대하여 성공적으로 발생하였음을 가리키는 것이다.
2.2.4: 항-레트로바이러스 처리시의 SIV-감염 원숭이의 치료적 백신접종.
MVA-BN계 치료 HIV 백신은 항-레트로바이러스 치료중인 대상에 쉽게 사용된다. 따라서 본 연구는 PMPA로 치료한 SIV 감염 원숭이에 있어서 각종 SIV 항원 (gag, pol, env, rev, tat 및 nef)을 엔코딩하는 재조합 MVA의 안전성 (SIV 레벨에대한 영향) 및 효능이 뉴클레오시드 아날로그이고 HIV 및 SIV에 대하여 효과있는지를 연구하기 위한 것이다 (Rosenwirth,et al.B. 2000, J Virol 74, 1704-11)
구성물
모든 재조합 MVA 구성물은 CEF세포 상에서 증식되고, 트리스 pH7.4 에서 슈크로스 정제 및 제형화되었다.
백신접종 프로토콜
3개 그룹 (n=6)의 레수스 원숭이 (Mccaca mulalta)를 병원성 1차 SIV 분리물(1XC) 50 MID50로 감염시켰고 그 후 19주 동안 PMPA (60mg/kg 피하투여)으로 매일 치료하였다. 10주째, 동물에 대해 재조합 MVA-BN(근육내 투여) 또는 식염수로 백신접종했고 6주후 다시 동일한 백신접종을 수행했다. 그룹 1에는 MVA gag-pol 및 MVA-env의 혼합물을, 그룹 2에는 MVA-tat, MVA-rev 및 MVA-nef의 혼합물을 각각 투여했고 그룹 3에는 염수를 제공했다. 동물들의 임상 상태를 충분히 관측하고 바이러스 감염, 면역 파라미터 및 혈액학 및 혈액 임상 화학적 변수의 모든 범위를 측정하기 위해 정상 혈액시료를 취했다.
모든 동물이 감염 2주후 피크점에 달하는 높은 SIV 로드를 형성하였다 (도 8). PMPA로 매일 처리한 뒤, 9주째에 SIV 레벨이 감소 및 낮은 레벨에서 안정화 되었다. 앞서의 연구에서와 같이 백신접종후 10주 및 16주째에는 SIV 레벨에 대한 아무런 영향도 나타나지 않았으며 이는 MVA-BN이 면역-부전 동물에 대해 안전한 백신 벡터임을 증명하는 것이다. 동물이 PMPA 처리 (21주째)를 받았을 때, SIV레벨이증가했다. 그룹 1 내의 3마리는 대조부 그룹 3과 비교하여 감소된 SIV 레벨을 나타내었으나, PMPA 처리 종결뒤 그룹간 평균 SIV 로드는 큰 차이가 없었다 (도 8). SIV 감염된 T세포 라이세이트에 대한 ELISA를 이용하면, 모든 그룹의 동물들이 감염뒤 4주째에 SIV에 대한 항체 반응을 발생하였다 (도 9). 대조부 그룹(식염수) 내의 SIV 항체 역가는 PMPA 처리 과정에서 감소했고 PMPA 처리 중단시 현저히 증가했으며, 이는 항-레트로바이러스 치료 과정에서 SIV 레벨의 감소 및 후속 증가를 반영하는 것이다 (도 9). SIV 항체 역가의 유사한 패턴이 MVA-tat, MVA-rev 및 MVA-nef를 수용한 그룹 2에서도 관찰되었으며 이는, ELISA 에서 사용된 SIV 감염 T셀 용혈물 내의 조절 단백질이 발현되지 않음을 반영하는 것이다. 이와 대조적으로, 그룹 1에서의 항-SIV 항체 역가는 10주째에 MVA gag-pol 및 MVA-env로 백신접종시 증가하였으며 이는 재조합 MVA-BN이 항-레트로바이러스 치료를 받는 SIV 감염 동물에 있어서 SIV에 대한 면역 반응을 촉진할 수 있음을 가리키는 것이다. 중요한 것은, 항-SIV 항체 역가가 16주째의 2차 면역화 처리 후에 촉진되었으며 이는 MVA가 심지어 MVA에 대한 면역성 예후가 있는 경우에도 면역-부전 동물의 면역 반응을 촉진할 수 있다는 사실을 입증한다 (도 8). 그룹 1의 항-MVA 항체 역가는 또한 1차 면역화 뒤의 항체 반응의 발생으로 이 패턴을 반영하였고 이것은 2차 백신접종에 따라 크게 촉진되다. (도 10).
(참고문헌)
표 1
CEF Hela HaCat 143B BHK Vero CV-1
MVA-BN 579.73 0.04 0.22 0.00 65.88 2.33 0.00
MVA-575 796.53 0.15 1.17 0.02 131.22 10.66 0.06
MVA-HLR 86.68 124.97 59.09 0.83 87.86 34.97 29.70
MVA-Vero 251.89 27.41 1.28 2.91 702.77 1416.46 4.48
감염 4일후 인풋 레벨보다 큰 바이러스 증폭
증폭비 = 아웃풋 TCID50ㆍ인풋 TCID50
모든 수치는 TCID50임
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당 절차가 가능한 모든 지정국 및 해당 지정국의 법률하에 정당히 허용되는 범위 내에서, 기탁된 미생물 시료는 관련 특허법, 예, EPC 규칙 28조(4), 영국 특허법령 1995, 2조 3항; 오스트레일리아 법률 3.25(3); 덴마크 특허법령 22조 및 33조(3) 및 기타 지정국의 유사조항에 의거하여, 독립전문기관에 배포함으로써만 사용할 수 있다.
