BR0115533B1

BR0115533B1 - Variation of vaccinia ankara modified virus

Info

Publication number: BR0115533B1
Application number: BRPI0115533A
Authority: BR
Inventors: Meisinger Christine; Chaplin Paul; Howley Paul
Original assignee: Bavarian Nordic As
Priority date: 2000-11-23
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2017-11-14
Also published as: US20050271688A1; SI1335987T1; JP2004514436A; DK1335987T3; PL212047B1; US20030215466A1; DK1335987T4; LU92311I2; CZ295808B6; US7384644B2; KR20080032016A; US7335364B2; US20110182933A1; CY1105594T1; EE05680B1; IL154712A0; US20080089907A1; JP4421188B2; EP1598425A1; HUP0400685A2

Abstract

"variação do vírus vaccinia ankara modificado". a presente invenção refere-se a um vírus atenuado, que é derivado do vírus akara vaccinia modificado e que é caracterizado pela perda de sua capacidade de se replicar de forma reprodutiva em linhagens de células humanas. esta descreve ainda vírus recombinantes derivados deste vírus e o uso do vírus ou de seus recombinantes como um medicamento ou uma vacina. adicionalmente, é fornecido um processo para induzir uma resposta imunológica mesmo em pacientes com o sistema imunológico comprometido, em pacientes com imunidade preexistente ao vírus vaccinia ou em pacientes sofrendo terapias antivirais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIAÇÃO DO VÍRUS VACCINIA ANKARA MODIFICADO". A presente invenção refere-se a um vírus atenuado, que é derivado do vírus Vaccinia Ankara Modificado e que é caracterizado pela perda de sua capacidade de se replicar de forma reprodutiva em linhagens de células humanas. Esta descreve também vírus recombinantes derivados deste vírus e o uso do vírus ou de seus recombinantes como medicamento ou vacina. Adicionalmente, é fornecido um método para induzir uma resposta imunológica mesmo em pacientes com o sistema imunológico comprometido, em pacientes com imunidade preexistente ao vírus vaccinia ou em pacientes que estão sofrendo terapia antiviral.

Fundamento da Invenção O vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) está relacionado com o vírus Vaccinia, um membro do gênero Orthopoxvirus na família Poxviridae. O MVA foi gerado por 516 passagens em série da cepa Ankara de vírus vaccinia (CVA) em fibroblastos de embrião de galinha (para revisão ver Mayr, A. e outros. Infection 3, 6-14 [1975]). Como uma conseqüência destas passagens durante longos períodos o vírus MVA resultante deletou aproximadamente 31 quilobases de sua seqüência genômica e, portanto, foi descrito como altamente restrito a células hospedeiras de células de aves (Meyer, H. e outros, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, [1991]). Foi mostrado, em uma variedade de modelos animais que o MVA resultante não possuía virulência significativa (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Adicionalmente, esta cepa de MVA foi testada em testes clínicos como uma vacina para a imunização contra a doença da varíola humana (Mayr e outros, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl e outros, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Estes estudos envolviam mais de 120.000 seres humanos, incluindo pacientes de alto risco e provaram que, comparado com as vacinas com base no Vaccinia, o MVA diminuiu a virulência ou a capacidade de infecção embora mantivesse uma boa imunogeni-cidade.

Nas décadas posteriores o MVA foi engenheirado para ser utili- zado como um vetor viral para a expressão de genes recombinantes ou como uma vacina recombinante (Sutter, G. e outros [1994], Vaccine 12: 1032-40).

Sob este aspecto, é mais surpreendente que muito embora Mayr e outros tenham demonstrado durante os anos 70 que o MVA estivesse altamente atenuado e sem virulência em seres humanos e mamíferos, algumas observações relatadas recentemente (Blanchard e outros, 1998, J Gen Virol 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198-211; Altenber-ger, Patente U.S. Ns 5.185.146; Ambrosini e outros, 1999, J Neurosci Res 55(5), 569) mostraram que o MVA não está completamente atenuado em linhagens de células de mamíferos e de seres humanos uma vez que podia ocorrer uma replicação residual nestas células. É assumido que os resultados relatados nestas publicações tenham sido obtidos com várias cepas de MVA, uma vez que os vírus utilizados diferem essencial mente em relação às suas propriedades, particularmente em seu comportamento de crescimento em várias linhagens de células. O comportamento de crescimento é reconhecido como um indicador para a atenuação do vírus. Geralmente, uma cepa viral é considerada atenuada se esta perdeu sua capacidade ou apenas reduziu a capacidade de se replicar reprodutivamente em células hospedeiras. A observação mencionada anteriormente, de que o MVA não é completamente incompetente em relação à replicação em células humanas e de mamíferos, faz com que se questione a segurança absoluta do MVA como uma vacina humana ou um vetor para vacinas recombinantes.

Particularmente, para uma vacina assim como para uma vacina recombinante o equilíbrio entre a eficiência e a segurança do vírus vetor da vacina é extremamente importante.

Objetivo da invenção Assim, é um objetivo da invenção fornecer novas cepas virais que possuem segurança aumentada para o desenvolvimento de produtos mais seguros, tais como vacinas ou produtos farmacêuticos. Além disso, um objetivo adicional é fornecer meios para melhorar um regime de vacinação existente.

Descrição detalhada da invenção Para atingir os objetivos descritos acima, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção são fornecidos novos vírus vac-cinia, que são capazes de se replicar de forma reprodutiva em células e linhagens de células não-humanas, especialmente em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e na linhagem de células de rins de filhote de hamster BHK (ECACC 85011433), mas que não são capazes de se replicarem de forma reprodutiva em linhagens de células humanas.

As cepas de vaccinia conhecidas se replicam de forma reprodutiva em pelo menos algumas linhagens de células humanas, em particular na linhagem de células de queratinócitos humanos HaCat_(Boukamp e outros. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71). A replicação na linhagem de células HaCat é um prognóstico para a replicação in vivo, em particular, para a replicação in vivo em seres humanos. Na verdade, é mostrado na seção de exemplos que todas as cepas de vaccinia conhecidas testadas que mostram uma replicação produtiva residual em HaCat também se replicam in vivo. Assim, a invenção se refere preferencialmente a vírus vaccinia que não se replicam de forma reprodutiva na linhagem de células humanas HaCat. Mais preferencialmente, a invenção se refere a cepas de vírus vaccinia que não são capazes de se replicar de forma reprodutiva em qualquer uma das linhagens de células humanas a seguir: a linhagem de células de adenocarcinoma de cérvice humano HeLa (ATCC Ng CCL-2), a linhagem de células de rim de embrião humano 293 (ECACC Νθ 85120602), a linhagem de células de os-teossarcoma ósseo humano 143B (ECACC Ne 91112502) e a linhagem de células HaCat. O comportamento de crescimento ou a amplificação/replicação de um vírus é normalmente expressa pela taxa de vírus produzido partindo de uma célula infectada (Saída) para a quantidade utilizada originalmente para infectar as células pela primeira vez (Entrada) ("taxa de amplificação"). Uma taxa de "1" entre a Saída e a Entrada define uma condição de amplificação em que a quantidade de vírus produzido partindo das células infecta- das é a mesma que a quantidade utilizada inicialmente para infectar as células. Esta condição sugere o fato, de que as células infectadas são permissivas para a infecção viral e para a reprodução do vírus.

Uma taxa de amplificação menor que 1, isto é um decréscimo da amplificação abaixo do nível de entrada é um indicador para uma falta de replicação reprodutiva e, assim, um indicador para a atenuação do vírus. Portanto, era de interesse particular para os inventores identificar e finalmente isolar uma cepa, que exibe uma taxa de amplificação menor que 1 em várias linhagens de células humanas, em particular em todas as linhagens de células humanas 143B, HeLa, 293 e HaCat.

Assim, o termo "incapaz de se replicar de forma reprodutiva" significa que o vírus de acordo com a invenção exibe uma taxa de amplificação menor que 1 em linhagens de células humanas, tais como as linhagens de células 293 (ECACC NQ 85120602), 143B (ECACC NQ 91112502), HeLa (ATCC Nõ CCL-2) e HaCat (Boukamp e outros. 1988, J Cell Biol 106(3); 761-71), sob as condições que são resumidas no exemplo 1 do presente relatório descritivo para algumas cepas específicas de MVA. Preferencialmente, a taxa de amplificação do vírus de acordo com a invenção é de 0,8 ou menor em cada uma das linhagens de células humanas HeLa, HaCat e 143B anteriores. É mostrado em detalhes no Exemplo 1 e na tabela 1 que os vírus de acordo com a presente invenção não se replicam de forma reprodutiva em qualquer uma das linhagens de células 143B, HeLa e HaCat. A cepa particular de acordo com a presente invenção que foi utilizada nos exemplos foi depositada na European Collection of Cell Cultures sob o número V00083008. Esta cepa é referida como "MVA-BN" ao longo de todo o relatório descritivo.

As cepas conhecidas de MVA exibem uma replicação residual em pelo menos uma das linhagens de células humanas testadas (figura 1, exemplo 1). Todas as cepas conhecidas de Vaccinia exibem pelo menos alguma replicação na linhagem de células HaCat, enquanto que as cepas de MVA de acordo com a presente invenção, em particular a MVA-BN, não se replicam de forma produtiva em células HaCat. Em mais detalhes, a MVA-BN exibe uma taxa de amplificação de 0,05 até 0,2 na linhagem de células de rins embrionários Humanos 293 (ECACC Nõ 85120602). Na linhagem de células de osteossarcoma ósseo Humano 143B (ECACC Ns 91112502), a taxa está na faixa de 0,0 até 0,6. Para a linhagem de células de adenocarci-noma de cérvice Humano HeLa (ATCC Ns CCL-2) e para a linhagem de células de queratinócitos humanos HaCat (Boukamp e outros. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71) a taxa de amplificação está na faixa de 0,04 até 0,8 e de 0,02 até 0,8, respectivamente. A MVA-BN possui uma taxa de amplificação de 0,01 até 0,06 na célula renal de macaco verde Africano (CV1: ATCC Ns CCL-70). Assim, a MVA-BN que é uma cepa protótipo de acordo com a presente invenção não se replica de forma produtiva em qualquer uma das linhagens de células humanas testadas. A taxa de amplificação da MVA-BN é claramente maior que 1 em fibroblastos de embrião de galinha (CEF: culturas primárias) ou na linhagem de células renais de filhote de hamster BHK (ATCC Νδ CRL-1632). Como é resumido acima, uma taxa maior que "1" indica uma replicação reprodutiva, uma vez que a quantidade de vírus produzida partindo das células infectadas é aumentada comparada com a quantidade de vírus, que foi utilizada para infectar as células. Portanto, o vírus pode ser facilmente propagado e amplificado em culturas primárias de CEF com uma taxa maior que 500 ou em células BHK com uma taxa maior que 50.

Em uma modalidade particular da presente invenção, a invenção se refere a derivados do vírus que são depositados sob ECACC V0083008. Os "derivados" dos vírus que são depositados sob ECACC V00083008 se referem a vírus que exibem essencialmente as mesmas características que as da cepa depositada mas exibem diferenças em uma ou mais partes de seu genoma. Os vírus que possuem as mesmas "características de replicação" que as do vírus depositado são vírus que se replicam com taxas de amplificação similares às taxas da cepa depositada em células CEF e nas linhagens de células BHK, HeLa, HaCat e 143B e que exibem uma replicação in vivo similar à determinada no modelo de camundongos transgênicos AGR129 (ver abaixo).

