KR102605505B1 - 폭스바이러스에서 이식유전자의 안정성을 강화시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

폭스바이러스에서 이식유전자의 안정성을 강화시키는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는 재조합형 폭스바이러스를 제공한다. 좀더 구체적으로, 상기 재조합형 폭스바이러스는 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 항원들을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 변형된 핵산을 포함하며, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 연속적 계대를 통하여 안정적이다. 또한, 이와 관련된 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

폭스바이러스에서 이식유전자의 안정성을 강화시키는 조성물 및 방법
발명의 분야
본 발명은 재조합형(recombinant) 폭스바이러스(poxviruses) 및 변형된(modified) 뮤신(Mucin) 1, 세포 표면 연합된 (MUC1) 이식유전자, 인간 암배아 항원 (CEA) 이식유전자, 및/또는 하나 또는 그 이상의 동시-자극적(costimulatory) 분자들을 포함하는 이의 조성물에 관한 것이다. 적어도 하나 양태에서, 상기 변형된 MUC1, CEA, 및/또는 동시-자극적 분자 이식유전자는 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대(passaging)를 통하여 상기 폭스바이러스에 대한 안정성을 향상시킨다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 백신 및 의학 조성물로써 사용을 위한 재조합형 폭스 바이러스 및 이의 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
재조합형 폭스바이러스는 감염성 유기체 및 더욱 최근에는, 종양에 대항하는 면역요법 백신으로 이용되어 왔었다. Mastrangelo 외, J Clin Invest. 2000;105(8):1031-1034. 이들 스바이러스 집단중 두 가지, 폭스바이러스(avipoxvirus) 및 오르소폭스바이러스(orthopoxvirus)는 종양과의 싸움에 효과가 있는 것으로 나타났고, 잠재적 암 치료와 관련이 있었다. Id.
예시적인 한 가지 아비폭스바이러스 종, 계두(fowlpox)는 포유류 세포에 유입되어 단백질을 발현하지만, 복제 실패때문에 인간 투여용으로 안전한 운반체(vehicle)인 것으로 나타났다. Skinner 외, Expert Rev Vaccines. 2005 Feb;4(1):63-76. 추가적으로, 발현 운반체로서 계두 바이러스의 사용은 암, 말라리아, 결핵 및 AIDS에 대한 백신의 수많은 임상 시험에서 평가중에 있다. Id.
오르소폭스바이러스 중에서 가장 잘 알려진 백시니아(Vaccinia)는 전 세계적으로 천연두 근절에 사용되었으며 벡터 및/또는 백신으로써 유용성을 보였다. 재조합형 백시니아 벡터는 몇 가지 종양 연합된 유전자들 이를 테면 p97, HER-2/neu, p53 및 ETA를 포함하는, 광범위한 삽입된 유전자들을 발현시키도록 조작되었다 (Paoletti, 외, 1993).
감염성 질환 및 암에 대한 면역요법 백신으로 유용하다고 판명된 폭스바이러스성 균주는 MVA (Modified Vaccinia Ankara) 바이러스다. MVA는 백시나아 바이러스 (CVA) 앙카라 균주의 닭 배아 섬유 아세포에서 516 회 연속 계대에 의해 생성되었다 (참고용으로 Mayr, A., 외, Infection 3, 6-14 (1975)을 볼 것). 이러한 장기적인 계대의 결과로, 생성된 MVA 바이러스의 게놈은 약 31 킬로베이스의 게놈 서열이 결실되어 있었고, 따라서 조류 세포로의 복제용으로 한정된 숙주 세포로 기술되었다(Meyer, H. 외, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). 다양한 동물 모델에서 생성된 MVA가 유의적으로 무해하다는 것이 밝혀졌다(Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)).
백신이나 의약품과 같은 보다 안전한 제품 개발을 위하여 향상된 안전 프로파일을 갖는 MVA의 균주가 기술되었다. 국제 PCT 공개 WO2002042480 (예를 들면, U.S. 특허 번호 6,761,893 및 6,913,752 또한 참고)를 참고하며, 이들 모두는 본 명세서 참고문헌에 편입된다. 이러한 변이체는 비인간 세포 및 세포주, 특히 닭 배아 섬유 아세포 (CEF)에서 생식 복제가 가능하지만, 특히 HeLa, HaCat 및 143B 세포주를 비롯한 인간 세포주에서는 복제가 불가능하다. 그러한 균주는 생체 내에서, 예를 들어, 심각하게 면역-절충되고(immune-compromised), 복제 바이러스에 매우 민감한 마우스 모델 AGR 129와 같은 특정 마우스 계통에서 또한 생식 복제가 불가능하다. U.S. 특허 번호. 6,761,893 참고. 이러한 VA 변이체 및 "MVA-BN"으로 지칭되는 조합형들을 비롯한 이의 유도체들이 기술되었다. 국제 PCT 공개 WO2002042480 (예를 들어, U.S. 특허 번호 6,761,893 및 6,913,752 또한 참고) 참고. 암 면역요법 백신 개발에서, 상기 종양 항원 MUC1은 재조합형 폭스바이러스에 의해 발현될 때, 다양한 암에 대항하여 환자의 면역 반응을 유도 및 부양시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, Mehebtash 외, Clin Cancer Res. 2011 Nov 15;17(22):7164-73 참고.
MUC1 (MUC-1, 뮤신 1, 세포 표면 연합된) (CD227로도 공지됨)은 폐, 위장, 눈 및 몇몇 다른 장기의 상피 세포 및 조혈 세포 및 활성화된 T 세포의 상피 세포의 정점(apical) 표면과, 조혈 세포 및 활성화된 T 세포와 같은 비-상피 세포의 작은 부분 집합을 구성하는 당 단백질이다. 건강 상피 조직에서의 이의 주요 기능은 화학 물질 및 미생물 제제에 대한 윤활 및 물리적 장벽을 제공하는 것이다. Hollingsworth MA, Swanson BJ (January 2004). "Mucins in cancer: protection and control of cell surface". Nature Reviews Cancer 4 (1): 45-60.
MUC1은 막경유 도메인에 의해 정점 표면에 고정되어 있다. Hattrup CL, Gendler, SJ (2008). "Structure and Function of Cell Surface (Tethered) Mucins". Annu. Rev. Physiol. 70: 431-457. MUC1의 세포외 도메인은 20 개의 아미노산 가변 수 탠덤 반복부 (VNTR) 도메인을 포함하는데, 이 도메인은 일반적으로 심하게 당화(glycosylated)되며, 이때 반복부 수는 상이한 개체들에서 20 내지 120으로 다양하다. Brayman M, Thathiah A, Carson DD (January 2004). "MUC1: a multifunctional cell surface component of reproductive tissue epithelia". Reprod Biol Endocrinol 2: 4.
많은 인간 암종(이를 테면, 난소암, 유방암, 췌장암, 대장암 및 전립선암) 및 혈액암(다발성 골수종 및 일부 B-세포 비-호지킨 림프종)은 MUC1을 비정상적으로 과발현시킨다는 것이 입증되었다. Pecher 외. Anticancer Res. 2001 Jul-Aug. 21:2591-2596. 정상 조직에서 MUC1은 클러스터된(clustered) 발현과는 달리,종양 세포의 전체 표면에 균일하게 분포된다. Correa 외. Immunology. Jan 2003; 108(1): 32-41. 더욱이, MUC1은 일반적으로 종양에서 당화가 적게되어, 단백질의 새로운 그리고 잠재적 항원성 에피토프(epitopes)를 면역계에 노출시킨다. Reis 외, Int J Cancer. 1998 Aug 21;79(4):402-10.
인간 암종과의 MUC1 연합 관점에서, 선행 기술은 단백질의 면역원성을 향상시키기 위해 MUC1을 변형시키려고 시도하였다. 예를 들면, Hamblin 외, US2006/0147458은 고유한(native) MUC1에 대한 감소된 상동성을 가지고, 뿐만 아니라 7XVNTR 세그먼트(segment)를 갖는 MUC1 서열을 기획하기 위하여 "코돈 사용 계수(codon usage coefficient)"를 이용하였다. Hamblin 외, US2006/0147458은 면역원성을 높이기 위해 HSP-70-MUC1 융합 단백질을 만들었다. Finn, 외에게 허여된 미국 특허 번호 5,744,144는 20 개 아미노산 탠덤 반복부 2개를 첨가함으로써, MUC1 단백질을 변형하였다.
인간 암배아 항원 (CEA)은 결장, 직장, 위 그리고 췌장 종양의 대부분에서 (1), 유방암종 (2)의 약 50 % 그리고 폐암종의 70 %(3)에서 발현되는 180kD 당 단백질이다. CEA는 또한 태아 장 조직에서 발현되며, 대장 상피에서도 그 정도는 작지만 발현된다. 몇 가지 연구에서 환자에게서 항-CEA 항체의 존재를 보고하였고 (4-7), 다른 연구에서는 보고되지 않아, CEA의 면역원성은 모호하다(8-10). CEA는 1965년에 인간 소화관 선암종에서 암 특이적 태아 항원으로 처음 기술되었다(Gold, P. 및 Freeman, S. O. (1965) Exp. Med. 121:439-462). 그 이후로, CEA는 인간 위장관의 거의 모든 고형 종양에서 과잉 생산된 세포 표면 항원으로 특징지어졌다. 인간 CEA 단백질에 대한 유전자가 복제되었다. (Oikawa 외 (1987) Biochim. Biophys. Res. 142:511-518; 유럽 출원 번호. EP 0346710).
암 치료를 개선하기 위한 의학적으로 충족되지 못했던 실질적인 필요성이 있다. 암에 대한 면역 반응을 유도하는데 있어서 MUC1 항원 및 CEA 항원의 효과 관점에서, 암 환자에게 항원을 효과적으로 도입할 수 있는 개선된 백신이 필요하다.
또한, 규제 승인을 얻는데 장애가 되는 것들을 성공적으로 극복 할 수 있는 암 치료법을 제공할 필요성이 커지고 있다. 특히, 대규모 생산, 불순물 및 이와 유사한 것들의 어려움은 치료에 대한 규제 승인을 얻고, 그 치료를 수혜 환자에게 전달하는데 있어 상당한 장애물이 될 수 있다. 적어도 한 가지 양태에서, 본 발명의 다양한 실시예들의 개발과 함께, 대량 생산, 불순물 및 다른 문제들을 포함하는 어려움들이 성공적으로 극복되었다.
발명의 간단한 요약
하나 또는 그 이상의 반복적 뉴클레오티드 영역들에서 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM을 인코드하는 핵산에 다양한 치환에 의해 재조합형 폭스바이러스에서 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 이식유전자의 안정성이 강화되는 것으로 본 발명에서 밝혀졌다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는 재조합형 폭스바이러스에 관한 것이다. 상기 재조합형 폭스바이러스는 적어도 2개의 가변적 N-말단 반복부 (VNTR) 도메인을 갖는 MUC1 펩티드를 인코드하는 제1 핵산을 포함하며, 이때 a) 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인의 정렬은 셔플화되고(shuffled), 그리고 b) 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인은 코돈 최적화되고(optimized), 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 연속적 계대를 통하여 안정적이 된다.
하나 또는 그 이상의 바람직한 구체예들에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 서열 번호:2 (336 MUC)에 적어도 95% 상동성인, 서열 번호:3 (373 MUC)에 적어도 95% 상동성인, 서열 번호: 4 (399/400 MUC1)에 적어도 95% 상동성인, 또는 서열 번호: 5 (420 MUC1)에 적어도 95% 상동성인 제1 핵산을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 서열 번호: 2 (336 MUC1)에 적어도 95% 상동성인 핵산을 포함한다. 또다른 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 서열 번호:3 (373 MUC)에 적어도 95% 상동성인 핵산을 포함한다.
여전히 또다른 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 서열 번호: 13 또는 14 (CEA)에 적어도 99% 상동성인 핵산을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 서열 번호: 13 또는 14를 포함한다.
상기 재조합형 폭스바이러스는 임의 유형의 폭스바이러스일 수 있음이 고려된다. 특정 구체예들에서, 상기 폭스바이러스는 오르소폭스바이러스 또는 아비폭스바이러스이다. 바람직한 구체예들에서, 상기 오르소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, MVA 바이러스, MVA-BN, 및 MVA-BN의 유도체들로부터 선택된다. 기타 더욱 바람직한 구체예들에서, 상기 오르소폭스바이러스는 MVA, MVA-BN, 또는 MVA-BN의 유도체들이다. 기타 바람직한 구체예들에서, 상기 아비폭스바이러스는 계두 바이러스다.
다른 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 MUC1 및/또는 CEA 핵산에 추가하여, 상기 본 발명의 재조합형 폭스바이러스는 TRICOM (TRIad의 동시-자극적 분자들)을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 함유한다.
특정 구체예들에서, 상기 본 발명의 재조합형 폭스바이러스 및/또는 핵산은 이종성(heterologous) 프라임-부스터 투여 요법(prime-boost dosing regimen)에 이용될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 상기 요법은 다음을 포함한다: a) MVA 바이러스의 하나 또는 그 이상의 프라이밍 용량(priming doses), 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산이 함유된 MVA 바이러스; 그리고 b) 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산이 함유된 계두 바이러스의 하나 또는 그 이상의 부스팅 용량(boosting doses).
본 명세서에서 기술된 상기 재조합형 폭스바이러스, 핵산, 방법, 백신, 및 조성물은 키트로 구체화될 수 있음도 고려된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 조성물, 백신, 키트, 또는 이의 용도에 관한 것으로써, 다음을 포함한다: 이를 테면, MVA에 국한되지 않는, 재조합형 오르소폭스바이러스, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는 상기 재조합형 오르소폭스바이러스; 그리고 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는, 이를 테면, 계두에 국한되지 않는, 재조합형 아비폭스바이러스.
다른 구체예들에서, 본 발명은 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 이식유전자를 인코드하는 재조합형 폭스바이러스를 생성시키는 하나 또는 그 이상의 방법에 관한 것이다.
한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는 MUC1 이식유전자를 갖는 재조합형 폭스바이러스를 만드는 방법이 있는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: a) 본 명세서의 핵산 또는 발현 카세트중 임의의 하나를 제공하고; 그리고 b) 상기 핵산 또는 상기 발현 카세트를 재조합형 폭스바이러스 안으로 삽입시킨다.
또다른 구체예에서, 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는 재조합형 폭스바이러스를 만드는 방법이 있는데, 이 방법은 다음을 포함한다: a) 적어도 2개의 가변적 N-말단 반복부 (VNTR) 도메인을 갖는 MUC1 펩티드를 인코드하는 제1 핵산 서열을 제공하며, 이때 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인의 정렬은 셔플화되고, 그리고 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인은 코돈 최적화되고; 그리고 b) CEA 펩티드를 인코드하는 제2 핵산을 제공하고, 이때 상기 제2 핵산은 상기 제2 핵산의 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역에 적어도 하나 뉴클레오티드 치환을 포함하고, 이때 상기 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역은 a) 3개 이상의 연속적으로 반복된 G 또는 C 뉴클레오티드 및/또는 b) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 T 뉴클레오티드로 규정되고; 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 연속적 계대를 통하여 안정적이 된다.
본 발명의 추가 목적 및 이점은 다음의 설명에서 부분적으로 설명 될 것이고, 그리고 일부는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이거나 본 발명의 실시에 의해 습득될 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
첨부된 도면은 본 명세서에 통합되어 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 구체예를 도시하며, 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 PANVAC (MUC1 및 CEA)의 이식유전자의 불안정성을 설명하는 PCR 분석이다. TBC-FPV 게놈 (IGR61/62)안에 MUC1 및 CEA의 통합에 이용된 PCR 엠플리콘의 결과를 나타낸다. 예상된 PCR 단편의 높이와 잠재적인 wt -단편(fragment)이 표시된다. 몇 가지 더 작은 크기의 결손 단편들이 탐지될 수 있고, 34℃ 또는 37℃에서 반복적 계대 동안에 더 많아 질 수 있다. PANVA-F의 계대 0에서 7에 대한 결과를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 MUC1의 아미노산 서열과 본 발명의 다양한 구체예들에 따른 VNTR 도메인 반복부들의 셔플링을 나타낸다. A) PANVAC (서열 번호: 6)에서 발견된 MUC1 아미노산. PANVAC MUC1에서 발견된 6가지 VNTRs를 나타낸다. B) mBN336, mBN373, 및 mBN420 (서열 번호: 30)에서 발견된 MUC1 아미노산. mBN336, mBN373, 및 mBN420 MUC1에서 발견된 3VNTRs를 나타낸다. 밑줄친 아미노산들은 WO 2013/103658의 작용(agonist) 에피토프를 형성하도록 변형된 아미노산들을 나타낸다.
도 3a-3c는 본 발명의 다양한 구체예들에 따라 MUC1 VNTR 도메인 반복부의 쌍으로 정렬(pairwise alignments) 및 예시적인 코돈 최적화(optimization)를 나타낸다. A) PANVAC VNTR #2 (서열 번호: 7) 및 mBN336, mBN373, mBN420 VNTR #1 (서열 번호: 8)의 정렬, B) PANVAC VNTR #1 (서열 번호: 9) 및 mBN336, mBN373, mBN420 VNTR #2 (서열 번호: 10)의 정렬, C) PANVAC VNTR #3 (서열 번호: 11) 및 mBN336, mBN373, mBN420 VNTR #3 (서열 번호: 12)의 정렬. 밑줄친 뉴클레오티드들은 WO 2013/103658의 작용 에피토프를 형성하도록 변형된 뉴클레오티드 영역들을 나타낸다.
도 4a-4c는 PANVAC와 비교하였을 때, 본 발명에 따라 상기 재조합형 폭스바이러스 기반의 구조체들에서 이용된 MUC1 코딩 서열들의 쌍으로의 정렬을 나타낸다. A) MUC1 PANVAC (서열 번호:1) 대비(versus) MUC1 mBN336 (서열 번호:2); B) MUC1 PANVAC (서열 번호:1) 대비 MUC1 mBN373 (서열 번호:3); C) MUC1 PANVAC (서열 번호:1) 대비 MUC1 mBN420 (서열 번호:5). 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 예시적인 반복적 영역은 밑줄친다.
도 5는 PANVAC의 CEA와 비교하였을 때(서열 번호: 13), 본 발명에 따라 상기 재조합형 폭스바이러스 기반의 구조체들에서 이용된 mBN373 및 mBN420 (서열 번호: 14)의 CEA 코딩서열의 쌍으로의 정렬을 나타낸다. 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 예시적인 반복적 영역은 밑줄친다.
도 6은 PANVAC의 B7-1과 비교하였을 때(서열 번호:16), PANVAC와 비교하였을 때, 본 발명에 따라 상기 재조합형 폭스바이러스 기반의 구조체들에서 이용된 mBN373 및 mBN420 (서열 번호: 15)의 B7-1 코딩서열의 쌍으로의 정렬을 나타낸다. 예시적인 반복적 영역은 보여지는 치환(정렬에서 비(non) * 영역)으로 도시된다.
도 7은 PANVAC와 비교하였을 때(서열 번호:19), PANVAC와 비교하였을 때, 본 발명에 따라 상기 재조합형 폭스바이러스 기반의 구조체들에서 이용된 mBN373 및 mBN420 (서열 번호: 18)의 ICAM-1 코딩서열의 쌍으로의 정렬을 나타낸다. 예시적인 반복적 영역은 보여지는 치환(정렬에서 비(non) * 영역)으로 도시된다.
도 8은 PANVAC와 비교하였을 때(서열 번호:22), PANVAC와 비교하였을 때, 본 발명에 따라 상기 재조합형 폭스바이러스 기반의 구조체들에서 이용된 mBN373 및 mBN420 (서열 번호: 21)의 LFA-3 코딩서열의 쌍으로의 정렬을 나타낸다. 예시적인 반복적 영역은 도시된 치환(정렬에서 비(non) * 영역)으로 도시된다.
