PL212047B1 - Zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN i jego pochodna, genom i zawierające je kompozycja farmaceutyczna, zwłaszcza szczepionka oraz ich zastosowania - Google Patents
Zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN i jego pochodna, genom i zawierające je kompozycja farmaceutyczna, zwłaszcza szczepionka oraz ich zastosowaniaInfo
- Publication number
- PL212047B1 PL212047B1 PL361459A PL36145901A PL212047B1 PL 212047 B1 PL212047 B1 PL 212047B1 PL 361459 A PL361459 A PL 361459A PL 36145901 A PL36145901 A PL 36145901A PL 212047 B1 PL212047 B1 PL 212047B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mva
- virus
- derivative
- human
- vaccine
- Prior art date
Links
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 title abstract description 125
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 228
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 70
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 26
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 75
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 70
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 68
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 52
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 45
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 37
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 claims description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 claims description 6
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 claims description 6
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 5
- 201000008873 bone osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 5
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 3
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 17
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 44
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 29
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 23
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 14
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 10
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 9
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 8
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 7
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 7
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 7
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical class C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000779745 Backhousia myrtifolia Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241000725630 Ectromelia virus Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 206010060891 General symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 206010027201 Meningitis aseptic Diseases 0.000 description 1
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000001419 lymphocytic choriomeningitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
- A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy atenuowanego wirusa, wywodzącego od zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara, charakteryzującego się brakiem zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkich liniach komórkowych. W zgłoszeniu opisano rekombinowane wirusy pochodzące od wspomnianego wirusa oraz zastosowanie wirusa lub jego rekombinowanych pochodnych jako leku lub szczepionki. Ponadto, przedstawiono sposób wywołania odpowiedzi immunologicznej, nawet u pacjentów o upośledzonej odporności, pacjentów wykazujących wcześniej odporność na wirus szczepionki lub pacjentów poddanych terapii przeciwwirusowej.
Stan techniki
Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) jest spokrewniony z wirusem krowianki, należącym do rodzaju Orthopoxvirus rodziny Poxviridae. MVA otrzymano w wyniku 516 pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w fibroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa Mayr, A. i wsp., Infection 3,6-14 [1975]). W następstwie tego typu, długotrwałych pasaży, uzyskany wirus MVA utracił około 31 kilozasad z sekwencji genomowej, zatem, został opisany jako silnie specyficzny wobec komórek gospodarza ograniczonych do komórek ptasich (Meyer, H. i wsp., J. Gen.Virol. 72, 1031 -1038 [1991]). Na przykładzie różnych moldeli zwierzęcych wykazano, że otrzymany MVA był silnie wirulentny (Mayr, A. & Danner, K. [1978], Dev.Biol.Stand.41: 225-34). Ponadto, wspomniany szczep MVA poddano próbom klinicznym, stosując go jako szczepionkę do immunizacji przeciwko ospie ludzkiej (Mayr i wsp., Zbl.Bakt.Hyg. I, Abt.Org.B 167,375-390 [1987], Stickl i wsp., Dtsch.med.Wschr.99, 2386-2392 [1974]). Badaniami tymi objęto ponad 120,000 osób, w tym pacjentów grupy wysokiego ryzyka, i stwierdzono, że w porównaniu ze szczepionkami opartymi na krowiance, MVA posiadał zmniejszoną zjadliwość lub zakaźność, natomiast utrzymywał wysoki poziom immunogenności.
W ostatnich latach MVA uzyskiwany był i stosowany jako wektor wirusowy w ekspresji rekombinowanego genu lub jako rekombinowana szczepionka (Sutter, G. i wsp. [1994], Vaccine 12: 1032-40).
W związku z powyższym, zadziwiający jest fakt, że nawet, jeżeli Mayr i wsp. w latach 1970-tych wykazali, że MVA jest silnie atenuowany i awirulentny wobec ludzi i ssaków, na podstawie kilku ostatnich obserwacji (Blanchard i wsp., 1998, J.Gen.Virol. 79, 1159-1167; Carrol & Moss, 1997, Virology 238, 198-211; Altenberger, US Patent 5, 185, 146; Ambrosini i wsp., 1999, J.Neurosci. Res. 55(5), 569) stwierdzono, że MVA nie jest w pełni atenuowany u ludzi i w ludzkich liniach komórkowych, ponieważ w komórkach tych może zachodzić resztkowa replikacja. Podsumowano, że przedstawione we wspomnianych publikacjach wyniki uzyskano z użyciem różnych szczepów MVA, a zatem zastosowano istotnie różne wirusy o odmiennych właściwościach, szczególnie dotyczących wzrostu w różnych liniach komórkowych.
Za wskaźnik atenuacji wirusa uznano właściwości jego wzrostu. Ogólnie, przyjmuje się szczep wirusa za atenuowany, jeżeli utracił on zdolność reproduktywnej replikacji w komórkach gospodarza, lub też zdolność ta została zredukowana. Powyżej wspomniana obserwacja, świadcząca, że MVA nie jest całkowicie pozbawiony zdolności do replikacji u ludzi i w komórkach ssaczych, stawia pod znakiem zapytania całkowite bezpieczeństwo stosowania MVA jako szczepionki dla ludzi lub jako wektora rekombinacyjnych szczepionek.
Szczególnie, niezmiernie ważna w przypadku szczepionki, jak i rekombinowanej szczepionki, jest równowaga pomiędzy skutecznością a bezpieczeństwem wektora wirusowego szczepionki.
Przedmiot wynalazku
Celem wynalazku jest odkrycie nowych szczepów wirusa o zwiększonym bezpieczeństwie, odpowiednich do prowadzenia produkcji bezpiecznych produktów, takich jak szczepionki lub leki. Ponadto, kolejnym celem jest zapewnienie środków do udoskonalania istniejących systemów szczepienia.
Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN zdeponowanego w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ECACC), Salisbury (UK), pod numerem V00083008, charakteryzujący się tym, że:
(i) jest zdolny do reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionu kurcząt (CEF) oraz w linii komórek nerki młodego chomika BHK i jest niezdolny do reproduktywnej replikacji w liniach komórek ludzkich, (ii) jest niezdolny do replikacji in vivo w organizmie myszy o silnie upośledzonej odporności.
Korzystnie, linie komórek ludzkich stanowią: linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka kości
143B, ludzka linia komórkowa keratynocytów HaCat oraz linia komórkowa ludzkiego gruczolakoraka szyjki macicy HeLa. Korzystnie, mysz o silnie upośledzonej odporności jest niezdolna do produkcji
PL 212 047 B1 dojrzałych komórek B i T. Korzystnie, mysz o silnie upośledzonej odporności jest transgeniczną myszą AGR129. Korzystnie Wirus MVA-BN lub jego pochodna według wynalazku charakteryzuje się tym, że został on oczyszczony jako klon. Równie korzystnie, zawiera przynajmniej jedną sekwencję heterologicznego kwasu nukleinowego. Korzystnie, wspomniana sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego wybrana jest z sekwencji kodujących przynajmniej jeden antygen, epitop antygenowy i/lub składnik terapeutyczny. Korzystnie epitopy antygenowe pochodzą z wirusa grypy, z wirusów wybranych z rodziny Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis - wirusów opryszczki, ludzkiego wirusa braku odporności lub z wirusów powodujących gorączkę krwotoczną. Korzystnie sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego jest genem nef.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest genom określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodnej według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku i/lub genom według wynalazku określony powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik i/lub substancję dodatkową.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka charakteryzująca się tym, że zawiera określonego powyżej wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku i/lub genom według wynalazku określony powyżej.
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna lub szczepionka według wynalazku zawierają przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej.
Korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według wynalazku są przeznaczone do oddziaływania na, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej w organizmie żywego zwierzęcia lub człowieka.
Równie korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według wynalazku są przeznaczone do szczepienia zwierzęcia lub człowieka przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy. W szczególności, chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna, natomiast zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność lub istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Zgodnie z kolejnym wariantem wynalazku, zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej, przy czym korzystnie terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową.
Równie korzystnie określone powyżej: wirus MVA-BN lub jego pochodna, lub genom są przeznaczone do wprowadzania homologicznej lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórek docelowych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie określonych powyżej: wirusa MVA-BN lub jego pochodnej i/lub genomu według wynalazku do wytwarzania leku lub szczepionki. Korzystnie lek lub szczepionka są przeznaczone do podawania w celu wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia lub człowieka. Równie korzystnie, lek lub szczepionka są przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy, przy czym w szczególności chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna. Równie korzystnie lek lub szczepionka zawiera przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej, przy czym w szczególności wirus MVA-BN lub jego pochodna są przeznaczone do wytwarzania leku do podawania w terapeutycznie skutecznych ilościach w pierwszym szczepieniu („szczepienie podstawowe”) i w drugim szczepieniu („szczepienie przypominające”). W szczególności zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność lub istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Korzystnie zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej, przy czym szczególnie korzystnie terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową.
Korzystnie wirus MVA-BN lub jego pochodna według wynalazku określone powyżej są przeznaczone jako adiuwant.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej według wynalazku określonych powyżej jako adiuwanta.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzenia sekwencji homologicznego i/lub heterologicznego kwasu nukleinowego do komórek docelowych in vitro charakteryzujący się tym, że obejmuje infekcję komórek docelowych wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej albo transfekcję komórki docelowej genomem według wynalazku określonym powyżej.
PL 212 047 B1
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania peptydu lub białka charakteryzujący się tym, że obejmuje
a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej,
b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz
c) izolację i/lub wzbogacenie peptydu i/lub białka wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wirusa MVA-BN lub jego pochodnej charakteryzujący się tym, że obejmuj e
a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określonych powyżej,
b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz
c) izolację i/lub wzbogacenie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka, korzystnie komórka ludzka, charakteryzująca się tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określone powyżej albo genom według wynalazku określony powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do szczepienia podstawowego/przypominającego charakteryzujący się tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną według wynalazku określone powyżej, kompozycję według wynalazku określoną powyżej, szczepionkę według wynalazku określoną powyżej do pierwszego szczepienia („szczepienia podstawowego”) w pierwszej fiolce/pojemniku i do drugiego szczepienia („szczepienia przypominającego”) w drugiej fiolce/pojemniku.
Szczegółowy opis korzystnych realizacji wynalazku
W celu osiągnięcia wspomnianych celów opisano nowe wirusy krowianki, zdolne do reproduktywnej replikacji w innych niż ludzkie komórkach i liniach komórkowych, szczególnie w fibroblastach embrionu kurcząt (CEF) i linii komórek nerki młodego chomika BHK (ECACC 85011433), lecz nie wykazujące zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkich liniach komórkowych.