Em uma modalidade preferida, as cepas de vírus vaccinia de acordo com a presente invenção, em particular a MVA-BN e seus derivados, são caracterizadas por uma falha em se replicarem in vivo. No contexto da presente invenção, a "falha em se replicar in vivo" se refere a vírus que não se replicam em seres humanos e no modelo de camundongos explicado abaixo. A "falha em se replicar in vivo” pode ser preferencialmente determinada em camundongos que são incapazes de produzir células B e T maduras. Um exemplo para tais camundongos é o modelo de camundongos transgênicos AGR129 (obtido de Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurique, Suíça). Esta cepa de camundongos possui interrupções gênicas direcionadas nos genes dos receptores para IFN do tipo I (IFN-oc/β) e do tipo II (IFN-γ) e no RAG. Devido a estas interrupções os camundongos não possuem o sistema de IFN e são incapazes de produzir células B e T maduras e desta maneira são gravemente comprometidos imunologica-mente e altamente suscetíveis a um vírus replicante. Ao invés dos camundongos AGR129 pode ser utilizada qualquer outra cepa de camundongos que seja incapaz de produzir células B e T maduras e desta maneira seja gravemente comprometida imunologicamente e altamente suscetível a um vírus replicante. Em particular, os vírus de acordo com a presente invenção não matam camundongos AGR129 dentro de um período de tempo de pelo menos 45 dias, mais preferencialmente dentro de pelo menos 60 dias, mais preferencialmente dentro de 90 dias após a infecção dos camundongos com vírus a 107 pfu administrado intraversadonealmente. Preferencialmente, os vírus que exibem "falha em se replicar in vivo" são também caracterizados pelo fato de que não se pode recuperar vírus de órgãos ou tecidos dos camundongos AGR129 45 dias, preferencialmente 60 dias e mais preferencialmente 90 dias após a infecção dos camundongos com vírus a 107 pfu administrado intraversadonealmente. Informações detalhadas em relação aos ensaios de infecção com camundongos AGR129 e aos ensaios que são utilizados para determinar se o vírus pode ser recuperado de órgãos e tecidos de camundongos infectados podem ser encontradas na seção de exemplos.

Em uma modalidade preferida as cepas do vírus vaccinia de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN e seus derivados, são caracterizadas por uma imunogenicidade mais alta comparada com a cepa MVA 575 conhecida que é determinada em um modelo de camundon-gos de desafio letal. Os detalhes deste experimento são resumidos no exemplo 2, mostrado abaixo. Sucintamente, em tal modelo um camundongo não vacinado morre após a infecção com cepas de vaccinia competentes em relação à replicação, tais como a cepa L929 TK+ da Western Reserve ou a IHD-J. A infecção com os vírus vaccinia competentes em relação à replicação é referida como "desafio" no contexto da descrição do modelo de desafio letal. Quatro dias após o desafio os camundongos são geralmente mortos e o título viral nos ovários é determinado através de ensaios de placas padronizados utilizando células VERO (para mais detalhes ver a seção de exemplos). O título viral é determinado para camundongos não vacinados e para camundongos vacinados com os vírus vaccinia de acordo com a presente invenção. Mais especificamente os vírus de acordo com a presente invenção são caracterizados pelo fato de que neste teste após a vacinação com vírus a 102 TCIDso/mL de acordo com a presente invenção os títulos de vírus nos ovários são reduzidos em pelo menos 70%, preferencialmente em pelo menos 80%, mais preferencialmente em pelo menos 90% comparados com os dos camundongos não vacinados.

Em uma modalidade preferida, os vírus vaccinia de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN e seus derivados, são úteis para a imunização com a administração de iniciador/reforço (primer/boost) da vacina. Há vários relatos que sugerem que os regimes de prepara-ção/reforço que utilizam o MVA como um vetor de distribuição induzem respostas imunológicas fracas e são inferiores aos regimes de iniciação com DNA e reforço com MVA (Schneider e outros, 1998, Nat. Med. 4; 397-402). Em todos estes estudos foram utilizadas cepas de MVA que são diferentes dos vírus vaccinia de acordo com a presente invenção. Para explicar a resposta imunológica fraca, se o MVA for utilizado para a administração de ini-ciador e de reforço foi levantada a hipótese de que os anticorpos gerados para o MVA durante a administração de iniciador neutralizam o MVA fornecido na segunda imunização, prevenindo um reforço eficiente da resposta imunológica. Em contraste, é relatado que os regimes de iniciador com DNA/reforço com MVA são superiores em gerar respostas com alta avidez, porque este regime combina a capacidade do DNA de iniciar eficientemente a resposta imunológica com as propriedades do MVA para reforçar esta resposta na ausência de uma imunidade preexistente para MVA. De forma evidente, se uma imunidade preexistente ao MVA e/ou ao vaccinia prevenir o reforço da resposta imunológica então, o uso do MVA como uma vacina ou agente terapêutico teria uma eficiência limitada, particularmente nos indivíduos que foram vacinados contra a varíola. Entretanto, de acordo com uma modalidade adicional o vírus vaccinia de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN e seus derivados assim como os vírus recombi-nantes correspondentes que carregam seqüências heterólogas, podem ser utilizados para iniciar de forma eficiente e então reforçar as respostas imunológicas em animais nativos assim como em animais com uma imunidade preexistente aos vírus pox. Assim, o vírus vaccinia de acordo com a presente invenção induz pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade nos regimes de iniciação com vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia comparado com os regimes de preparação com DNA/reforço com o vírus vaccinia.

Um vírus vaccinia é considerado como indutor pelo menos substancialmente no mesmo nível da imunidade em regimes de iniciação com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia quando comparado com regimes de iniciação com DNA/reforço com o vírus vaccinia se a resposta de CTL que é medida em um dos dois ensaios a seguir ("ensaio 1" e "ensaio 2"), preferencialmente nos dois ensaios, for pelo menos substancialmente a mesma nos regimes de iniciação com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia quando comparados com regimes de iniciação com DNA/reforço com o vírus vaccinia. Mais preferencialmente, a resposta de CTL após a administração de iniciador com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia é mais alta em pelo menos um dos ensaios, quando comparada com os re- gimes de iniciação com DNA/reforço com o vírus vaccinia. Mais preferencialmente, a resposta de CTL é mais alta em ambos os ensaios a seguir.

Ensaio 1: Para as administrações de iniciador com o vírus vacci-nia/reforço com o vírus vaccinia camundongos BALB/c (H-2d) de 6-8 semanas de idade recebem imunização preparatória através da administração intravenosa com vírus vaccinia a 107 TCID50 de acordo com a presente invenção expressando o polítopo murino que é descrito em Thomson e outros, 1988, J. Immunol. 160, 1717 e recebem a imunização de reforço com a mesma quantidade do mesmo vírus, administrada da mesma maneira três semanas depois. Para esta finalidade, é necessário construir um vírus vaccinia recombinante que expressa o dito polítopo. Os métodos de construção de tais vírus recombinantes são conhecidos pelos versados na técnica e são descritos em maiores detalhes abaixo. Em regimes de iniciador com DNA/reforço com 0 vírus vaccinia a vacinação preparatória é feita através da injeção intramuscular dos camundongos com 50 pg do DNA expressando o mesmo antígeno que o do vírus vaccinia; a administração de reforço com o vírus vaccinia é feita exatamente da mesma maneira que para a administração de iniciador com o vírus vaccinia/de reforço com o vírus vaccinia. O DNA plasmideal que expressa o polítopo é também descrito na publicação referenciada anteriormente de Thomson e outros. Em ambos os regimes o desenvolvimento de uma resposta de CTL contra os epitopos SYIPSAEKI, RPQASGVYM e/ou YPHFMPTNL é determinada duas semanas após a administração de reforço. A determinação da resposta de CTL é preferencialmente feita através da utilização da análise de ELISPOT que é descrita por Schneider e outros, 1998, Nat. Med. 4, 397-402 e que é resumida na seção de exemplos abaixo para um vírus específico de acordo com a presente invenção. O vírus de acordo com a presente invenção é caracterizado neste experimento pelo fato de que a resposta imunológica de CTL contra os epitopos mencionados acima que é induzida pela administração de iniciador com o vírus vaceinia/reforço com o vírus vaccinia é substancialmente a mesma, preferencialmente pelo menos a mesma que a induzida pela administração de iniciador com o DNA/reforço com o vírus vaccinia que é avalia- da pelo número de células produtoras de IFN-γ/Ι O6 células do baço (ver também a seção de experimentos).

Ensaio 2: Este ensaio corresponde basicamente ao ensaio 1. Entretanto, ao invés de utilizar vírus vaccinia a 107 TCID50 administrado i.v. como no ensaio 1, neste ensaio 0 vírus vaccinia a 108 TCID50 de acordo com a presente invenção é administrado subcutaneamente para a imunização preparatória e para a imunização de reforço. O vírus de acordo com a presente invenção é caracterizado neste experimento pelo fato de que a resposta imunológica de CTL contra os epitopos mencionados anteriormente que é induzida através da administração de iniciador com o vírus vacci-nia/reforço com o vírus vaccinia é substancialmente a mesma, preferencialmente pelo menos a mesma que a induzida pela administração de preparação com DNA/reforço com o vírus vaccinia que é avaliada através do número de células produtoras de IFN-y/106 células do baço (ver também a seção de experimentos). A força de uma resposta de CTL que é medida em um dos ensaios exibidos anteriormente corresponde ao nível de proteção.

Assim, os vírus de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para as finalidades de vacinação.

Em resumo, 0 vírus vaccinia de acordo com a presente invenção é caracterizado por possuir pelo menos uma das propriedades a seguir: (i) capacidade de se replicar de forma reprodutiva em fibroblas-tos de embrião de galinha (CEF) e na linhagem de células BHK, mas nenhuma capacidade de se replicar de forma reprodutiva na linhagem de células humanas HaCat, (ii) falha em se replicar in vivo, (íii) indução de uma imunogenicidade mais alta comparada com a da cepa MVA 575 conhecida (ECACC V00120707) em um modelo de desafio letal e/ou (iv) indução de pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade nos regimes de iniciador com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia quando comparado com o dos regimes de iniciador com DNA/reforço com o vírus vaceinia.

Preferencialmente, o vírus vaccinia de acordo com a presente invenção possui pelo menos duas das propriedades anteriores, mais preferencialmente pelo menos três das propriedades anteriores. São mais preferidos os vírus vaccinia que possuem todas as propriedades anteriores.

Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a um kit para vacinação que compreende um vírus de acordo com a presente invenção para a primeira vacinação ("iniciador") em um primeiro frasco/recipiente e para uma segunda vacinação ("reforço") em um segundo frasco/recipiente. O vírus pode ser um vírus vaccinia não-recombinante, isto é um vírus vaccinia que não contém seqüências nucleotídicas heterólogas. Um exemplo para tal vírus vaccinia é o MVA-BN e seus derivados. Altemativamente, o vírus pode ser um vírus vaccinia recombinante que contém seqüências nucleotídicas adicionais que são heterólogas em relação ao vírus vaccinia. Como é resumido em outras seções da descrição, as seqüências heterólogas podem codificar epitopos que induzem uma resposta pelo sistema imunológico. Assim, é possível utilizar o vírus vaccinia recombinante para vacinar contra as proteínas ou agentes que compreendem o dito epitopo. Os vírus podem ser formulados como é mostrado abaixo em maiores detalhes. A quantidade de vírus que pode ser utilizada para cada vacinação foi definida anteriormente.