도 9a 및 9b는 mBN336에서 MUC1 이식유전자의 안정성을 분석하는 실험을 설명한다. A) 임상 시험 재료 (CTM)/ GMP 재료 생산 동안 그리고 생산 후 계대를 대표하는 7가지 계대에 걸쳐 CEA 안정성에 대한 PCR 결과. B) CTM/ GMP 재료 생산 동안 그리고 생산 후 계대를 대표하는 7가지 계대에 걸쳐 MUC1 안정성에 대한 PCR 결과. C) CTM/ GMP 재료 생산 동안 그리고 생산 후 계대를 대표하는 7가지 계대에 걸쳐 TRICOM 안정성에 대한 PCR 결과. MVA-mBN336B 생산에 이용된 재조합 플라스미드는 양성 대조군으로 이용되었으며, MVA-BN®은 음성 대조군 (비어있는 벡터 골격)으로 이용되었고, 그리고 H2O는 PCR 반응의 대조군으로 이용되었다.
도 10a 및 10b는 mBN336의 계대(Passages) 5, 6, 및 7의 분석을 나타낸다. A) 시퀀싱에 의한 분석용으로 보내진 계대 7 시료의 PCR 증폭. 각 개별 이식유전자: CEA, MUC1, 및 TRICOM에 대한 개별 PCR 증폭이 실행되었다. B) 계대 5에서 기인된 프레임 이동(frame shift)으로 결과되는 탐지된 점 돌연변이가 함유된 좌(loci)를 묘사하는 MUC1 nt-서열의 전기영동도(Electropherograms).
도 11a 및 11b는 mBN373에서 MUC1 이식유전자의 안정성을 분석하는 실험을 설명한다. A) 각 계대에 대한 삽입된 이식유전자에 대한 PCR 분석. FPV-mBN373B 생성에 이용된 재조합 플라스미드는 양성 대조군으로 이용되었고, FPV (균주 TBC-FPV)는 음성 대조군으로 이용되었다. B) 계대 7에서 FPV-mBN373B의 분석에서 예상된 밴드 크기는 5566 bp (PCR1) 및 5264 bp (PCR2)인데, 이는 삽입된 이식유전자 및 각 삽입된 측면(flanking) 영역을 포괄한다. 서열 분석에서 CTM/ GMP 재료의 생산 동안 그리고 그 이후의 계대를 대표하는 7 계대 이후 상기 재조합형의 유전적 안정성이 확인되었다.
도 12는 PCR 분석으로써, 이는 mBN420에서 MUC1, CEA, 및 TRICOM 이식유전자의 안정성을 분석한다. MVA-BN 게놈 (IGR88/89) 안에 5개 모든 이식유전자의 통합에 이용된 부위의 PCR 엠플리콘의 결과를 나타낸다. 예상된 PCR 단편의 높이와 잠재적인 wt-단편(fragment)이 표시된다. 몇 가지 더 작은 크기의 결손 단편들이 탐지될 수 있고, 30℃ 에서 반복적 계대 동안에 더 많아 질 수 있다. mBN420의 계대 0에서 7에 대한 결과를 나타낸다.
도면에 표시된 모든 쌍으로 정렬 된 정렬은 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/에서 이용가능한, Clustal Omega sequences Alignment 도구를 사용하여 수행되었다.
발명의 상세한 설명
전술한 요약 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것이며, 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
PANVAC는 각각 이식유전자 MUC1, CEA, 및 TRICOM를 발현시키는 백시니아 (PANVAC-V) 및 계두 (PANVAC-F)의 상기 재조합형 폭스바이러스를 이용한 이종성(heterologous) 프라임-부스터 전략을 채택한다. PANVAC는 암 치료에 효과적인 것으로 나타났으며, 현재 결장직장암, 난소암, 유방암, 및 방광암을 비롯한 다양한 암에 대한 임상시험중에 있다. MVA-CV301은 임상시험중에 있는 또다른 이종성(heterologous) 백신 조합(예를 들어, Gulley 외, Clin Cancer Res 2008; vol. 14:10, Tsang 외, Clin Cancer Res 2005; vol. 11 참고)이다. MVA-CV301은 각각 이식유전자 MUC1, CEA, 및 TRICOM를 발현시키는 MVA 및 계두를 이용한 이종성(heterologous) 프라임-부스터 전략을 채택한다.
한편 PANVAC 및 MVA-CV301은 암 치료에 효과적이지만, PANVAC 재조합형 폭스바이러스의 이식유전자는 상기 바이러스들의 연속적 계대 및 생산시에 덜 안정하게 된다. 표 1 및 2에서 나타낸 바와 같이, PANVAC-V 및 PANVAC-F의 연속적 계대 후, MUC1 및 CEA를 발현시키는 바이러스의 백분율은 꾸준하게 감소된다.
PANVAC-V MVB1, MVB2 및 계대에서 플락(Plaques)을 발현시키는 백분율
단백질 MVB 플락을 발현시키는 평균 백분율(%)
MVB 계대 1* 계대 2* 계대 3* 계대 4*
CEA 1 99.5 99.8 98.3 94.7 90.0
2 100.0 97.6 95.1 91.8 89.0

MUC1		 1 99.8 99.3 95.0 91.6 83.0
2 99.7 98.2 95.9 86.3 73.6
B7.1 1 99.9 99.9 99.7 99.4 97.7
2 99.9 100.0 99.9 99.8 99.1
ICAM-1 1 99.8 99.5 98.8 98.6 97.5
2 99.6 99.4 99.1 98.2 98.2
LFA-3 1 100.0 99.9 99.7 99.5 98.5
2 100.0 99.6 99.9 99.8 99.1
*각 숫자는 세 가지 별개 실험에서 얻은 평균값을 나타낸다.
PANVAC-F MVB1, MVB2 및 계대에서 플락을 발현시키는 백분율.
단백질 MVB 플락을 발현시키는 평균 백분율(%)
MVB 계대 1* 계대 2* 계대 3* 계대 4*
CEA 1 99.2 99.5 96.1 80.4 54.9
2 100.0 99.4 98.8 89.8 63.9
MUC1 1 99.7 99.3 95.3 75.7 44.3
2 99.6 99.8 98.3 89.4 55.4
B7.1 1 100.0 100.0 100.0 99.8 99.8
2 99.5 99.2 99.7 100.0 99.5
ICAM-1 1 100.0 99.9 99.8 99.4 99.5
2 99.8 99.5 99.7 100.0 99.9
LFA-3 1 100.0 100.0 100.0 100.0 99.9
2 100.0 99.9 99.7 100.0 100.0
*각 숫자는 세 가지 별개 실험에서 얻은 평균값을 나타낸다.
적어도 하나의 양태에서, MUC1 및/또는 CEA 발현 감소는 MUC1 및/또는 CEA 이식유전자의 적어도 부분적인 손실의 결과인 것으로 보인다. 도 1은 PANVAC의 MUC 및 CEA 이식유전자 서열 손실을 나타낸다. 도 1에서, 재조합형 PANVAC-F 산물은 4445 bp에 존재하는 것으로 예측되었다. 그러나, 도시된 바와 같이, 실험에서 다수의 더 작은 크기의 단편들의 존재를 발견하였고, 이는 MUC1 및 CEA의 단편화된 서열인 것으로 확인었다 (데이터 제공되지 않음). MUC1 이식유전자 및 기존 재조합형 폭스바이러스에서 발현 상실 및 불안정성은 CV301 재조합형 폭스바이러스의 생산 및 순도를 저해한다.
다양한 핵산 및 본 발명의 재조합형 폭스바이러스를 만들기에 앞서, 상기 이식유전자의 안정화를 위하여, 본 발명자들은 PANVAC 및 MVA-CV301의 재조합 백시니아, 재조합 MVA 및 재조합형 계두 바이러스의 맞춤화 및/또는 변형화를 여러차례 시도하였다. 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 이식유전자 및/또는 상기 재조합형 백시니아, 재조합형 MVA, 및 재조합형 계두 바이러스에 대한 변형(modifications)에는 다음을 함유한다: (i) 이식유전자들이 삽입되었던 유전자사이(intergenic)의 영역 (IGRs)의 변경 또는 변형, (ii) 하나 또는 그 이상의 이식유전자의 코돈들을 최적화, (iii) 이식유전자 프로모터를 다변화, 및 (iv) MUC1 이식유전자에서 VNTR 영역의 수 및 정렬을 변형. 표에 기술된 바와 같이, 구조체들중 많은 것들이 기능 상실 돌연변이 또는 단편 결손으로 인해 안정적으로 생성되지 못하였고, 이로 인하여 이식유전자 발현되지 못했다.
시도(Attempts) 구조체 - MVA 바이러스
구조체 이름 구조체 상세설명 결과
MVA-mBN247 IGR148/149에서 MUC/CEA/TRICOM
PANVAC-V와 정확히 일치되는 프로모터 & TGs		 생성 실패
MVA-mBN269 IGR148/149에서 오직 CEA 만(PANVAC-V에서와 같이) 안정적
MVA-mBN317 IGR44/45에서 최적화된 코돈 사용과 함께 CEA
IGR148/149에서 변화없는 TRICOM		 생성동안 이미 CEA 상실
MVA-mBN329 IGR44/45에서 CEA (PANVAC-V에서와 같이)
IGR148/149에서 변화없는 TRICOM		 성공적 생성
30℃ & 37℃ (BN-CVD에 의한 FACS)에서 7개 계대의 경우 TGs의 안정적 발현
MVA-mBN332 GR88/89에서 MUC1-C3-opt6VNTRs
IGR44/45에서 CEA (PANVAC-V에서와 같이)
IGR148/149에서 TRICOM (PANVAC-V에서와 같이)		 생성 실패
MVA-mBN335 IGR88/89에서 MUC1-C5-opt6VNTRs-SignMut
IGR44/45에서 CEA (PANVAC-V에서와 같이)
IGR148/149에서 TRICOM (PANVAC-V에서와 같이)		 생성 실패
시도 구조체 - 계두 바이러스
구조체 이름 구조체 상세설명 결과
FPV-mBN285 BamJ (PANVAC-F와 상이함)에서 CEA & TRICOM
PANVAC-F와 정확히 일치되는 프로모터 & TGs		 생성 실패
FPV-mBN318 IGR61/62에서 FPV-mBN285 + MUC1-C3-opt6VNTRs-SignMut 생성 실패
FPV-mBN319 IGR61/62에서 FPV-mBN285 + MUC1-C14-opt3VNTRs-SignMut 생성 실패
FPV-mBN322 IGR61/62에서 FPV-mBN285 + MUC1-C5-opt6VNTRs 생성 실패
FPV-mBN338 IGR61/62에서 FPV-mBN285 + MUC1-C5-opt6VNTRs-SignMut 생성 실패
FPV-mBN339 IGR61/62에서 FPV-mBN285 + MUC1-C13-opt3VNTRs 생성 실패
FPV-mBN351 IGR61/62에서 단지 MUC1-C13-opt3VNTRs 만
MUC-1의 미약한 발현
FPV-mBN352 BamJ에서 MUC1/CEA/TRICOM
MUC1-C13-opt3VNTRs을 위한 FPV-40K 프로모터와 함께		 CEA에서 단일 뉴클레오티드 돌연변이가 반복적으로 생성됨
FPV-mBN353 IGR61/62의 ORFs에 역 방향으로 MUC1을 갖는, FPVmBN285 + (FPV-40K 프로모터)-MUC1-C13-opt3VNTRs MUC1의 즉각적 손실
FPV-mBN362 FPV-mBN351 & FPVmBN285 동시-감염(co-infection)
BamJ에서 IGR61/62 & TRICOM에서 (PrS)-MUC1-C13-opt3VNTRs		 CEA에서 단일 뉴클레오티드 돌연변이가 반복적으로 생성됨
이러한 여러 시도 후, MVA-mBN336이 작제되었다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, MVA-mBN336은 변형된 MUC1, CEA, 및 변형된 TRICOM 이식유전자를 함유하는 MVA-CV301 재조합형 폭스바이러스이다. 도 9 및 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, MVA-mBN336은 PANVAC와 비교하였을 때(도 1 및 표 1 참고), 이식유전자 안정성을 입증하였다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, MVA-mBN336은 계대 4를 통하여 이식유전자 (MUC1, CEA, 및 TRICOM 모두의 안정성을 보여주었다. 계대 5에서 시작하여, 분석된 재료의 소집단내에서 프레임이동(frameshift) 돌연변이가 탐지되었다. 계대 4를 통해 보여진 안정성으로, MVA-mBN336이 PANVAC 및 MUC1을 비롯한 안정적인 폭스바이러스를 생성하려는 다른 시도와 관련된 안정성 문제를 극복할 수 있음을 보여주었다. MVA-mBN336의 안정성은 MVA-기반의 백신의 제작 및 대규모 생산이 전형적으로 계대 3 또는 계대 4에서 MVAs으로부터 취해지기 때문에 추가적으로 유리하다. 따라서, MVA-mBN336은 계대 4를 통하여 안정적이기 때문에, 대규모 생산은 시작될 수 있고, 안정성에 관한 상당한 규제 장애가 극복 될 수 있다.
불안정성 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 핵산을 합성하였고, 이 핵산은 MUC1 이식유전자, CEA 이식유전자, 및 TRICOM 이식유전자를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 제공한다. 본 발명에 의해 보여진 바와 같이, 본 발명의 MUC1, CEA, 및 TRICOM 핵산은 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 상기 재조합형 폭스바이러스 및 이에 함유된 상기 이식유전자들의 유전적 안정성을 개선시킨다.
따라서, 다양한 구체예들에서, 본 발명은 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 항원들을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 신규한 핵산을 보유한 재조합형 폭스바이러스를 제공한다. 본 명세서에서 보다 상세히 제시된 바와 같이, 적어도 하나의 양태에서, 재조합형 폭스바이러스의 일부로 통합될 때, 상기 하나 또는 그 이상의 변형된 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 인코딩 핵산 서열들은 상기 재조합형 폭스바이러스에 있는 이식 유전자의 안정성 및 존재를 개선시킨다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태( "a", "an") 및 관사("the")는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "핵산"에 대한 언급에는 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하고, "방법"에 대한 언급에는 본원에 기재된 방법으로 변형되거나 치환될 수 있는 당업자에게 공지된 대등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소들에 붙어있는 "적어도(at least)"이라는 용어는 그 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 통상적인 실험만으로 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대응하는 다수의 균등물을 인지할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 본 발명에 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 후속하는 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)"이라는 단어 및 이의 변형어 이를테면, "포함하는(comprises)"및 "포함하는(comprising)"는 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 경우, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "함유하는((containing) 또는 (including))" 또는 때때로 "보유하는(having)"라는 용어로 대체될 수 있다. 본 발명의 양태 또는 구체예의 맥락에서, 본 명세서에서 사용될 경우마다 전술한 용어 (포함, 함유, 보유) 중 임의의 것을 "~구성된(consisting of)라는 용어로 대체할 수 있지만, 바람직함은 덜하다. 본 명세서에서 사용되는 경우, "~로 구성된(consisting of)"이란 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에 사용되는 경우, "본질적으로 ~로 구성된다(consisting essentially of)"는 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 복수의 요소들 사이의 연결 용어 "및/또는(and/or)"은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없이 첫 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 옵션 없이, 두 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째와 두 번째 요소를 함께 적용 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 하나는 상기 의미 내에 있는 것으로 이해되므로, 여기에 사용된 "및/또는"이라는 용어의 충족요건에 부합된다. 하나 또는 그 이상의 옵션에 대한 동시 적용 가능성 또한 상기 의미 내에 포함되는 것으로 이해되므로, 따라서 "및/또는"이라는 용어의 용어의 충족요건에 부합된다.
본원에 기술된 "돌연변이(mutation)"는 본원에서 정의된 바와 같이, 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환과 같은 핵산에서의 대한 임의의 변형이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "동시-자극적 분자들(Costimulatory molecules)"은 이의 리간드에 결합될 때, T 세포가 활성화될 수 있는 제 2 신호를 전달하는 분자이다. T 세포 상에 가장 잘 알려진 동시-자극적 분자는 B7-1 (B7.1 또는 CD80로도 또한 알려짐) 또는 B7-2 (CD86으로도 또한 알려짐)에 결합하는, CD28이다. 추가적인 동시-자극적 분자는 B7-3이다. T 세포의 활성화를 위한 제2 신호를 또한 제공하는 부속 분자들은 세포내 흡착 분자 (ICAM-1 및 ICAM-2), 백혈구 기능 연합된 항원 (LFA-1, LFA-2 및 LFA-3)를 함유한다. 인테그린 및 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 구성원들은 또한 동시-자극 분자들로서의 기능을 할 수 있다.
상기 재조합형 폭스바이러스, MUC1, CEA, TRICOM, 및 기타 이식유전자와 함께 다음의 용어가 사용될 때 "유전적 안정성(Genetic stability), "안정성(tability)", "발현의 안정성(Stability of expression)", "연속적 계대를 통한 안정(stable through successive passaging)", "연속적 계대를 통한 안정성(stability through successive passaging)" 또는 "연속적 계대를 통한 발현의 안정성(stability of expression through successive passaging)"란 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 적어도 계대 3 또는 계대 4까지 상기 재조합형 폭스바이러스의 이식유전자의 뉴클레오티드 서열이 기본적으로 고유하거나 및/또는 변화되지 않고 유지된다는 것을 의미한다. 폭스바이러스의 대량 생산 및 생산에 의해 생성되는 최종 생성물이 전형적으로 계대 3 또는 4이기 때문에, 적어도 계대 3 또는 4를 통하여 안정성을 갖는 재조합 폭스바이러스는 특히 중요하다. "실질적으로 손상되지 않고 및/또는 실질적으로 변하지 않는다(Materially intact and/or materially unchanged)"는 것은 계대의 수가 증가함에 따라, 이식유전자의 발현이 일정하게 감소되는 원인이 되는 단일 또는 단편 돌연변이 (예컨대, 치환, 결실 등을 포함)의 부재를 의미한다. 예를 들면, 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, PANVAC의 다양한 이식유전자의 발현 수준은 계대 횟수가 증가함에 따라 감소 하였다. 본 출원의 실시예 2 내지 4에 기재된 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는, 이식유전자의 유전적 안정성 또는 안정성이 분석 될 수 있는 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 안정성을 측정하기 위한 당업계에 공지된 추가의 방법은 PCR, FACS, FACS에 의한 이식유전자 동시-발현 측정 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 "숙주 세포(host cell)"는 외인성 분자, 바이러스 또는 미생물의 발생 및/또는 생산을 목적으로 외래 분자, 바이러스 또는 미생물이 도입된 세포이다. 하나의 비-제한적인 예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, CEF 세포와 같은 적합한 세포 배양물의 세포는 폭스바이러스 또는 다른 대안적인 구체예에서 외래 또는 이종성(heterologous) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터로 감염될 수 있다. 따라서, 상기 적합한 세포 배양물은 폭스바이러스 및/또는 외래 또는 이종성(heterologous) 유전자에 대하여 숙주 기능을 한다.