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본 발명에 의하여 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 베이비 햄스터의 신장 세포주 BHK 내에서의 재생산적 복제가 가능하나 인간의 세포주 내에서는 불가능한 새로운 백시니아 바이러스가 제공된다.

Claims (27)

  1. (i) 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
    (ii) in vivo 복제가 불가하고;
    (iii) 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
    (iv) DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교하여, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도하는 특성들 중 적어도 하나를 갖는 백시니아 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상술한 바이러스는 다음의 인간 세포주: 인간 태아 신장세포주 293, 인간 골육종 세포주 143B 및 인간 자궁경부 아데노칼시노마 세포주 HeLa 중 어느 것에서도 재생산적인 복제능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 백시니아 바이러스.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서,
    유럽 세포 배양물 기탁기관 (ECACC)(Salisbury, UK)에 V00083008 로 기탁된 것과 그의 유도체임을 특징으로 하는 백시니아 바이러스.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 헤테로성 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백시니아 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 헤테로성 핵산 서열은 적어도 하나의 항원, 항원성 에피토프 및/또는 치료 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백시니아 바이러스.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스로부터 유래된 게놈 혹은 기능부.
  7. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 및/또는 제6항에 따른 게놈 및/또는 기능부와 또한 약제학적 수용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 및/또는 제6항에 따른 게놈 및/또는 기능부를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  9. 인간을 포함하여 살아있는 동물의 면역학적 반응에 영향을 미치고 바람직하게는 이를 유도하는 약물로서 이용되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제6항에 따른 게놈 및/또는 기능부, 제7항에 따른 조성물 혹은 제8항에 따른 백신.
  10. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제7항에 따른 조성물 혹은 제8항에 따른 백신 또는 제9항에 따른 바이러스로서, 상기 바이러스, 상기 조성물 또는 상기 백신은 1차 접종 ("프라이밍 접종") 및 2차 접종 ("부스팅 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 바이러스, 조성물 또는 백신.
  11. 의약품 혹은 백신의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제6항에 따른 게놈.
  12. 상동성 및/또는 헤테로성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는 방법으로서,
    타겟 세포를 제4항 또는 제5항에 따른 바이러스로 감염 혹은 타겟 세포를 제6항에 따른 게놈으로 트랜스펙션 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 도입방법.
  13. (a) 숙주세포를 제1항 또는 제5항에 따른 바이러스로 감염시키고,
    (b) 감염된 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양하고, 및
    (c) 상기 숙주세포에서 생성된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 분리 및/또는 농축하는 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 제조방법.
  14. 인간을 포함하여 살아있는 동물의 체내에서 면역학적 반응에 영향을 미치거나, 바람직하게는 이를 유도하는 방법으로서,
    제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제6항에 따른 게놈 및/또는 기능부, 제7항에 따른 조성물 혹은 제8항에 따른 백신을 대상 동물 혹은 인간에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    적어도 102TCID50(조직 배양 감염량)의 바이러스를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 바이러스, 조성물 혹은 백신은 1차 접종 ("프라이밍 접종") 및 2차 접종 ("부스팅 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물이 면역-부전성인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물이 폭스바이러스에 대한 면역성 예후를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물이 항-바이러스 치료중인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 항-바이러스 치료는 항-레트로바이러스 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제6항에 따른 게놈 및/또는 기능부의 용도.
  22. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 제6항에 따른 게놈을 인간을 포함하여 백신치료 대상인 살아있는 동물의 몸에 보조제로서 투여하는 것을 특징으로 하는 백신 내에 포함된 항원 및/또는 항원성 에피토프에 대한 특이적 면역 반응을 향상시키는 방법.
  23. 보조제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 혹은 제6항에 따른 게놈.
  24. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 혹은 제6항에 따른 게놈을 함유하는 세포 바람직하게는 인간의 세포.
  25. - 시판하는 백시니아 바이러스 균주, 바람직하게는 MVA 575를 인간을 제외하고 바이러스가 재생산적으로 복제될 수 있는 세포에 도입하고 이때의 세포는 바람직하게는 CEF 세포 및 세포주 BHK 로부터 선택되는 단계;
    - 이들 세포로부터 바이러스 입자물을 분리/농축하는 단계; 및
    - 수득된 바이러스가 제1항에서 정의한 생물학적 성질 중 적어도 하나를 갖는지를 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 단계들은 필요시 원하는 복제 특성을 갖는 바이러스가 수득될 때까지 반복될 수 있는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 백시니아 바이러스의 수득 방법.
  26. 제1 유리병/용기 내에서 1차 접종 ("프라이밍 접종") 및 제2 유리병/용기 내에서 2차 접종 ("부스팅 접종")을 위한 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제7항에 따른 조성물 혹은 제8항에 따른 백신 또는 제9항에 따른 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라임/부스트 면역화 키트.
  27. 백신 제조를 위한 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스, 제7항에 따른 조성물 혹은 제8항에 따른 백신 또는 제9항에 따른 바이러스의 용도로서,
    상기 바이러스, 상기 조성물 혹은 상기 백신이 1차 접종 및 2차 접종에서 치료학적으로 유효한 양으로서 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
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