Um versado na técnica sabe como se pode obter vírus Vaccinia que possuem pelo menos uma das propriedades a seguir: - capacidade de se replicar de forma reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e na linhagem de células renais de filhote de hamster BHK, mas nenhuma capacidade de se replicar de forma reprodutiva na linhagem de células de queratinócitos humanos HaCat, - falha em se replicar in vivo, - indução de uma imunogenicidade mais alta comparada com a da cepa MVA 575 conhecida em um modelo de desafio letal e/ou - indução de pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade nos regimes de iniciação com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia quando comparado com o dos regimes de preparação com DNA/reforço com o vírus vaccinia.

Um processo para a obtenção de tal vírus pode compreender as etapas a seguir: (i) introdução de uma cepa de vírus vaccinia conhecida, preferencialmente o MVA 574 ou o MVA 575 (ECACC V00120707) em células não-humanas nas quais o vírus é capaz de se replicar de forma reprodutiva, em que as células não-humanas são preferencialmente selecionadas das células CEF e da linhagem de células BHK, (ii) isolamento/enriquecimento de partículas virais provenientes destas células e (iii) analisar se o vírus obtido possui pelo menos uma das propriedades biológicas desejadas que são definidas anteriormente, em que as etapas acima podem ser repetidas opcionalmente até que um vírus com as características de replicação desejadas seja obtido. A invenção se refere ainda a vírus obtidos por este método de acordo com a presente invenção. Os métodos pelos quais as propriedades biológicas desejadas podem ser determinadas são explicados em outras partes desta descrição.

Na aplicação deste método, os inventores identificaram e isolaram em vários ciclos de purificação de clones uma cepa de acordo com a presente invenção partindo da passagem 575 do isolado de MVA (MVA 575). Esta nova cepa corresponde à cepa com o número de acesso ECACC V0083008, mencionada anteriormente. O comportamento de crescimento dos vírus vaccinia de acordo com a presente invenção, em particular o comportamento de crescimento do MVA-BN, indica que as cepas de acordo com a presente invenção são muito superiores a qualquer outro isolado de MVA caracterizado até agora em relação à atenuação em linhagens de células humanas e à falha de se replicarem in vivo. As cepas de acordo com a presente invenção são, portanto, candidatas ideais para o desenvolvimento de produtos mais seguros, tais como vacinas ou produtos farmacêuticos que serão descritos abaixo.

Em uma modalidade, o vírus de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN e seus derivados, é utilizado como uma vacina contra doenças causadas pelo vírus pox humano tais como a varíola. Em uma modalidade adicional, o vírus de acordo com a presente invenção pode ser recombinante, isto é pode expressar genes heterólogos como, por exemplo, antígenos ou epitopos heterólogos ao vírus e pode ser assim útil como uma vacina para induzir uma resposta imunológica contra antígenos ou epitopos heterólogos. O termo "resposta imunológica" significa a reação do sistema imunológico, quando uma substância ou microorganismo estranho entra no organismo. Por definição, a resposta imunológica é dividida em uma reação específica e uma reação não-específica embora ambas possuam reação cruzada de forma próxima. A resposta imunológica não-específica é a defesa imediata contra uma ampla variedade de substâncias estranhas e agentes infecciosos. A resposta imunológica específica é a defesa produzida após uma fase de atraso, quando o organismo é desafiado com uma substância pela primeira vez. A resposta imunológica específica é altamente eficiente e é responsável pelo fato de que um indivíduo que se recupera de uma infecção específica fica protegido contra esta infecção específica. Assim, uma segunda infecção com o mesmo ou com um agente infeccioso muito similar produz sintomas muito mais brandos ou nenhum sintoma, uma vez que já existe uma "imunidade preexistente" a este agente. Tal imunidade e a memória imunológica, respectivamente, persistem durante um longo período de tempo, em alguns casos até mesmo durante toda a vida. Conse-qüentemente, a indução de uma memória imunológica pode ser utilizada para a vacinação. O "sistema imunológico" significa um órgão complexo envolvido na defesa do organismo contra substâncias e microorganismos estranhos. O sistema imunológico compreende uma parte celular compreendendo vários tipos celulares, tais como, por exemplo, linfócitos e outras células derivadas das células brancas do sangue e uma parte humoral compreendendo pequenos peptídeos e fatores do complemento. "Vacinação" significa que um organismo é desafiado com um agente infeccioso, por exemplo, em uma forma atenuada ou inativa do dito agente infeccioso, para induzir uma imunidade específica. O termo vacinação cobre ainda o desafio de um organismo com vírus vaccinia recombi-nantes de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN e seus derivados, que expressam antígenos ou epitopos que são heterólogos ao vírus. Os exemplos para tais epitopos são fornecidos em outras partes da descrição e cobrem, por exemplo, os epitopos de proteínas derivadas de outros vírus, tais como o vírus da Dengue, o vírus da Hepatite C, HIV ou epitopos derivados de proteínas que estão associadas com o desenvolvimento de tumores e câncer. Após a administração do vírus vaccinia recom-binante no corpo os epitopos são expressos e são apresentados para o sistema imunológico e uma resposta imunológica específica contra estes epitopos pode ser induzida. O organismo, assim, é imunizado contra o agen-te/proteína contendo o epitopo que é codificado pelo vírus vaccinia recombi-nante. "Imunidade" significa uma proteção parcial ou completa de um organismo contra doenças causadas por um agente infeccioso devido a uma eliminação bem sucedida de uma infecção anterior com o dito agente infeccioso ou uma parte característica do mesmo. A imunidade está baseada na existência, na indução e na ativação de células especializadas do sistema imunológico.

Como é salientado anteriormente em uma modalidade da invenção, os vírus recombinantes de acordo com a presente invenção, em particular o MVA-BN recombinante e seus derivados, contêm pelo menos uma seqüência de ácido nucléico heteróloga. O termo "heteróloga" é utilizado posteriormente aqui para qualquer combinação de seqüências de ácido nucléico que não é encontrada normalmente associada intimamente com o vírus na natureza, tal vírus é também chamado de "vírus recombinante".

De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, as seqüências heterólogas são preferencialmente epitopos antigênicos, que são selecionados de qualquer fonte sem ser proveniente do vaccinia. Mais preferencialmente, o dito vírus recombinante expressa um ou mais epitopos antigênicos do Plasmodium falciparum, de Micobactérias, do vírus Influenza, de vírus selecionados da família dos Flavivírus, de Paramyxovirus, dos vírus da Hepatite, dos vírus da imunodeficiência Humana ou de vírus que causam febre hemorrágica, tais como os Hantavírus ou os Filovírus, isto é, Ebola ou vírus Marburg.

Ainda de acordo com uma modalidade adicional, mas também em adição à seleção de epitopos antigênicos mencionados anteriormente, as seqüências heterólogas podem ser selecionadas de uma outra fonte poxviral ou de vaccinia. Estas seqüências virais podem ser utilizadas para modificar o espectro de hospedeiros ou a imunogenicidade do vírus.

Em uma modalidade adicional, o vírus de acordo com a presente invenção pode codificar um gene/ácido nucléico heterólogo que expressa um composto terapêutico. Um "composto terapêutico" codificado pelo ácido nucléico heterólogo no vírus pode ser, por exemplo, um ácido nucléico terapêutico, tal como um ácido nucléico de sentido oposto ou um peptídeo ou uma proteína com atividade biológica desejada.

De acordo com uma modalidade adicional preferida, a expressão da seqüência de ácido nucléico heteróloga está preferencialmente, mas não exclusivamente, sob o controle transcricional de um promotor de vírus pox, mais preferencialmente de um promotor de vírus vaccinia.

Ainda de acordo com uma modalidade adicional, a inserção de uma seqüência de ácido nucléico heteróloga é feita preferencialmente em uma região não-essencial do genoma do vírus. Em uma outra modalidade preferida da invenção, a seqüência de ácido nucléico heteróloga é inserida em um sítio de deleção que ocorre naturalmente do genoma do MVA (divulgado no PCT/EP96/02926). Os métodos que possibilitam a inserção de seqüências heterólogas no genoma viral de pox são conhecidos por um versado na técnica.

De acordo com uma outra modalidade preferida adicional, a invenção inclui ainda o genoma do vírus, seus recombinantes ou partes funcionais dos mesmos. Tais seqüências virais podem ser utilizadas para a identificação ou para o isolamento do vírus ou de seus recombinantes, por exemplo, através da utilização da PCR, das tecnologias de hibridização ou através do estabelecimento de ensaios de ELISA. Além disso, tais seqüên-cias virais podem ser expressas partindo de um vetor de expressão para produzir a proteína ou o peptídeo codificado que então pode suplementar mutantes de deleção de um vírus que não possui a seqüência viral contida no vetor de expressão. "Parte funcional" do genoma viral significa uma parte da seqüência genômica completa, que codifica uma entidade física, tal como uma proteína, um domínio de proteína, um epitopo de uma proteína. A parte funcional do genoma viral descreve também partes da seqüência genômica completa, que codifica elementos reguladores ou partes de tais elementos com atividade que pode ser individualizada, tais como elementos promotores, intensificadores, que atuam em cis ou em trans. O vírus recombinante de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a introdução da seqüência de ácido nucléico heteróloga em uma célula alvo, a dita seqüência sendo homóloga ou heteróloga em relação à célula alvo. A introdução de uma seqüência de ácido nucléico heteróloga em uma célula alvo pode ser utilizada para produzir peptídeos ou po-lipeptídeos heterólogos in vitro e/ou completar vírus codificados pela dita seqüência. Este método compreende a infecção de uma célula hospedeira com o MVA recombinante, o cultivo da célula hospedeira infectada sob condições adequadas e o isolamento e/ou o enriquecimento do peptídeo, proteína e/ou vírus produzido pela dita célula hospedeira.

Além disso, o método para introduzir uma seqüência homóloga ou heteróloga em células pode ser aplicado para terapia in vitro ou preferencialmente in vivo. Para a terapia in vitro, as células isoladas que foram previamente infectadas (ex vivo) com o vírus são administradas ao corpo do animal vivo para induzir uma resposta imunológica. Para a terapia in vivo, o vírus ou seus recombinantes são administrados diretamente ao corpo do animal vivo para induzir uma resposta imunológica. Neste caso, as células que circundam o local da inoculação são infectadas diretamente in vivo pelo vírus ou seus recombinantes de acordo com a invenção.

Uma vez que o vírus de acordo com a invenção tem crescimento altamente restrito em células humanas e de macacos e, assim, é altamente atenuado, é ideal tratar uma ampla faixa de mamíferos incluindo os seres humanos. Conseqüentemente, a presente invenção fornece também uma composição farmacêutica e uma vacina, por exemplo, para induzir uma resposta imunológica no corpo de um animal vivo, incluindo um ser humano. O vírus da invenção é também seguro em quaisquer outros protocolos de terapia gênica. A composição farmacêutica pode incluir de forma geral um ou mais veículos, aditivos, antibióticos, conservantes, adjuvantes, diluentes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis e/ou aprovados. Tais substâncias auxiliares podem ser água, solução salina, glicerol, etanol, agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tamponadoras de pH ou similares. Os veículos adequados são tipicamente moléculas lentamente metaboli-zadas grandes, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos, agregados de lipídeos ou similares.