Znane szczepy krowianki ulegają reproduktywnej replikacji w przynajmniej kilku ludzkich liniach komórkowych, szczególnie linii komórkowej ludzkich keratynocytów HaCat (Boukamp i wsp., 1988, J.Cell Biol. 106 (3): 761-71). Przypuszcza się, że replikacja w linii komórkowej HaCat zachodzi in vivo, szczególnie w przypadku replikacji in vivo u ludzi. W istocie, w części zawierającej przykłady wykazano, że wszystkie testowane, znane szczepy krowianki, które wykazują szczątkową replikację produktywną w HaCat również replikują in vivo. Zatem, korzystna realizacja wynalazku dotyczy wirusów krowianki, które nie ulegają reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórek HaCat. Szczególnie korzystna realizacja wynalazku związana jest ze szczepami wirusa krowianki nie zdolnymi do reproduktywnej replikacji w żadnej z następujących ludzkich linii komórkowych: ludzka linia komórek gruczolakoraka szyjki macicy HeLa (ATCC Nr CCL-2), ludzka linia komórek nerki embrionu 293 (ECACC Nr 85120602), ludzka linia komórkowa kostniakomięsaka kości 143B (ECACC Nr 91112502) i linia komórkowa HaCat.
Wzrost lub amplifikacja/replikacja wirusa wyrażane są zazwyczaj przez stosunek wirusa otrzymanego z zainfekowanej komórki (ilość otrzymana) do ilości pierwotnie użytej w pierwszym miejscu do infekcji komórek (ilość dostarczona) („stosunek amplifikacji”). Stosunek „1” między wartością otrzymaną a dostarczoną definiuje poziom amplifikacji, dla którego ilość otrzymanego z zainfekowanych komórek wirusa jest taka sama jak ilość użyta początkowo do infekcji komórek. Stan ten świadczy o tym, że zainfekowane komórki są podatne na infekcję wirusową i reprodukcję wirusa.
Stosunek amplifikacji mniejszy od 1, tj. obniżenie amplifikacji poniżej poziomu wartości dostarczonej jest wskaźnikiem braku replikacji reproduktywnej, a zatem, wskazuje na atenuację wirusa.
Zatem, szczególnie interesujące dla Wynalazców było zidentyfikowanie i ostatecznie, wyizolowanie szczepu, wykazującego stosunek amplifikacji mniejszy niż 1 w kilku ludzkich liniach komórkowych, szczególnie we wszystkich liniach komórkowych 143B, HeLa, 293 i HaCat.
Zatem, sformułowanie „niezdolny do reproduktywnej replikacji” oznacza, że wirus według wynalazku wykazuje stosunek amplifikacji mniejszy od 1 w ludzkich liniach komórkowych, takich jak linie komórkowe: 293 (ECACC Nr 85120602), 143B (ECACC Nr 9112502), HeLa (ATCC Nr CCL-2) oraz
HaCat (Boukamp i wsp., 1988, J.Cell Biol. 106 (3): 761-71), w warunkach przedstawionych w przykładzie 1 niniejszego opisu dla kilku specyficznych szczepów MVA. Korzystnie, stosunek amplifikacji
PL 212 047 B1 wirusa według wynalazku wynosi 0.8 lub mniej, w każdej z powyższych ludzkich linii komórkowych HeLa, HaCat czy 143B.
Wykazano szczegółowo w Przykładzie 1 oraz Tabeli 1, że wirusy stanowiące korzystną realizację niniejszego wynalazku nie ulegają reproduktywnej replikacji w żadnej z linii komórek 143B, HeLa czy HaCat.
Szczep stanowiący szczególną realizację niniejszego wynalazku, zastosowany w przykładach, został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych pod numerem V00083008. Szczep ten nazwano w opisie „MVA-BN”.
Znane szczepy MVA wykazują szczątkową replikację w przynajmniej jednej z badanych ludzkich linii komórkowych (Figura 1, Przykład 1). Wszystkie znane szczepy krowianki ulegają, przynajmniej w pewnym stopniu, replikacji w linii komórkowej HaCat, natomiast szczepy MVA ujawnione w wynalazku, szczególnie MVA-BN, nie podlegają produktywnej replikacji w komórkach HaCat. Bardziej szczegółowo, MVA-BN wykazuje stosunek amplifikacji 0.05 do 0.2 w ludzkiej linii komórek nerki embrionu 293 (ECACC Nr 85120602). W ludzkiej linii komórek kostniakomięsaka kości 143B (ECACC Nr 91112502) stosunek obejmuje przedział 0.0 do 0.6. W przypadku ludzkiej linii komórek gruczolakoraka szyjki macicy HeLa (ATCC Nr CCL-2) i ludzkiej linii komórek keratynocytów HaCat (Boukamp i wsp. 1988, J.Cell Biol.-106 (3): 761-71) stosunek amplifikacji mieści się w zakresie, odpowiednio, 0.04 do 0.8 i 0.02 do 0.8. MVA-BN wykazywał stosunek amplifikacji 0.01 do 0.06 w komórkach nerki afrykańskiej małpy zielonej (CV1:ATTC Nr CCL-70). Zatem, MVA-BN, który jest prototypowym szczepem według wynalazku, nie replikuje produktywnie w żadnej z testowanych linii komórek ludzkich.
Stosunek amplifikacji dla MVA-BN jest ewidentnie wyższy od 1 w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF: hodowle podstawowe) lub w linii komórek nerki chomika BHK (ATTC Nr CRL-1632). Jak podkreślono wyżej, stosunek większy niż 1 wskazuje na replikację reproduktywną, ze względu na to, że ilość wirusa otrzymanego z zainfekowanych komórek jest większa niż ilość wirusa użyta do zainfekowania komórek. Zatem, wirus może być łatwo propagowany i powielany (amplifikowany) w hodowlach podstawowych CEF przy stosunku wyższym niż 500, lub też w komórkach BHK przy stosunku wyższym niż 50.
W szczególnej realizacji niniejszego wynalazku, wynalazek ujawnia pochodne wirusa, zdeponowanego pod numerem ECACC V0083008. „Pochodne” wirusa zdeponowanego pod numerem ECACC V00083008 odnoszą się do wirusów wykazujących istotnie takie same właściwości replikacyjne jak zdeponowany szczep, lecz charakteryzujące się różnicami w jednej lub kilku częściach swojego genomu. Wirusy, posiadające takie same „właściwości replikacyjne” jak zdeponowany wirus, są wirusami ulegającymi replikacji w podobnym stosunku replikacji jak zdeponowany szczep, w komórkach CEF i linii komórkowej BHK, HeLa, HaCat oraz 143B i ulegającymi replikacji in vivo podobnej do określonej w modelu transgenicznej myszy AGR129 (patrz, poniżej).
W korzystnej realizacji, szczepy wirusa krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, charakteryzują się brakiem replikacji in vivo. W rozumieniu niniejszego wynalazku „brak replikacji in vivo” odnosi się do wirusów nie ulegających replikacji u ludzi i w mysim modelu, omówionym niżej. „Brak replikacji in vivo” może być korzystnie określony u myszy, niezdolnych do produkowania dojrzałych komórek B i T. Przykładem takiej myszy jest model transgenicznej myszy AGR129 (otrzymany z Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Szwajcaria).
Wspomniany szczep myszy posiada ukierunkowane uszkodzenia genów w genie receptora IFN I typu (IFN-α/β) i typu II (IFN-γ) oraz w RAG. Z powodu wspomnianych uszkodzeń, myszy te nie posiadają układu IFN i nie są zdolne do produkowania dojrzałych komórek B i T, i jako takie, wykazują poważne upośledzenie odporności i dużą wrażliwość wobec replikującego wirusa. Zamiast myszy
AGR129, możliwe jest zastosowanie jakiegokolwiek innego szczepu myszy, niezdolnego do produkcji dojrzałych komórek B i T, a zatem o silnie upośledzonej odporności i wysoko podatnego wobec replikującego wirusa. W szczególności, wirusy ujawnione w wynalazku nie zabijają myszy AGR129 w okresie przynajmniej 45 dni, korzystniej, przynajmniej 60 dni, najkorzystniej 90 dni po infekcji myszy dawką 107 pfu wirusa, podawaną dootrzewnowe. Korzystnie, wirusy wykazujące „brak replikacji in vivo” charakteryzują się ponadto tym, że nie jest możliwe uzyskanie żadnego wirusa z narządów lub tkanek myszy AGR129 po 45 dniach, korzystnie 60 dniach i najkorzystniej 90 dniach po infekcji myszy dawką 107 pfu wirusa podaną dootrzewnowe. Szczegółowe informacje na temat badań obejmujących infekcję myszy AGR129 i analiz, zastosowanych do określenia czy możliwe jest uzyskanie wirusa z narządów i tkanek zainfekowanej myszy, zamieszczono w części zawierającej przykłady.
PL 212 047 B1
W korzystnej realizacji, szczepy wirusa krowianki, w szczególności MVA-BN i jego pochodne, charakteryzują się wyższą immunogennością w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575, określoną na podstawie analizy mysiego modelu letalnej infekcji.
Szczegóły wspomnianego eksperymentu przedstawiono w zamieszczonym poniżej przykładzie 2. W skrócie, w modelu tym, niezaszczepione myszy umierają po zainfekowaniu replikacyjnie kompetentnymi szczepami krowianki, takimi jak szczep Western Reserve L929 TK+ lub IHD-J. Infekcja replikacyjnie kompetentnymi wirusami krowianki określana jest jako „infekcja” w odniesieniu do modelu infekcji letalnej. Cztery dni po infekcji, myszy zazwyczaj uśmiercano i określano miano wirusa w jajnikach przy użyciu standardowej metody płytkowej (analiza łysinek) z wykorzystaniem komórek VERO (więcej szczegółów zamieszczono w części zawierającej przykłady). Określano miano wirusa dla niezaszczepionych myszy i dla myszy szczepionych wirusami krowianki stanowiącymi realizację wynalazku. Bardziej szczegółowo, wirusy według wynalazku charakteryzują się w tym teście, tym, że 2 po szczepieniu 102 TCID50/ml wirusa według wynalazku, miano wirusa w jajnikach zostało zredukowane o przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80%, bardziej korzystnie przynajmniej 90% w porównaniu z myszami niezaszczepionymi.