본 명세서에서 기술된 핵산 서열들에 대하여 "서열 상동성(homology) 또는 동일성(identity) 백분율(%)"이란 서열들을 배열하고, 필요에 따라 최대 백분율의 서열 동일성을 획득하기 위하여 갭을 도입한 후, 후보 서열에서 참고 서열의 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레이티드(가령, 이로부터 유도된 핵산 서열)의 백분율로 정의되며, 임의의 보존 치환은 서열 동일성 부분으로 간주되지 않는다. 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 상동성 백분율을 결정하기 위한 목적으로 배열은 당업자의 기술 분야에 있는 다양한 방법을 통하여 이루어질 수 있는데, 예를 들면, 공개 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 이를 테면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 획득하기 위한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
예를 들면, 핵산 서열들을 위한 적절한 정렬은 Smith 및 Waterman, (1981 ), Advances in Applied Mathematics 2:482-489의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763에의해 정상화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 구현은 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공되는 "BestFit" 유틸리티 응용으로 제공된다. 이 방법의 디폴트 매개변수들은 Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (Genetics Computer Group, Madison, Wis.에서 이용가능)에서 기술된다. 본 발명의 맥락에서 동일성 백분율을 확립하는 바람직한 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되어, IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif)에 의해 배포된 Edinburgh University에 의해 저작권 보호된 MPSRCH 패키지 프로그램를 사용하는 것이다. 이 패키지 모음에서 Smith-Waterman 알고리즘을 사용할 수 있는데, 이때 스코어링 테이블에 디폴트 매개변수가 사용된다 (예 : 갭 오픈 페널티 12, 갭 확장 페널티 1, 갭 6). 생성된 데이터에서 "일치(Match)" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 간의 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수로 사용되는 BLAST이다. 예를 들면, BLASTN 및 BLASTP는 다음의 디폴트 매개변수를 이용하여 사용될 수 있다: 유전적 코드=표준; 필터=없음; 스트랜드(strand)=양쪽; 컷오프(cutoff)=60; 기대(expect)=10; 매트릭스(Matrix)=BLOSUM62; 목록(Descriptions)=50개 서열; 소트(sort by)=HIGH SCORE; 데이터베이스=비-변환(non-redundant), GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS 해독+Swiss 단백질+Spupdate+PIR. 이 프로그램의 세부 사항은 다음 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
"프라임-부스트 백신 접종(prime-boost vaccination)" 또는 "프라임-부스트 처방(prime-boost regimen)"이란 용어는 특정 항원을 표적으로 하는 백신의 첫 번째 프라이밍 주사하고, 일정 간격을 두고 동일한 백신의 1 회 이상의 부스팅 주사하는, 백신 접종 전략 또는 처방을 의미한다. 프라임-부스트 백신 접종은 동종 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 동종 프라임-부스트 백신 접종은 프라이밍 주입 및 하나 또는 그 이상의 부스팅 주사 모두에 대해 동일한 항원 및 벡터를 포함하는 백신을 사용한다. 이종 프라임-부스트 백신 접종은 프라이밍 주입 및 하나 또는 그 이상의 부스팅 주입 모두에 대해 동일한 항원을 포함하지만, 프라이밍 주입 및 하나 또는 그 이상의 부스팅 주입을 위하여 상이한 벡터를 이용하는 백신을 사용한다. 예를 들면, 동종 프라임 - 부스트 백신 접종은 프라이밍 주입을 위한 하나 또는 그 이상의 항원을 발현하는 핵산을 포함하는 재조합 폭스 바이러스를 사용할 수 있고, 이 동일한 재조합 폭스바이러스가 하나 또는 그 이상의 부스팅 주사를 위한 하나 또는 그 이상의 항원을 발현한다. 대조적으로, 이종성(heterologous) 프라임-부스트 백신 접종은 프라이밍 주입을 위한 하나 또는 그 이상의 항원을 발현하는 핵산을 포함하는 재조합 폭스바이러스를 이용하고, 하나 또는 그 이상의 부스팅 주사를 위한 하나 또는 그 이상의 항원을 발현하는 상이한 재조합 폭스바이러스를 이용할 수 있다.
용어 "재조합형(recombinant)"은 본래 존재하지 않거나 자연계에서 발견되지 않는 정렬로 다른 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있는, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "연속 계대(Successive Passaging)"란 세포 계대를 사용하여 재조합 바이러스를 생산하는 것과 관련된다. 단지 예로서, 숙주 세포는 초기 계대에서 바이러스 또는 재조합 바이러스에 감염된다. 바이러스는 복제되고, 초기 계대에서 생성된다. 숙주 세포의 감염 및 배양 후에, 바이러스는 숙주 세포로부터 수거되고, 세포/바이러스 현탁액에 수집된다. 이 절차는 일반적으로 후속 세포 계대에서 여러 번 반복되며, 각 계대는 더 많은 재조합 바이러스를 생산 및 복제한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "이식유전자(transgene)" 또는 "이종성(heterologous)" 유전자는 야생형 폭스바이러스성 게놈 (예를 들어, 백시니아, 계두, 또는 MVA)에 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열로 이해된다. 폭스바이러스, 이를 테면, 백시니아 바이러스에 존재하는 "이식유전자" 또는 "이종성(heterologous) 유전자"는 상기 재조합형 폭스바이러스가 숙주 세포로 투여된 후, 상응하는 이종성(heterologous) 유전자 산물, 가령, "이종성(heterologous) 항원" 및/또는 "이종성(heterologous) 단백질"로 발현되도록 상기 폭스바이러스성 게놈에 통합된다는 것으로 당업자는 이해한다. 발현은 이종성(heterologous) 유전자를 폭 바이러스-감염 세포에서 발현을 허용하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결시킴으로써 일반적으로 이루어진다. 바람직하게는, 조절 요소는 천연 또는 합성 폭스바이러스 프로모터를 포함한다.
"TRICOM." 공동자극 분자들의 세동이(Triad)(TRICOM으로도 알려짐)는 B7-1 (B7.1 또는 CD80으로도 알려짐), 세포내 흡착 분자-1 (ICAM-1, CD54로도 알려짐) 및 림프구 기능-연합된 항원-3 (LFA-3, CD58로도 알려짐)을 함유하고, 항원-특이적 면역 반응을 증가시키기 위하여 특이적 항원을 발현시키는 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 폭스바이러스성 벡터)에 보통 함유된다. TRICOM의 개별 구성 요소는 동일하거나 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 특정 항원을 갖는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 제공 될 수 있다. 예시적인 벡터는 예를 들면, Hodge 외, "A Triad of Costimulatory Molecules Synergize to Amplify T-Cell Activation," Cancer Res. 59:5800-5807 (1999) 및 U.S. 특허 번호 7,211,432 B2에서 기술되며, 이들 두 문헌은 참고자료에 편입된다.
"벡터(vector)"란 이종성(heterologous) 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다. 상기 이종성 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 치료의 목적의 관심 서열을 포함할 수 있으며, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상에서 복제 할 수 없어야 한다. 상기 용어는 클로닝 벡터 및 바이러스성 벡터를 포함한다.
신규한 MUC1 핵산 서열들
본 발명의 개발과 함께, 발명자들은 상기 재조합형 폭스바이러스, 구체적으로 상기 오르소폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스, MVA, MVA-BN) 및 상기 아비폭스바이러스 (예를 들어, 계두 바이러스)의 계대 과정에 걸쳐, MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM을 인코드하는 핵산의 하나 또는 그 이상의 영역이 돌연변이(예를 들어, 결손된, 치환된 등등)되고, 이로 인하여 상기 재조합형 폭스바이러스 및 그 안의 이식유전자의 안정성에 기여하는 것을 결정하였다.
VNTR 영역에 대한 변형
앞서 명시된 바와 같이, VNTR 영역은 20개 아미노산 가변적 수 텐덤 반복부 (VNTR) 도메인이 함유된 MUC1의 세포외 도메인으로, 상이한 개체에서 반복부의 수는 20부터 120까지 가변적이다. Brayman 외, 참고. 상기 VNTR 도메인의 아미노산 서열은 전형적으로 동일하지만(예를 들어, 도 2a 참고), 상기 VNTRs의 뉴클레오티드 서열은 가변적일 수 있다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, PANVAC의 일부분으로써, MUC1은 6개 VNTRs를 보유하도록 합성되었다.
하나의 양태에서, 본 발명의 개발 과정에 걸쳐, MUC1 VNTR 영역을 인코드하는 핵산에 있어서 하나 또는 그 이상의 변형으로 재조합형 폭스바이러스에서 MUC1 이식유전자의 안정성이 개선된 것으로 확인되었다. 특히, 본 발명자들은 PANVAC MUC1과 비교하였을 때, VNTR을 코딩하는 핵산을 셔플링하는 것이 MUC1 이식유전자의 안정성을 더욱 강화 시킨다는 것을 확인했다. 본원에서 이용된 바와 같이, VNTRs의 "셔플링(shuffling)"은 VNTR 도메인 반복부를 인코딩하는 핵산의 순서를 재정렬하는 것으로 정의된다. 도 2a 및 도 2b는 VNTR을 셔플링하는 비-제한적인 예를 도시한 것이다. 도 2a에서 PANVAC VNTR 도메인의 순서는 VNTR # 1-6으로 표시된다. 도 2b를 보면, mBN336, mBN373, mBN420의 VNTR # 1을 인코딩하는 핵산은 PANVAC의 VNTR #에 대응한다. mBN336, mBN373, mBN420의 VNTR #2는 PANVAC에서 VNTR#1에 대응한다. 따라서, mBN336, mBN373, mBN420의 MUC1을 합성함에 있어서, PANVAC VNTRs #1 및 2의 순서는 셔플링되었다.
본 발명에 의해, 도 2a 및 2b에 도시된 VNTR 도메인은 단지 MUC1 VNTR 도메인을 대표한 것이며, VNTR 도메인의 수 및 셔플링된 VNTRs 정렬은 변할 수 있음이 이해된다.
VNTRs의 셔플링외에도, VNTR 도메인의 코돈을 최적화하는 것이 MUC1 이식유전자의 안정성을 더욱 향상시키는 것으로 판명되었다. 본원에서 이용된 바와 같이, "코돈 최적화(optimizing codons)"는 반복적 뉴클레오티드 서열의 상동성으로 인해, VNTR의 뉴클레오티드 서열로의 돌연변이 및/또는 결실의 가능성을 최소화하기 위하여, VNTR의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 치환하는 것으로 정의된다.
더욱 특이적 구체예에서, 도 3a-3b의 정렬에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 핵산의 하나 또는 그 이상은 VNTR 도메인내 다양한 치환을 함유한다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, mBN373 및 mBN420 (이하에서 mBN373/420)의 VNTR1은 설명된 코돈 최적화 치환에 추가하여, WO 2013/103658 의 작용 에피토프를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열(밑줄로 표시된 영역)을 포함한다. 도 3b 및 3c에 나타낸 것과 같이, mBN373/420 변형의 VNTRs 2 및 3은 설명된 코돈 최적화 치환을 포함한다.
본 발명에 의해, 도 3a 및 3c에 나타낸 것과 같이, VNTR 도메인에 대한 설명된 코돈 최적화는 MUC1 VNTR 도메인은 코돈 최적화를 단순히 대표하는 것으로 이해된다. 단지 예로서, VNTR 도메인에서 변형의 특정 지점에서 대체 뉴클레오티드가 치환될 수 있다는 것이 본 발명에 의해 고려된다. 또한, VNTR 도메인에서의 특정 지점의 변형은 이 변형이 침묵 변형 (silent modification)이 되도록 변화될 수 있다. 본원에 사용된 침묵 변형은 이러한 변형이 MUC1 항원의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 MUC1 핵산은 1) 셔플화되고 및 2) 코돈 최적화된 하나 또는 그 이상의 VNTR 도메인 영역을 포함된다. MUC1의 비-VNTR 영역에 대한 변형.
본 발명의 또다른 양태에서, VNTR 도메인의 이들 영역 외부에 하나 또는 그 이상의 변형이 만들어졌다. 더 특이적 양태에서, 본 발명의 개발 과정에 걸쳐, MUC1 VNTR 영역의 이들 뉴클레오티드 영역 외부(비-VNTR 영역)에 하나 또는 그 이상의 변형은 MUC1 이식유전자의 안정성을 개선시킨 것으로 확인되었다. 이들 영역 (밑줄친 뉴클레오티드)의 대표적인 예는 하기에 설명된다. 상기 VNTR 영역은 회색 음영으로 표시된다.
바이러스의 연속적인 계대를 통해 안정적인 재조합 폭스바이러스를 생성시키기 위해, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 핵산을 합성하였다. 좀더 구체적으로, 도 2a에서 2c를 통하여 설명된 바와 같이, 보이는 바와 같이, PANVAC MUC1 (서열 번호:1)의 VNTR 영역 외부 밑줄친 부위중 하나 또는 그 이상에서 하나 또는 그 이상의 치환이 만들어졌다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, MUC1 핵산의 VNTR 영역 외부 반복적 뉴클레오티드 영역중 적어도 하나에 대하여 치환을 포함하는 신규한 MUC1 핵산이 있다. 적어도 하나의 양태에서, 하나 또는 그 이상의 반복적 영역은 다음과 같이 정의된다: (i) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 3개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 3개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드. 더 특이적 양태들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 반복적 뉴클레오티드 영역은 (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드로 추가 정의된다. 특정 기타 더 특이적 양태들에 있어서, 상기 연속적으로 반복된 뉴클레오티드는 (i) 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 연속 T 뉴클레오티드로 정의된다.
도 2a 내지 2c를 통하여 나타낸 바와 같이, 상기 신규한 MUC1핵산은 MUC1 핵산의 VNTR 영역 외부 적어도 2, 3, 4, 또는 5개의 반복적 뉴클레오티드 영역에서 치환을 포함할 수 있다. 추가 양태들에 있어서, 상기 신규한 MUC1 핵산은 VNTR 영역 외부 적어도 10, 15, 20, 또는 25개의 반복적 뉴클레오티드 영역에서 치환을 포함할 수 있다.
추가 양태들에 있어서, 상기 신규한 MUC1 핵산은 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대에 결쳐 돌연변이 되기 더 쉬운 경향의 VNTR 영역에서 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 예시적인 양태에서, 상기 신규한 MUC1 핵산은 표 5에서 나타낸 바와 같이, PANVAC MUC1 (서열 번호:1)의 뉴클레오티드 영역 및/또는 이의 조합으로부터 선택된, VNTR 영역 외부의 MUC1 뉴클레오티드 반복적 영역중 하나 또는 그 이상에서 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다.
7-16 19-32 40-45 65-68 122-128 136-138
194-200 207-213 222-224 240-253 296-299 705-714
731-734 761-765 770-773 791-795 847-864 880-883
895-922 933-953 1004-1006 1009-1113 1030-1050 1075-1081
1085-1090 1097-1102 1153-1156 1166-1171 1201-1212 1237-1246
1264-1280 1294-1300 1328-1332 1335-1346 1353-1357 1375-1381
1407-1410 1418-1423 1426-1431 1437-1442 1449-1454 1459-1464
1471-1479 1494-1500
더욱 바람직하게는, 상기 신규한 MUC1 핵산은 표 6에 나타낸 바와 같이, PANVAC MUC1 (서열 번호:1)의 뉴클레오티드 영역 및/또는 이의 조합으로부터 선택된, VNTR 영역 외부의 MUC1 뉴클레오티드 반복적 영역중 하나 또는 그 이상에서 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다.
7-16 19-32 40-45 65-68 122-128 136-138
194-200 207-213 222-224 240-253 296-299 705-708
710-714 731-734 761-765 770-773 791-795 847-855
857-864 880-883 895-898 899-914 916-922 933-937
940-943 945-953 1004-1006 1009-1113 1030-1050 1075-1081
1085-1090 1097-1102 1153-1156 1166-1171 1201-1212 1237-1240
1243-1246 1264-1280 1294-1300 1328-1332 1335-1337 1338-1343
1344-1346 1353-1357 1375-1381 1407-1410 1418-1423 1426-1431
1437-1442 1449-1454 1459-1464 1471-1479 1494-1500
표 5 및 표 6에 열거된 뉴클레오티드 위치는 MUC1의 비-VNTR 영역에서 발견되는 MUC1 핵산 반복부 영역의 대표일 뿐임을 본 발명에서 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 반복적 영역은 서열 번호:1의 명시된 뉴클레오티드 위치 (예를 들어, 240-253)을 보유하며 , 특정 영역은 또다른 MUC1 핵산내 또다른 뉴클레오티드 위치에 상응할 수 있다.
추가 구체예들에서, VNTR 외부의 반복부 영역에 대한 변형 및 / 또는 VNTR 영역에서의 변형은 침묵 변형이며, 이는 변형이 MUC1 항원의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 적어도 하나의 양태에서, 하나 또는 이상의 반복부 영역을 변형시켜 MUC1 이식유전자의 안정성을 향상시키는 것은 MUC1의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고, 특정 뉴클레오티이드 및/또는 반복부 영역 만이 변형될 수 있다는 점에서 도전적이었다.
전술한 견지에서, 하나 또는 그 이상의 구체예들에서, 본 발명은 1) a) 셔플링 및 b) 코돈 최적화로부터 선택된 VNTR 도메인 반복부에 대한 하나 또는 그 이상의 변형; 그리고 2) VNTR 외부의 반복적인 영역에 대한 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하는, 하나 또는 그 이상의 MUC1 핵산을 함유한다.
또다른 양태에서, 본 발명의 MUC1 핵산은 대상에서 MUC1 이식유전자의 면역원성을 향상시키도록 구성된 하나 또는 그이상의 변형을 포함할 수 있다. 한 가지 비-제한적 예에서, MUC1 핵산은 WO 2013/103658에 기술된 하나 또는 그 이상의 작용 에피토프를 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 본원에 참고차료로 편입된다. 더욱 특이적 구체예에서, 본 발명의 MUC1은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 작용 에피토프를 함유한다: YLAPPAHGV [서열 번호: 24], YLDTRPAPV [서열 번호: 25], YLAIVYLIAL [서열 번호: 26], YLIALAVCQV [서열 번호: 27], YLSYTNPAV [서열 번호: 28], 및 SLFRSPYEK [서열 번호: 29] (밑줄친 부분은 치환된 아미노산들이다).
바람직한 구체예들에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 2 (336 MUC), 서열 번호: 3 (373 MUC), 서열 번호: 4 (399/400 MUC1), 또는 서열 번호: 5 (420 MUC1)에 대하여 적어도 95% 상동성의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 추가적인 바람직한 구체예들에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 2 (336 MUC), 서열 번호:3 (373 MUC), 서열 번호: 4 (399/400 MUC1), 또는 서열 번호: 5 (420 MUC1)에 대하여 적어도 96%, 97%, 또는 98% 상동성의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 2 (336 MUC), 서열 번호:3 (373 MUC), 서열 번호: 4 (399/400 MUC1), 또는 서열 번호: 5 (420 MUC1)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
여전히 다른 바람직한 구체예들에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 또는 서열 번호: 34에 대하여 적어도 95% 상동성의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 추가적인 바람직한 구체예들에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 또는 서열 번호: 34에 대하여 적어도 96%, 97%, 또는 98% 상동성의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MUC1 핵산은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 또는 서열 번호: 34로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
신규한 CEA 핵산 서열들
본 발명의 또다른 양태에서, CEA 핵산의 반복부 영역에서 하나 또는 그 이상의 변형이 CEA 이식유전자의 안정성을 개선시키는 것으로 확인되었다. 이들 영역의 대표적인 예들은 도 5의 쌍을 이룬 정렬로 설명된다. 이들 예시적인 반복적 영역은 표시된 치환 (정렬의 비 * 영역)으로 설명된다.
적어도 하나의 양태에서, 상기 치환은 재조합형 폭스바이러스의 안정성을 더 강화시켰다. 이것은 적어도 부분적으로 도 9와 10에 나와있는 mBN336의 안정성 데이터로 부분적으로 증명된다. 앞서 명시된 바와 같이, mBN336은 MUC1, CEA, 및 TRICOM을 함유한다. mBN336은 변형된 MUC1 핵산을 포함하지만, mBN336은 CEA에 대한 추가 변형을 포함하지 않으며, TRICOM 동시-자극적 분자에 대한 중간 변형만을 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 MUC1에 대한 변형은 재조합 폭스 바이러스의 안정성을 개선시켰지만, 계대 5에서 시작하는 불안정성은 여전히 남아 있었다. 변형된 CEA가 mBN373에서 계두 바이러스의 일부로 포함되면, 이식유전자와 계두 바이러스의 안정성이 계대 5를 지나 계대 7 까지 입증되었다. (예를 들어, 도 11 참고).
따라서, 다양한 구체예들에서, 본 발명은 CEA 핵산의 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역에 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 CEA 펩티드를 인코드하는 핵산(CEA 핵산)을 함유하고, 이때 상기 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 정의된다: a) 3개 이상의 연속적으로 반복된 G 또는 C 뉴클레오티드 및/또는 b) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 T 뉴클레오티드. 추가 구체예들에서, 상기 반복적 뉴클레오티드 영역은 a) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 G 뉴클레오티드 및/또는 b) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 C 뉴클레오티드로 추가 정의된다.
바람직한 구체예들에서, 상기 CEA 핵산의 반복적 뉴클레오티드 영역은 (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드로 정의된다. 추가 바람직한 구체예들에서, 상기 반복적 뉴클레오티드 영역은 (i) 4개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드로 추가 정의된다.
하나 또는 그 이상의 구체예들에서, 상기 CEA 핵산은 상기 제2 핵산의 상기 반복적 뉴클레오티드 영역에 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 10에 대하여 적어도 하나의 치환을 함유한다. 바람직한 구체예에서, 상기 CEA 핵산은 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 및/또는 적어도 19개의 반복적 뉴클레오티드 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 CEA 핵산은 상기 제2 핵산의 19개 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예들에서, 상기 CEA 핵산은 서열 번호: 14 (mBN373/420 CEA)를 포함한다.