Para a preparação de vacinas, o vírus ou seus recombinantes de acordo com a invenção são convertidos em uma forma aceitável fisiologica-mente. Isto pode ser feito com base na experiência na preparação de vacinas de vírus pox utilizadas para a vacinação contra a varíola (que são descritas por Stickl, H. e outros [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Por exemplo, o vírus purificado é armazenado a -80°C com um título de 5x108 TCID5o/mL formulado em aproximadamente Tris 10 mM, NaCI 140 mM pH 7,4. Para a preparação de injeções para vacina, por exemplo, 102-108 partículas do vírus são liofilizadas em 100 ml_ de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de peptona a 2% e albumina humana a 1% em uma ampola, preferencialmente uma ampola de vidro. Alternativamente, as injeções para vacina podem ser produzidas através da secagem por congelamento do vírus em etapas em uma formulação. Esta formulação pode conter aditivos adicionais, tal como manitois, dextrano, açúcar, glicina, lacto-se ou polivinilpirrolidona ou outros aditivos, tais como antioxidantes ou gás inerte, estabilizantes ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina do soro humano) adequados para a administração in vivo. A ampola de vidro é, então, selada e pode ser armazenada entre 4°C e a temperatura ambiente durante vários meses. Entretanto, enquanto não houver necessidade a ampola é armazenada preferencialmente a temperaturas abaixo de -20°C.

Para a vacinação ou para terapia, o liofilizado pode ser dissolvido em 0,1 até 0,5 ml_ de uma solução aquosa, preferencialmente solução salina fisiológica ou tampão Tris e administrado de forma sistêmica ou local, isto é, de origemmente, intramuscularmente ou qualquer outra via de administração conhecida pelo versado. O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser otimizados pelos versados na técnica de uma maneira conhecida.

Adicionalmente, de acordo com uma modalidade adicional o vírus de acordo com a presente invenção é particularmente útil para induzir respostas imunológicas em animais comprometidos imunologicamente, por exemplo, macacos (CD4 < 400/μΙ_ de sangue) infectados com SIV ou em seres humanos comprometidos imunologicamente. O termo "comprometido imunologicamente" descreve a condição do sistema imunológico de um indivíduo, que exibe apenas respostas imunológicas incompletas ou possui uma eficiência reduzida na defesa contra agentes infecciosos. Ainda de forma mais interessante e também de acordo com uma modalidade adicional, o vírus de acordo com a presente invenção pode reforçar respostas imunológicas em animais ou seres humanos comprometidos imunologicamente, mesmo na presença de uma imunidade preexistente a vírus pox nestes animais ou seres humanos. De forma particularmente interessante o vírus de acordo com a presente invenção podia também reforçar respostas imunológicas em animais ou seres humanos que estavam sofrendo uma terapia antiviral, por exemplo, anti-retroviral. "Terapia anti-retroviral" inclui conceitos terapêuticos com a finalidade de eliminar ou reprimir a infecção viral incluindo, por exemplo, (i) a aplicação de análogos de nucleotídeos, (ii) a aplicação de inibidores para a atividade enzimática ou para a montagem viral ou (iii) a aplicação de citocinas para influenciar as respostas imunológicas do hospedeiro.

Ainda de acordo com uma modalidade adicional, a vacina é es- pecialmente, mas não exclusivamente, aplicável no campo veterinário, por exemplo, para a imunização contra a infecção de animais por pox. Em pequenos animais, a inoculação para a imunização é preferencialmente realizada de origemmente ou pela via nasal, enquanto que em animais maiores ou seres humanos é preferida uma inoculação subcutânea, intramuscular ou oral.

Foi descoberto pelos inventores que uma injeção para vacina contendo uma dose eficiente de apenas 102 TCID50 (dose infecciosa para cultura de tecido) do vírus de acordo com a presente invenção já é suficiente para induzir a imunidade completa contra um desafio do vírus vaccinia do tipo selvagem em camundongos. Isto é particularmente surpreendente uma vez que seria esperado que tal grau alto de atenuação do vírus de acordo com a presente invenção influenciaria de forma negativa e, desta maneira, reduziría sua imunogenicidade. Tal expectativa é baseada na crença de que para a indução de uma resposta imunológica os epitopos antigênicos precisam ser apresentados para o sistema imunológico em uma quantidade suficiente. Um vírus que está altamente atenuado e, assim, não se replica, pode apresentar apenas uma quantidade muito pequena de epitopos antigênicos, que é quanto ele próprio incorpora. Esta quantidade de antígeno, carregada pelas partículas virais, não era considerada suficiente para a indução de uma resposta imunológica potente. Entretanto, o vírus de acordo com a invenção estimula mesmo com uma dose eficiente muito baixa de apenas 102 TCID5o uma resposta imunológica protetora e potente em um modelo de desafio de camundongo/vaccinia. O vírus de acordo com a presente invenção exibe assim uma imunogenicidade inesperada e até mesmo aumentada comparada com a de outras cepas de MVA caracterizadas até agora. Esta alta imunogenicidade torna 0 vírus de acordo com a presente invenção e qualquer vacina derivada do mesmo especialmente útil para a aplicação em animais ou seres humanos comprometidos imunologicamente.

Ainda de acordo com uma outra modalidade da invenção, o vírus é utilizado como um adjuvante. Um "adjuvante" no contexto da presente descrição se refere a um intensificador da resposta imunológica específica nas vacinas. "A utilização do vírus como um adjuvante" significa a inclusão do vírus em uma vacina preexistente para estimular adicionalmente o sistema imunológico do paciente que recebe a vacina. O efeito de imunização de um epitopo antigênico na maioria das vacinas é freqüentemente intensificado através da adição de um assim chamado adjuvante. Um adjuvante co-estimula o sistema imunológico porque causa uma reação imunológica específica mais forte contra um epitopo antigênico de uma vacina. Este estímulo pode ser regulado por fatores do sistema imunológico não-específico, tais como interferon e interleucina.

Conseqüentemente, em uma modalidade adicional da invenção, o vírus é utilizado em mamíferos incluindo seres humanos para ativar, dar apoio ou reprimir o sistema imunológico e preferencial mente para ativar a resposta imunológica contra qualquer determinante antigênico. O vírus pode ser também utilizado para dar apoio ao sistema imunológico em uma situação de suscetibilidade aumentada contra infecções, tal como no caso de estresse. O vírus utilizado como um adjuvante pode ser um vírus não-recombinante, isto é um vírus que não contém DNA heterólogo em seu ge-noma. Um exemplo para este tipo de vírus é o MVA-BN. Alternativamente, o vírus que é utilizado como um adjuvante é um vírus recombinante que contém em seu genoma seqüências de DNA heterólogo que não estão naturalmente presentes no genoma viral. Para uso como um adjuvante, o DNA viral recombinante do vírus contém e expressa preferencialmente genes que codificam peptídeos ou proteínas estimuladoras imunológicas, tais como as interleucinas.

De acordo com uma modalidade adicional, é preferido que o vírus esteja inativado, quando utilizado como um adjuvante ou adicionado a uma outra vacina. A inativação do vírus pode ser realizada, por exemplo, através de calor ou de produtos químicos, como é conhecido na técnica. Preferencialmente, o vírus é inativado por β-propiolactona. De acordo com esta modalidade da invenção, o vírus inativado pode ser adicionado às vacinas contra várias doenças infecciosas ou proliferativas para aumentar a res- posta imunológica do paciente a esta doença.

Sumário da Invenção A invenção inter alia compreende o que vem a seguir, sozinho ou em combinação: Vírus Vaccinia que possui pelo menos uma das propriedades a seguir: - capacidade de se replicar de forma reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e na linhagem de células renais de filhotes de hamster BHK, mas nenhuma capacidade de se replicar de forma reprodutiva na linhagem de células de queratinócitos humanos HaCat, - falha em se replicar in vivo, - indução de uma imunogenicidade mais alta comparada com a da cepa MVA 575 conhecida em um modelo de desafio letal e/ou - indução de pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade nos regimes de iniciação com o vírus vaccinia/reforço com o vírus vaccinia quando comparado com o dos regimes de iniciação com DNA/reforço com o vírus vaccinia. O vírus como acima, em que o vírus não é capaz de se replicar de forma reprodutiva em qualquer uma das linhagens de células humanas a seguir: a linhagem de células renais de embrião humano 293, a linhagem de células de osteossarcoma ósseo humano 143B e a linhagem de células de adenocarcinoma de cérvice humano HeLa. O vírus como acima estando depositado na European Collection of Cell Cultures (ECACC - Coleção Européia de Cultura de Células), Salis-bury (Reino Unido) sob o número V00083008 e derivados do mesmo. O vírus como acima que compreende pelo menos uma seqüên-cia de ácido nucléico heteróloga. O vírus como acima, em que a dita seqüência de ácido nucléico heteróloga é selecionada de uma seqüência que codifica pelo menos um antígeno, um epitopo antigênico e/ou um composto terapêutico.

Genoma ou partes funcionais do mesmo derivados do vírus como definido acima.

Composição farmacêutica que compreende o vírus como acima e/ou o genoma e/ou a parte funcional do mesmo como definido acima e um veículo, diluente e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável.

Vacina que compreende o vírus como acima e/ou o genoma e/ou parte funcional do mesmo como definido acima. O vírus como acima, o genoma e/ou parte funcional do mesmo como definido acima, a composição como definida acima ou a vacina como definida acima como uma droga para afetar, preferencialmente induzir, uma resposta imunológica em um animal vivo, incluindo um ser humano. O vírus como acima, a composição farmacêutica como definida acima, a vacina como definida acima ou o vírus como definido acima, em que o vírus, a composição ou a vacina é administrada em quantidades tera-peuticamente eficientes em uma primeira inoculação ("inoculação de iniciação") e em uma segunda inoculação ("inoculação de reforço").

Uso do vírus como acima e/ou do genoma como definido acima, para a preparação de um medicamento ou de uma vacina. Método para a introdução de seqüências de ácido nucléico homólogas e/ou heterólogas em células alvo que compreende a infecção das células alvo com o vírus que compreende as seqüências heterólogas que são definidas anteriormente ou a transfecção da célula alvo com o genoma como é definido anteriormente. Método para a produção de um peptídeo, uma proteína e/ou um vírus que compreende - a infecção de uma célula hospedeira com o vírus como acima, - o cultivo da célula hospedeira infectada sob condições adequadas e - o isolamento e/ou o enriquecimento do peptídeo e/ou da proteína e/ou dos vírus produzidos pela dita célula hospedeira. Método para afetar, preferencialmente induzir uma resposta imunológica no corpo de um animal vivo que inclui um ser humano que compreende a administração do vírus como acima, o genoma e/ou a parte funcional do mesmo como definido acima, a composição como definida acima ou a vacina como definida acima ao animal ou ao ser humano a ser tratado. Método como acima que compreende a administração de pelo menos 102 TCID50 (dose infecciosa para cultura de tecido) do vírus. Método como acima, em que o vírus, a composição ou a vacina é administrada em quantidades eficientes terapeuticamente em uma primeira inoculação ("inoculação de iniciação") e em uma segunda inoculação ("ino-culação de reforço"). O método como acima, em que o animal é comprometido imunologicamente. O método como acima, em que o animal possui uma imunidade preexistente a vírus pox. O método como acima, em que o animal está sofrendo uma terapia antiviral. O método em que o animal está sofrendo uma terapia antiviral, caracterizado pelo fato de que a terapia antiviral é uma terapia anti-retroviral.