W korzystnej realizacji, wirusy krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, są użyteczne w immunizacji przy podaniu podstawowym/przypominającym szczepionki. Istnieją liczne raporty, wskazujące, że system szczepienia podstawowego/przypominającego z zastosowaniem MVA jako wektora dostarczającego indukuje niską odpowiedź immunologiczną i jest gorszy od systemu obejmującego szczepienie podstawowe DNA i przypominające MVA (Schneider i wsp., 1998, Nat.Med.4; 397-402). We wszystkich tych badaniach zastosowane szczepy MVA były odmienne od wirusów krowianki według niniejszego wynalazku. W celu wyjaśnienia słabej odpowiedzi immunologicznej, w przypadku zastosowania MVA w podaniu podstawowym i przypominającym, przypuszczano, że wyprodukowane przy podstawowym podaniu przeciwciała wobec MVA neutralizowały MVA podane podczas drugiej immunizacji, uniemożliwiając skuteczne wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej. Przeciwnie, doniesiono, że system szczepienia podstawowego DNA/przypominającego MVA był lepszy w generowaniu silnej odpowiedzi, ponieważ system ten łączył zdolność DNA do skutecznej podstawowej odpowiedzi immunologicznej z właściwościami MVA do wzmocnienia tej odpowiedzi przy braku istniejącej wcześniej odporności na MVA. Innymi słowy, jeżeli istniejąca wcześniej odporność na MVA i/lub krowiankę zapobiega wzmocnieniu odpowiedzi immunologicznej, zastosowanie MVA jako szczepionki lub leku może mieć ograniczoną skuteczność, szczególnie w przypadku zaszczepionych przeciwko ospie. Jednakże, zgodnie z kolejną realizacją, wirus krowianki, szczególnie MVA-BN i jego pochodne, jak również odpowiadające im wirusy rekombinowane posiadające sekwencje heterologiczne, mogą być zastosowane do uzyskania skutecznej podstawowej, a następnie przypominającej (wzmacniającej) odpowiedzi immunologicznej u natywnych zwierząt, jak i zwierząt posiadających istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy. Zatem, ujawniony wirus krowianki indukuje przynajmniej istotnie ten sam poziom odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, w porównaniu z systemem szczepienia podstawowego DNA/przypominającego wirusem krowianki.
Przyjęto, że wirus krowianki powoduje indukcję przynajmniej istotnie tego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego DNA/przypominającego wirusem krowianki, jeżeli odpowiedź CTL, mierzona w jednej z dwóch poniższych analiz („analizie 1” i „analizie 2”), korzystnie w obu analizach, jest przynajmniej taka sama w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego z użyciem DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Korzystniej, odpowiedź CTL po podaniu szczepienia podstawowego z wirusem krowianki/przypominającego z wirusem krowianki jest wyższa w przynajmniej jednej z analiz, od uzyskanej w systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki. Najkorzystniej, odpowiedź CTL jest wyższa w obu następujących analizach.
Analiza 1: W celu szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, 6-8 tygodniowe myszy BALB/c (H-2d) immunizowano wstępnie poprzez dożylne podanie 107 TCID50 wirusa krowianki stanowiącego korzystną realizację wynalazku, ekspresjonującego politop murynowy, zgodnie z opisem Thomson i wsp., 1988, J.Immunol.160, 1717 oraz poddawano immunizacji przypominającej stosując taką samą dawkę wirusa, podawaną w taki sam sposób trzy tygodnie później. W tym celu niezbędne było otrzymanie rekombinowanego wirusa krowianki ekspresjonującego wspomniany politop. Sposoby uzyskiwania rekombinowanych wirusów są znane specjalistom
PL 212 047 B1 w dziedzinie i zostały przedstawione szczegółowo poniżej. W systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki, szczepienie podstawowe dokonywane jest drogą domięśniowego wstrzyknięcia myszy 50 pg DNA ekspresjonującego taki sam antygen jak wirus krowianki; podanie przypominające wirusa krowianki następuje dokładnie taką samą drogą jak podawanie podstawowe wirusa krowianki/przypominające wirusa krowianki.
Plazmid DNA ekspresjonujący politop został również opisany w załączonej tytułem referencji publikacji wg Thomson i wsp. W obu systemach, rozwinięcie odpowiedzi immunologicznej CTL na epitopy SYIPSAEKI, RPQASGVYM i/lub YPHFMPTNL określane jest dwa tygodnie po podaniu przypominającym. Określenie odpowiedzi CTL jest korzystnie dokonywane przy użyciu analizy ELISPOT, opisanej przez Schneider i wsp., 1998, Nat.Med.4, 397-402, jak podkreślono poniżej, w części zawierającej przykłady, i dla jednego specyficznego wirusa według niniejszego wynalazku. Wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku charakteryzował się w eksperymencie, tym, że odpowiedź immunologiczna, oceniana na podstawie ilości komórek produkujących IFN-y/106 komórek śledziony (patrz również część eksperymentalna), wobec wspomnianych powyżej epitopów, indukowana podaniem podstawowym wirusa krowianki/przypominającym wirusa krowianki była istotnie taka sama, korzystnie przynajmniej taka sama, jak indukowana przez podanie podstawowe DNA/przypominające wirusa krowianki.
Analiza 2: Analiza ta częściowo odpowiada analizie 1. Jednakże, zamiast zastosowania podawania i.v. 107 TCID50 wirusa krowianki, jak w analizie 1, w 2 analizie, podawane jest podskórnie w podstawowej immunizacji i w immunizacji przypominającej 108 TCID50 wirusa krowianki stanowiącego przykładową realizację wynalazku. Wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku, charakteryzował się omawianym w eksperymencie tym, że odpowiedź immunologiczna CTL na wymienione powyżej epitopy, indukowana przez podanie podstawowe wirusa krowianki/przypominające wirusa krowianki była istotnie taka sama, korzystnie, przynajmniej taka sama, jak indukowana przez podanie podstawowe z DNA/przypominające z wirusem krowianki. Odpowiedź oceniana była na podstawie ilości komórek produkujących IFN-y/106 komórek śledziony (patrz, również część eksperymentalna).
Siła odpowiedzi CTL, mierzona w jednej z przedstawionych wyżej analiz odpowiadała poziomowi ochrony. Zatem, wirusy według wynalazku są szczególnie odpowiednie do zastosowania w szczepieniu. Reasumując, wirus krowianki stanowiącego przykładową realizację wynalazku charakteryzuje się posiadaniem przynajmniej jednej z następujących właściwości:
(i) zdolność reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF) oraz w linii komórkowej BHK, lecz przy tym brak zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórkowej HaCat, (ii) brak replikacji in vivo, (iii) indukcja wyższej immunogenności w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575 (ECACC V00120707) w modelu letalnej infekcji i/lub (iv) indukcja przynajmniej istotnie takiego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w systemie szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki.
Korzystnie, wirus krowianki stanowiący przykładową realizację wynalazku posiada przynajmniej dwie z wyżej wymienionych cech, korzystniej przynajmniej trzy z wyżej wymienionych cech. Najkorzystniej, wirusy krowianki posiadają wszystkie wyżej wymienione cechy. W kolejnej realizacji, wynalazek dotyczy zestawu do szczepienia, obejmującego wirus według niniejszego wynalazku do pierwszego szczepienia („podstawowego”) w pierwszej fiolce/pojemniku oraz do drugiego szczepienia („przypominającego”) w drugiej fiolce/pojemniku. Wirus może być nierekombinowanym wirusem krowianki, tj. wirusem krowianki nie zawierającym heterologicznych sekwencji nukleotydów. Przykładem takiego wirusa krowianki jest MVA-BN i jego pochodne. Alternatywnie, wirus może być rekombinowanym wirusem krowianki, zawierającym dodatkowe sekwencje nukleotydowe, heterologiczne dla wirusa krowianki. Jak podkreślono w każdej z części opisu, sekwencje heterologiczne mogą kodować epitopy, które indukują odpowiedź układu odpornościowego. Zatem, możliwe jest zastosowanie rekombinowanego wirusa krowianki do szczepienia przeciwko białkom lub czynnikom obejmującym wspomniany epitop. Wirusy mogą być otrzymywane zgodnie ze szczegółowym opisem zamieszczonym poniżej. Ilość wirusa, która może być użyta do każdego szczepienia została zdefiniowana powyżej.
Dla specjalistów w dziedzinie oczywiste jest uzyskanie wirusów krowianki posiadających przynajmniej jedną z następujących właściwości:
PL 212 047 B1
- zdolność reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (CEF) oraz w linii komórek nerki młodych chomików BHK, lecz jednoczesny brak zdolności reproduktywnej replikacji w ludzkiej linii komórkowej keratynocytów HaCat,
- brak replikacji in vivo,
- indukcja wyższej immunogenności w porównaniu ze znanym szczepem MVA 575 (ECACC V00120707) w modelu infekcji letalnej oraz/lub
- indukcja przynajmniej istotnie takiego samego poziomu odporności w systemie szczepienia podstawowego wirusem krowianki/przypominającego wirusem krowianki, jak w przypadku systemu szczepienia podstawowego z DNA/przypominającego z wirusem krowianki.
Proces otrzymywania takiego wirusa może obejmować następujące etapy:
(i) wprowadzenie znanego szczepu wirusa krowianki, korzystnie MVA 574 lub MVA 575 (ECACC V00120707) do innych niż ludzkie komórek, w których wirus jest w stanie ulegać reproduktywnej replikacji, przy czym różne niż ludzkie komórki są korzystnie wybrane spośród komórek CEF i linii komórek BHK, (ii) izolacja/wzbogacenie cząsteczek wirusa z tych komórek i (iii) analiza pozwalająca na określenie czy uzyskany tak wirus posiada przynajmniej jedną ze zdefiniowanych powyżej, pożądanych właściwości biologicznych, przy czym powyższe etapy mogą być dowolnie powtarzane, aż do momentu otrzymania wirusa o pożądanych cechach replikacyjnych. Wynalazek dotyczy ponadto wirusów otrzymanych w wyniku metody według niniejszego wynalazku. Sposoby określania pożądanych właściwości biologicznych zostały wyjaśnione w kolejnych częściach niniejszego opisu.
Stosując wspomnianą metodę Wynalazcy zidentyfikowali i wyizolowali w kilku etapach oczyszczania klonu szczep stanowiący przykładową realizację wynalazku, poczynając od pasażu izolatu MVA 575 (MVA 575). Otrzymany w ten sposób nowy szczep odpowiada wspomnianemu uprzednio szczepowi o numerze przyjęcia ECACC V0083008.