신규한 TRICOM 핵산 서열들
본 발명의 또다른 양태에서, TRICOM 동시-자극적 분자들을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산에 하나 또는 그 이상의 변형이 만들어졌다. 더 특이적 양태에서, 본 발명의 개발 과정에 결쳐, TRICOM 핵산의 상기 반복적 영역내 하나 또는 그 이상의 변형은 TRICOM 이식유전자의 안정성을 개선시킨 것으로 확인되었다. 이들 영역의 대표적인 예들은 도 6-8의 쌍을 이룬 정렬로 설명된다. 이들 예시적인 반복적 영역은 표시된 치환 (정렬의 비 * 영역)으로 설명된다.
적어도 하나의 양태에서, 상기 하나 또는 그 이상의 치환은 재조합형 폭스바이러스의 안정성을 더 강화시켰다. 이것은 적어도 부분적으로 도 9와 10에 나와있는 mBN336의 안정성 데이터로 부분적으로 증명된다. 앞서 명시된 바와 같이, mBN336은 변형된 MUC1을 함유한다. 그러나, mBN336은 CEA에 대한 추가 변형을 포함하지 않으며, TRICOM 동시-자극적 분자에 대한 중간 변형만을 포함한다. 따라서, 개시된 MUC1에 대한 변형은 mBN336의 안정성을 개선시켰지만, 계대 5에서 시작하는 불안정성은 여전히 남아 있었다. 상기 변형된 이식유전자가 계두 바이러스의 일부로 포함되면, 이식유전자 및 폭스바이러스의 안정성이 계대 5를 지나 계대 7 까지 입증되었다. (예를 들어, 도 11 참고).
한 구체예에서, 상기 신규한 TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 15 또는 17 (B7-1의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 18 또는 20 (ICAM-1의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 21 또는 23 (LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 추가적인 바람직한 구체예들에서, TRICOM 핵산은 서열 번호:15 또는 17 (B7-1의 경우), 서열 번호: 18 또는 20 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 21 또는 23 (LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 더욱 바림직한 구체예들에서, TRICOM 핵산은 서열 번호:17 (B7-1의 경우), 서열 번호: 20 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 23 (LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 15 또는 17 (B7-1의 경우), 서열 번호: 18 또는 20 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 21 또는 23 (LFA-3의 경우)을 포함한다.
여전히 또다른 구체예에서, TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 17 (B7-1의 경우), 서열 번호: 20 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 23 (LFA-3의 경우)을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 신규한 TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 15 (B7-1의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 18 (ICAM-1의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 21 (LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 추가적인 바람직한 구체예들에서, TRICOM 핵산은 서열 번호:15(B7-1의 경우), 서열 번호: 18(ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 21(LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 85%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 상기 신규한 TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 17 (B7-1의 경우)에 대하여 적어도 80%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 20 (ICAM-1의 경우)에 대하여 적어도 80%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 23 (LFA-3의 경우)에 대하여 적어도 80%, 90%, 또는 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 15 (B7-1의 경우), 서열 번호: 18 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 21 (LFA-3의 경우)을 포함한다.
또다른 구체예에서, TRICOM 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 17 (B7-1의 경우), 서열 번호: 20 (ICAM-1의 경우), 및/또는 서열 번호: 23 (LFA-3의 경우)을 포함한다.
본 발명은 본원에 제공된 신규한 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것으로 간주된다.
재조합형 폭스바이러스
하나 또는 그 이상의 구체예들에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 하나 또는 그 이상의 MUC1 핵산을 포함하는 재조합형 폭스바이러스를 함유한다. 더욱 바람직한 구체예들에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 본 명세서에서 기술된 MUC1 핵산 서열 및 CEA 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구체예들에서, MUC1 핵산은 서열 번호:2, 서열 번호: 3 (373 MUC), 서열 번호: 5 (420 MUC1), 또는 서열 번호: 4 (399/400 MUC1)에 대하여 적어도 95% 상동성의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 CEA 핵산 서열은 서열 번호: 13 또는 14를 포함한다.
여전히 추가적인 구체예들에서, 상기 본 발명의 재조합형 폭스바이러스는 이를 테면 이들 본 명세서에서 기술된 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 동시-자극적 분자들을 함유한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 동시-자극적 분자들은 TRICOM (B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3)을 함유한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 B7-1 동시-자극적 분자들은 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 및 서열 번호: 17를 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 ICAM-1 동시-자극적 분자는 서열 번호:18, 서열 번호: 19, 및 서열 번호: 20을 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 LFA-3 동시-자극적 분자는 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 및 서열 번호: 23을 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3은 차례로 서열 번호: 15, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 21을 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다. 또다른 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3은 차례로 서열 번호: 17, 서열 번호: 20, 및 서열 번호: 23을 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다.
본 명세서의 다양한 구체예들에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 바람직하게는 오르소폭스바이러스 이를 테면, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 앙카라 (MVA) 바이러스, MVA-BN, 또는 MVA-BN의 유도체들이나, 이에 국한되지 않는다.
백시니아 바이러스 균주의 예로는 균주 Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda 및 WR이다. 바람직한 백시니아 바이러스 (VV) 균주는 Wyeth (DRYVAX) 균주 (U.S. 특허 7,410,644)이다.
또다른 바람직한 VV 균주는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) (Sutter, G. 외, [1994], Vaccine 12: 1032-40)이다. 본 발명의 실행에 유용하고, Budapest Treaty에 부합되도록 기탁된 MVA 바이러스 균주의 예로는 균주 MVA 572(European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom에 1994년 1월 27일자로 기탁된 기탁 번호 ECACC 94012707), 및 MVA 575(2000년 12월 7일자로 ECACC 00120707로 기탁됨), MVA-BN(European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 2000년 8월 30일자로 기탁번호 V00083008로 기탁됨)이며, 그리고 MVA-BN의 유도체들은 추가적인 예시적인 균주들이다.
MVA-BN의 "유도체(derivatives)"는 본원에 기술된 바와 같이 MVA-BN과 본질적으로 동일한 복제 특성을 나타내지만, 그들의 게놈의 하나 또는 그 이상의 부분에서 차이를 나타내는 바이러스를 지칭한다. MVA-BN 및 이의 유도체들은 생체 내 및 생체 외에서 생식적으로 복제하지 못하는 복제 무능력이다. 보다 구체적으로, 시험관내에서, MVA-BN 또는 이의 유도체는 닭 배아 섬유 아세포 (CEF)에서 생식 복제가 가능하지만, 인간 각질세포 세포주 HaCat (Boukamp 외 (1988), J. Cell Biol. 106:761-771), 인간 골육종 세포주 143B (ECACC 기탁 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293 (ECACC 기탁 번호 85120602) 및 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (ATCC 기탁 번호 CCL-2)에서 생식 복제가 불가능한 것으로 기술되어있다. 추가적으로, MVA-BN 또는 이의 유도체는 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575보다 적어도 2 배 미만, 보다 바람직하게는 3 배 미만의 바이러스 증폭률을 갖는다. MVA-BN 및 이의 유도체의 성질 테스트 및 검사는 WO 02/42480 (U.S. 특허 출원 번호. 2003/0206926) 및 WO 03/048184 (U.S. 특허 출원 번호. 2006/0159699)에 기술된다.
이전 단락에서 기술된 바와 같이, 시험관 내 인간 세포주에서 용어 "생식 복제가 불가능(not capable of reproductive replication)" 또는 "생식 복제 능력 없음(no capability of reproductive replication)"이란 용어는 예를 들어 WO 02/42480에 기술되어 있고, 이 문헌에는 원하는 특성을 지닌 MVA를 어떻게 획득하는 지에 대하여 또한 교시하고 있다. 상기 용어는 WO 02/42480 또는 미국 특허 6,761,893에 기재된 분석법을 사용하여, 감염 후 4 일째에 시험관내에서 바이러스 증폭률이 1 미만인 바이러스에 적용된다.
용어 "생식적으로 복제하는데 실패한다(failure to reproductively replicate)"는 이전 단락에서 설명한대로, 감염 후 4 일째에 인간의 세포주에서 바이러스 증폭률이 1 인 바이러스를 말한다. WO 02/42480 또는 미국 특허6,761,893에 기술된 분석법은 바이러스 증폭률의 측정에 적용 가능하다.
이전 단락에서 설명한 대로, 시험관내 인간 세포주에서 바이러스의 증폭 또는 복제는 일반적으로 감염된 세포에서 생산된 바이러스의 양(결과물)과 처음에 세포를 감염시키는데 사용된 양 (유입물)의 비율, "증폭율(amplification ratio")로 보통 나타낸다. 증폭율 "1"은 감염된 세포에서 생산된 바이러스의 양이 세포를 감염시키는데 처음 사용된 양과 같은 것으로 정의되고, 이것은 감염된 세포가 바이러스 감염 및 복제에 허용되는 증폭 상태임을 의미한다. 대조적으로, 1 미만의 증폭율, 즉 유입 수준과 비교하여 생산의 감소는 생식 복제의 결핍을 나타내고, 따라서 바이러스의 감쇠(attenuation)를 나타낸다.
또다른 구체예에서, 본원에 개시된 MUC1 및/또는 기타 핵산을 포함하는 재조합 폭스바이러스는 아비포스바이러스, 예를 들어, 계두바이러스이나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "아비폭스바이러스(avipoxvirus)"는 임의의 아비폭스바이러스, 이를 테면, 계두바이러스(Fowlpoxvirus), 카나리폭스바이러(Canarypoxvirus), 운코폭스바이러스(Uncopoxvirus), 미나폭스바이러스(Mynahpoxvirus), 피젼폭스바이러스(Pigeonpoxvirus), 피시타신폭스바이러스(Psittacinepoxvirus), 큐아리폭스바이러스(Quailpoxvirus), 피코크폭스바이러스(Peacockpoxvirus), 펭귄폭스바이러스(Penguinpoxvirus), 스파로우폭스바이러스(Sparrowpoxvirus), 스타링폭스바이러스(Starlingpoxvirus ) 및 터키폭스바이러스(Turkeypoxvirus)를 말한다. 바람직한 아비폭스바이러스는 카나이폭스바이러스 및 계두 바이러스이다.
계두 바이러스의 예로는 균주 FP-1, FP-5, TROVAC (U.S. 특허 번호 5,766,598), POXVAC-TC (U.S. 특허 7,410,644), TBC-FPV (Therion Biologics- FPV)이며, FP-1은 하루된 닭에서 백신으로 이용되도록 변형된 듀베(Duvette) 균주다. 상기 균주는 1980년 10월 O DCEP 25/CEP67/2309로 명시된 시판되는 계두 바이러스 백신 균주 이며, Institute Merieux, Inc. 에서 이용가능하며, FP-5는 American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wis., 미국 수의학(United States Veterinary) 라이센스 번호 165, 일련번호 30321에서 이용가능한 닭 배아 기원의 상업적 계두 바이러스 백신 균주다.
특정 바람직한 구체예들에서, 서열 번호: 5 (420 MUC1), 서열 번호: 4 (399/400 MUC1), 서열 번호:3 (373 MUC1), 또는 서열 번호:2 (336 MUC1)로부터 선택된 MUC1 핵산 서열을 포함하는 재조합형 오르소폭스바이러스, 이를 테면 백시니아, MVA, MVA-BN, 또는 MVA-BN의 유도체들이 있다. 더욱 바람직한 구체예들에서, 상기 재조합형 오르소폭스바이러스는 서열 번호: 2 (420 MUC1)로 부터 선택된 MUC1 핵산 서열, 서열 번호: 13 또는 14, 및 TRICOM로부터 선택된 CEA 핵산을 포함하는 MVA 바이러스다. 가장 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 2 (336 MUC1)을 포함하는 MUC1 핵산, 서열 번호: 13을 포함하는 CEA 핵산 및 TRICOM을 포함하는 재조합형 MVA이 있다. 또다른 가장 바람직한 예에서, TRICOM은 서열 번호: 17, (B7-1), SEQ I NO: 20 (ICAM-1), 및 서열 번호: 23 (LFA-3)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 함유한다.
특정 다른 바람직한 구체예들에서, 재조합형 아비폭스바이러스, 이를 테면 서열 번호: 3 (373 MUC1)을 포함하는 MUC1 핵산 서열을 포함하는 계두 바이러스가 있다. 특정 더욱 바람직한 구체예들에서, 상기 재조합형 아비폭스바이러스는 서열 번호: 3 (373)을 포함하는 MUC1 핵산, 서열 번호: 13 또는 14에서 선택된 CEA 핵산, 및 TRICOM을 포함하는 계두 바이러스다. 가장 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 3 (373 MUC1)을 포함하는 MUC1 핵산 서열, 서열 번호: 14를 포함하는 CEA 핵산, 및 TRICOM을 포함하는 재조합형 계두 바이러스가 있다. 또다른 가장 바람직한 예에서 TRICOM는 서열 번호: 15 (B7-1), 서열 번호: 18 (ICAM-1), 및 서열 번호: 21(LFA-3)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 함유한다.
발현 카세트/대조군 서열들
다양한 양태에서, 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 핵산은 하나 또는 그 이상의 발현 카세트 내에 매립되며, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 핵산은 발현 대조군 서열들에 작동가능하도록 연계된다. "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 기술된 성분이 의도된 방식, 예를 들어, 발현되는 핵산을 전사하기 위한 프로모터와 같은 기능을 하도록 관계가 되어 있음을 의미한다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 조절 서열과 양립 가능한 조건하에 달성되도록 결합된다. 상기 발현 조절 서열은 적절한 프로모터, 인핸서(enhancers), 전사 터미네이터(terminators), 단백질 인코딩 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈, 인트론에 대한 스플라이싱(splicing) 시그널 및 인-프레임(in-frame) 중지 코돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 프로모터는 SV40 초기(early) 프로모터, RSV 프로모터,레트로바이러스 LTR, 아데노바이러스 주요(major) 후기(late) 프로모터, 인간 CMV 즉각(immediate) 초기 I 프로모터, 그리고 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 폭스바이러스 프로모터: 백시니아 바이러스 또는 MVA-유도된 및 FPV-유도된 프로모터: 30K 프로모터, I3 프로모터, PrS 프로모터, PrS5E 프로모터, Pr7.5K, Pr13.5 long 프로모터, 40K 프로모터, MVA-40K 프로모터, FPV 40K 프로모터, 30k 프로모터, PrSynIIm 프로모터, 및 PrLE1 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 추가적인 프로모터는 WO 2010/060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611 및 WO 2014/063832에서 추가 기술되며, 이들은 전문이 본 명에서의 참고자료에 편입된다.
추가적인 발현 대조군 서열들은 리더 서열들, 종료 코돈, 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호 및 원하는 숙주 시스템에서 원하는 재조합형 단백질 (예를 들어, MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM)을 인코딩하는 상기 핵산 서열의 적절한 전사 및 후속적 해독에 필수적인 임의의 다른 서열을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기 폭스바이러스 벡터는 또한 원하는 숙주 시스템에서 상기 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전사 및 후속적 복제에 필요한 추가 요소를 함유할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 이러한 벡터가 종래의 방법 (Ausubel 등, (1 987), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 및 Sons, New York, NY)의 통상적인 방법을 이용하여 용이하게 작제될 수 있음을 더 이해할 것이며, 이들은 상업적으로 이용 가능하다.
특정 구체예들에서, 본 명세서의 상기 재조합형 오르소폭스바이러스 및/또는 아비폭스바이러스는 하나 또는 그 이상의 사이토킨, 이를 테면 IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α, 또는 IFN-γ, 하나 또는 그 이상의 성장 인자, 이를 테면 GM-CSF 또는 G-CSF, 하나 또는 그 이상의 동시-자극적 분자들, 이를 테면 ICAM-1, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, 또는 다른 B7 관련된 분자들을 포함하며; 하나 또는 그 이상의 분자들, 이를 테면 OX-40L 또는 41 BBL, 또는 이들 분자들의 조합은 생물학적 어쥬번트(adjuvants)로 이용될 수 있다(예를 들면, Salgaller 외, 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; Lotze 외, 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao 외, 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper 외, 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90 참고). 이들 분자들은 숙주에 전신으로(또는 국소적으로) 투여될 수 있다. 몇 가지 예에서, IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, OX-40L, 41 BBL 및 ICAM-1이 투여된다.
이식유전자를 포함하는 재조합형 폭스바이러스 생성
본원에서 제공되는 상기 재조합형 폭스바이러스는 당분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합형 폭스바이러스를 획득하는 방법 또는 폭스바이러스성 게놈 안으로 외인성(exogenous) 코딩 서열을 삽입하는 방법은 당분야 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 표준 분자 생물 기술의 방법, 이를 테면 DNA의 클로닝, DNA 및 RNA 단리, Western 블롯 분석, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술은 Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.) [J. Samb rook 외, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술되며, 바이러스의 취급 및 조작을 위한 기술은 Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy 외, (eds.), Academic Press (1996)]에 기술된다. 마찬가지로, MVA의 취급, 조작 및 유전 공학에 대한 기술과 노하우는 Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(예를 들어, Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors) 참고] 및 Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998)(예를 들어, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector) 참고]에 기술된다.
본원에 개시된 다양한 재조합 폭스바이러스의 생성을 위해, 상이한 방법들이 적용될 수 있다. 바이러스에 삽입될 DNA 서열은 폭스바이러스의 DNA 절편에 상응하는 DNA가 삽입된 대장균 플라스미드 구조물 내로 삽입될 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 연결될 수 있다. 프로모터-유전자 연계(linkage)는 비-필수 좌를 함유하는 폭스바이러스 DNA 영역의 측면 DNA 서열과 상동성을 갖는 DNA가 양 말단 측면에 위치하도록 플라스미드 구조체 내에 위치 할 수 있다. 생성된 플라스미드 구조체는 대장균 박테리아 내에서 증식시켜 증폭시킬 수 있고, 단리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 함유하는 분리된 플라스미드는 새포 배양액, 이를 테면, 닭 배아 섬유아세포(CEFs)로 형질 감염될 수 있고, 이 배양물은 동시에 폭스바이러스에 감염된다. 플라스미드의 상동성 폭스바이러스 DNA와 바이러스성 게놈 간에 각기 재조합으로 외래 DNA 서열들의 존재로 변형된 폭스바이러스가 만들어질 수 있다
바람직한 구체예에 따르면, 적합한 세포 배양물의 세포, 예를 들어, CEF 세포는 폭스바이러스로 감염될 수 있다. 상기 감염된 세포는 후속적으로, 외래 또는 이종성(heterologous) 유전자 또는 유전자들, 이를 테면 본 명세서에서 제공되는 하나 또는 그 이상의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 포함하는 제1 플라스미드에 의해; 바람직하게는 폭스바이러스 발현 대조군 요소의 전사 제어하에서 후속적으로 형질감염될 수 있다. 상기에서 설명된 바와 같이, 플라스미드는 외인성 서열을 폭스바이러스 게놈의 선택된 부분으로 삽입되도록 유도할 수 있는 서열을 또한 포함한다. 임의선택적으로, 플라스미드 벡터는 폭스바이러스성 프로모터에 작용 가능하도록 연결된 표지(marker) 및/또는 선별 유전자를 포함하는 카세트를 또한 함유한다. 적합한 표지 또는 선별 유전자들은 예를 들어, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 네오마이신-포스포리보실전이효소 또는 기타 표지들을 인코딩하는 유전자들이다. 선별 또는 표지 카세트의 사용으로 생성된 재조합 폭스 바이러스의 식별 및 분리가 단순화된다. 그러나, 재조합형 폭스바이러스는 PCR 기술에 의해 또한 식별될 수 있다. 후속적으로, 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 획득된 재조합형 폭스바이러스에 의해 감염될 수 있고, 그리고 제 2 의 외래 또는 이종성(heterologous) 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제 2 의 벡터로 형질감염될 수 있다. 이 경우, 상기 유전자는 상기 폭스바이러스성 게놈의 상이한 삽입 부위로 도입되며, 상기 제2 벡터는 상기 폭스바이러스의 게놈 안으로 상기 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 통합을 지시하는 폭스바이러스-상동성 서열에서 또한 상이하다. 상동성 재조합이 발생한 후에, 둘 또는 그 이상의 외래 또는 이종성(heterologous) 유전자들을 포함하는 재조합 바이러스가 분리될 수 있다. 재조합 바이러스에 부가적인 외래 유전자를 도입하기 위해, 감염 및 형질감염의 단계는 감염을 위한 이전 단계에서 분리된 재조합 바이러스를 사용하고, 형질감염을 위한 추가 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 추가 벡터를 사용함으로써 반복될 수 있다.