Uso do vírus como acima, do genoma e/ou de parte funcional do mesmo como definido acima como adjuvante.

Um método para intensificar uma resposta imunológica específica contra um antígeno e/ou epitopo antigênico incluído em uma vacina que compreende a administração do vírus como acima ou do genoma como definido acima, como um adjuvante ao corpo de um animal vivo incluindo um ser humano a ser tratado com a vacina. O vírus como acima ou o genoma como definido acima, como adjuvante.

Uma célula, preferencialmente uma célula humana, contendo o vírus como acima ou o genoma ou parte funcional do mesmo como definido acima. Método para a obtenção do vírus vaccinia como acima que compreende as etapas a seguir: - introdução de uma cepa de vírus vaccinia comumente disponível, preferencialmente o MVA 575 em células não-humanas nas quais o vírus é capaz de se replicar de forma reprodutiva, em que as células não- humanas são preferencialmente selecionadas das células CEF e da linhagem de células BHK, - isolamento/enriquecimento de partículas virais provenientes destas células e - analisar se o vírus obtido possui pelo menos uma das propriedades biológicas que são definidas anteriormente, em que as etapas acima podem ser repetidas opcionalmente até que um vírus com as características de replicação desejadas seja obtido.

Kit para imunização de iniciador/reforço que compreende um vírus como acima, uma vacina como acima ou o vírus como droga como definido anteriormente para uma primeira inoculação ("inoculação de iniciação") em um primeiro frasco/recipiente e para uma segunda inoculação ("inoculação de reforço") em um segundo frasco/recipiente.

Uso do vírus como acima, da composição como definido anteriormente e/ou da vacina como definido anteriormente para a preparação de uma vacina em que o vírus, a composição ou a vacina é administrada em uma inoculação de iniciação e em que o mesmo vírus ou vacina é administrada em uma inoculação de reforço.

Breve Descrição das Figuras Figura 1: Cinética de crescimento de cepas diferentes de MVA em linhagens de células diferentes. Na parte A) os resultados estão agrupados de acordo com as cepas de MVA testadas enquanto que na parte B) os resultados estão agrupados de acordo com as linhagens de células testadas. B) A quantidade de vírus recuperada de uma linhagem de células após quatro dias (D4) de cultivo foi determinada através de ensaio de placas e expressa na forma da razão de vírus recuperado após 4 dias para o inóculo inicial no dia 1 (D1).

Figura 2: Proteção fornecida contra um desafio letal do vaccinia após vacinações com MVA-BN ou MVA 575. A proteção é medida através da redução nos títulos dos ovários determinados 4 dias após o desafio por ensaio de placas padronizado.

Figura 3: Indução de CTL e de proteção fornecida contra um desafio com influenza utilizando regimes de iniciação-reforço diferentes. 3A: Indução de respostas de CTL a 4 epitopos restritos a H-2d diferentes após vacinações com combinações diferentes de vacinas de DNA ou de MVA-BN que codificam um polítopo murino. Os camundongos BALB/c (5 por grupo) foram vacinados com DNA (intramuscularmente) ou com MVA-BN (subcutaneamente) e receberam imunizações de reforço três semanas depois. As respostas de CTL a 4 epitopos diferentes codificados pelas vacinas (TYQRTRALV, influenza; SYIPSAEKI, P. bergher, YPHFMPTNL, Cito-megalovírus; RPQASGVYM, LCV) foram determinadas utilizando um ensaio de ELISPOT 2 semanas após as imunizações de reforço. 3B: Indução de respostas de CTL a 4 epitopos diferentes após vacinações com combinações diferentes de vacinas de DNA ou de MVA-BN que codificam um polítopo murino. Os camundongos BALB/c (5 por grupo) foram vacinados com DNA (intramuscularmente) ou com MVA-BN (intrave-nosamente) e receberam imunizações de reforço três semanas depois. As respostas de CTL a 4 epitopos diferentes codificados pelas vacinas (TYQRTRALV, influenza; SYIPSAEKI, P. bergher, YPHFMPTNL, Citomegalovírus; RPQASGVYM, LCV) foram determinadas utilizando um ensaio de ELISPOT 2 semanas após as imunizações de reforço. 3C: Freqüência de células T específicas aos peptídeos e ao MVA após a preparação-reforço homóloga utilizando uma dose ótima (1 x 108 TCID50) de MVA-BN recombinante, fornecida subcutaneamente. Grupos de 8 camundongos foram vacinados com duas injeções das combinações como é indicado na figura. Duas semanas após a vacinação final o número de esplenócitos específicos ao peptídeo foi medido utilizando um ensaio de ELISPOT com INF-γ. As barras representam o número médio de pontos específicos mais/menos o desvio padrão da média.

Figura 4: Carga de SIV de macacos vacinados com MVA-BN nef ou com MVA-BN.

Figura 5: Sobrevivência de macacos vacinados após a infecção com SIV.

Figura 6: Títulos de anticorpos no soro de macacos para MVA- BN. Os títulos de anticorpos para cada animal são exibidos através de formatos diferentes, enquanto que o título médio é ilustrado na forma de um retângulo preenchido.

Figura 7: Níveis de SIV em macacos comprometidos imunologi-camente (CD4 < 400 mL de sangue) após vacinações com MVA-BN que codifica tat. Os macacos tinham recebido anteriormente três vacinações com MVA-BN ou MVA-BN nef (semana 0, 8, 16) e tinham sido infectados com um isolado patogênico de SIV (semana 22). Nas semanas 100, 102 e 106 (indicadas por setas) os macacos foram vacinados com o MVA-BN tat.

Figura 8: Níveis de SIV em macacos sofrendo terapia anti-retroviral e vacinações terapêuticas utilizando MVA-BN. Três grupos de macacos (n = 6) foram infectados com SIV e tratados diariamente com PMPA (indicado pela linha preta). Nas semanas 10 e 16 os animais foram vacinados (indicado por setas) com misturas de MVA recombinante ou com solução salina.

Figura 9: Resposta humoral gerada para SIV após infecção e vacinações com MVA recombinante. Três grupos (n = 6) de macacos foram infectados com um isolado patogênico de SIV (semana 0) e então tratados com a terapia anti-retroviral (PMPA; indicado pela linha em negrito). Os macacos foram vacinados com misturas de MVA recombinante ou com solução salina nas semanas 10 e 16. Os anticorpos para SIV foram determinados utilizando lisados de células T infectadas como antígeno em um ELISA padronizado.

Figura 10: Resposta humoral gerada para MVA em macacos infectados por SIV sofrendo terapia anti-retroviral. Três grupos (n = 6) de macacos foram infectados com um isolado patogênico de SIV (semana 0) e então tratados com a terapia anti-retroviral (PMPA; indicado pela linha em negrito). Os macacos foram vacinados com misturas de MVA recombinante ou com solução salina nas semanas 10 e 16. Os anticorpos para MVA foram determinados utilizando um ELISA de captura padronizado para MVA.

Figura 11: Indução de anticorpos para MVA após vacinação de camundongos com vacinas diferentes para varíola. Os níveis de anticorpos gerados para MVA após as vacinações com MVA-BN (semanas 0 e 4), foram comparados com os para as cepas de vaccina convencionais, Elstree e Wyeth, fornecidas através da escarificação da cauda (semana 0), MVA 572 (semanas 0 e 4) e MVA-BN e MVA 572 fornecidas como uma vacina pré-Elstree. O MVA 572 foi depositado na European Collection of Animal Cell Cultures como ECACC V94012707. Os títulos foram determinados utilizando uma ELISA de captura e calculados através de regressão linear utilizando a parte linear do gráfico e definidos como a diluição que resultou em uma densidade óptica de 0,3. MVA-BN : MVA-BN é significativamente diferente (p > 0,05) do MVA 572 : MVA 572.

Exemplos Os exemplos a seguir irão ilustrar adicional mente a presente invenção. Será bem entendido por um versado na técnica que os exemplos fornecidos não podem de forma alguma ser interpretados de uma maneira que limite a estes exemplos a aplicabilidade da tecnologia fornecida pela presente invenção.

Exemplo 1 Cinética de Crescimento de uma nova cepa de MVA em linhagens de células selecionadas e replicação in vivo (i) Cinética de crescimento em linhagens de células: Para a caracterização de uma cepa recém-isolada de acordo com a presente invenção (referida também como MVA-BN) a cinética de crescimento desta nova cepa foi comparada com as de outras cepas de MVA, que já haviam sido caracterizadas. O experimento foi feito através da comparação da cinética de crescimento dos vírus a seguir nas células primárias e nas linhagens de células listadas subseqüentemente: MVA-BN (estoque de Vírus #23, 18. 02. 99 bruto, titulado em 2,0 x 107 TCID50/mL); MVA que foi caracterizado por Altenburger (Patente U.S. Nõ 5.185.146) e referido também como MVA-HLR; MVA (passagem 575) que foi caracterizado por Anton Mayr (Mayr, A. e outros [1975] Infection 3; 6-14) e referido também como MVA-575 (ECACC V00120707); e MVA-Vero que foi caracterizado no Pedido de Patente Internacional PCT/EP01/02703 (WO 01/68820) (estoque de Vírus, passagem 49, nQ 20, 22.03.99 bruto, titulado em 4,2 x 107 TCID5o/mL).

As células primárias e linhagens de células utilizadas eram: CEF Fibroblastos de embrião de galinha (recém-preparados de ovos SPF);

HeLa Adenocarcinoma de cérvice humano (epitelial), ATCC NQ CCL-2; 143B Osteossarcoma ósseo humano TK-, ECAAC Ne 91112502;

HaCat Linhagem de células de queratinócito humano, Boukamp e outros, 1988, J Cell Biol 106(3): 761-771; BHK Rim de filhote de hamster, ECACC 85011433;

Vero Fibroblastos renais de macaco verde Africano, ECACC 85020299;

CV1 Fibroblastos renais de macaco verde Africano, ECACC 87032605.

Para a infecção as células diferentes foram semeadas em placas de 6 cavidades a uma concentração de 5 x 105 células/cavidade e foram incubadas durante a noite a 37°C, 5% de C02 em DMEM (Gibco, Νθ de Categoria 61965-026) mais FCS a 2%. O meio de cultura foi removido e as células foram infectadas a uma moi de aproximadamente 0,05 durante uma hora a 37°C, 5% de C02 (para infecção, é assumido que os números de células dobram durante a noite). A quantidade de vírus utilizada para cada infecção dos tipos de células diferentes era de 5 x 104 TCID50 e isto será referido como Entrada. As células foram então lavadas 3 vezes com DMEM e finalmente 1 mL de DMEM, FCS a 2% foi adicionado e as placas foram mantidas sob incubação durante 96 horas (4 dias) a 37°C, 5% de C02. Estas infecções foram interrompidas através do congelamento das placas a -80°C prontas para titulação.