Właściwości wzrostu wirusów krowianki stanowiących przykładową realizację niniejszego wynalazku, szczególnie wzrost MVA-BN, wskazuje, że szczepy te są znacznie lepsze od jakichkolwiek innych, dotychczas scharakteryzowanych izolatów MVA pod względem atenuacji w ludzkich liniach komórkowych i braku replikacji in vivo. Szczepy te są, zatem, idealnymi kandydatami do rozwijania bezpiecznych produktów, takich jak szczepionki lub leki, co zostanie opisane poniżej w dalszej części wynalazku.
W jednej z realizacji, wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku, w szczególności MVA-BN i jego pochodne, zastosowany został jako szczepionka przeciwko chorobie wywołanej przez wirusa ospy ludzkiej, takiej jak ospa. W kolejnej realizacji, wirus stanowiący przykładową realizację wynalazku może być rekombinowany, tj., może ekspresjonować geny heterologiczne, jak, np., antygeny lub epitopy heterologiczne dla wirusa, a zatem może być użyteczny jako szczepionka do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko heterologicznym antygenom lub epitopom.
Termin „odpowiedź immunologiczna” oznacza reakcję układu immunologicznego, na obcą substancję lub mikroorganizm, który dostał się do organizmu. Zgodnie z definicją, odpowiedź immunologiczna jest podzielona na reakcję swoistą i nieswoistą, jednakże obie reakcje są ściśle powiązane. Nieswoista odpowiedź immunologiczna jest natychmiastową obroną przeciwko szerokiemu spektrum obcych substancji i czynników infekcyjnych. Swoista odpowiedź immunologiczna jest obroną wzbudzoną po fazie lag, gdy organizm jest zainfekowany substancją po raz pierwszy.
Swoista odpowiedź immunologiczna jest bardzo skuteczna i odpowiada za fakt ochrony przed specyficzną infekcją osobnika po przebyciu swoistej infekcji. Zatem, druga infekcja tym samym lub bardzo podobnym czynnikiem infekcyjnym, powoduje znacznie bardziej łagodne symptomy lub ich całkowity brak, ze względu na już „istniejącą wcześniej odporność” na ten czynnik. Taka odpowiednio, odporność i pamięć immunologiczna pozostaje przez dłuższy czas, w pewnych przypadkach nawet przez całe życie. Zgodnie z powyższym, indukcja pamięci immunologicznej może być użyta i zastosowana w szczepieniach.
„Układ immunologiczny” oznacza złożony organ, włączony w odpowiedź organizmu przeciwko obcym substancjom i mikroorganizmom. Układ immunologiczny obejmuje część komórkową, zawierającą kilka typów komórek, takich jak, np., limfocyty i inne komórki pochodzące z komórek białych krwinek oraz humoralną część, zawierającą małe peptydy i czynniki dopełniacza.
„Szczepienie” oznacza, że organizm jest wzbudzany czynnikiem infekcyjnym, np., w atenuowanej lub inaktywowanej postaci wspomnianego czynnika infekcyjnego, w celu indukcji odporności swoistej.
PL 212 047 B1
Termin szczepienie odnosi się również do wzbudzenia organizmu rekombinowanymi wirusami krowianki według niniejszego wynalazku, w szczególności rekombinowanym MVA-BN i jego pochodnymi, ekspresjonującymi antygeny lub epitopy, heterologiczne dla wirusa. Przykłady takich epitopów podano w pozostałej części opisu, obejmują one, np., epitopy z białek pochodzących od innych wirusów, takich jak wirus Dengue, wirusa zapalenia wątroby C, HIV lub epitopów pochodzących z białek włączonych w rozwój guzów i nowotworów. Po podaniu rekombinowanego wirusa krowianki, w organizmie ekspresjonowane są epitopy prezentowane układowi immunologicznemu i może być indukowana swoista odpowiedź immunologiczna przeciwko tym epitopom. Organizm, zatem, jest immunizowany przeciwko czynnikowi/białku zawierającemu kodowany przez rekombinowany wirus krowianki epitop.
„Odporność” oznacza częściową lub całkowitą ochronę organizmu przeciwko chorobie wywołanej przez czynnik infekcyjny, uzyskaną poprzez skuteczną eliminację postępującej infekcji wywołanej przez wspomniany czynnik infekcyjny lub jego charakterystyczną część. Odporność opiera się na istnieniu, indukcji i aktywacji wyspecjalizowanych komórek układu immunologicznego.
Jak wspomniano wyżej, w jednej z realizacji wynalazku, rekombinowane wirusy stanowiącego przykładową realizację wynalazku, w szczególności rekombinowany MVA-BN i jego pochodne, zawierają przynajmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego. Termin „heterologiczny” stosowany jest tu dla jakiejkolwiek kombinacji sekwencji kwasu nukleinowego, która nie występuje w wirusie w naturze. Tego typu wirus jest również zwany „wirusem rekombinowanym”.
Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencje heterologiczne są korzystnie epitopami antygenów, wybranymi z jakiegokolwiek źródła innego niż krowianka. Najkorzystniej, wspomniany rekombinowany wirus ekspresjonuje jeden lub więcej antygenowych epitopów z Plasmodium falciparum, Mycobacteria, wirusa grypy, z wirusów wybranych z rodziny Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis - wirusów opryszczki, ludzkiego wirusa braku odporności lub z wirusów powodujących gorączkę krwotoczną, takich jak Hantavirus lub Filovirus, tj., wirus Ebola lub Marburg.
Według jeszcze innej realizacji, lecz również w nawiązaniu do wspomnianej wyżej selekcji epitopów antygenowych, sekwencje heterologiczne mogą zostać wybrane z innego źródła wirusów ospy lub krowianki. Takie sekwencje wirusowe mogą być zastosowane do modyfikacji spektrum gospodarza lub immunogenności wirusa.
W innej realizacji wirus według wynalazku może kodować heterologiczny gen/kwas nukleinowy ekspresjonujący składnik terapeutyczny. „Składnik terapeutyczny” kodowany przez heterologiczny kwas nukleinowy w wirusie może być, np., terapeutycznym kwasem nukleinowym, takim jak antysensowny kwas nukleinowy lub peptyd lub białko o pożądanej aktywności biologicznej.
Według kolejnej, korzystnej realizacji, ekspresja sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jest korzystnie, lecz nie wyłącznie, pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy, korzystniej, promotora wirusa krowianki.
Zgodnie z jeszcze inną realizacją, insercja sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jest dokonywana korzystnie w nieistotnym regionie genomu wirusa. W innej realizacji wynalazku, sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego wstawiana jest w występującym naturalnie miejscu delecji genomu wirusa MVA (ujawnionym w PCT/EP96/02926). Sposoby insercji sekwencji heterologicznych do genomu wirusa ospy znane są specjalistom w dziedzinie.
Według kolejnej, korzystnej realizacji, wynalazek dotyczy również genomu wirusa, jego rekombinantów lub części funkcjonalnych. Takie sekwencje wirusowe mogą być użyte do identyfikacji lub izolacji wirusa lub jego rekombinantów, np., poprzez zastosowane PCR, technik hybrydyzacyjnych lub analizy ELISA. Ponadto, takie sekwencje wirusowe mogą być ekspresjonowane z wektora ekspresji w celu uzyskania kodowanych białek lub peptydów, które następnie mogą uzupełniać mutanty delecyjne wirusa, nie posiadające sekwencji wirusowej zawartej w wektorze ekspresji.
Rekombinowany wirus według niniejszego wynalazku może być wykorzystany do wprowadzenia sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki docelowej, wspomniana sekwencja może być homologiczna lub heterologiczną dla komórki docelowej. Wprowadzenie sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki docelowej może mieć na celu uzyskanie heterologicznych peptydów lub polipeptydów i/lub całkowitych wirusów kodowanych przez tą sekwencję in vitro. Sposób ten obejmuje infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA, hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz izolację i/lub wzbogacenie peptydu, białka i/lub wirusa wyprodukowanego przez wspomniane komórki gospodarza.
Ponadto, sposób wprowadzenia homologicznej lub heterologicznej sekwencji do komórek może być zastosowany w terapii in vitro i korzystnie in vivo. W przypadku terapii in vitro, wyizolowane
PL 212 047 B1 komórki, które wcześniej (ex vivo) zainfekowano wirusem, podawane są żywemu zwierzęciu w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. W terapii in vivo, wirus lub jego rekombinanty są podawane bezpośrednio do organizmu żywego zwierzęcia w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. W tym przypadku, komórki otaczające miejsce inokulacji są bezpośrednio infekowane in vivo przez wirusa lub jego rekombinantów według wynalazku.
Ze względu na to, że wirus według wynalazku ma silnie ograniczony wzrost w komórkach ludzkich i małpich, a zatem jest silnie atenuowany, jest idealny do traktowania nim szerokiego spektrum ssaków, włączając ludzi. Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje również kompozycję farmaceutyczną i szczepionkę, np., do indukcji odpowiedzi immunologicznej w żywym organizmie zwierzęcia, włączając ludzi. Wirus według wynalazku jest ponadto bezpieczny w zastosowaniu w jakiejkolwiek innej terapii genowej.
Kompozycja farmaceutyczna może ogólnie obejmować jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych i/lub zalecanych nośników, dodatków, antybiotyków, konserwantów, adiuwantów, rozcieńczalników i/lub substancji stabilizujących. Taką substancją może być woda, solanka, glicerol, etanol, czynniki nawilżające lub emulsyfikatory, substancje buforujące pH itp. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj duże, wolno metabolizowane cząsteczki, tak jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, agregaty lipidowe itp.
W celu przygotowania szczepionki, wirus lub jego rekombinanty według wynalazku są zamieniane w fizjologicznie przyswajaną postać. Może to być dokonane w oparciu o doświadczenie w otrzymywaniu szczepionek wirusa ospy, stosowanych w szczepieniu przeciwko ospie (wg opisu Stickl, H i wsp. [1974] Dtsch.med.Wschr. 99, 2386-2392). Na przykład, oczyszczony wirus przechowywany jest w -80°C, o mianie 5x108 TCID50/ml, przygotowany w około 10 mM Tris, 140 mM NaCl, w pH 7.4. Do przygotowania dawki szczepionki, np., 102-108 cząsteczek wirusa jest liofilizowanych w 100 ml buforowanej fosforanem solanki (PBS), w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy w ampułkach, korzystnie w szklanych ampułkach. Alternatywnie, dawka szczepionki może być otrzymana w wyniku stopniowego zamrażania-suszenia wirusa w formulacji. Formulacja ta może zawierać dodatkowe składniki, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicynę, laktozę lub poliwinylopirolidon lub inne dodatki, takie jak przeciwutleniacze lub obojętny gaz, stabilizatory lub białka rekombinowane (np., ludzka albumina krwi), odpowiednie do podawania in vivo. Szklane ampułki są następnie zamykane i mogą być przechowywane między 4°C a temperaturą pokojową przez kilka miesięcy. Jednakże, dopóki nie ma żadnej potrzeby, ampułka przechowywana jest korzystnie w temperaturze poniżej -20°C.