대안적으로, 전술한 바와 같은 감염 및 형질감염의 단계는 상호 호환 가능한데, 즉, 적절한 세포를 먼저 외래 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 감염시킨 후, 폭스바이러스에 감염시킬 수 있다. 추가의 대안으로서, 각각의 외래 유전자를 상이한 바이러스에 도입하고, 수득된 모든 재조합 바이러스로 세포를 공동- 감염시키고, 모든 외래 유전자를 포함하는 재조합체를 스크리닝하는 것이 또한 가능하다. 세 번째 대안으로는, 시험관내에서 DNA 게놈 및 외래 서열의 결찰시키고, 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하여 재조합된 백시니아 바이러스 DNA 게놈을 재구성하는 것이다. 네 번째 대안으로는 대장균 또는 또다른 박테리아 종에서 박테리아 인공 염색체(BAC)로 클론된 폭스바이러스 게놈과 백시니아 바이러스 게놈에서 통합을 원하는 부위 측면에 있는 서열에 상동성인 DNA 서열에 인접한 선형 외래 서열 간에 상동성 재조합이다.
본 명세서의 하나 또는 그 이상의 핵산은 상기 폭스바이러스의 임의의 적합한 부분 안으로 삽입될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 이용된 상기 폭스바이러스는 MVA 및/또는 계두 바이러스를 함유한다. MVA 및 계두 바이러스의 적합한 부분은 MVA 및 계두 게놈의 비-필수 부분들이다.
MVA의 경우, MVA 게놈의 비-필수 부분은 유전자사이의 영역 또는 MVA 게놈의 공지된 결손 부위 1-6이 될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 상기 재조합형 MVA의 비-필수 부분들은 바이러스성 성장에 비-필수적인 MVA 게놈의 코딩 영역일 수 있다. 그러나, 삽입 부위는 MVA 게놈에서 이들 바람직한 삽입 부분에 국한되지 않는데, 그 이유는 본 발명의 상기 핵산(예를 들어, MUC1, CEA, 및 TRICOM) 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 임의의 수반되는 프로모터는 적어도 하나 세포 배양계, 이를 테면 닭 배아 섬유아세포 (CEF 세포)에서 증폭되고, 증식될 수 있는 바이러스성 게놈을 수득할 수 있는 한, 바이러스 게놈의 임의의 부위로 삽입되는 것이 본 발명의 범위내에 있기 때문이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 핵산은 MVA 및/또는 계두 바이러스의 하나 또는 그 이상의 유전자사이의 영역 (IGR) 안으로 삽입될 수 있다. 용어 "유전자사이의 영역(intergenic region)"이란 MVA 및/또는 계두 바이러스 게놈의 2개 인접 오픈 리딩 프레임(ORF), 바람직하게는 MVA 및/또는 계두 바이러스 게놈의 2개의 필수 ORFs 사이에 위치한 바이러스성 게놈의 부분을 말한다. MVA의 경우, 특정 구체예들에서, IGR은 IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, 및 IGR 148/149로부터 선택된다. 계두 바이러스의 경우, IGR은 BamH1로부터 선택된다,
MVA 바이러스의 경우, 뉴클레오티드 서열들은 하나 또는 그 이상의 공지의 결손 부위, 가령, MVA 게놈의 결손 부위 I, II, III, IV, V, 또는 VI 안으로 추가적으로 또는 대안으로,삽입될 수 있다 . 용어 "공지의 결손 부위(known deletion site)"란 MVA가 유래된 모체 바이러스의 게놈, 구체적으로 모체 장뇨막 백시니아 바이러스 앙카라 (CVA) (예를 들어, Meisinger-Henschel 외 (2007), Journal of General Virology 88:3249-3259에서 기술된 것과 같은)의 게놈에 대해 20 계대 516으로 특징지어지는 CEF 세포 상에서 연속 계대를 통하여 결손되는 MVA 게놈의 일부를 지칭한다.
백신
특정 구체예들에서, 본 명세서의 상기 재조합형 폭스바이러스는 백신의 일부로써 제형화될 수 있다. 백신 제조를 위하여, 상기 폭스바이러스는 생리학적으로 허용 가능한 형태로 전환될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 제조는 천연두에 대한 백신 접종에 사용되는 폭스바이러스 백신의 제조 경험에 기초하고 있다(예를 들면, Stickl, H. 외, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974에서 설명된 바와 같이).
예시적인 제조는 다음과 같다. 정제된 바이러스는 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4에서 조제된 5 x 108 TCID50/ml 역가로 -80℃ 에 보관된다. 백신 주사(shots)를 만들기 위하여, 예를 들어, 102-108 입자의 바이러스는 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 안에 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민 존재하에 인산염-완충된 염수(PBS)에서 동결건조될 수 있다. 대안으로, 백신 주사는 제형에서 바이러스의 단계적 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 특정 구체예들에서, 제형(formulation)은 생체 투여에 적합한 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토오스, 폴리비닐피롤리돈 또는 기타 첨가제, 이를 테면, 산화 방지제 또는 불활성 기체, 안정화제 또는 재조합 단백질(예 : 인간 혈청 알부민)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이어서, 앰플을 밀봉하고 예를 들어, 4℃ 내지 실온 사이의 적합한 온도에서 수개월 동안 저장할 수 있다. 그러나, 필요할 때 까지, 앰플은 -20℃ 이하의 온도에서 보관하는 것이 바람직하다.
백신 접종 또는 치료에 관련된 다양한 구체예에서, 동결 건조물은 0.1 내지 0.5 ml의 수용액, 바람직하게는 생리식염수 또는 트리스 완충액에 용해되고, 전신 또는 국소 투여, 이를 테면, 비경구(parenteral), 피하, 정맥내, 근육내, 비강내, 피내(intradermal) 또는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여된다. 투여 방식, 투여량 및 투여 횟수의 최적화는 당업자의 기술 및 지식 범위 내에 있다.
특정 구체예들에서, 감쇠된 백시니아 바이러스 균주는 면역-절충된 동물, 예를 들어, SIV에 감염된 원숭이(혈액 μl에 CD4<400) , 또는 면역-절충된 인간에게서 면역 반응을 유도하는데 유용하다. "면역력이 절충된(immune-compromised)"이란 용어는 면역 반응이 불완전하거나 감염성 병원체에 대한 방어 효과가 감소된 개인의 면역계 상태를 나타낸다.
키트, 조성물, 및 사용 방법
다양한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 폭스바이러스를 포함하는 키트 및/ 또는 조성물을 포괄한다. 바람직하게는, 조성물은 제약학적 또는 면역원성 조성물이다.
한 구체예에서, 2 또는 그 이상의 재조합형 폭스바이러스를 포함하는 키트 및/또는 조성물이 있으며, 이때 각 재조합형 폭스바이러스는 본 명세서의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유한다. 상기 조합은 이를 테면 본 명세서의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는 a) 오르소폭스바이러스, 이를 테면 백시니아, MVA, MVA-BN, 또는 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는 MVA-BN의 유도체들 및 b) 아비폭스바이러스, 계두를 포함한다. 상기 오르소폭스바이러스 및 계두 바이러스 조합은 동종 또는 이종 프라임-부스트 처방으로 투여될 수 있음이 고려된다.
또다른 구체예에서, 2 또는 그 이상의 재조합형 폭스바이러스 조합을 함유하는 키트 및/또는 조성물은 a) 본 명세서의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는 MVA 바이러스 및 b) 아비폭스바이러스, 이를 테면 본 명세서의 MUC1, CEA, 및/또는 TRICOM 핵산을 함유하는 계두를 포함한다. MVA 바이러스 및 계두 바이러스 조합은 동종 또는 이종 프라임-부스트 처방으로 투여될 수 있음이 고려된다.
추가적인 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 재조합형 폭스바이러스 각각은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 상기 동시-자극적 분자들을 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 동시-자극적 분자들은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 TRICOM 분자들이다.
키트 및/또는 조성물은 재조합 폭스바이러스의 투여에 대한 설명과 함께, 본 발명의 재조합 폭스바이러스의 하나 또는 다중 용기 또는 바이알을 포함할 수 있음도 고려된다.
본원에 제공된 키트 및/또는 조성물은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 및/또는 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 방부제, 보조제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 보조물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충물질 또는 이와 유사한 것등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 및 이와 유사한 것등과 같은 일반적으로 크고 느리게 대사되는 분자다.
조성물 (예를 들어, 제약학적 및/또는 면역원성 조성물) 제조를 위하여, 본 명세서에서 제공되는 상기 재조합형 폭스바이러스는 생리학적으로 허용 가능한 형태로 전환될 수 있다. 이것은 H. Stickl 외, Dtsch. med. Wschr. 99:2386-2392 (1974)에서 기술된 바와 같이, 천연두 백신 접종에 사용된 폭스바이러스 백신의 준비 경험을 토대로 수행할 수 있다.
예를 들면, 정제된 바이러스는 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4에서 조제된 5x108 TCID50/ml 역가로 -80℃에 보관된다. 백신 주사를 만들기 위하여, 예를 들어, 102-108 또는 102-109 입자의 바이러스는 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 안에 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민 존재하에 인산염-완충된 염수(PBS)에서 동결건조될 수 있다. 대안으로, 백신 주사는 제형에서 바이러스의 단계적 동결 건조에 의해 생산될 수 있다. 이 제형은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐 피롤리돈과 같은 기타 첨가제 또는 항산화제 또는 불활성 기체, 안정 화제 또는 생체 내 투여에 적합한 재조합 단백질 (예 : 인간 혈청 알부민)과 같은 기타 보조제를 함유할 수 있다. 전형적인 바이러스를 함유하는, 동결-건조에 적합한 제형은 10 mM 트리스-완충액, 140 mM NaCl, 18.9 g/l 덱스트란 (MW 36,000-40,000), 45 g/l 수크로스, 0.108 g/l L-글루타민산 모노 포타슘염 모노하이드레이트 pH 7.4를 포함한다. 그 다음, 유리 앰플을 밀봉하고, 4℃ 내지 실온 사이에서 수개월 동안 저장할 수 있다. 그러나, 필요할 때 까지, 앰플은 -20℃ 에서 또는 그 이하의 온도에서 보관하는 것이 바람직하다.
백신 접종 또는 치료에 관련된 다양한 구체예에서, 동결 건조물은 수성 용액(가령, 0.1 내지 0.5 ml), 바람직하게는 생리식염수 또는 트리스 완충액에 용해되고, 전신 또는 국소 투여, 이를 테면, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내 또는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여된다. 투여 방식, 투여량 및 투여 횟수는 당업자가 공지된 방식으로 최적화 할 수 있다.
다양한 다른 구체예들에서, 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 상기 재조합형 폭스바이러스 및/또는 이식유전자를 생성 및/또는 개선시키는 것과 관련된 하나 또는 그 이상의 방법이 있다. 더욱 특이적 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 적어도 3 또는 4회 계대를 통하여 안정적이 된다.
다중 계개를 통하여 안정적 재조합형 폭스바이러스를 보유하는 것은 여러가지 이유로 인하여 특이 중요한데, 그중 일부는 재조합 바이러스의 대규모 생산 및 의약품으로서의 사용뿐만 아니라 다중 계대를 통한 백신안정성에 대한 정부 정책이 포함된다. 본 발명의 재조합형 폭스바이러스의 경우, 적어도 3 또는 4회 계대를 통하여 안정적 재조합형 폭스바이러스를 생산하는 것은 PANVAC-V 및 PANVAC-F가 계대 1에서는 불안정하고, 및/또는 이식유전자 생존가능성의 상실이 나타나기 시작하기 때문이다 (예를 들어, 표1 및 2; 그리고 도 1a 및 1b 참고).
한 구체예에서, 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적으로 되는 MUC1 이식유전자를 갖는 폭스바이러스를 생산하는 방법이 있는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: a) 본 명세서의 상기 핵산 또는 발현 카세트중 임의의 하나를 제공하고; 그리고 b) 상기 핵산 또는 상기 발현 카세트를 재조합형 폭스바이러스 안으로 삽입하고, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스 연속적 계대를 통하여 안정적이 된다.
본 명세서에 따른 예시적인 방법
1. 또다른 구체예에서, 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적인 재조합형 폭스바이러스를 만드는 방법이 있고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 적어도 2개의 가변적 N-말단 반복부 (VNTR) 도메인을 갖는 MUC1 펩티드를 인코딩하는 제1핵산을 제공하고, 이때 a) 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인의 정렬은 셔플화되고, 그리고 b) 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인은 코돈 최적화되고, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 연속적 계대를 통하여 안정적이다.
2. 또다른 구체예에서, 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적인 재조합형 폭스바이러스를 만드는 방법이 있고, 상기 방법은 다음을 포함한다: MUC1 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 제공하고, MUC1 단백질은 적어도 2개의 VNTR 도메인을 포함하며; 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인 반복부의 순서를 셔플링 또는 재배열하고; 상기 적어도 2개의 VNTR 도메인 반복부의 코돈을 최적화시키고; 제1 핵산 서열을 상기 폭스바이러스 안으로 삽입시켜 상기 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적인 재조합형 폭스바이러스를 만든다.
3. 1 및 2중 임의의 하나의 방법에서, 이때 제1 핵산은 서열 번호:2에 대하여 적어도 95% 상동성이며, 서열 번호: 4에 대하여 적어도 95% 상동성이며, 서열 번호: 3에 대하여 적어도 95% 상동성이며, 또는 서열 번호: 5에 대하여 적어도 95% 상동성이다.
4. 1 내지 3중 임의의 하나의 방법에서, 이때 상기 핵산은 서열 번호: 2에 대하여 적어도 95% 상동성이다.
5. 1 내지 4중 임의의 하나의 방법에서, 이때 상기 핵산은 적어도 서열 번호: 3에 대하여 적어도 95% 상동성이다.
6. 1 내지 5중 임의의 하나의 방법에서, 이때 상기 핵산은 서열 번호: 2를 포함한다.
7. 1 내지 6중 임의의 하나의 방법에서, 이때 상기 핵산은 서열 번호: 5를 포함한다.
8. 1 내지 7중 임의의 하나의 방법에서, 이때 방법은 CEA 펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산의 반복적 뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 치환하고, 이때 상기 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 정의된다: (i) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 3개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 3개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드; 그리고 상기 제2 핵산을 상기 재조합형 폭스바이러스 안으로 삽입하는 것을 더 포함한다.
9. 8의 방법에서, 이때 상기 제2 핵산의 반복적 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 3개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 3개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 3개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
10. 8 및 9중 임의의 하나의 방법에서, 이때 상기 제2 핵산의 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드.
11. 1-10의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 CEA 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드.
12. 1-11의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 CEA 반복적 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 4개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
13. 1-12의 방법의 한 가지 양태에서, 치환은 상기 CEA 핵산의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 10개 반복적 뉴클레오티드 영역에서 있다.
14. 1-13의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 CEA 핵산은 서열 번호: 14를 포함한다.
15. 1-14의 방법의 한 가지 양태에서, 방법은 B7-1, ICAM-1, 및/또는 LFA-3, CEA로부터 선택된 동시-자극적 분자을 인코드하는 핵산의 반복적 뉴클레오티드 영역내 적어도 하나의 뉴클레오티드를 치환하고, 이때 상기 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 정의된다: (i) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 3개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 3개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드; 그리고 상기 재조합형 폭스바이러스에 동시-자극적 분자를 인코딩하는 상기 생산을 삽입하는 것을 더 포함한다.
16. 1-15의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자 반복적 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 3개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 3개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 3개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
17. 1-16의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 또는 C 뉴클레오티드.
18. 1-17의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자 반복적 영역은 다음과 같이 추가 정의된다: (i) 4개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
19. 1-18의 방법의 한 가지 양태에서, 치환은 상기 동시-자극적 분자 핵산의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 10개 반복적 뉴클레오티드 영역에서 있다.
20. 1-19의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자를 인코딩하는 핵산은 B7-1 (서열 번호: 15-17); ICAM-1 (서열 번호: 18-20) 및 LFA-3 (서열 번호: 21-23)로부터 선택된다.
21. 1-20의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자를 인코딩하는 핵산은 B7-1 (서열 번호: 15; ICAM-1 (서열 번호: 18) 및 LFA-3 (서열 번호: 21)중 적어도 하나에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성이다.
22. 1-21의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자를 인코딩하는 핵산은 B7-1 (서열 번호: 17; ICAM-1 (서열 번호: 20) 및 LFA-3 (서열 번호: 23)중 적어도 하나에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성이다.
23. 1-22의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자를 인코딩하는 핵산은 B7-1 (서열 번호: 17; ICAM-1 (서열 번호: 20) 및 LFA-3 (서열 번호: 23)중 적어도 하나를 포함한다.
24. 1-23의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 동시-자극적 분자를 인코딩하는 핵산은 다음을 포함한다: B7-1 (서열 번호: 15; ICAM-1 (서열 번호: 18) 및 LFA-3 (서열 번호: 21).
25. 1-24의 방법의 한 가지 양태에서, MUC1을 인코딩하는 제 1 핵산은 서열 번호: 31, 32, 33, 및 34로부터 선택된다.
26. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 상기 1-26의 방법의 상기 재조합형 폭스바이러스는 오르소폭스바이러스 또는 아비폭스바이러스로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 상기 오르소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, MVA, MVA-BN, 및 MVA-BN의 유도체들로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 오르소폭스바이러스는 MVA, MVA-BN, 또는 유도체 또는 MVA-BN이다. 여전히 또다른 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 아비폭스바이러스는 계두 바이러스다.
다른 구체예들에서, 연속적 계대를 통하여 폭스바이러스가 안정적인 재조합형 폭스바이러스를 생산하는 방법에서 본 명세서에 따른 a) 핵산, b) 발현 카세트, c) 조성물, d) 숙주 세포, 또는 e) 벡터의 용도가 있다.
여전히 다른 구체예에서, 약물, 바람직하게는 백신의 제조에서 본 명세서에 따른 a) 재조합형 폭스바이러스, b) 핵산, c) 발현 카세트, d) 조성물, d) 숙주 세포, 또는 e) 벡터의 용도가 있다.
여전히 다른 구체예에서, 약물, 바람직하게는 백신의 제조에서 본 명세서에 따른 재조합형 폭스바이러스, b) 핵산, b) 발현 카세트, c조성물, d) 숙주 세포, 또는 e) 벡터가 있다.