Análise de titulação (imunocoloração com um anticorpo específico para o vírus vaccinia) Para a titulação da quantidade de vírus, as células de teste (CEF) foram semeadas em placas de 96 cavidades em RPMI (Gibco, Ns de Cat. 61870-010), FCS a 7%, Antibiótico/Antimicótico a 1% (Gibco, Ne de Cat. 15240-062) a uma concentração de 1 x 104 células/cavidade e foram incubadas durante a noite a 37°C, 5% de CO2. As placas de 6 cavidades contendo os experimentos de infecção foram congeladas/descongeladas 3 vezes e foram preparadas diluições de 10'1 até 10'12 utilizando o meio de crescimento RPMI. As diluições de vírus foram distribuídas sobre as células de teste e incubadas durante cinco dias a 37°C, 5% de CO2 para permitir o desenvolvimento do CPE (efeito citopático). As células de teste foram fixadas (Acetona/Metanol 1:1) durante 10 minutos, lavadas com PBS e incubadas com anticorpo policlonal específico para vírus vaccinia (Quartett Berlin, N9 de Categoria 9503-2057) a uma diluição de 1:1000 em tampão de incubação durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavar duas vezes com PBS (Gibco, N9 de Categoria 20012-019) o anticorpo anticoelho acoplado a HPR (Promega Mannheim, N9 de Categoria W4011) foi adicionado a uma diluição de 1:1000 em tampão de incubação (PBS contendo FCS a 3%) durante uma hora à temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas duas vezes com PBS e incubadas com a solução de coloração (10 ml_ de PBS + 200 μΙ_ de solução saturada de o-dianisidina em etanol a 100% + 15 μι de H2O2 recém-preparada) até que pontos marrons estivessem visíveis (duas horas). A solução de coloração foi removida e foi adicionado PBS para interromper a reação de coloração. Cada cavidade exibindo um ponto marrom foi marcada como positiva para o CPE e o título foi calculado utilizando a fórmula de Kaerber (ensaio baseado na TCID50) (Kaerber, G. 1931, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480).

Os vírus foram utilizados para infectar conjuntos em duplicata de um lado CEF e BHK, que se esperava que fossem permissivos para MVA e no outro lado CV-1, Vero, HeLa, 143B e HaCat que se esperava que fossem não permissivas para MVA, em uma baixa multiplicidade de infecção, isto é, 0,05 unidade infecciosa por célula (5 x 104 TCID50). Depois disso, o inóculo de vírus foi removido e as células foram lavadas três vezes para remover quaisquer vírus não-absorvidos remanescentes. As infecções foram mantidas durante um total de 4 dias quando os extratos virais foram preparados e então titulados em células de CEF. A Tabela 1 e a Figura 1 mostram os resultados dos ensaios de titulação onde os valores são fornecidos como a quantidade total de vírus produzida após uma infecção de 4 dias.

Foi mostrado que todos os vírus amplificaram bem em células de CEF (fibroblastos de embrião de Galinha) que era esperado uma vez que esta é uma linhagem de células permissiva para todos os MVAs. Adicionalmente foi mostrado que todos os vírus amplificaram bem em BHK (linhagem de células renais de Hamster). MVA-Vero teve o melhor desempenho, uma vez que BHK é uma linhagem de células permissiva.

Em relação à replicação em células Vero (linhagem de células renais de Macaco), MVA-Vero amplificou bem como esperado a saber 1000 vezes acima da Entrada. MVA-HLR e também MVA-575 amplificaram bem com aumentos de 33 vezes e 10 vezes acima da Entrada, respectivamente. Foi observado que apenas MVA-BN não amplificava tão bem nestas células quando comparado aos outros, a saber somente um aumento de 2 vezes acima da Entrada.

Também em relação à replicação em células CV1 (linhagem de células renais de Macaco) foi descoberto, que MVA-BN é altamente atenuado nesta linhagem de células. Este exibiu um decréscimo de 200 vezes abaixo da Entrada. Também o MVA-575 não amplificou acima do nível de Entrada exibindo também uma amplificação ligeiramente negativa, a saber um decréscimo 16 vezes abaixo da Entrada. MVA-HLR amplificou melhor com um aumento de 30 vezes acima da Entrada, seguido por MVA-Vero com um aumento de 5 vezes acima da Entrada. O mais interessante é comparar a cinética de crescimento dos vários vírus nas linhagens de células humanas. Em relação à replicação reprodutiva em células 143B (linhagem de células de câncer ósseo humano) foi mostrado que MVA-Vero era o único que exibia amplificação acima da Entrada (aumento de 3 vezes). Todos os outros vírus não amplificam acima da Entrada mas havia uma grande diferença entre MVA-HLR e ambos MVA-BN e MVA-575. MVA-HLR era o "limite" (decréscimo de 1 vez abaixo da Entrada), enquanto que MVA-BN exibe a maior atenuação (decréscimo de 300 vezes abaixo da Entrada) seguido por MVA-575 (decréscimo de 59 vezes abaixo da Entrada). Para resumir, MVA-BN é superior em relação à atenuação em células 143B humanas.

Além disso, em relação à replicação em células HeLa (células de câncer de cérvice humano) foi mostrado que MVA-HLR amplificava bem nesta linhagem de células e ainda melhor do que amplificava nas células permissivas BHK (HeLa = aumento de 125 vezes acima da Entrada; BHK = aumento de 88 vezes acima da Entrada) MVA-Vero também amplificava nesta linhagem de células (aumento de 27 vezes acima da Entrada). Entretanto, MVA-BN e ainda até uma menor extensão MVA-575 eram atenuados nestas linhagens de células (MVA-BN = decréscimo de 29 vezes abaixo da Entrada e MVA-575 = decréscimo de 6 vezes abaixo da Entrada).

Em relação à replicação em células HaCat (linhagem de células de queratinócitos humanos) foi mostrado que MVA-HLR amplificava bem nesta linhagem de células (aumento de 55 vezes acima da Entrada). Tanto MVA-Vero adaptado quanto MVA-575 exibiam amplificação nesta linhagem de células (aumento de 1,2 e 1,1 acima da Entrada respectivamente). Entretanto, MVA-BN era o único que demonstrava atenuação (decréscimo de 5 vezes abaixo da Entrada).

Como conclusão, pode-se citar que MVA-BN é a cepa viral mais atenuada neste grupo de vírus: MVA-BN demonstra ser extremamente atenuada nas linhagens de células humanas por exibir uma taxa de amplificação de 0,05 até 0,2 em células renais de embrião Humano (293: ECACC Nô 85120602) (dados não incorporados na Tabela 1), esta exibe ainda uma taxa de amplificação de aproximadamente 0,0 em células 143B; uma taxa de amplificação de aproximadamente 0,04 em células HeLa; uma taxa de amplificação de aproximadamente 0,22 em células HaCat. Adicionalmente, MVA-BN está exibindo uma taxa de amplificação de aproximadamente 0,0 em células CV1. Somente em células Vero pode-se observar amplificação (taxa de 2,33), entretanto, não até a mesma extensão que nas linhagens de células permissivas tais como BHK e CEF (comparar com a Tabela 1). Assim, MVA-BN é a única cepa de MVA conhecida que exibe uma taxa de amplificação menor que 1 em todas as linhagens de células humanas 143B, HeLa, HaCat e 293. MVA-575 exibe um perfil similar ao da MVA-BN mas não é tão atenuada quanto a MVA-BN. MVA-HLR amplificou bem em todas as linhagens de células testadas (exceto para as células 143B), esta pode ser assim considerada competente em relação à replicação em todas as linhagens de células testadas com a exceção das células 143B. Em um caso esta amplificou ainda melhor em uma linhagem de células humanas (HeLa) do que em uma linhagem de células permissiva (BHK). MVA-Vero não exibe amplificação em todas as linhagens de células mas até uma extensão menor que a demonstrada por MVA-HLR (ignorando o resultado para 143B). Todavia esta não pode ser considerada como pertencente à mesma "classe", em relação à atenuação, que MVA-BN ou MVA-575. 2. Replicação in vivo Dado que certas cepas de MVA claramente se replicam in vitro, foi examinada a capacidade de replicação de cepas diferentes de MVA in vivo utilizando um modelo de camundongos transgênicos AGR129. Esta linhagem de camundongos possui interrupções gênicas direcionadas aos genes dos receptores para IFN do tipo I (IFN-α/β) e do tipo II (INF-γ) e em RAG. Por causa destas interrupções, os camundongos não possuem sistema de IFN e são incapazes de produzir células B e T maduras e como tais são gravemente comprometidos imunologicamente e altamente suscetíveis a um vírus replicante. Grupos de seis camundongos foram imunizados (i.p.) com 107 pfu de MVA-BN, MVA-HLR ou MVA 572 (utilizado em 120.000 pessoas na Alemanha) e monitorados diariamente em relação a sinais clínicos. Todos os camundongos vacinados com MVA HLR ou MVA 572 morreram no período de 28 e 60 dias, respectivamente. Na necrópsia havia sinais gerais de uma infecção viral grave na maioria dos órgãos e através de um ensaio de placas padronizado foi recuperado MVA (108 pfu) dos ovários. Em contraste, os camundongos vacinados com a mesma dose de MVA-BN (correspondendo à cepa depositada ECACC V00083008) sobreviveram durante mais de 90 dias e nenhum MVA pode ser recuperado de órgãos ou tecidos.

Quando tomados juntos os dados dos estudos in vitro e in vivo demonstraram claramente que MVA-BN é mais altamente atenuado do que a cepa de MVA-HLR de origem e comercial.

Exemplo 2 Dados imunológicos e in vivo Estes experimentos foram ajustados para comparar regimes diferentes de doses e de vacinações de MVA-BN comparado com outros MVAs. 2.1. Cepas Diferentes de MVA Diferem em Relação à sua Capacidade de Estimular a Resposta Imunológica.

As cepas de vaccinia competentes em relação à replicação induzem respostas imunológicas potentes em camundongos e em altas doses são letais. Embora o MVA seja altamente atenuado e possua uma capacidade reduzida de se replicar em células de mamíferos, há diferenças na atenuação entre cepas diferentes de MVA. A MVA BN parece ser mais atenuada que as outras cepas de MVA, mesmo a cepa de origem MVA 575. Para determinar se esta diferença na atenuação afeta a eficiência de MVA de induzir respostas imunológicas protetoras, doses diferentes de MVA BN e de MVA 575 foram comparadas em um modelo de desafio letal com vaccinia. Os níveis de proteção foram medidos através da redução nos títulos de vaccinia nos ovários determinados 4 dias após o desafio, uma vez que isto permite uma avaliação quantitativa de doses e de cepas diferentes de MVA.

Modelo de Desafio Letal Camundongos BALB/c (H-2d) fêmeas de 6-8 semanas de idade livres de patógenos específicos (n=5) foram imunizados (i.p.) com doses diferentes (102, 104 ou 106 TCIDso/mL) de MVA BN ou MVA 575. MVA-BN e MVA-575 foram propagados em células CEF e foram purificados em sacaro-se e formulados em Tris pH 7,4. Três semanas depois os camundongos receberam um reforço da mesma dose e cepa de MVA, que foi seguido duas semanas depois por um desafio letal (i.p.) com uma cepa de vaccinia competente em relação à replicação. Como o vírus vaccinia competente em relação à replicação (abreviado como "rVV") foi utilizada a cepa WR-L929 TK+ ou a cepa IHD-J. Os camundongos para controle receberam uma vacina com placebo. A proteção foi medida através da redução nos títulos nos ovários determinada 4 dias após o desafio por ensaio de placas padronizado. Para este os camundongos foram sacrificados no 4S dia após o desafio e os ovários foram removidos, homogeneizados em PBS (1 mL) e os títulos virais foram determinados através de ensaio de placas padronizado utilizando células VERO (Thomson e outros, 1998, J. Immunol. 160: 1717).