Do szczepienia lub leczenia, liofilizat może być rozpuszczony w 0.1 do 0.5 ml wodnego roztworu, korzystnie roztworu soli fizjologicznej lub buforze Tris i podawany układowo lub miejscowo, tj., pozajelitowe, domięśniowo lub jakąkolwiek inną drogą podawania znaną specjalistom w dziedzinie. Sposób podawania, dawka i ilość podawania może być optymalnie dobrana przez specjalistów w dziedzinie, w powszechnie znany sposób.
Ponadto, według kolejnej realizacji, wirus według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczny w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u zwierząt o upośledzonej odporności, np., małp (CD4<400 μΐ krwi) zainfekowanych SIV lub ludzi z niedoborem odporności. Termin „upośledzenie (niedobór) odporności” oznacza stan układu immunologicznego osobnika, wykazujący jedynie niepełną odpowiedź immunologiczną lub posiadający obniżoną skuteczność obrony przeciwko czynnikom infekcyjnym. Bardzo interesujące jest odkrycie, według innej realizacji, że wirus według niniejszego wynalazku może powodować wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej u zwierząt lub ludzi o upośledzonej odporności (z niedoborem), nawet w obecności istniejącej wcześniej u tych zwierząt lub ludzi odporności na wirusy ospy. Szczególnie interesujące jest, że wirus według niniejszego wynalazku może wzmacniać odpowiedź immunologiczną również u zwierząt lub ludzi przechodzących terapię przeciwwirusową, np., terapię przeciwretrowirusową. „Terapia antywirusowa” obejmuje działanie terapeutyczne mające na celu wyeliminowanie lub zahamowanie infekcji wirusowej, włączając, np., (i) zastosowanie analogów nukleotydów, (ii) zastosowanie inhibitorów wirusowej aktywności enzymatycznej lub składania wirusa lub (iii) zastosowanie cytokin wpływających na odpowiedź immunologiczną gospodarza.
Według innej realizacji, szczepionka jest szczególnie, lecz nie wyłącznie, możliwa do zastosowania w dziedzinie weterynarii, np., do immunizacji przeciwko infekcji ospy zwierzęcej. U małych zwierząt, inokulacja w celu immunizacji jest dokonywana korzystnie pozajelitowe lub nosowo, podczas gdy u większych zwierząt lub ludzi preferowane jest szczepienie podskórnie, domięśniowe lub ustne.
PL 212 047 B1 2
Wynalazcy odkryli, że już porcja szczepionki zawierająca skuteczną dawkę jedynie 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli tkankowej) wirusa według wynalazku, jest wystarczająca do indukcji pełnej odporności przeciwko infekcji dzikiego typu wirusa krowianki u myszy. Jest to szczególnie zaskakujące ze względu na to, że można było oczekiwać, że tak silnie atenuowany wirus według wynalazku, mógłby wywołać negatywny skutek, a zatem, obniżyć immunogenność. Takie oczekiwanie oparte było na przekonaniu, że do indukcji odpowiedzi immunologicznej epitopy antygenne muszą być prezentowane układowi immunologicznemu w wystarczającej ilości. Wirus silnie atenuowany, a zatem, nie replikujący, może jedynie prezentować niewielką ilość antygennych epitopów, tzn., tyle ile sam zawiera. Ta ilość antygenu, przenoszona przez cząsteczki wirusa, nie była uważana za wystarczającą do indukcji silnej odpowiedzi immunologicznej. Jednakże, wirus według wynalazku, stymuluje nawet przy 2 bardzo niskiej skutecznej dawce jedynie 102 TCID50 silną i ochronną odpowiedź immunologiczną w modelu infekcji myszy/krowianką. Wirus według niniejszego wynalazku wykazuje, zatem nieoczekiwaną, a nawet zwiększoną immunogenność w porównaniu z innymi, scharakteryzowanymi dotychczas szczepami MVA. Tak silna immunogenność czyni wirus według wynalazku i jakąkolwiek, pochodzącą od niego szczepionkę, szczególnie użytecznymi do zastosowania u zwierząt lub ludzi o upośledzonej odporności. Według jeszcze innej realizacji wynalazku, wirus zastosowany jest jako adiuwant. W niniejszym opisie „adiuwant” określa wzmacniacz swoistej odpowiedzi immunologicznej w szczepionkach. „Zastosowanie wirusa jako adiuwanta” oznacza włączenie wirusa do istniejącej wcześniej szczepionki w celu dodatkowej stymulacji układu immunologicznego pacjenta otrzymującego szczepionkę. Efekt immunizacji wywołanej przez epitop antygenowy w większości szczepionek jest często wzmacniany poprzez dodatek tzw. adiuwanta. Adiuwant współstymuluje układ immunologiczny poprzez wywołanie silniejszej swoistej reakcji immunologicznej przeciwko epitopowi antygennemu szczepionki. Stymulacja ta może być regulowana przez czynniki nieswoistego układu immunologicznego, takie jak interferony i interleukiny.
W związku z tym, w dalszej realizacji wynalazku, wirus stosowany jest wobec ssaków, włączając ludzi do aktywacji, podtrzymywania lub zahamowania układu immunologicznego, i korzystnie, do aktywacji odpowiedzi immunologicznej przeciwko jakiemukolwiek antygennemu czynnikowi determinującemu. Wirus również może być użyty do wspomagania układu immunologicznego w sytuacji zwiększonej wrażliwości na infekcje, takiej jak w przypadku stresu.
Wirus zastosowany jako adiuwant może być wirusem nierekombinowanym, tj., wirusem, który nie zawiera heterologicznego DNA w swoim genomie. Przykładem tego typu wirusa jest MVA-BN. Alternatywnie, wirus użyty jako adiuwant jest wirusem rekombinowanym, posiadającym w swoim genomie sekwencje heterologicznego DNA, które nie istnieją naturalnie obecne w genomie wirusa. W celu zastosowania jako adiuwant, rekombinowany wirusowy DNA wirusa zawiera korzystnie i ekspresjonuje geny, które kodują stymulujące odporność peptydy lub białka, takie jak interleukiny.
Według kolejnej realizacji, korzystnie, wirus stosowany jako adiuwant lub dodawany do innej szczepionki jest inaktywowany. Inaktywacja wirusa może być uzyskana, jak wiadomo specjalistom, np. w wyniku ogrzewania lub oddziaływania odczynników chemicznych. Korzystnie, wirus jest inaktywowany przez propriolakton. Zgodnie z tą realizacją wynalazku, inaktywowany wirus może być dodany do szczepionek przeciwko licznym infekcjom lub chorobom proliferacyjnym w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej pacjenta wobec tej choroby.
Krótki opis Figur
Figura 1: Kinetyka wzrostu różnych szczepów MVA w różnych liniach komórkowych. W części A) wyniki zgrupowano według badanych szczepów MVA, natomiast w części B) wyniki zgrupowano według testowanych linii komórkowych. B) Ilość wirusa uzyskanego z linii komórkowej po czterech dniach (D4) hodowli określano stosując metodę płytkową (analizę łysinek) i wyrażano jako stosunek otrzymanego po 4 dniach wirusa do wyjściowego inokulum w pierwszym dniu (D1).
Figura 2: Zapewnienie ochrony przed infekcją letalną krowianka w następstwie szczepienia MVA-BN lub MVA 575.
Ochronę mierzono poprzez redukcję miana w jajnikach, określaną 4 dni po zainfekowaniu, przy użyciu standardowej metody płytkowej.
Figura 3: Indukcja CTL i ochrona przed infekcją grypy przy użyciu różnych systemów szczepienia podstawowego-przypominającego.
3A: Indukcja odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy H-2d w następstwie szczepienia różnymi kombinacjami szczepionek DNA lub MVA-BN, kodujących politop murynowy. Myszy BALB/c (5 na grupę) szczepiono DNA (domięśniowo) lub MVA-BN (podskórnie) i trzy tygodnie podawano szczepienie przy12
PL 212 047 B1 pominające. Odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy, kodowane przez szczepionki (TYQRTRALV, grypa; SYIPSAEKI, P.berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalowirus; RPQASGVYM, LCV) określono stosując analizę ELISPOT 2 tygodnie po szczepieniach przypominających.
3B: Indukcja odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy następujących szczepionek z różnymi kombinacjami DNA lub szczepionek MVA-BN kodujących polipeptyd murynowy. Myszy BALB/c (5 na grupę) zaszczepiano DNA (domięśniowo) lub MVA-BN (dożylnie) i poddawano szczepieniom przypominającym trzy tygodnie później. Odpowiedzi CTL na 4 różne epitopy kodowane przez szczepionki (TYQRTRALV, grypa; SYIPSAEKI, P.berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalowirus; RPQASGVYM, LCV) określono stosując analizę ELISPOT 2 tygodnie po szczepieniach przypominających.
3C: Częstość peptydu i swoistych wobec MVA komórek T, po homologicznym szczepieniu podstawowym/przypominającym przy użyciu optymalnej dawki (1x 108 TCID50) rekombinowanego MVA-BN, podanego podskórnie. Grupy 8 myszy zaszczepiano w dwóch seriach kombinacji, jak wskazano na Figurze. Dwa tygodnie po końcowym szczepieniu mierzono ilość splenocytów swoistych dla peptydu, stosując analizę IFN-gamma ELISPOT. Słupki oznaczają średnią liczbę swoistych punktów plus/minus standardowe odchylenie od średniej.
Figura 4: Infekcja SIV małp zaszczepionych MVA-BN nef lub MVA-BN.
Figura 5: Przeżywalność zaszczepionych małp w następstwie infekcji SIV.
Figura 6: Miano przeciwciał surowicy krwi małp dla MVA-BN. Miano przeciwciał dla każdego zwierzęcia przedstawiono za pomocą różnych kształtów, natomiast miano średnie zilustrowano jako pełne romby.
Figura 7: Poziom SIV u małp z obniżoną odpornością (CD<400 ml krwi) w następstwie szczepienia MVA-BN kodującym tat. Małpy otrzymały wcześniej trzy szczepienia MVA-BN lub MVA-BN nef (0, 8, 16 tydzień) i zostały zainfekowane patogennym izolatem SIV (22 tydzień). W 100, 102 i 106 tygodniu (wskazane strzałkami) małpy zaszczepiano MVA-BN tat.