여전히 추가적인 구체예에서, 표적 세포 안으로 코딩 서열을 도입시키는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합형 폭스바이러스, b) 핵산, b) 발현 카세트, c) 조성물, d) 숙주 세포, 또는 e) 벡터가 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명을 예시하지만, 청구의 범위를 어떤 식 으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 재조합형 폭스바이러스의 작제
MUC1(예를 들어, mBN399, mBN400, mBN336, mBN373, 및 mBN420)을 인코드하는 폭스바이러스의 생성은 제시된 MUC1 및 CEA 핵산 서열들과 이들의 프로모터를 CEF 배양의 동시 감염 및 형질 감염을 통하여 삽입하고, 이어서 바이러스성 게놈과 재조합 플라스미드 pBN146 사이의 상동성 재조합의 허용에 의해 실행된다. 삽입물-휴대 바이러스를 단리하고, 특징화하고, 그리고 바이러스 스톡(stocks)을 준비하였다.
mBN398 및 mBN400의 작제를 위하여, 백시니아 바이러스내 IGR88/89에 또한 존재하는 상동성 서열을 함유하는 MVA 재조합 플라스미드를 이용하였다. MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열은 백시니아 바이러스성 게놈으로의 재조합을 허용하도록 백시니아 바이러스 서열들 사이 IGR 88/89에 삽입되었다. 따라서, 폭스바이러스 프로모터의 하류 MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열이 함유되도록 플라스미드가 작제되었다. mBN 398 및 mBN400의 경우, 서열 번호: 1 (MUC1) 및 서열 번호: 13 (CEA)이 이용되었다. mBN398에서 MUC1 및 CEA를 위한 프로모터는 각각 PrS 프로모터 (MUC1) 및 40k-MVA1 프로모터 (CEA)이었다. mBN400에서 MUC1 및 CEA를 위한 프로모터는 각각 Pr13.5long (MUC1) 및 PrS5E 프로모터 (CEA)이었다. TRICOM의 동시-자극적 분자들은 mBN398 및 mBN400의 일부로 함유되었다. 이들 서열들은 다음을 함유한다: B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3 그리고 각각 서열 번호: 16, 19, 및 21을 포함한다.
mBN336의 작제를 위하여, 3개 이식유전자 pBN 374 (TRICOM의 경우), pBN 515 (CEA, 서열 번호: 13) , pBN 525 (MUC1, 서열 번호: 2) 에 대하여 3개의 재조합 플라스미드가 이용되었고, 삽입 유전자들은 MVA (IGR88/89(MUC1), IGR 44/45 (CEA), IGR 148/149 (TRICOM)에도 또한 존재한다. MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열은 MVA 바이러스성 게놈으로의 재조합을 허용하도록 MVA 바이러스 서열들 사이에 삽입되었다. 따라서, 폭스바이러스 프로모터의 하류 MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열이 함유되도록 플라스미드가 작제되었다. mBN336의 경우, 서열 번호: 2 (MUC1) 및 서열 번호: 13 (CEA)이 이용되었다. 프로모터는 PrS 프로모터 (MUC1의 경우) 및 40k 프로모터 (CEA의 경우)이다. TRICOM의 동시-자극적 분자들은 mBN336의 일부로 함유되었다. 이들 서열들은 다음을 함유한다: B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3 그리고 각기 서열 번호: 17, 20, 및 23을 포함한다. pBN632는 MVA (IGR 88/89 안에)에 또한 존재하는 서열들을 함유한다. MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열은 MVA 바이러스성 게놈으로의 재조합을 허용하도록 MVA 바이러스 서열들 사이에 삽입되었다. 따라서, 폭스바이러스 프로모터의 하류 MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열이 함유되도록 플라스미드가 작제되었다. mBN420의 경우, 서열 번호: 5 (MUC1) 및 서열 번호: 14 (CEA)가 이용되었다. MUC1 및 CEA의 프로모터는 각기 Pr13.5 프로모터 (US 특허 공개 2015/0299267 참고) (MUC1) 및 40k MVA1 프로모터 (CEA)이다. TRICOM의 동시-자극적 분자들은 mBN420의 일부로 함유되고, 그리고 IGR 88/89 안에 통합된다. 이들 서열들은 다음을 함유한다: B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3 그리고 각기 서열 번호: 15, 18, 및 21을 포함한다.
mBN373의 작제를 위하여, 재조합 플라스미드 pBN563은 계두 바이러스 안에 또한 존재하는 서열을 함유한다. MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열은 계두 바이러스성 게놈 게놈으로의 재조합을 허용하도록 계두 바이러스 서열들 사이의 BamH1 영역에 삽입된다. 따라서, 폭스바이러스 프로모터의 하류 MUC1 및 CEA 뉴클레오티드 서열이 함유되도록 플라스미드가 작제되었다. mBN373의 경우, 서열 번호: 3 (MUC1) 및 서열 번호: 14 (CEA)가 이용되었다. MUC1 및 CEA의 프로모터는 각각 40K FPV-1 PrS 프로모터 (MUC1) 및 40k-MVA1 프로모터 (CEA)이다. TRICOM의 동시-자극적 분자들은 mBN373의 일부분으로 포함되었다. 이들 서열들은 다음을 함유한다: B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3을 포함하고, 이들은 차례로 서열 번호: 15, 18, 및 21을 포함한다.
상기 재조합 플라스미드는 단량체 레드 형광 단백질과 조합된, 합성 백시니아 바이러스 프로모터 (Ps), 약물 저항성 유전자 GPT, 내부 리보좀 진입 부위 (IRES), 및 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 및 약물 저항성 유전자 구아닌-산틴 포스포리보실전이효소 (Ecogpt)를 포함하는 선별 카세트를 또한 함유한다. 모든 선별 유전자들 (GFP, NPTII, 및 mRFP1)은 단일 비시스트로닉 전사체에 의해 인코드되었다.
CEF 배양물은 mBN399/400의 경우 백시니아 바이러스, mBN336, mBN420의 경우 MVA-BN, 또는 mBN373의 경우 FPV로 접종하였고, 각 CEF 배양물은 플라스미드 DNA로 또한 형질감염되었다. 다시, 이들 세포 배양물의 샘플을 선별 약물을 함유하는 배지에서 CEF 배양물에 접종하고, EGFP-발현 바이러스 클론은 플라크 정제에 의해 분리하였다. 선별 약물 존재하에 성장하고, EGFP를 발현시키는 바이러스 스톡은 다음중 하나로 명명되었다: mBN399, mBN400 (백시니아 바이러스), mBN336, mBN420 (MVA 바이러스), 및 mBN373 (계두). 상기 재조합형 바이러스의 생산 및 바이러스 스톡의 준비는 1-5회 플락 정제를 갖는, 5-12회의 연속적 계대를 수반한다.
상기 재조합형 폭스바이러스는 선별 약물 부재하에서 CEF 세포 배양물에서 계대되었다. 선별 약물의 부재는 삽입된 서열로부터 선별 유전자들을 인코딩하는 영역, gpt 및 EGFP 및 연합된 프로모터 (선별 카세트) 의 상실을 허용하였다. 선별 카세트의 상실을 초래하는 재조합은 F1 I4L 영역 및 그 영역의 서브섹션인 F1 반복부 (F1 rpt)에 의해 매개되는데, 이 반복부는 각 구조물의 플라스미드에서 선별 카세트의 측면에 위치한다. 이러한 복제된 서열은 본원에 기술된 구조체의 기술된 유전자사이의 영역에 삽입된 MUC1 및 CEA 서열만을 남겨두고 선별 카세트의 손실을 초래하는 재조합을 매개하도록 포함되었다.
선별 카세트가 없는 플락-정제된 바이러스가 제조되었다. 이러한 준비에는 5 회의 플락 정제를 비롯한 15 회 계대와 관련되었다.
mBN336, mBN420, 및 mBN373 스톡에서 MUC1 및 CEA 서열의 존재 및 모계 MVA-BN 바이러스의 부재는 PCR 분석에 의해 확인되었으며, 네스트(nested) PCR을 이용하여 선별 카세트 (gpt 및 EGFP 유전자들/ NPTII 및 mRFP1) 부재를 증명하였다.
MUC1 및 CEA 단백질의 발현은 시험관에서 MVA-BN-MUC1-CEA-TRICOM 으로 접종된 세포에서 입증되었다.
실시예 2: MVA-mBN336 계대 1-7의 PCR 분석
MVA-mBN336B의 유전적 안정성은 7 회 계대를 위한 배양에서 평가되었다. MVA-mBN336B는 5가지 인간 이식유전자를 인코드하는데, 인간 뮤신 1 (MUC-1) 및 이 백신 후보물질의 표적 항원인 인간 암배아 항원 (CEA), 그리고 백혈구 기능-연합된 항원-3 (LFA-3), 세포내 흡착 분자 1 (ICAM-1), 및 B7-1의 3개 유전자는 강건하고 직접적인(directed) 면역 반응을 유도용 서포트로써 인간 면역 동시-자극적 분자들 (동시-자극적 분자들의 TRIad, 또는 TRICOM으로 명명됨)을 코드한다. 상기 이식유전자들은 MVA-BN®의 3개 유전자사이의 영역 (IGR) 안으로 삽입되었다: CEA를 함유하는 IGR 44/45, hMUC1을 함유하는 IGR 88/89, 및 TRICOM 유전자들을 함유하는 IGR 148/149. 이식유전자 발현은 폭스 바이러스 프로모터 40k-MVA1, 30k, I3L 및 PrS에 의해 구동된다.
1 차 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 세포를 준비하고, VP-SFM 배지에서 롤러 병 (RB)에 (7x107 세포)접종하고, 37℃에서 4 일 동안 배양하였다. VP-SFM 배지를 100 ㎖ RPMI 배지로 대체하고 세포를 1x108 세포/ RB의 세포 수를 나타내는 약 .3-00.1의 MOI로 감염시키고, 30℃에서 3 일 동안 배양하였다. 항온처리 후, 적어도 16 시간 동안 -20℃에서 RB를 동결시켜 바이러스 샘플을 채취한 다음, RB를 해동시키고, 세포 바이러스 현탁액을 수집하였다. 세포 현탁액의 정확한 부피를 결정하고, 바이러스 시료를 초음파 처리한 후 분주하고(aliquoted), 80℃에서 보관하였다. 이 과정은 여섯 번 반복되면 7 계대가 되었다.
삽입된 이식유전자의 PCR 분석은 30℃에서 배양한 후, 각각의 계대에 대해 수행하였다. 도 9a는 7 회 계대에 걸쳐 CEA 안정성에 대한 PCR 결과를 나타낸다. 도 9b는 7 회 계대 동안 MUC1의 안정성에 대한 PCR 결과를 나타낸다. 도 9c는 TRICOM이 7회 계대에 걸쳐 안정성에 대한 PCR 결과를 나타낸다. MVA-mBN336B 생산에 이용된 재조합 플라스미드는 양성 대조군으로 이용되었으며, MVA-BN®은 음성 대조군 (비어있는 벡터 골격)으로 이용되었고, 그리고 H2O는 PCR 반응의 대조군으로 이용되었다.
도 10a 및 도 10b는 계대 7 샘플의 분석을 도시한다. 도 10a는 시퀀싱에 의한 분석을 위해 계대 7 시료의 PCR 증폭이다. 각 개별 이식유전자: CEA, MUC1, 및 TRICOM에 대하여 개별 PCR 증폭이 실행되었다. B) 프레임 이동으로 이어지는, 검출된 점 돌연변이를 포함하는 좌를 묘사하는 MUC1 nt-서열의 전기 영동 사진. 상기 점 돌연변이는 계대 5에서 첫번째 PCR 증폭에서 탐지되었으며, 프레임 이동으로 이어지는, 검출된 점 돌연변이를 포함하는 좌를 묘사하는 MUC1 nt-서열의 전기 영동 사진. 상기 점 돌연변이는 계대 5에서 처음 탐지되었으며, 계대 5, 6, 및 7에서 발생되는 도연변이를 분석하는 전기영동사진이다.
도 9 및 도 10에서 나타낸 바와 같이, mBN336에서 MUC1, CEA, 및 TRICOM 조합은PANVAC-V 및 PANVAC-F에서 MUC1, CEA, 및 TRICOM 이식유전자와 비교하였을 때 안정성이 개선되고, 그리고 증가되었음이 증명되었다 (예를 들어, 도 1과 표 1 및 표 2를 도 3 및 도 4와 비교). 계대 5에서 시작하여, 분석된 재료의 소집단내에서 프레임이동(frameshift) 돌연변이가 탐지되었다.
계대 4를 통해 보여진 안정성으로, MVA-mBN336이 PANVAC 및 MUC1을 포함하는 안정적인 폭스바이러스를 생성하려는 다른 시도와 관련된 안정성 문제를 극복할 수 있음을 보여주었다. MVA-mBN336의 안정성은 MVA-기반의 백신의 제작 및 대규모 생산이 전형적으로 계대 3 또는 계대 4에서 MVAs으로부터 취해지기 때문에 추가적으로 유리하다. 따라서, MVA-mBN336은 계대 4를 통하여 안정적이기 때문에, 대규모 생산은 시작될 수 있고, 안정성에 관한 상당한 규제 장애가 극복 될 수 있다.
실시예 3: FPV-mBN373의 개선된 안정성
FPV-mBN373B의 유전적 안정성은 7회 계대를 통하여 평가되었다. 배양은 임상 시험 재료 제조에 사용된 대규모 생산 과정에서 적용된 롤러 병 (RB)에서 수행되었다. 각 계대에서 바이러스 역가는 유동 세포 계측법 분석 및 PCR에 의한 이식유전자 삽입체의 정확한 크기에 의해 분석하였다. 또한, 최종 계대 (P7)는 이식유전자의 시퀀싱에 의해 분석되었다.
1 차 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 세포를 준비하고, VP-SFM 배지에서 RBs (7x107 세포/RB)에 접종하고, 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. VP-SFM 배지를 100 ㎖ RPMI 배지로 대체하고 세포를 1x108/RB의 세포 수를 나타내는 0.1의 MOI로 감염시키고, 37℃에서 4 일 동안 배양하였다. 항온처리 후, 적어도 16 시간 동안 -20℃에서 RB를 동결시켜, 바이러스 시료를 채취한 다음, RB를 해동시켜 세포 바이러스 현탁액을 수집하였다. 세포 현탁액의 정확한 부피를 결정하고, 바이러스 시료를 초음파 처리한 후 분주하고, 80℃에서 보관하였다. 감염성 바이러스 역가는 각 계대 후 결정되어, 바이러스 역가를 모니터하고, 다음 계대의 감염에서 정의된 MOI를 갖는 것이 가능하도록 한다. 이 과정은 여섯 번 반복되면 7 계대가 되었다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, 삽입된 이식유전자의 PCR 분석은 37℃에서 배양한 후, 각각의 계대에 대해 수행하였다. FPV-mBN373B의 생성에 사용된 재조합 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하고, FPV를 음성 대조군 (비어있는 벡터 골격)으로 사용하고, H2O를 PCR 반응의 대조군으로 사용하였다.
도 11b에 나타낸 바와 같이, 일곱번째 계대의 시퀸싱은 이식유전자 및 각 측면 영역의 최소한 600bp를 함유하는 BamHI J 부위의 증폭후에 수행하였다. 계대 7 (37℃)에서 분석된 FPV-mBN373B의 PCR 엠플리콘은 5566 bp (PCR1) 및 5264 bp (PCR2)의 예상 밴드 크기로 나타나며, 이는 삽입된 이식유전자 및 적어도 600 bp의 각 측면 영역을 포괄하는 것이다. 결과는 이론적인 서열과 비교하여 조립 된 서열의 100 % 동일성을 보였고, 이는 37 ℃에서 7회 계대에 대한 FPV-mBN373B의 유전적 안정성을 확인였다.
적어도 하나의 양태에서, mBN373에서 MUC1 이식유전자, 서열 번호: 3의 결과적인 안정성은 mBN373 및 mBN336 둘다 서열 번호:3을 함유하는 것으로 놀랍다. 따라서, 서열 번호: 3의 MUC1은 mBN336 (MVA 바이러스)의 계대5에서 불안정성을 나타내기 시작하고, 동일한 서열 번호:3은 적어도 계대 7까지 mBN373 (계두 바이러스)에서 안정적이다.
실시예 4: MVA-mBN420의 안정성
MVA-mBN 420의 유전적 안정성은 7회 계대를 통하여 평가되었다. 배양은 임상 시험 재료 제조에 사용된 대규모 생산 과정에서 적용된 롤러 병 (RB)에서 수행되었다. 이 연구는 약 0.05 ~ 0.1의 MOI 및 바이러스 배양 기간 4 일을 사용하여 30 ℃와 34 ℃에서 수행되었으며, 그 이유는 이들 조건이 임상 실험 재료 제조에 사용되는 일반적인 대규모 생산의 대표적인 조건이기 때문이다. 각 계대에서 바이러스 역가는 유동 세포 계측법 분석 및 PCR에 의한 이식유전자 삽입체의 정확한 크기에 의해 분석하였다.
0.05 차 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 세포를 준비하고, VP-SFM 배지에서 RBs (7x107 세포/RB)에 접종하고, 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. VP-SFM 배지를 100 ㎖ RPMI 배지로 대체하고 세포를 1x108/RB의 세포 수를 나타내는 0.05 내지 0.1의 MOI로 감염시키고, 30℃ 및 34℃에서 4 일 동안 배양하였다. 항온처리 후, 적어도 16 시간 동안 -20℃에서 RB를 동결시켜, 바이러스 시료를 채취한 다음, RB를 해동시켜 세포 바이러스 현탁액을 수집하였다. 상기 바이러스 시료를 초음파 처리한 후 분주하고, 80℃에서 보관하였다. 감염성 바이러스 역가는 각 계대 후 결정되어, 바이러스 역가를 모니터하고, 다음 계대의 감염에서 정의된 MOI를 갖는 것이 가능하도록 한다. 이 과정은 여섯 번 반복되면 7 계대가 되었다.
삽입된 이식유전자의 PCR 분석은 30℃ 4에서 배양한 후, 각각의 계대에 대해 수행하였다. 30 ℃에서 수행한 계대의 결과는 도 12에 제시된다. mBN420의 생성에 사용된 재조합 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하고, MVA-BN을 음성 대조군 (비어있는 벡터 골격)으로 사용하고, H2O를 PCR 반응의 대조군으로 사용하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, mBN420에서의 MVA의 안정성은 mBN336에서의 MVA 및 mBN373에서의 계두 바이러스와 비교하여 감소되었다.
실시예 5: MUC1 및 CEA를 인코딩하는 추가적인 재조합형 MVA 및 재조합형 계두 바이러스의 개선된 안정성
본 발명의 부가적인 재조합 MVAs 및 재조합 계두 바이러스의 생성은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된다. 서열 번호: 31, 32, 33, 또는 34 (MUC1의 경우) 및 서열 번호: 13 또는 14 (CEA의 경우)을 포함하는 MUC1, CEA, 및 TRICOM 이식유전자를 인코딩하는 핵산은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 MVA-BN에 삽입된다. 추가적으로, TRICOM은 MVA에 삽입하고, 서열 번호: 15 또는 17 (B7.1의 경우), 서열 번호: 18 또는 20 (ICAM-1의 경우), 그리고 서열 번호: 21 또는 23 (LFA-3의 경우)을 함유하는 TRICOM 서열들은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 MVA안으로 삽입된다.
추가적으로, 서열 번호: 31, 32, 33, 또는 34 (MUC1의 경우) 및 서열 번호: 13 또는 14 (CEA의 경우)를 포함하는 MUC1 및 CEA 이식유전자를 인코딩하는 핵산은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 MVA-BN 안으로 삽입된다. 추가적으로, TRICOM은 계두 바이러스로 삽입되는데, 서열 번호: 15 또는 17 (B7.1의 경우), 서열 번호: 18 또는 20 (ICAM-1의 경우), 및 서열 번호: 21 또는 23 (LFA-3의 경우)를 함유하는 TRICOM 서열들은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 계두로 삽입된다.
서열 번호: 31, 32, 33, 또는 34는 각각 서열 번호: 35를 포함하는 MUC1 펩티드를 인코드한다.
서열 번호: 31, 32, 33, 및 34의 상기 신규한 MUC1 핵산은 각각 WO 2013/103658의 작용 에피토프 없이 본 발명의 핵산의 변이를 인코드한다. 몇 가지 양태들에서, 작용 에피토프의 치환 및/또는 제거는 본 발명의 재조합 폭스바이러스의 안정성에 영향을 미치지 않는데, 그 이유는 작동 에피토프의 존재가 안정성 또는 불안정성보다는 MUC1의 면역원성을 향상시키는 기능을 하기 때문이다.
실시예 1에서 설명된 바와 같이, MUC1, CEA, 및 TRICOM 단백질의 발현은 시험관에서 MVA-BN-MUC1-CEA-TRICOM 으로 접종된 세포에서 입증되었다.
MVA 및/또는 계두 바이러스의 이식유전자의 개선된 유전적 안정성은 7회 계대에 걸쳐 평가되었다. 배양은 임상 시험 재료 제조에 사용된 대규모 생산 과정에서 적용된 롤러 병 (RB)에서 수행된다. 이 연구는 약 00.05-00.1 의 MOI 및 바이러스 배양 기간 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일을 사용하여 30℃, 34℃ 또는 37 ℃(이용된 벡터 시스템에 따라)에서 수행되었으며, 그 이유는 이들 조건이 임상 실험 재료 제조에 사용되는 일반적인 대규모 생산의 대표적인 조건이기 때문이다. 각 계대에서 바이러스 역가는 유동 세포 계측법 분석 및 PCR에 의한 이식유전자 삽입체의 정확한 크기에 의해 분석한다. 또한, 최종 계대 (P7)는 이식유전자의 시퀀싱에 의해 분석된다.