Os camundongos vacinados com as duas imunizações de 104 ou de 106 TCIDso/mL de MVA-BN ou de MVA-575 estavam completamente protegidos como foi julgado por uma redução de 100% nos títulos de rVV nos ovários 4 dias após o desafio (Figura 2). O vírus do desafio havia sido eliminado. Entretanto, foram observadas diferenças nos níveis de proteção fornecidas por MVA-BN ou por MVA-575 em doses mais baixas. Os camundongos que receberam duas imunizações de 102 TCID50/mL de MVA 575 tiveram falha na proteção como foi julgado pelos altos títulos de rVV nos ovários (média de 3,7 x 107 pfu ± 2,11 x 107). Em contraste, os camundongos vacinados com a mesma dose de MVA-BN induziram uma redução significativa (96%) nos títulos de rVV nos ovários (média de 0,21 x 107 pfu + 0,287 x 107). Os camundongos de controle que receberam uma vacina com placebo tinham um título viral médio de 5,11 x 107 pfu (± 3,59 x 107) (Figura 2).

Ambas as cepas de MVA induzem respostas imunológicas protetoras em camundongos contra um desafio letal com rVV. Embora ambas as cepas de MVA sejam equivalentemente eficientes em doses mais altas, as diferenças em sua eficiência são claramente evidentes em doses subóti-mas. MVA-BN é mais potente que sua cepa de origem MVA-575 em relação à indução de uma resposta imunológica protetora contra um desafio letal com rVV, que pode estar relacionada à atenuação aumentada da MVA-BN comparada à MVA-575. 2.2. MVA-BN em Regimes de Vacinação de Proteção-Reforço 2.2.1.: Indução de anticorpos para MVA após a vacinação de camun- dongos com vacinas diferentes para varíola A eficiência de MVA-BN foi comparada com a de outras cepas de MVA e de vaccinia utilizadas anteriormente na erradicação da varíola. Estas incluíam imunizações únicas utilizando as cepas de vaccinia Elstree e Wyeth produzidas em células CEF e fornecidas através da escarificação da cauda e imunizações utilizando MVA 572 que foi utilizada anteriormente no programa de erradicação da varíola na Alemanha. Em adição, tanto MVA-BN quanto MVA 572 foram comparadas como uma pré-vacina seguida por Elstree através de escarificação. Para cada grupo foram utilizados oito ca-mundongos BALB/c e todas as vacinações de MVA (1 x 107 TCID50) foram fornecidas subcutaneamente na semana 0 e na semana 3. Duas semanas após a imunização de reforço os camundongos foram desafiados com vaccinia (IHD-J) e os títulos nos ovários foram determinados 4 dias após o desafio. Todas as vacinas e os regimes induziram 100% de proteção.

As respostas imunológicas induzidas utilizando estas vacinas ou regimes diferentes foram medidas nos animais antes do desafio. Foram utilizados ensaios para medir os níveis de anticorpos neutralizadores, de proliferação de células T, de produção de citocinas (IFN-γ versus IL-4) e de produção de IFN-γ pelas células T. O nível das respostas das células T induzidas por MVA-BN, que é medido por ELIspot, era geralmente equivalente ao de outro MVA e de outros vírus vaccinia demonstrando bioequivalência. Uma análise semanal dos títulos de anticorpos para MVA após os diferentes regimes de vacinação revelou que as vacinações com MVA-BN aumentavam significativamente a velocidade e a grandeza da resposta de anticorpos comparada com a de outros regimes de vacinação (Figura 11). Na verdade os títulos de anticorpos para MVA eram significativamente mais altos (p>0,05) nas semanas 2, 4 e 5 (1 semana após o reforço na semana 4) quando se vacinava com MVA-BN comparados com os dos camundongos vacinados com MVA 572. Após a vacinação de reforço na semana 4, os títulos de anticorpos eram também significativamente mais altos no grupo do MVA-BN comparado com os camundongos que receberam uma única vacinação das cepas de vaccinia Elstree ou Wyeth. Estes resultados demonstram claramente que 2 vacinações com MVA-BN induziram uma resposta de anticorpos superior comparada com a da vacinação única clássica com as cepas de vaccinia tradicionais (Elstree e Wyeth) e confirmam as descobertas da seção 1.5 de que MVA-BN é mais imunogênica que as outras cepas de MVA. 2.2.2.: Regimes de iniciação e reforço com MVA geram o mesmo nível de proteção que os regimes de iniciação com DNA e reforço com MVA em um modelo de desafio com influenza. A eficácia dos regimes de iniciação-reforço com MVA para gerar respostas de CTL com alta avidez foi avaliada e comparada com a dos regimes de iniciação com DNA/reforço com MVA que foram relatados como sendo superiores. Os regimes diferentes foram avaliados utilizando um constructo de polítopo murino codificado por um vetor de DNA ou MVA-BN e os níveis de indução de CTL foram comparados através de ELISPOT, enquanto que a avidez da resposta foi medida na forma do grau de proteção fornecida após um desafio com influenza.

Constructos O plasmídeo de DNA codificando o polítopo murino (10 epitopos de CTL incluindo influenza, ovalbumina) foi descrito anteriormente (Thomson e outros, 1998, J. Immunol. 160: 1717). Este polítopo murino foi inserido no sítio de deleção II de MVA-BN, propagado em células CEF, purificado em sacarose e formulado em Tris pH 7,4.

Protocolos de Vacinação No presente estudo foram utilizados camundongos BALB/c (H-2d) fêmeas de 6-8 semanas de idade livres de patógenos específicos. Foram utilizados grupos de 5 camundongos para análises de ELISPOT enquanto que 6 camundongos por grupo foram utilizados para os experimentos de de- safio com influenza. Os camundongos foram vacinados com regimes diferentes de iniciação-reforço utilizando MVA ou DNA codificando o polítopo murino que é detalhado nos resultados. Para as imunizações com DNA, os camundongos foram anestesiados e então receberam uma única injeção de 50 pg de DNA plasmideal livre de endotoxinas (em 50 μΙ_ de PBS) no músculo do quadríceps sob anestesia. As imunizações primárias utilizando MVA foram feitas através de administração intravenosa de 107 pfu de MVA-BN por camundongo ou através de administração subcutânea de 107 pfu ou de 108 pfu de MVA-BN por camundongo. As imunizações de reforço foram fornecidas três semanas após as imunizações primárias. O reforço com o DNA plasmideal foi feito da mesma maneira que na imunização primária com DNA (ver acima). A fim de estabelecer respostas de CTL foram realizados ensaios de ELISPOT padronizados (Schneider e outros, 1998, Nat. Med. 4; 397-402) em esplenócitos 2 semanas após a última imunização de reforço utilizando o peptídeo do epitopo de CTL de influenza (TYQRTRALV), o peptídeo do epi-topo de P. berghei (SYIPSAEKI), o epitopo peptídico de Citomegalovírus (YPHFMPTNL) e/ou o epitopo peptídico de LCV (RPQASGVYM). Para os experimentos de desafio os camundongos foram anestesiados e infectados i.n. com uma dose subletal do vírus influenza "Ressortant", Mem71 (4,5 x 105 pfu em 50 mL de PBS). No 5e dia após a infecção, os pulmões foram removidos e os títulos virais foram determinados em duplicata na linhagem de células renais caninas Madin-Darby utilizando um ensaio de placas padronizado para influenza.

Resultados: Utilizando somente a vacina com DNA a indução de CTL aos 4 epitopos H-2d codificados pelo polítopo murino era fraca e apenas respostas fracas podiam ser detectadas para dois dos epitopos para P. berghei (SYIP-SAEKI) e para o vírus da coriomeningite linfocítica (RPQASGVYM). Em contraste, utilizando o regime de preparação com DNA e reforço com MVA (107 pfu de MVA-BN fornecidas subcutaneamente) havia significativamente mais CTL induzidas para SLY (aumento de 8 vezes) e para RPQ (aumento de 3 vezes) e eram também observadas respostas para um terceiro epitopo para o citomegalovírus murino (YPHFMPTNL) (Figura 3A). Entretanto, utilizando 107 pfu de MVA-BN fornecidas subcutaneamente em um regime homólogo de iniciação e reforço houve a indução do mesmo nível de respostas que o DNA seguido pelo MVA-BN (Figura 3A). Surpreendentemente, não havia diferença significativa nos números de CTLs induzidas para os três epitopos quando uma imunização de MVA-BN (107 TCID50) foi utilizada, indicando que uma imunização secundária com MVA-BN não reforçava significativamente as respostas de CTL.

Foi mostrado anteriormente que administração subcutânea de 107 pfu de MVA era a rota e a concentração de vírus mais ineficientes para vacinação utilizando outras cepas de MVA, particularmente se comparada com as imunizações intravenosas (Schneider e outros 1998). Com a finalidade de definir os regimes ótimos de imunização, o experimento acima foi repetido alterando a quantidade de vírus ou alterando o modo de administração. Em um experimento foram fornecidas vacinações de 107 pfu de MVA-BN intravenosamente (Figura 3B). Em um experimento adicional 108 pfu de MVA-BN foram administradas subcutaneamente (Figura 3C). Nestes experimentos as imunizações de iniciação-reforço com MVA-BN induziram números médios de CTL mais altos para os três epitopos de CTL comparados com os dos regimes de iniciação com DNA e reforço com MVA. Ainda, ao contrário de 107 pfu de MVA-BN fornecidas subcutaneamente a imunização com 107 pfu de MVA-BN fornecidas intravenosamente e a imunização com 108 pfu fornecidas subcutaneamente reforçaram significativamente as respostas de CTL, indicando claramente que MVA-BN pode ser utilizado para reforçar as respostas de CTL na presença de uma imunidade preexistente ao vetor. 2.2.3.: Eficiência de uma Vacina de MVA-BN nef em Macacos Rhesus Infectados com SIV.

Para determinar a eficiência de uma vacina de MVA-BN nef através da avaliação da carga viral e do retardamento da doença após um desafio com um isolado primário virulento de SIV. Além disso, o estudo determinará se 0 MVA-BN pode ser utilizado para reforçar de forma segura as respostas imunológicas em macacos comprometidos imunologicamente com uma imunidade preexistente para MVA.