Figura 8: Poziom SIV u małp poddanych terapii przeciwretrowirusowej i szczepieniom leczniczym z użyciem MVA-BN. Trzy grupy małp (n=6) infekowano SIV i traktowano codziennie PMPA (wskazano linią czarną). W 10 i 16 tygodniu zwierzęta szczepiono (wskazano strzałkami) mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej.
Figura 9: Odpowiedź humoralną powstała na SIV w następstwie infekcji i szczepień rekombinowanym MVA. Trzy grupy (n=6) małp infekowano patogennym izolatem SIV (tydzień 0), a następnie stosowano terapię antyretrowirusową (PMPA; wskazano pogrubioną linią). Małpy zaszczepiano mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej w 10 i 16 tygodniu. Przeciwciała na SIV określano stosując lizaty zainfekowanych komórek T jako antygen w standardowym teście ELISA.
Figura 10: Odpowiedź humoralną powstała na MVA u zainfekowanych SIV małp poddanych terapii przeciwretrowirusowej. Trzy grupy (n=6) małp infekowano patogennym izolatem SIV (tydzień 0) a następnie stosowano terapię przeciwretrowirusową (PMPA; wskazano pogrubioną linią). Małpy zaszczepiano mieszaniną rekombinowanego MVA lub roztworem soli fizjologicznej w 10 i 16 tygodniu. Przeciwciała na MVA określano stosując standardowy test ELISA dla MVA.
Figura 11: Indukcja przeciwciał dla MVA w następstwie szczepienia myszy różnymi szczepionkami przeciwko ospie. Poziom przeciwciał wobec MVA powstałych w wyniku szczepienia MVA-BN (tydzień 0 i 4), porównywano z konwencjonalnymi szczepami krowianki, Elstree i Wyeth, podanymi poprzez ogon i uśmiercenie (tydzień 0), MVA 572 (tydzień 0 14) oraz MVA-BN i MVA 572 podanymi jako szczepionka pre-Elstree. MVA 572 został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych jako ECACC V94012707. Miana określano stosując ELISA i wyliczano metodą regresji liniowej przy użyciu liniowej części wykresu i definiowano jako rozcieńczenie dające optymalną gęstość 0.3. *MVA-BN:MVA-BN jest znacząco (p>0.05) różne od MVA 572 : MVA 572.
Przykłady
Następujące przykłady ilustrują niniejszy wynalazek. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje zrozumiałe, że załączone przykłady w żaden sposób nie ograniczają do wymienionych w opisie zastosowań sposobów według niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Kinetyka wzrostu nowego szczepu MVA w wybranych liniach komórkowych oraz replikacja In vivo (i) Kinetyka wzrostu w liniach komórkowych
W celu scharakteryzowania kinetyki wzrostu nowo wyizolowanego szczepu według niniejszego wynalazku (następnie nazywanego MVA-BN), porównywano kinetykę wzrostu tego nowo wyizolowanego szczepu z kinetyką innych, wcześniej już scharakteryzowanych, szczepów MVA.
PL 212 047 B1
Eksperyment przeprowadzono poprzez porównanie kinetyki wzrostu następujących wirusów w niżej wymienionych komórkach podstawowych i liniach komórkowych:
MVA-BN (roztwór wirusa #23, 18.02.99 surowy, miareczkowany przy 2,0x 107 TCID50/ml);
MVA scharakteryzowany przez Altenburger (patent US 5, 185, 146) i dalej nazywany MVA-HLR;
MVA (575 pasaż) scharakteryzowany przez Antona Mayra (Mayr, A., i wsp./. [1975] Infection 3; 6-14) i dalej zwany MVA 575 (ECACC V00120707) oraz
MVA-Vero scharakteryzowany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/EP 01/02703 (WO 01/68820) (roztwór wirusa, 49 pasaż, #20, 22.03.99 surowy, miareczkowany przy 4,2 x 107 TCID50/ml).
Zastosowano komórki podstawowe i linie komórkowe:
CEF - fibroblastów embrionu kurcząt (świeżo uzyskane z jaj SPF) ;
HeLa - ludzki gruczolakorak szyjki macicy HeLa (nabłonka), ATCC Nr CCL-2;
143B - ludzki kostniakomięsak TK-, ECACC Nr 91112502;
HaCaT - linia komórkowa ludzkich keratynocytów, Boukamp i wsp., 1988, J.Cell. Biol. 106(3): 761-771;
BHK - nerki młodego chomika, ECACC 85011433;
Vero - fibroblasty nerki zielonej małpy afrykańskiej, ECACC 85020299;
CV1 - fibroblasty nerki zielonej małpy afrykańskiej, ECACC 87032605.
5
W celu infekcji, różne komórki były hodowane na 6-studzienkowych płytkach w stężeniu 5 x 105 kom./studzienkę i inkubowane przez noc w 37°C, przy 5% CO2, w DMEM (Gibco, Nr kat. 61965-026) plus 2% FCS.
Podłoże hodowlane usuwano a komórki infekowano w przybliżeniu 0.05 części na godzinę w 37°C, 5% CO2 (dla infekcji przyjęto, że komórki ulegają podwojeniu przez noc). Ilość wirusa, jaką zastosowano w każdej z infekcji różnych typów komórek wynosiła 5 x 104 TCID50 i nazywano ją ilością dostarczoną. Następnie, komórki 3 razy przemywano DMEM i ostatecznie, dodawano 1 ml DMEM, 2% FCS i pozostawiano płytki inkubując przez 96 godzin (4 dni) w 37°C, 5% CO2. Infekcje te zatrzymywano poprzez zamrożenie płytek w -80°C, gotowe do analizy miana.
Analiza miana (immunobarwienie przeciwciałem swoistym wobec wirusa krowianki)
W celu miareczkowania ilości wirusa, komórki testowe (CEF) zaszczepiano na 96-studzienkowych płytkach w RPMI (Gibco, Nr kat. 61870-010), 7% FCS, 1% antybiotyku/antymikotyku (Gibco, nr kat. 15240-062) w stężeniu 1 x 104 kom./studzienkę i inkubowano przez noc w 37°C, 5%
CO2. 6-studzienkowe płytki zawierające eksperymentalną infekcję były zamrażane/rozmrażane 3 razy, -1 -12 a następnie przygotowywano rozcieńczenia 10-1 do 10-12, stosując podłoże wzrostowe RPMI. Rozcieńczenia wirusa rozdzielano na komórki testowe i inkubowano przez pięć dni w 37°C, 5% CO2 w celu uzyskania efektu CPE (efektu cytopatycznego). Badane komórki utrwalano (aceton/metanol 1:1) przez 10 min, przemywano PBS i inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem swoistym wobec wirusa krowianki (Quartett Berlin, Nr kat. 9503-2057), w rozcieńczeniu 1 : 1000 w buforze do inkubacji przez jedną godzinę w temp. pokojowej. Po dwukrotnym przemyciu PBS (Gibco, nr kat. 20012-019), dodawano sprzężone HPR przeciwkrólicze przeciwciało (Promega Mannheim, Nr kat. W4011) w rozcieńczeniu 1 : 1000, w buforze do inkubacji (PBS zawierającym 3% FCS) przez godzinę w temp. pokojowej. Komórki ponownie dwukrotnie przemywano PBS i inkubowano z roztworem barwiącym (10 ml PBS + 200 pl nasyconego roztworu odianizydyny w 100% etanolu + 15 pl H2O2 świeżo przygotowanego) aż brązowe plamy stały się widoczne (dwie godziny). Roztwór barwiący usuwano i dodawano PBS do zatrzymania reakcji barwiącej.
Każda studzienka wykazująca brązowe zabarwienie była oznaczana jako pozytywna dla CPE i obliczano dla niej miano stosując wzór Kaerber'a (analiza oparta na TCID50) (Kaerber, G. 1931. Arch. Exp.Pathol.Pharmakol. 162, 480).
Wirusy stosowano do infekcji podwójnych serii CEF i BHK, przypuszczalnie podatnych na MVA, i z drugiej strony, do CV-1, Vero, HeLa, 143B i HaCat, dla których oczekiwano brak podatności na MVA, przy niskim namnażaniu infekcji, tj., 0.05 jednostki infekcji na komórkę (5 x 104 TCID50). Następnie, usuwano inokulum wirusowe i komórki przemywano trzykrotnie w celu usunięcia jakichkolwiek pozostałych niezaabsorbowanych wirusów. Infekcje pozostawiano na 4 dni, po czym przygotowywano ekstrakty wirusowe, a następnie miareczkowano na komórkach CEF. W Tabeli 1 i na Figurze 1 przedstawiono wyniki analizy miareczkowania a wartości podano jako ilość wirusa wyprodukowaną po 4 dniach infekcji.
PL 212 047 B1
Wykazano, że wszystkie wirusy ulegały amplifikacji w komórkach CEF (fibroblastach embrionu kurcząt), jak przypuszczano ze względu na to, że jest to linia podatna na wszystkie MVA. Ponadto, stwierdzono, że wszystkie wirusy ulegały dobrze amplifikacji w BHK (linii komórek nerki chomika). MVA-Vero wykazywał najlepsze wyniki, ponieważ BHK jest wrażliwą na wirusy linią komórkową.
Rozpatrując replikację w komórkach Vero (linia komórek nerki małpy) MVA-Vero ulegał znacznemu powieleniu, jak oczekiwano, 1000-krotnie ponad ilość dostarczonego wirusa. MVA-HLR, jak również MVA-575, ulegały w znacznym stopniu amplifikacji, wzrastając, odpowiednio 33-krotnie i 10-krotnie ponad ilość dostarczoną wirusa. Jedynie MVA-BN nie ulegał powieleniu tak dobrze w tych komórkach, w porównaniu z innymi, jedynie 2-krotnie przewyższył ilość pierwotnie dostarczonego wirusa.
Rozpatrując również replikację w komórkach CV1 (linia komórek nerki małpy) odkryto, że MVA-BN jest silnie atenuowany w tej linii komórkowej. Wykazano 200-krotne obniżenie poniżej ilości dostarczonej wirusa. Również MVA-575 nie ulegał amplifikacji powyżej poziomu dostarczonego wirusa, wykazując lekko negatywną amplifikację, związaną z 16-krotnym obniżeniem poniżej ilości dostarczonej. MVA-HLR najlepiej amplifikował, zaobserwowano 30-krotnie więcej wirusa niż zostało dostarczone, następnie MVA-Vero z 5-krotnie podwyższoną ilością dostarczoną wirusa.