일차 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 세포를 준비하고, VP-SFM 배지에서 RBs (7x107 세포/RB)에 접종하고, 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. VP-SFM 배지를 RPMI 배지 100 ㎖로 교체하고 세포를 MOI 0.005에서 0.1로 감염시키고, 30℃, 34℃ 또는 37℃(사용된 벡터 시스템에 따라 다름)에서 4 일 동안 배양하였다. 항온처리 후, 적어도 16 시간 동안 -20℃에서 RB를 동결시켜 바이러스 샘플을 채취한 다음, RB를 해동시키고, 세포 바이러스 현탁액을 수집한다. 상기 바이러스 시료를 초음파 처리한 후 분주하고, 80℃에서 보관한다. 감염성 바이러스 역가는 각 계대 후 결정되어, 바이러스 역가를 모니터하고, 다음 계대의 감염에서 정의된 MOI를 갖는 것이 가능하도록 한다. 이 과정은 여섯 번 반복되면 7회 계대가 된다.
삽입된 이식유전자의 PCR 분석은 30℃, 34 ℃ 또는 37 ℃ (사용된 벡터 시스템에 따라 다름)에서 배양한 후, 각각의 계대에 대해 수행한다. 각 대응하는 폭스바이러스 (예를 들어, MVA-BN 또는 계두 바이러스)를 생성하는데 이용된 재조합 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하고, MVA-BN 또는 계두 바이러스는 음성 대조군 (비어있는 벡터 골격)으로 사용하고, 그리고 H2O를 PCR 반응의 대조군으로 사용한다.
일곱번째 계대의 시퀸싱은 이식유전자 및 각 측면 영역의 최소한 600bp를 함유하는 IGR부위의 증폭후에 수행한다. 각 구조체의 PCR 엠플리콘은 계대 7에서 분석된다. MUC1, CEA 및/또는 TRICOM 핵의 시퀀싱 결과는 이식유전자중에서 MVA 및/또는 계두 바이러스가 안정하다는 것을 입증하기 위해 수행된다.
본원에 기재된 방법 또는 조성물의 정확한 세부 사항은 기술된 발명의 사상을 벗어나지 않고, 변화되거나 수정될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 본 발명자들은 하기 청구 범위의 사상 및 범위 내에서 그러한 모든 수정 및 변형을 청구한다.
SEQUENCE LISTING <110> BAVARIAN NORDIC A/S <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE STABILITY OF TRANSGENES IN POXVIRUSES <130> BNIT0011PCT <140> <141> <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 coding sequence from PANVAC <400> 1 atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60 gttacgggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac aagctccgta 180 ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240 gccccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccttgt ggggacagga tgtcacctcg 300 gtaccagtta ctagaccagc tttaggtagc acagcacctc ctgctcatgg agtaactagt 360 gctcctgata ctcgtccagc tcctggcagt actgcaccac cggcacatgg cgtaacatca 420 gcacctgata caagacctgc acctggatct acagcgccgc ctgcgcacgg agtgacatcg 480 gcgcccgata cgcgccccgc tcccggtagc accgcaccgc ccgcccacgg tgttacaagt 540 gcacccgata cccggccggc acccggaagt accgctccac ctgcacacgg ggtcacaagc 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<223> VNTR #1 coding sequence from PANVAC <400> 9 ggtagcacag cacctcctgc tcatggagta actagtgctc ctgatactcg tccagctcct 60 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR #2 coding sequence from mBN420 and mBN336 <400> 10 gttagcacag cacctcccgc acacggtgta actagcgcgc ctgatacacg tcccgctccc 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR #3 coding sequence from PANVAC <400> 11 ggatctacag cgccgcctgc gcacggagtg acatcggcgc ccgatacgcg ccccgctccc 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR #3 coding sequence from mBN420 and mBN336 <400> 12 ggatctaccg ctccgccagc gcacggagtg acgtcagcac cagatacgag gccagcgcct 60 <210> 13 <211> 2103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA coding sequence from PANVAC <400> 13 atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60 acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120 acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180 catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240 ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300 atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360 accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420 tacccggaac tccctaagcc ttctattagc tccaataata gtaagcctgt cgaagacaaa 480 gatgccgtcg cttttacatg cgagcccgaa actcaagacg caacatatct ctggtgggtg 540 aacaaccagt ccctgcctgt gtcccctaga ctccaactca gcaacggaaa tagaactctg 600 accctgttta acgtgaccag gaacgacaca gcaagctaca aatgcgaaac ccaaaatcca 660 gtcagcgcca ggaggtctga ttcagtgatt ctcaacgtgc tttacggacc cgatgctcct 720 acaatcagcc ctctaaacac aagctataga tcaggggaaa atctgaatct gagctgtcat 780 gccgctagca atcctcccgc ccaatacagc tggtttgtca atggcacttt ccaacagtcc 840 acccaggaac tgttcattcc caatattacc gtgaacaata gtggatccta cacgtgccaa 900 gctcacaata gcgacaccgg actcaaccgc acaaccgtga cgacgattac cgtgtatgag 960 ccaccaaaac cattcataac tagtaacaat tctaacccag ttgaggatga ggacgcagtt 1020 gcattaactt gtgagccaga gattcaaaat accacttatt tatggtgggt caataaccaa 1080 agtttgccgg ttagcccacg cttgcagttg tctaatgata accgcacatt gacactcctg 1140 tccgttactc gcaatgatgt aggaccttat gagtgtggca ttcagaatga attatccgtt 1200 gatcactccg accctgttat ccttaatgtt ttgtatggcc cagacgaccc aactatatct 1260 ccatcataca cctactaccg tcccggcgtg aacttgagcc tttcttgcca tgcagcatcc 1320 aacccccctg cacagtactc ctggctgatt gatggaaaca ttcagcagca tactcaagag 1380 ttatttataa gcaacataac tgagaagaac agcggactct atacttgcca ggccaataac 1440 tcagccagtg gtcacagcag gactacagtt aaaacaataa ctgtttccgc ggagctgccc 1500 aagccctcca tctccagcaa caactccaaa cccgtggagg acaaggatgc tgtggccttc 1560 acctgtgaac ctgaggctca gaacacaacc tacctgtggt gggtaaatgg tcagagcctc 1620 ccagtcagtc ccaggctgca gctgtccaat ggcaacagga ccctcactct attcaatgtc 1680 acaagaaatg acgcaagagc ctatgtatgt ggaatccaga actcagtgag tgcaaaccgc 1740 agtgacccag tcaccctgga tgtcctctat gggccggaca cccccatcat ttccccccca 1800 gactcgtctt acctttcggg agcggacctc aacctctcct gccactcggc ctctaaccca 1860 tccccgcagt attcttggcg tatcaatggg ataccgcagc aacacacaca agttctcttt 1920 atcgccaaaa tcacgccaaa taataacggg acctatgcct gttttgtctc taacttggct 1980 actggccgca ataattccat agtcaagagc atcacagtct ctgcatctgg aacttctcct 2040 ggtctctcag ctggggccac tgtcggcatc atgattggag tgctggttgg ggttgctctg 2100 ata 2103 <210> 14 <211> 2103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA coding sequence from mBN373 and mBN420 <400> 14 atggagtctc cctcggctcc tccacacaga tggtgcatcc cttggcagag gctcctgctc 60 acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120 acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgcctcag 180 catctctttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240 ggatatgtaa taggaactca acaagctact ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300 atatacccta atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360 accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420 taccctgaac tccctaagcc ttctattagc tccaataata gtaagcctgt cgaagacaaa 480 gatgccgtcg ctttcacatg cgagcccgaa actcaagacg caacatatct ctggtgggtg 540 aacaaccagt ccctgcctgt gtctcctaga ctccaactca gcaacggaaa tagaactctg 600 accctgttta acgtgaccag gaacgacaca gcaagctaca aatgcgaaac ccaaaatcca 660 gtcagcgcca ggaggtctga ttcagtgatt ctcaacgtgc tttacggacc cgatgctcct 720 acaatcagcc ctctaaacac aagctataga tcaggagaaa atctgaatct gagctgtcat 780 gccgctagca atcctccagc tcaatacagc tggtttgtca atggcacttt ccaacagtcc 840 acccaggaac tgttcattcc caatattacc gtgaacaata gtggatccta cacgtgccaa 900 gctcacaata gcgacaccgg actcaaccgc acaaccgtga cgacgattac cgtgtatgag 960 ccaccaaaac cattcataac tagtaacaat tctaacccag ttgaggatga ggacgcagtt 1020 gcattaactt gtgagccaga gattcaaaat accacttatt tatggtgggt caataaccaa 1080 agtttgccgg ttagcccacg cttgcagttg tctaatgata accgcacatt gacactcctg 1140 tccgttactc gcaatgatgt aggaccttat gagtgtggca ttcagaatga attatccgtt 1200 gatcactccg accctgttat ccttaatgtt ttgtatggcc cagacgaccc aactatatct 1260 ccatcataca cctactaccg tcccggcgtg aacttgagcc tttcttgcca tgcagcatct 1320 aatccacctg cacagtactc ctggctgatt gatggaaaca ttcagcagca tactcaagag 1380 ttatttataa gcaacataac tgagaagaac agcggactct atacttgcca ggccaataac 1440 tcagccagtg gtcacagcag gactacagtt aaaacaataa ctgtttccgc ggagctgccc 1500 aagccctcca tctccagcaa caactccaaa cccgtggagg acaaggatgc tgtggccttc 1560 acctgtgaac ctgaggctca gaacacaacc tacctgtggt gggtaaatgg tcagagcctc 1620 ccagtcagtc ccaggctgca gctgtccaat ggcaacagga ccctcactct attcaatgtc 1680 acaagaaatg acgcaagagc ctatgtatgt ggaatccaga actcagtgag tgcaaaccgc 1740 agtgacccag tcaccctgga tgtcctctat ggaccggaca cacccatcat ttcacctcca 1800 gactcgtctt acctttcggg agcggacctc aacctctcct gccactcggc ctctaaccca 1860 tctccgcagt attcttggcg tatcaatggg ataccgcagc aacacacaca agttctcttt 1920 atcgccaaaa tcacgccaaa taataacggg acctatgcct gttttgtctc taacttggct 1980 actggccgca ataattccat agtcaagagc atcacagtct ctgcatctgg aacttctcct 2040 ggtctctcag ctggagccac tgtcggcatc atgattggag tgctggttgg ggttgctctg 2100 ata 2103 <210> 15 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized B7.1 coding sequence from mBN373 and mBN420 <400> 15 atgggacaca ccagaaggca gggcacaagc ccatccaagt gtccctacct gaacttcttt 60 cagctcctgg tgctggctgg cctgtcccac ttctgctccg gagtgatcca cgtgaccaag 120 gaggtcaaag aagtcgccac actgagctgc gggcacaatg tgtccgtgga ggaactggct 180 cagacacgga tctactggca gaaagagaag aaaatggtgc tgaccatgat gtccggcgac 240 atgaacatct ggcctgagta caagaaccgc accatcttcg acatcaccaa caatctgagc 300 atcgtgatcc tcgctctgag gccctccgac gagggaacat acgagtgcgt ggtgctgaag 360 tacgagaagg acgccttcaa acgcgagcac ctggccgagg tcaccctgtc cgtgaaggca 420 gacttcccaa cacccagcat cagcgacttc gagatcccta ccagcaacat ccggcggatt 480 atctgcagca cctccggagg cttcccagag cctcacctga gctggctcga gaacggcgaa 540 gagctcaacg ccatcaacac taccgtgtcc caggaccctg agacagagct gtacgctgtg 600 agcagcaagc tggacttcaa catgaccaca aatcacagct ttatgtgcct catcaagtac 660 ggccacctga gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcagga acacttccca 720 gacaatctcc tgccctcctg ggctatcaca ctgattagcg tgaatggcat cttcgtgatc 780 tgctgtctga cctactgctt cgctcccaga tgccgggagc gcaggagaaa cgagaggctg 840 agacgggaat ccgtgaggcc cgtg 864 <210> 16 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B7.1 coding sequence from PANVAC <400> 16 atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60 cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120 gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180 caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggagac 240 atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300 attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360 tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420 gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480 atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540 gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600 agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660 ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720 gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat tttcgtgata 780 tgctgcctga cctactgctt tgccccacgc tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840 agaagggaaa gtgtacgccc tgta 864 <210> 17 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized B7.1 coding sequence from mBN336 <400> 17 atgggccaca ccagaaggca gggcaccagc ccctccaagt gcccctacct gaacttcttc 60 cagctcctgg tgctggccgg cctgtcccac ttctgctccg gcgtgatcca cgtgaccaaa 120 gaggtcaaag aagtcgccac actgagctgc ggccacaatg tgtccgtgga ggaactggct 180 cagacccgga tctactggca gaaagaaaag aaaatggtgc tgaccatgat gtccggcgac 240 atgaacatct ggcctgagta caagaaccgc accatcttcg acatcaccaa caacctgagc 300 atcgtgatcc tcgccctgag gccctccgac gagggcacct acgagtgcgt ggtgctgaag 360 tacgagaagg acgccttcaa gcgcgagcac ctggccgagg tcaccctgtc cgtgaaggcc 420 gacttcccaa cccccagcat cagcgacttc gagatcccaa ccagcaacat ccggcggatc 480 atctgcagca cctccggcgg cttccccgag cctcacctga gctggctcga gaacggcgaa 540 gaactcaacg ccatcaacac taccgtgtcc caggaccccg agacagagct gtacgccgtg 600 agcagcaagc tggacttcaa catgaccaca aaccacagct ttatgtgcct catcaagtac 660 ggccacctga gagtgaatca gaccttcaac tggaacacca ccaagcagga acacttcccc 720 gacaatctgc tgccctcctg ggctatcacc ctgattagcg tgaatggcat cttcgtgatc 780 tgctgtctga cctactgctt cgcccccaga tgccgggagc ggcggagaaa cgagcggctg 840 cggcgggaat ccgtgaggcc cgtg 864 <210> 18 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized ICAM-1 coding sequence from mBN373 and mBN420 <400> 18 atggctccta gctcacctag accagctctg cctgccctgc tcgtgctgct cggagctctg 60 ttccctggac caggcaacgc ccagaccagc gtgtcaccta gcaaagtgat tctgcccaga 120 ggaggctccg tgctggtcac atgtagcacc agctgcgacc agcccaagct cctcgggatc 180 gagacacctc tgcccaagaa agagctgctc ctgccaggca acaatcggaa agtgtacgag 240 ctgtccaatg tgcaggaaga tagccagccc atgtgctact ccaactgtcc cgacggccag 300 agcaccgcca agacctttct gaccgtgtac tggacacctg agcgggtgga actggctcca 360 ctgcccagct ggcagccagt gggcaagaat ctgaccctgc ggtgccaggt ggaaggcgga 420 gctcccagag ccaacctgac agtggtgctc ctgagaggcg agaaagagct gaagcgggaa 480 cctgccgtgg gcgagccagc cgaagtgacc acaaccgtgc tcgtgcggag ggaccaccac 540 ggagccaact tcagctgcag aaccgagctg gacctcaggc cacagggcct ggaactgttc 600 gagaacacca gcgctcccta ccagctccag accttcgtgc tcccagcaac accacctcag 660 ctggtgtcac ctcgggtgct ggaagtggac acccagggca cagtcgtgtg cagcctggac 720 ggcctgtttc ccgtgtccga agctcaggtc cacctggctc tcggagacca gagactgaac 780 cctaccgtga cctacggcaa tgacagcttc agcgccaagg cctccgtgtc cgtgaccgcc 840 gaggatgaag gcacccagag gctgacatgc gccgtgattc tgggcaacca gagccaggaa 900 accctgcaga ccgtcaccat ctatagcttc cctgcaccta atgtgatcct gacaaagccc 960 gaggtgtccg agggcactga agtgaccgtg aaatgcgagg cccaccctag agccaaagtg 1020 accctgaacg gcgtgccagc ccagccactc ggaccaagag cacagctcct gctgaaagcc 1080 acacccgagg ataacggccg gtccttctcc tgcagcgcta ccctcgaagt ggccggacag 1140 ctgatccaca agaaccagac cagagagctg agagtgctgt acggccctag actggacgag 1200 agagactgcc caggcaactg gacctggccc gagaactccc agcagacacc catgtgccag 1260 gcttggggca acccactgcc agagctgaag tgcctgaagg acggcacctt ccctctgccc 1320 atcggcgagt ccgtgacagt gaccagggac ctggaaggca cctacctgtg cagagccaga 1380 tccacacagg gcgaagtgac acgggaggtc accgtgaatg tgctgtcacc tcgctacgag 1440 atcgtgatca tcaccgtggt cgctgcagct gtgatcatgg gcacagccgg actgagcaca 1500 tacctgtaca accggcagcg gaagatcaag aagtacaggc tgcagcaggc ccagaaaggc 1560 acacccatga agcccaacac ccaggccact cctccc 1596 <210> 19 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-1 coding sequence from PANVAC <400> 19 atggctccca gcagcccccg gcccgcgctg cccgcactcc tggtcctgct cggggctctg 60 ttcccaggac ctggcaatgc ccagacatct gtgtccccct caaaagtcat cctgccccgg 120 ggaggctccg tgctggtgac atgcagcacc tcctgtgacc agcccaagtt gttgggcata 180 gagaccccgt tgcctaaaaa ggagttgctc ctgcctggga acaaccggaa ggtgtatgaa 240 ctgagcaatg tgcaagaaga tagccaacca atgtgctatt caaactgccc tgatgggcag 300 tcaacagcta aaaccttcct caccgtgtac tggactccag aacgggtgga actggcaccc 360 ctcccctctt ggcagccagt gggcaagaac cttaccctac gctgccaggt ggagggtggg 420 gcaccccggg ccaacctcac cgtggtgctg ctccgtgggg agaaggagct gaaacgggag 480 ccagctgtgg gggagcccgc tgaggtcacg accacggtgc tggtgaggag agatcaccat 540 ggagccaatt tctcgtgccg cactgaactg gacctgcggc cccaagggct ggagctgttt 600 gagaacacct cggcccccta ccagctccag acctttgtcc tgccagcgac tcccccacaa 660 cttgtcagcc cccgggtcct agaggtggac acgcagggga ccgtggtctg ttccctggac 720 gggctgttcc cagtctcgga ggcccaggtc cacctggcac tgggggacca gaggttgaac 780 cccacagtca cctatggcaa cgactccttc tcggccaagg cctcagtcag tgtgaccgca 840 gaggacgagg gcacccagcg gctgacgtgt gcagtaatac tggggaacca gagccaggag 900 acactgcaga cagtgaccat ctacagcttt ccggcgccca acgtgattct gacgaagcca 960 gaggtctcag aagggaccga ggtgacagtg aagtgtgagg cccaccctag agccaaggtg 1020 acgctgaatg gggttccagc ccagccactg ggcccgaggg cccagctcct gctgaaggcc 1080 accccagagg acaacgggcg cagcttctcc tgctctgcaa ccctggaggt ggccggccag 1140 cttatacaca agaaccagac ccgggagctt cgtgtcctgt atggcccccg actggacgag 1200 agggattgtc cgggaaactg gacgtggcca gaaaattccc agcagactcc aatgtgccag 1260 gcttggggga acccattgcc cgagctcaag tgtctaaagg atggcacttt cccactgccc 1320 atcggggaat cagtgactgt cactcgagat cttgagggca cctacctctg tcgggccagg 1380 agcactcaag gggaggtcac ccgcgaggtg accgtgaatg tgctctcccc ccggtatgag 1440 attgtcatca tcactgtggt agcagccgca gtcataatgg gcactgcagg cctcagcacg 1500 tacctctata accgccagcg gaagatcaag aaatacagac tacaacaggc ccaaaaaggg 1560 acccccatga aaccgaacac acaagccacg cctccc 1596 <210> 20 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized ICAM-1 coding sequence from mBN336 <400> 20 atggccccta gcagccctag accagccctg cctgccctgc tggtgctgct gggcgctctg 60 ttccccggac ccggcaacgc ccagaccagc gtgtccccca gcaaagtgat tctgcccaga 120 ggcggctccg tgctggtcac atgtagcacc agctgcgacc agcccaagct cctcgggatc 180 gagacacccc tgcccaagaa agagctgctg ctgcccggca acaaccggaa agtgtacgag 240 ctgtccaatg tgcaggaaga tagccagccc atgtgctact ccaactgccc cgacggccag 300 agcaccgcca agacctttct gaccgtgtac tggacccccg agcgggtgga actggcccca 360 ctgcccagct ggcagcccgt gggcaagaat ctgaccctgc ggtgccaggt ggaaggcgga 420 gcccccagag ccaacctgac agtggtgctc ctgcggggcg aaaaagagct gaagcgggag 480 cctgccgtgg gcgagccagc cgaagtgacc acaaccgtgc tcgtgcggag ggaccaccac 540 ggcgccaact tcagctgcag aaccgagctg gacctcaggc cacagggcct ggaactgttc 600 gagaacacca gcgcccccta ccagctccag accttcgtgc tcccagcaac cccccctcag 660 ctggtgtccc ctcgggtgct ggaagtggac acccagggca cagtcgtgtg cagcctggac 720 ggcctgtttc ccgtgtccga agctcaggtc cacctggctc tcggggacca gagactgaac 780 cctaccgtga cctacggcaa tgacagcttc agcgccaagg cctccgtgtc cgtgaccgcc 840 gaggatgagg gcacccagag gctgacatgc gccgtgattc tgggcaacca gagccaggaa 900 accctgcaga ccgtcaccat ctatagcttc cctgccccca atgtgatcct gacaaagccc 960 gaggtgtccg agggcactga agtgaccgtg aaatgcgagg cccaccccag ggccaaagtg 1020 accctgaacg gcgtgccagc ccagccactc ggaccaagag cacagctcct gctgaaagcc 1080 acccccgagg ataacggccg gtccttctcc tgcagcgcta ccctcgaagt ggccgggcag 1140 ctgatccaca agaaccagac ccgggagctg agagtgctgt acggccccag actggacgag 1200 agagactgcc ccggcaactg gacctggccc gagaactccc agcagacccc catgtgccag 1260 gcttggggca acccactgcc agagctgaag tgcctgaagg acggcacctt ccctctgccc 1320 atcggcgagt ccgtgacagt gacccgggac ctggaaggca cctacctgtg ccgggccaga 1380 tccacacagg gcgaagtgac acgggaggtc accgtgaatg tgctgtcccc ccgctacgag 1440 atcgtgatca tcaccgtggt cgctgcagct gtgatcatgg gcacagccgg cctgagcaca 1500 tacctgtaca accggcagcg gaagatcaag aagtacaggc tgcagcaggc ccagaaaggc 1560 acccccatga agcccaacac ccaggccacc cctccc 1596 <210> 21 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized LFA-3 coding sequence from mBN373 and mBN420 <400> 21 atggtggctg gctctgatgc agggagagcc ctgggagtgc tgtctgtcgt gtgcctgctg 60 cactgcttcg gcttcatcag ctgcttcagc cagcagatct acggagtggt ctacggcaac 120 gtgaccttcc acgtgcccag caacgtgcct ctgaaagagg tgctctggaa gaaacagaag 180 gacaaggtcg cagagctgga gaacagcgag ttccgggcct tcagcagctt caagaaccgg 240 gtgtacctgg acaccgtgtc cggcagcctg accatctaca acctgaccag cagcgacgag 300 gacgagtacg agatggaaag ccctaacatc accgacacca tgaagttctt tctgtacgtg 360 ctggaaagcc tgcccagccc aacactgacc tgtgccctga ccaacggctc catcgaggtg 420 cagtgcatga ttcccgagca ctacaactcc cacagaggcc tgatcatgta ctcttgggac 480 tgccctatgg aacagtgcaa gcgcaacagc accagcatct acttcaagat ggagaacgac 540 ctccctcaga agatccagtg cacactgagc aatccactgt tcaacaccac atccagcatc 600 atcctgacaa cctgtattcc cagcagtggc cacagcagac acagatacgc cctgatccct 660 attccactgg ccgtgatcac cacatgcatc gtgctgtaca tgaacggcat cctgaagtgc 720 gaccggaagc ccgaccggac caacagcaac 750 <210> 22 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LFA-3 coding sequence from PANVAC <400> 22 atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60 cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat 120 gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag 180 gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg 240 gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa 300 gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtg 360 cttgagtctc ttccatctcc cacactaact tgtgcattga ctaatggaag cattgaagtc 420 caatgcatga taccagagca ttacaacagc catcgaggac ttataatgta ctcatgggat 480 tgtcctatgg agcaatgtaa acgtaactca accagtatat attttaagat ggaaaatgat 540 cttccacaaa aaatacagtg tactcttagc aatccattat ttaatacaac atcatcaatc 600 attttgacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc 660 ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatggtat tctgaaatgt 720 gacagaaaac cagacagaac caactccaat 750 <210> 23 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized LFA-3 coding sequence from mBN336 <400> 23 atggtggctg gctctgatgc aggcagagcc ctgggcgtgc tgtctgtcgt gtgcctgctg 60 cactgcttcg gcttcatcag ctgcttcagc cagcagatct acggcgtggt gtacggcaac 120 gtgaccttcc acgtgcccag caacgtgcct ctgaaagagg tgctctggaa gaagcagaag 180 gacaaggtcg cagagctgga aaacagcgag ttccgggcct tcagcagctt caagaaccgg 240 gtgtacctgg acaccgtgtc cggcagcctg accatctaca acctgaccag cagcgacgag 300 gacgagtacg agatggaaag ccccaacatc accgacacca tgaagttctt tctgtacgtg 360 ctggaaagcc tgcccagccc caccctgacc tgtgccctga ccaacggctc catcgaggtg 420 cagtgcatga tccccgagca ctacaactcc caccggggcc tgatcatgta ctcttgggac 480 tgccctatgg aaacgtgcaa gcgcaacagc accagcatct acttcaagat ggaaaacgac 540 ctcccccaga aaatccagtg caccctgagc aaccccctgt tcaacaccac ctccagcatc 600 atcctgacca cctgtatccc cagcagcggc cacagcagac acagatacgc cctgatcccc 660 atccccctgg ccgtgatcac cacatgcatc gtgctgtaca tgaacggcat cctgaagtgc 720 gaccggaagc ccgaccggac caacagcaac 750 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 Agonist Epitope <400> 24 Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 agonist epitope <400> 25 Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro Val 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 agonist epitope <400> 26 Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 agonist epitope <400> 27 Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Val 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 agonist epitope <400> 28 Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 agonist epitope <400> 29 Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys 1 5 <210> 30 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 amino acid sequence as found in mBN336, mBN373, and mBN420 <400> 30 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Tyr Leu Ala 100 105 110 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro 115 120 125 Val Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly 165 170 175 Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe 180 185 190 Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His 195 200 205 Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro 210 215 220 Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val 225 230 235 240 Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser 245 250 255 Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp 260 265 270 Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly 275 280 285 Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr 290 295 300 Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile 325 330 335 Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser 340 345 350 Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys 355 360 365 Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys 370 375 380 Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg 385 390 395 400 Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly 405 410 415 Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val 420 425 430 Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 435 440 445 Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 450 455 <210> 31 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 coding sequence for mBN336 w/o agonist epitopes from WO 2013/103658 <400> 31 atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60 gttacgggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac aagctccgta 180 ctctccagcc acagcccagg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240 gcaccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccttgt ggggacagga tgtcacctcg 300 gtaccagtta ctagaccagc tttaggcagc acagcgccac cggctcatgg cgttacatcg 360 gctcctgaca ctcgaccggc accaggcagc acagcacctc ccgcacacgg tgtaactagc 420 gcgcctgata cacgtcccgc tcccggatct accgctccgc cagcgcacgg agtgacgtca 480 gcaccagata cgaggccagc gcctgctagc actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 540 gctaccacaa ccccagccag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 600 actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 660 acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 720 tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 780 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 840 tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 900 gtacagttga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 960 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1020 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1080 atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gttgcactgg ccattgtcta tctcattgcc 1140 ttggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg 1200 gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc 1260 cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagt 1320 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttg 1365 <210> 32 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 coding sequence for mBN373 w/o agonist epitopes from WO 2013/103658 <400> 32 atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60 gttacgggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac aagctccgta 180 ctctccagcc acagcccagg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240 gcaccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccttgt ggggacagga tgtcacctcg 300 gtaccagtta ctagaccagc tttaggcagc acagcgccac cggctcatgg cgttacatcg 360 gctcctgaca ctcgaccggc accaggcagc acagcacctc ccgcacacgg tgtaactagc 420 gcgcctgata cacgtcccgc tcccggatct accgctccgc cagcgcacgg agtgacgtca 480 gcaccagata cgaggccagc gcctgctagc actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 540 gctaccacaa ccccagccag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 600 actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 660 acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 720 tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 780 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 840 tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 900 gtacagttga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 960 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1020 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1080 atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gttgcactgg ccattgtcta tctcattgcc 1140 ttggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg 1200 gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc 1260 cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagt 1320 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttg 1365 <210> 33 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 coding sequence for mBN420 w/o agonist epitopes from WO 2013/103658 <400> 33 atgacacctg gcactcagtc accattcttc ctgctgttac tcttgacagt gcttacagtt 60 gttacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagcggagtt cagtgcctag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac aagctccgta 180 ctctccagcc acagcccagg ttcaggctcc agcaccactc aaggacagga tgtcactctg 240 gcaccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccttgt ggggacagga tgtcacatcg 300 gtaccagtta ctagaccagc tttaggcagc acagcgccac cggctcatgg cgttacatcg 360 gctcctgaca ctcgaccggc accaggcagc acagcacctc ccgcacacgg tgtaactagc 420 gcgcctgata cacgtcccgc tcccggatct accgctccgc cagcgcacgg agtgacgtca 480 gcaccagata cgaggccagc gcctgctagc actctggtgc acaatggcac atctgccagg 540 gctaccacaa ctccagccag caagagcact ccattctcaa ttccaagcca tcactctgat 600 actcctacca cacttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 660 acggtacctc cactcacctc atccaatcac agcacttctc ctcagttgtc tactggagtc 720 tccttctttt tcctgtcctt tcacatttca aacttgcagt tcaattcttc cctggaagat 780 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgagatgtt cttgcagatt 840 tataaacaag gtggattcct tggcctctct aatattaagt tcaggccagg atctgtggtc 900 gtacagttga ctctggcctt cagagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 960 ttcaatcagt ataagacgga agcagcctca cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1020 gttagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctggag ctggtgtgcc aggctggggc 1080 atcgcgctgc tcgtgttggt ctgtgttctg gttgcactgg ccattgtcta tctcattgcc 1140 ttggctgttt gtcagtgcag acgcaagaac tacggacagc tggacatctt tccagctcgg 1200 gatacctacc atcctatgag cgagtaccct acctaccaca cacatggtcg ctatgtgcca 1260 cctagcagta ccgatcgtag tccctatgag aaagtttctg caggtaatgg tggcagcagt 1320 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttg 1365 <210> 34 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 coding sequence for mBN optimized w/o agonist epitopes from WO 2013/103658 <400> 34 atgacacctg gcactcagtc accattcttc ctgctgttac tcttgacagt gcttacagtt 60 gttacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagcggagtt cagtgcctag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac aagctccgta 180 ctctccagcc acagcccagg ttcaggctcc agcaccactc aaggacagga cgtcactctg 240 gcaccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccttgt ggggacagga tgtgacatcg 300 gtaccagtta ctagaccagc tttaggcagc acagcgccac cggctcatgg cgttacatcg 360 gctcctgaca ctcgaccggc accaggcagc acagcacctc ccgcacacgg tgtaactagc 420 gcgcctgata cacgtcccgc tcccggatct accgctccgc cagcgcacgg agtgacgtca 480 gcaccagata cgaggccagc gcctgctagc actctggtgc acaatggcac atctgccagg 540 gctaccacaa ctccagccag caagagcact ccattctcaa ttccaagcca tcactctgat 600 actcctacca cacttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 660 acggtacctc cactcacctc atccaatcac agcacttctc ctcagttgtc tactggagtc 720 tccttctttt tcctgtcctt tcacatttca aacttgcagt tcaattcttc cctggaagat 780 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgagatgtt cttgcagatt 840 tataaacaag gtggattcct tggcctctct aatattaagt tcaggccagg atctgtggtc 900 gtacagttga ctctggcctt cagagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 960 ttcaatcagt ataagacgga agcagcctca cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1020 gttagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctggag ctggtgtgcc aggctggggc 1080 atcgcgctgc tcgtgttggt ctgtgttctg gttgcactgg ccattgtcta tctcattgcc 1140 ttggctgttt gtcagtgcag acgcaagaac tacggacagc tggacatctt tccagctcgg 1200 gatacctacc atcctatgag cgagtaccct acctaccaca cacatggtcg ctatgtgcca 1260 cctagcagta ccgatcgtag tccctatgag aaagtttctg caggtaatgg tggcagcagt 1320 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttg 1365 <210> 35 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 amino acid from mBN336/mBN373/mBN420 w/o agonist epitopes from WO 2013/103658 <400> 35 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala 100 105 110 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly 165 170 175 Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe 180 185 190 Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His 195 200 205 Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro 210 215 220 Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val 225 230 235 240 Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser 245 250 255 Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp 260 265 270 Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly 275 280 285 Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr 290 295 300 Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile 325 330 335 Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser 340 345 350 Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys 355 360 365 Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys 370 375 380 Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg 385 390 395 400 Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly 405 410 415 Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val 420 425 430 Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 435 440 445 Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 450 455

Claims (196)

  1. 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통한 안정한 재조합형 폭스바이러스로서, 상기 재조합형 폭스바이러스는 MUC1 펩티드를 인코딩하는 제 1 핵산을 포함하며, 이때 상기 제 1 핵산 서열은 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 5를 포함하고, 상기 재조합형 폭스바이러스는 재조합형 폭스바이러스의 연속적 계대를 통하여 안정적인, 재조합형 폭스바이러스.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 a) 및 b)의 존재는 PANVAC와 비교하였을 때, 연속적 계대를 통하여 안정성을 개선시키는, 재조합형 폭스바이러스.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 이때 제1 핵산 서열은 서열 번호:2를 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  7. 청구항 1에 있어서, 암 배아 항원 (CEA)을 인코딩하는 제2의 핵산을 더 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  8. 청구항 7에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 서열 번호:13을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  9. 청구항 7에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 상기 제2 핵산의 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역에 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함하며, 이때 상기 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 정의되는, 재조합형 폭스바이러스: a) 3개 이상의 연속적으로 반복된 G 또는 C 뉴클레오티드 및/또는 b) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 T 뉴클레오티드.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 추가 정의되는, 재조합형 폭스바이러스: a) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 G 뉴클레오티드 및/또는 b) 3개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 C 뉴클레오티드.
  11. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 반복적 뉴클레오티드 영역은 다음과 같이 추가 정의되는, 재조합형 폭스바이러스: (i) 4개 또는 그 이상의 연속적으로 반복된 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 G 또는 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
  12. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 반복적 영역은 다음과 같이 추가 정의되는, 재조합형 폭스바이러스: (i) 4개 또는 그 이상의 연속 G 뉴클레오티드, (ii) 4개 또는 그 이상의 연속 C 뉴클레오티드, 및/또는 (iii) 4개 또는 그 이상의 연속 T 뉴클레오티드.
  13. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 상기 제2 핵산의 상기 반복적 뉴클레오티드 영역에 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 10개 영역에 대하여 적어도 하나의 치환을 함유하는, 재조합형 폭스바이러스.
  14. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 상기 제2 핵산의 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 및/또는 적어도 19개의 반복적 뉴클레오티드 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  15. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 상기 제2 핵산의 19개 영역에 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  16. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 제2 핵산은 서열 번호: 14를 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  17. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 오르소폭스바이러스 및 아비폭스바이러스로부터 선택되는, 재조합형 폭스바이러스.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 오르소폭스바이러스는 백시니아 바이러스인, 재조합형 폭스바이러스.
  19. 청구항 18에 있어서, 이때 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)인, 재조합형 폭스바이러스.
  20. 청구항 19에 있어서, 이때 MVA는 MVA-BN인, 재조합형 폭스바이러스.
  21. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 적어도 계대 3 및/또는 계대 4를 통하여 안정적인, 재조합형 폭스바이러스.
  22. 청구항 17에 있어서, 이때 상기 아비폭스바이러스는 계두 바이러스인, 재조합형 폭스바이러스.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 재조합형 폭스바이러스는 적어도 계대 4를 통하여 안정적인, 재조합형 폭스바이러스.
  24. 삭제
  25. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 폭스바이러스는 하나 또는 그 이상의 공동-자극성 분자들을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 공동-자극성 분자들은 B7-1, ICAM-1, LFA-3, 및 이의 조합들로부터 선택되는, 재조합형 폭스바이러스.
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  28. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 B7-1 핵산은 서열 번호: 15, 16, 또는 17을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  29. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 B7-1 핵산은 서열 번호: 17을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  30. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 B7-1 핵산은 서열 번호:15를 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
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  32. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 ICAM-1 핵산은 서열 번호: 18, 19, 또는 20을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  33. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 ICAM-1 핵산은 서열 번호: 18을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  34. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 ICAM-1 핵산은 서열 번호: 20을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
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  36. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 LFA-3 핵산은 서열 번호: 21, 22, 또는 23을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  37. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 LFA-3 핵산은 서열 번호: 21을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  38. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 LFA-3 핵산은서열 번호: 23을 포함하는, 재조합형 폭스바이러스.
  39. 청구항 1, 4, 6-23, 25, 26, 28-30, 32-34, 및 36-38 중 임의의 한 항에 따른 재조합형 폭스바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  40. 청구항 1, 4, 6-23, 25, 26, 28-30, 32-34, 및 36-38 중 임의의 한 항에 따른 재조합형 폭스바이러스를 포함하는 단리된 숙주 세포.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111918660A (zh) * 2018-01-24 2020-11-10 复诺健生物科技加拿大有限公司 重组病毒疫苗
EP3847246A1 (en) 2018-09-06 2021-07-14 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020256099A1 (ja) * 2019-06-21 2020-12-24 国立大学法人大阪大学 外来遺伝子を安定的に保持する人工組換えｒｎａウイルスの作製方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005046614A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Therion Biologics Corporation System for treating and preventing breast cancer

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5122599A (en) 1986-08-13 1992-06-16 Molecular Diagnostics, Inc. CDNAS coding for members of the carcinoembryonic antigen family
US5766598A (en) 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
AU731860B2 (en) 1996-07-25 2001-04-05 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
AU2002356690B2 (en) 2001-12-04 2008-07-24 Bavarian Nordic A/S Flavivirus NS1 subunit vaccine
GB0212046D0 (en) 2002-05-24 2002-07-03 Glaxo Group Ltd Vaccines
GB0304634D0 (en) 2003-02-28 2003-04-02 Glaxo Group Ltd Vaccines
JP5060134B2 (ja) * 2003-12-12 2012-10-31 ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ・アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー・デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球のエピトープ及びそのＭＵＣ−１の非ＶＮＴＲ（ｎｏｎ−ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）由来のアゴニストエピトープ
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
AU2009319336B2 (en) 2008-11-27 2015-03-26 Bavarian Nordic A/S Promoters for recombinant viral expression
US8394385B2 (en) 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
CA2860599C (en) * 2012-01-03 2021-07-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Native and agonist ctl epitopes of the muc1 tumor antigen
US10111946B2 (en) 2012-06-22 2018-10-30 Bavarian Nordic A/S Poxviral vectors for low antibody response after a first priming immunization
KR20200087880A (ko) 2012-10-28 2020-07-21 버베리안 노딕 에이/에스 강력한 ｔ-세포 및 항체 반응을 위한 ｐｒ13.5 프로모터
EP3412304A3 (en) * 2013-10-23 2019-03-20 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Hla-a24 agonist epitopes of muc1-c oncoprotein and compositions and methods of use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005046614A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Therion Biologics Corporation System for treating and preventing breast cancer

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