Protocolos de Vacinação Dois grupos de macacos rhesus (Macaca mulalta) (n = 6) foram vacinados com uma injeção intramuscular em bolo com MVA-BN sozinho ou com um MVA-BN nef recombinante nas semanas 0, 8 e 16. Na semana 22 todos os macacos foram desafiados com 50 MID50 de um estoque patogênico de SIV associado a células (1XC) de PBMC de macaco rhesus não-cultivadas primárias através da rota intravenosa. A condição clínica dos animais foi monitorada freqüentemente e foram retiradas amostras de sangue de forma regular para a medida da viremia, dos parâmetros imunológicos e de uma faixa completa de parâmetros químicos hematológicos e clínicos do sangue. Os animais que desenvolveram uma doença similar à AIDS foram sacrificados e os macacos sobreviventes foram monitorados durante 99 semanas após a vacinação. Na semana 100 os macacos sobreviventes foram todos imunizados i.m. com MVA-BN tat e receberam imunizações adicionais com o mesmo MVA-BN tat nas semanas 102 e 106. Não foram observados efeitos adversos após qualquer uma das vacinações com MVA-BN ou MVA-BN nef. Após a infecção dos macacos com SIV os níveis de viremia aumentaram bruscamente e atingiram um pico duas semanas depois da infecção (Figura 4). Devido aos grandes desvios padrões dentro dos grupos não havia diferença significativa nos níveis médios de SIV entre os grupos vacinados com MVA-BN nef ou com MVA-BN. Entretanto, havia uma carga geral de SIV 10 vezes mais baixa no grupo vacinado com o MVA-BN nef comparada com a do grupo de controle (MVA-BN). Além disso, após 35 semanas depois da infecção (o período de observação inicial) apenas 1 dos seis macacos vacinados com MVA-BN nef teve que sofrer eutanásia devido à gravidade da doença, comparado com 4 dos 6 animais no grupo de controle (Figura 5). O desenvolvimento da doença se correlacionava claramente com uma carga viral mais alta e desta maneira os animais foram observados durante mais 29 semanas depois da infecção. A vacina de MVA-BN nef parecia retardar a progressão da doença quando comparada com o grupo de controle e mesmo na 46â semana após a infecção 5 dos 6 animais com MVA-BN nef sobreviveram (Figura 5). Entretanto, na 59ã semana após a infecção mais dois animais no grupo vacinado com nef sofreram eutanásia deixando cinco animais sobreviventes (três do grupo com MVA-BN nef e dois vacinados com MVA-BN). Um exame dos títulos de anticorpos gerados para MVA-BN nestes 12 macacos demonstrou claramente que MVA-BN podia reforçar a resposta imunológica mesmo na presença de uma imunidade preexistente para MVA (Figura 6). Após a imunização primária com MVA-BN ou com MVA-BN nef todos os macacos geraram uma resposta de anticorpos para MVA com um título médio de 1000. Esta resposta de anticorpos foi significativamente reforçada após a imunização secundária, demonstrando claramente que o MVA pode ser utilizado para iniciar-reforçar a resposta imunológica em macacos saudáveis. Estes títulos de anticorpos diminuíram gradativamente, de forma que os títulos médios para MVA na semana 99 eram de 2000.

Os cinco macacos sobreviventes estavam infectados com SIV e comprometidos imunologicamente com contagens de CD4 menores que 400/μΙ_ de sangue. Para investigar o impacto da utilização de MVA-BN em macacos comprometidos imunologicamente, os cinco animais foram vacinados três vezes com MVA-BN tat nas semanas 100, 102 e 106 após a vacinação inicial. A primeira imunização com MVA-BN tat reforçou significativamente a resposta de anticorpos para MVA nestes macacos comprometidos imunologicamente que foi reforçada adicionalmente com a terceira imunização seis semanas mais tarde (Figura 6). Estes resultados demonstram também que MVA-BN pode reforçar as respostas imunológicas na presença de uma imunidade preexistente significativa para MVA, mesmo em macacos comprometidos imunologicamente. Embora a resposta imunológica dos macacos tenha sido reforçada após as imunizações com MVA-BN tat, os níveis de SIV permaneceram estáveis, indicando que as imunizações com MVA-BN são seguras e não afetam os níveis de SIV nos macacos comprometidos imunologicamente (Figura 7).

Este estudo demonstrou que o MVA-BN pode iniciar-reforçar respostas imunológicas em macacos rhesus comprometidos imunologica-mente e que as imunizações com MVA-BN são seguras e não afetam os níveis de viremia em animais afetados com SIV. O retardamento na progressão da doença similar à AIDS nos animais vacinados com a vacina de MVA-BN nef, indica que foi gerada de forma bem-sucedida uma resposta imuno-lógica para nef. 2.2.4.: Vacinação Terapêutica de Macacos Infectados com SIV Sofrendo Tratamento Anti-Retroviral É plausível que uma vacina terapêutica para HIV baseada no MVA-BN seja utilizada em indivíduos sofrendo terapia anti-retroviral. Portanto este estudo investigou a segurança (efeito sobre os níveis de SIV) e a eficiência de MVAs recombinantes que codificam uma variedade de antíge-nos de SIV (gag, pol, env, rev, tat e nef) em macacos infectados com SIV tratados com PMPA. PMPA é um análogo de nucleosídeo e é eficaz contra HIV e SIV (Rosenwirth, B. e outros, 2000, J Virol 74, 1704-11).

Constructos Todos os constructos de MVA recombinante foram propagadas em células CEF, purificadas em sacarose e formuladas em Tris pH 7,4. Protocolo de Vacinação Três grupos (n = 6) de macacos rhesus (Macaca mulatta) foram infectados com 50 MID50 de um isolado primário patogênico de SIV (1XC) e então tratados diariamente com PMPA (60 mg/kg fornecidos s.c.) durante 19 semanas. Na semana 10, os animais foram vacinados com MVA-BN recombinante (i.m.) ou com solução salina e receberam vacinações idênticas 6 semanas mais tarde. O grupo 1 recebeu uma mistura de MVA gag-pol e MVa-env, o grupo 2 recebeu MVA-tat, MVA-rev e MVA-nef, enquanto que o grupo 3 recebeu solução salina. A condição clínica dos animais era monitorada freqüentemente e eram tiradas amostras de sangue regularmente para a medida da viremia, dos parâmetros imunológicos e de uma faixa completa de parâmetros químicos hematológicos e clínicos do sangue.

Todos os animais estabeleceram altas cargas de SIV que alcançaram um pico 2 semanas depois da infecção (Figura 8). Após o tratamento diário com PMPA os níveis de SIV diminuíram e se estabilizaram em níveis baixos na 9â semana. Como no estudo anterior, as vacinações com MVA nas semanas 10 e 16 não tiveram efeito sobre os níveis de SIV, indicando que o MVA-BN é um vetor para vacina seguro para animais comprometidos imunologicamente. Quando os animais deixaram o tratamento com o PMPA (semana 21) os níveis de SIV aumentaram. Embora os três animais no grupo 1 tivessem reduzido os níveis de SIV comparados com os do grupo 3 de controle, não havia diferença significativa na carga média de SIV entre qualquer um dos grupos após o término do tratamento com PMPA (Figura 8). Utilizando um ELISA para os lisados de células T infectadas com SIV, os animais em todos os grupos geraram uma resposta de anticorpos para SIV na 4- semana após a infecção (Figura 9). O título de anticorpos para SIV no grupo de controle (solução salina) caiu durante o tratamento com PMPA e aumentou rapidamente quando o tratamento com PMPA foi interrompido, refletindo a queda e o aumento subseqüente nos níveis de SIV durante a terapia anti-retroviral (Figura 9). Um padrão similar no título de anticorpos para SIV foi observado no grupo 2 que recebeu MVA-tat, MVA-rev e MVA-nef, refletindo possivelmente a subexpressão destas proteínas reguladoras nos lisados de células T infectadas com SIV utilizadas no ELISA. Entretanto, em contraste, os títulos de anticorpos anti-SIV no grupo 1 aumentaram após as vacinações com MVA gag-pol e MVA-env na 10a semana, indicando que o MVA-BN recombinante pode reforçar a resposta imunológica para SIV em animais infectados (SIV) sofrendo terapia anti-retroviral. De maneira importante, os títulos de anticorpos anti-SIV foram reforçados após a imunização secundária na 16â semana demonstrando mais uma vez que MVA pode reforçar respostas imunológicas em animais comprometidos imunologicamente, mesmo na presença de uma imunidade preexistente para MVA (Figura 8). Os títulos de anticorpos anti-MVA no grupo 1 também refletiam este padrão com a produção de uma resposta de anticorpos após a imunização primária e esta foi significativamente reforçada após a vacinação secundária (Figura 10).

Tabela 1:______________________________ ________________________________ Amplificação viral acima do nível de entrada após 4 dias de infecção Taxa de amplificação = TCID50 de saída - TCID50 de entrada.

Os valores estão em TCID50.

REFERÊNCIAS

Schneider, J., Gilbert, SC., Blanchard, TJ., Hanke, T., Robson, KJ., Hannan, CM., Becker, M., Sinden, R., Smith, GL. e Hill, AVS. 1998. Enhanced immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete efficacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat. Med. 4; 397-402.

Thomson, SA., Sherritt, MA., Medveczky, J., Elliott, SL., Moss, DJ., Fernando, GJP., Brown, LE. e Suhrbier, A. 1998. Delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J. Immunol. 160: 1717.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Cepa Ancara MVA-BN do vírus vaccinia modificado depositado na European Collection of Cell Cultures (ECACC) , Salisbury (Reino Unido) sob o número V00083008, em que a referida cepa Ancara MVA-BN é caracterizada por (i) ser capaz de replicação reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e em linhagem de células renais de embrião de hamster BHKf mas é incapaz de replicação reprodutiva em linhagem de células de osteossarcoma ósseo humano 143B, linhagem de células de queratinócitos humanos HaCat, linhagem de células renais de embrião humano 293 e a linhagem de células de adenocarcinoma de cérvice humano HeLa e (ii) ser insuficiente para replicar in vivo em ratos com imunidade severamente comprometida que são incapazes de produzir células B e T maduras.

2. MVA-BN, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os ratos com imunidade severamente comprometida são ratos transgênicos AGR129.

3. MVA-BN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que é um clone purificado.

4. MVA-BN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico heterólogo.

5. MVA-BN, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico heterólogo é selecionada a partir de uma sequência que codifica pelo menos um antigeno, um epitopo antigênico e/ou um composto terapêutico.

6. MVA-BN, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os epitopos antigênicos são de vírus selecionados a partir da família de Influenza virus, Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis virus, vírus da imunodeficiência humana ou vírus causadores de febre hemorrágica.

7. MVA-BN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo é o gene nef.

8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende MVA-BN como definida nas reivindicações 1 a 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente e/ou aditivo.

9. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende MVA-BN como definida nas reivindicações 1 a 7.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 102 TCIDso de MVA-BN.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 102 TCID50 de MVA-BN.

12. MVA-BN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ser para vacinação de um animal vivo, incluindo humano, contra uma doença humana de poxvirus.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 8 ou 11 caracterizada pelo fato de ser para vacinação de um animal vivo, incluindo humano, contra uma doença humana de poxvirus.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 9 ou 10 caracterizada pelo fato de ser para vacinação de um animal vivo, incluindo humano, contra uma doença humana de poxvirus.

15. Uso de MVA-BN como definida nas reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento ou uma vacina para induzir uma resposta imunológica no corpo de um animal vivo incluindo um humano.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o medicamento ou vacina é contra doenças de poxvirus.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença humana de poxvirus é smallpox.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o medicamento ou vacina compreende pelo menos 102 TCID50 de MVA-BN.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a MVA-BN é para ser administrada em quantidades terapeuticamente eficientes em uma primeira inoculação ("inoculação de iniciação") e em uma segunda inoculação ("inoculação de esforço").

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o animal é comprometido imunologicamente.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que o animal tem uma imunidade pré-existente aos poxviruses.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o animal está se submetendo a terapia antiviral.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a terapia antiviral é a terapia antiretroviral.

24. MVA-BN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é para uso como um adjuvante.

25. Kit para imunização de preparação/reforço caracterizado pelo fato de que compreende MVA-BN como definida nas reivindicações 1 a 7, uma composição como definida na reivindicação 8 ou 11, uma vacina como definida na reivindicação 9 ou 10 para uma primeira inoculação ("inoculação de iniciação") em um primeiro frasco/recipiente e para uma segunda inoculação ("inoculação de esforço") em um segundo frasco/recipiente.