Najbardziej interesujące jest porównanie kinetyki wzrostu różnych wirusów w ludzkich liniach komórkowych. Rozpatrując reprodukcyjną replikację w komórkach 143B (linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka kości), wykazano, że MVA Vero jako jedyny wykazał amplifikację powyżej ilości dostarczonej (3-krotnie większa ilość wirusa). Wszystkie pozostałe wirusy nie ulegały amplifikacji powyżej ilości dostarczonej, jednak istniała znaczna różnica pomiędzy MVA-HLR a obydwoma MVA-BN i MVA575. Ilość MVA-HLR była na poziomie „linii granicznej” (1x poniżej ilości dostarczonej), podczas gdy MVA-BN wykazał najwyższy stopień atenuacji (300 razy mniej niż początkowo), następnie MVA-575 (59 razy mniej niż początkowo). Podsumowując, MVA-BN okazał się najlepszy pod względem poziomu atenuacji w ludzkich komórkach 143B.
Ponadto, rozpatrując replikację w komórkach HeLa (komórki ludzkiego gruczolakoraka szyjki macicy) wykazano, że MVA-HLR ulegał dobrze amplifikacji w tej linii komórkowej, a nawet lepiej niż w podatnych na wirusa komórkach BHK (HeLa = 125-krotny wzrost powyżej ilości wirusa dostarczonej pierwotnie; BHK = 88-krotnie więcej wirusa niż pierwotnie). MVA-Vero również amplifikował w tej linii komórkowej (27-krotnie powyżej ilości dostarczonej pierwotnie).
Jednakże, MVA-BN i również w mniejszym stopniu MVA-575, były atenuowane w tych liniach komórkowych (MVA-BN =29 razy mniej niż pierwotnie i MVA-575 = 6 razy poniżej ilości dostarczonej pierwotnie).
Rozpatrując replikację w komórkach HaCat (linia komórkowa ludzkich keratynocytów) wykazano, że MVA-HLR w tej linii komórkowej ulegał amplifikacji na dość wysokim poziomie (55 razy ponad ilość dostarczonego wirusa). Zarówno przystosowany MVA-Vero, jak i MVA-575, ulegały amplifikacji w tej linii komórkowej (odpowiednio, 1.2- i 1.1-razy ponad pierwotną ilość wirusa). Jednakże, MVA-BN jako jedyny podlegał atenuacji (5-krotnie mniej wirusa niż pierwotnie).
Podsumowując, można uznać, że MVA-BN jest najsilniej atenuowanym szczepem wirusa w tej grupie wirusów: MVA-BN był niezwykle silnie atenuowany w ludzkich liniach komórkowych, wykazując stosunek amplifikacji 0.05 do 0.2 w komórkach nerki embrionu ludzkiego (293: ECACC Nr 85120602) (dane niezamieszczone w Tabeli 1), następnie, w komórkach 143B wykazywał stosunek amplifikacji około 0.0; w komórkach HeLa stosunek amplifikacji około 0.04; w komórkach HaCat stosunek amplifikacji około 0.22. Ponadto, MVA-BN wykazywał stosunek amplifikacji około 0.0 w komórkach CV1. Jedynie w komórkach Vero mogła być obserwowana amplifikacja (stosunek 2.33), jednakże, nie w takim samym zakresie jak w komórkach podatnych na wirusa, jak BHK i CEF (porównaj z Tabelą 1). Zatem, MVA-BN okazał się jedynym znanym szczepem MVA wykazującym stosunek amplifikacji niższy niż 1 we wszystkich ludzkich liniach komórkowych 143B, HeLa, HaCat i 293.
MVA-575 wykazywał podobny profil jak MVA-BN, lecz nie był atenuowany, jak w przypadku MVA-BN.
MVA-HLR amplifikował na dość wysokim poziomie we wszystkich badanych liniach komórkowych (za wyjątkiem komórek 143B), może być zatem uznany za kompetentny replikacyjnie we wszystkich badanych liniach komórkowych, z wyjątkiem komórek 143B. W jednym przypadku, podlegał on nawet lepiej amplifikacji w ludzkiej linii komórkowej (HeLa) niż we wrażliwej na wirusa linii komórkowej (BHK).
PL 212 047 B1
MVA-Vero ulegał amplifikacji we wszystkich liniach komórkowych, ale w mniejszym stopniu niż wykazywał to MVA-HLR (zaniedbując wynik dla 143B). Niemniej, nie może być uważany za tej samej „klasy”, pod względem atenuacji, co MVA-BN czy MVA-575.
2. Replikacja in vivo
Biorąc pod uwagę, że szczepy MVA dobrze replikują in vitro, badano zdolność różnych szczepów MVA do replikacji in vivo przy pomocy modelu myszy transgenicznej AGR129. Ten mysi szczep posiada ukierunkowanie uszkodzony gen w genie receptora IFN I typu (IFN-α/β) i II typu (IFN-γ) oraz w RAG. Ze względu na wspomniane uszkodzenia, myszy te nie posiadają układu IFN i nie są zdolne do produkcji dojrzałych komórek B i T, i jako takie, charakteryzują się silnym upośledzeniem odporności i wysoką podatnością na infekcję replikującego wirusa. Grupy sześciu myszy zaszczepiano (i.p) na poziomie 107 pfu MVA-BN, MVA-HLR lub MVA 572 (stosowany u 120, 000 ludzi w Niemczech) i codziennie śledzono objawy kliniczne. Wszystkie zaszczepione MVA-HLR lub MVA 572 myszy zmarły, odpowiednio, w ciągu 28 i 60 dni. Na podstawie sekcji stwierdzono w większości narządów ogólne objawy ostrej infekcji wirusowej i przy użyciu standardowej analizy płytkowej uzyskano MVA (108 pfu) z jajników. W przeciwieństwie do opisanego przypadku, myszy zaszczepione taką samą dawką MVA-BN (odpowiadającemu zdeponowanemu szczepowi ECACC V00083008) przeżyły przez ponad 90 dni i nie otrzymano żadnego MVA z narządów czy tkanek.
Na podstawie porównania danych z badań in vitro i in vivo jasno wynika, że MVA-BN jest silniej atenuowany niż jego szczep rodzicielski i komercyjny szczep MVA-HLR.
P r z y k ł a d 2
Dane immunologiczne i dane in vivo
Eksperymenty te wykonano w celu porównania różnych dawek i systemów szczepienia MVA-BN ze szczepieniami innymi MVA.
2.1. Różne szczepy MVA różnią się zdolnością do stymulowania odpowiedzi immunologicznej
Replikacyjnie kompetentne szczepy krowianki indukują silne odpowiedzi immunologiczne u myszy i w wysokich dawkach są letalne. Mimo że MVA są silnie atenuowane i mają zredukowaną zdolność do replikacji w komórkach ssaczych, istnieją różnice w poziomie atenuacji między różnymi szczepami MVA. W istocie, MVA-BN wydaje się być bardziej atenuowanym niż inne szczepy MVA, nawet spokrewniony z nim szczep MVA 575. W celu określenia czy ta różnica w atenuacji wpływa na skuteczność MVA w indukowaniu ochronnych odpowiedzi immunologicznych, porównywano różne dawki MVA BN i MVA 575 w modelu letalnej infekcji krowianka. Poziom ochrony mierzono poprzez redukcję miana krowianki w jajnikach określoną 4 dni po infekcji, co pozwoliło na ilościowe oszacowanie poziomu różnych dawek i szczepów MVA.
Model infekcji letalnej
Specyficzne, wolne od patogenu 6-8 tygodniowe samice myszy BALB/c (H-2d), (n=5) immunizowano (i.p.) różnymi dawkami (102, 104 lub 106 TCID50/ml) MVA-BN lub MVA 575. MVA-BN i MVA-575 namnażano w komórkach CEF, oczyszczano na cukrozie i przygotowywano w Tris o pH 7.4. Trzy tygodnie później myszy otrzymywały taką samą dawkę przypominającą tego samego szczepu MVA, dwa tygodnie, po której doprowadzano do infekcji letalnej (i.p.) replikacyjnie kompetentnym szczepem krowianki. Jako replikacyjnie kompetentny szczep krowianki (oznaczony jako „rVV”) zastosowano szczep WR-L929 TK+ lub szczep IHD-J. Myszy kontrolne otrzymały szczepionkę placebo. Ochronę mierzono poprzez redukcję miana w jajnikach określoną 4 dni po infekcji za pomocą standardowej analizy płytek (łysinki). Po 4 dniach od tej infekcji myszy uśmiercano, usuwano jajniki, homogenizowano w PBS (1 ml) i określano miano wirusa przy użyciu standardowej analizy płytek z zastosowaniem komórek VERO (Thomson i wsp., 1998, J.Immunol.160:1717).
Myszy zaszczepione dwoma immunizacjami z 104 lub 106 TCID50/ml MVA-BN lub MVA-575 były całkowicie chronione, co stwierdzono na podstawie 100% redukcji w jajnikach miana rVV 4 dni po infekcji (Fig. 2). Oczyszczono wirus infekcyjny. Jednakże, przy niższych dawkach obserwowano różnice w poziomie ochrony zapewnionej przez MVA-BN czy MVA575. Myszy, które otrzymały dwa szcze2 pienia na poziomie 102 TCID50/ml MVA 575 nie uzyskały ochrony, co stwierdzono na podstawie wysokiego miana w jajnikach (średnio 3.7 x 107 pfu +/- 3.59 x 107). Przeciwnie, myszy zaszczepione tą samą dawką MVA-BN indukowały znaczną redukcję (96%) w jajnikach miana rVV (średnio 0.21 x 107 pfu +/- 0.287 x 107). Myszy kontrolne, które otrzymały szczepionkę placebo wykazywały średnie miano wirusa na poziomie 5.11 x 107 pfu ( + /- 3.59 x 107) (Fig. 2).
Oba szczepy MVA indukowały ochronne odpowiedzi immunologiczne u myszy wobec letalnej infekcji rVV. Mimo że oba szczepy MVA są równie skuteczne przy wyższych dawkach, różnice w ich
PL 212 047 B1 skuteczności są jasno widoczne przy suboptymalnych dawkach. MVA-BN jest silniejszy niż spokrewniony z nim szczep MVA-575 w indukowaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko letalnej infekcji rVV, co może być związane ze wzrostem atenuacji MVA-BN w porównaniu z MVA-575.
2.2. MVA-BN w szczepieniu podstawowym/przypominającym
2.2.1.: Indukcja przeciwciał wobec MVA w następstwie szczepienia myszy różnymi szczepionkami przeciwko ospie
Skuteczność MVA-BN porównywano z innymi MVA i szczepami krowianki wcześniej zastosowanymi w leczeniu ospy. Eksperyment obejmował pojedynczą immunizację przy użyciu szczepów krowianki Elstree i Wyeth, otrzymanych w komórkach CEF i uzyskanych poprzez uśmiercenie ogonowe oraz immunizację z użyciem MVA 572, zastosowanego wcześniej w programie leczenia ospy w Niemczech. Ponadto, zarówno MVA-BN, jak i MVA 572, porównywano jako pre-szczepionki po Elstree drogą uśmiercenia. W każdej grupie wykorzystano osiem myszy BALB/c i wszystkie szczepienia MVA (1 x 107 TCID50) podawane były podskórnie w 0 i 3 tygodniu. Dwa tygodnie po szczepieniu przypominającym, myszy infekowano krowianka (IHD-J) i określano miana w jajnikach 4 dni po infekcji. Wszystkie szczepionki i systemy szczepień indukowały 100% ochronę.
Indukowane przez różne typy szczepionek lub systemy szczepień mierzono u zwierząt przed infekcją. Zastosowano analizy do pomiaru poziomu przeciwciał zobojętniających, proliferacji komórek T, produkcji cytokin (IFN-γ vs IL-4) oraz produkcji IFN-γ przez komórki T. Poziom odpowiedzi komórek T indukowanych przez MVA-BN, mierzony za pomocą ELIspot, był ogólnie, równy uzyskanym dla innych MVA i wirusów krowianki, co świadczy, że można go traktować za ich równoważnik biologiczny. Cotygodniowa analiza miana przeciwciał wobec MVA uzyskanego po różnych systemach szczepień ujawniła, że szczepienia MVA-BN znacznie wzmacniają szybkość i siłę odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z innymi systemami szczepień (Fig. 11). Istotnie, miana przeciwciał wobec MVA były znacząco wyższe (p>0.05) w 2, 4 15 tygodniu (1 tydzień po szczepieniu przypominającym w 4 tygodniu), gdy szczepiono z MVA-BN w porównaniu z myszami zaszczepionymi z MVA 572. Po szczepieniu przypominającym w 4 tygodniu, miana przeciwciał były znacznie wyższe w grupie MVA-BN, w porównaniu z myszami, które otrzymały pojedyncze szczepienie szczepem krowianki Elstree lub Wyrth. Wyniki te jasno wskazują, że 2 szczepienia MVA-BN indukują lepszą odpowiedź przeciwciałową w porównaniu z klasycznym pojedynczym szczepieniem tradycyjnymi szczepami krowianki (Elstree lub Wyrth) i potwierdzają odkrycie opisane w rozdziale 1.5, że MVA-BN jest bardziej immunogenny niż inne szczepy MVA.
2.2.2.: System szczepienia MVA podstawowego i potwierdzającego wywołuje ten sam poziom ochrony jak system szczepienia podstawowego z DNA i przypominającego z MVA w modelu infekcji wirusem grypy
Skuteczność systemu szczepienia podstawowego MVA i potwierdzającego w wywoływaniu silnej odpowiedzi CTL oceniano i porównywano z uznanym za lepszy systemem szczepienia podstawowego z DNA i przypominającego z MVA.
Oceniano różne systemy stosując konstrukt politopu murynowego, kodowany przez wektor DNA lub MVA-BN i porównywano poziom indukcji CTL przy użyciu ELISPOT, natomiast poziom odpowiedzi mierzono jako stopień zapewnionej ochrony po infekcji grypą.
Konstrukty
Plazmid DNA kodujący politop murynowy (10 epitopów CTL włączając grypę, owalalbuminę) opisano wcześniej (Thomson i wsp., 1998, J.Immunol.160:1717). Wspomniany politop murynowy wstawiono w 11 miejscu delecji MVA-BN, namnażanego na komórkach CEF, oczyszczono na cukrozie i przygotowano w Tris o pH 7.4.
Protokół szczepień
W badaniach wykorzystano specyficzne, wolne od patogenu 6-8 tygodniowe samice myszy
BALB/c (H-2d). Grupy 5 myszy poddano analizie ELISPOT, natomiast 6 myszy na grupę poddano eksperymentom infekcji grypą. Myszy zaszczepiano stosując różne systemy szczepienia podstawowego/przypominającego MVA lub DNA kodującym politop murynowy, jak wyszczególniono w części opisującej wyniki. Do immunizacji DNA, myszy znieczulano i podawano im pojedynczy zastrzyk 50 pg plazmidu wolnego od endotoksyny DNA (w 50 μΐ PBS) w mięśnie czworogłowe, pod znieczuleniem. Podstawową immunizację z użyciem MVA dokonano drogą podania dożylnego 107 pfu MVA-BN na mysz lub podania podskórnego 107 pfu lub 108 pfu MVA-BN na mysz. Immunizację przypominające miały miejsce trzy tygodnie po podstawowej immunizacji. Przypomnienie plazmidem DNA było dokonane w ten sam sposób jak podstawowa immunizacja DNA (jak wyżej). W celu ustalenia odpowiedzi
PL 212 047 B1
CTL zastosowano standardową analizę ELISPOT (Schneider i wsp., 1998, Nat.Med.4; 397-402) na splenocytach 2 tygodnie po ostatniej immunizacji przypominającej z użyciem epitopu peptydowego CTL grypy (TYQRTRALV), epitopu peptydowego P.berghei (SYIPSAEKI), epitopu peptydowego (YPHFMPTNL) i/lub epitopu peptydowego LCY (RPQASGVYM).
Do eksperymentów infekcyjnych myszy znieczulano i infekowano i.n. subletalną dawką wirusa 5 grypy, Mem 71 (4.5 x 105 pfu w 50 ml PBS). W 5 dniu po infekcji, usuwano płuca i określano miano wirusa w 2 powtórzeniach w linii psich komórek nerki Madin-Darby, z użyciem standardowej metody płytkowej (łysinek wirusa grypy).
Wyniki
Zastosowanie samej szczepionki DNA dało niską indukcję CTL wobec epitopów 4H-2d, kodowanych przez politop murynowy i jedynie słabą odpowiedź wykrytą dla dwóch z epitopów P.berghei (SYIPSAEKI) i wirusa limfocytowego zapalenia opon i splotów naczyniowych (RPQASGVYM). Przeciwnie, zastosowanie systemu szczepienia podstawowego z DNA, przypominającego z MVA (107 pfu MVA-BN podanego podskórnie) pozwoliło na uzyskanie istotnie większej wartości CTL indukowanej na SLY (8-krotny wzrost) i RPQ (3-krotny wzrost) oraz odpowiedzi obserwowanej wobec trzeciego epitopu dla muryny cytomegalowirusa (YPHFMPTNL) (Fig. 3A). Jednakże, zastosowanie 107 pfu MVA-BN, podanego podskórnie w homologicznym systemie szczepienia podstawowego przypominającego indukowało taki sam poziom odpowiedzi, jak podanie DNA poprzedzonego MVA-BN (Fig. 3A).
Zaskakująco, nie zaobserwowano żadnej znaczącej różnicy w liczbie CTL indukowanych wobec trzech epitopów po zastosowaniu jednej immunizacji MVA-BN (107 TCID50), co wskazuje, że drugie szczepienie MVA-BN nie wywołało znacznego wzmocnienia odpowiedzi CTL.
Wykazano wcześniej, że podskórne podanie 107 pfu MVA było najmniej skutecznym sposobem i stężeniem wirusa do szczepienia z użyciem innych szczepów MVA, szczególnie w porównaniu z immunizacja dożylną (Schneider i wsp., 1998). W celu określenia systemu optymalnej immunizacji, powyższy eksperyment powtarzano zmieniając ilość wirusa lub sposób podawania. W jednym z doświadczeń, podano dożylnie 107 pfu MVA-BN (Fig. 3B). W kolejnym eksperymencie podawano podskórnie 108 pfu MVA-BN (Fig. 3C). W eksperymentach tych podstawowe i przypominające immunizację z MVA-BN indukowały wyższą średnią liczbę CTL dla wszystkich trzech epitopów CTL niż w przypadku systemu szczepienia podstawowego z DNA i przypominającego z MVA. Również inną reakcję niż dla 107 pfu MVA-BN podanego podskórnie, odnotowano dla immunizacji 107 pfu MVA-BN podanego dożylnie i immunizacji 108 pfu wirusa podanego podskórnie. Szczepienia te znacznie wzmocniły odpowiedź CTL, jasno wskazując, że MVA-BN może być zastosowane do wzmocnienia odpowiedzi CTL w obecności istniejącej wcześniej odporności na wektor.
2.2.3.: Skuteczność MVA-BN nef szczepionki u zainfekowanych SIV Małp Rezus
W celu określenia skuteczności szczepionki MVA-BN wyrażonej przez oszacowanie ilości wirusa i stopnia opóźnienia choroby po infekcji wirulentnym, podstawowym izolatem SIV. Ponadto, wyniki badań wskazują czy MVA-BN może być stosowany bezpiecznie do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u małp o upośledzonej odporności z istniejącą wcześniej odpornością na MVA.
Protokół szczepień
Dwie grupy (n=6) małp rezus (Macaca mulatta) zaszczepiano dawką uderzeniową domięśniowo jedynie MVA-BN lub rekombinowanym MVA-BN nef w 0.8 i 16 tygodniu. W 22 tygodniu wszystkie małpy infekowano drogę dożylną 50 MID50 patogennego, związanego z komórkami roztworu SIV (1XC) z podstawowych, niehodowanych PBMC małp rezus. Stan kliniczny zwierząt stale kontrolowano i pobierano regularnie próby krwi do pomiaru wiremii, parametrów immunologicznych i pełnego zakresu hematologii oraz klinicznych parametrów chemicznych krwi. Zwierzęta, u których nastąpił rozwój choroby typu AIDS uśmiercano, a małpy, które przeżyły kontrolowano przez 99 tygodni po zaszczepieniu. W 100 tygodniu wszystkie żyjące małpy immunizowano i.m. MVA-BN tat i otrzymały dalsze szczepienia z tym samym MVA-BN tat w 102 i 106 tygodniu.
Nie odnotowano żadnych efektów ubocznych po jakimkolwiek ze szczepień MVA-BN lub MVA-BN nef. W następstwie infekcji małp SIV poziom wiremii silnie wzrósł i osiągnął maksimum dwa tygodnie po infekcji (Fig. 4). W wyniku dużego odchylenia standardowego w grupach, nie odnotowano znaczącej różnicy w średnim poziomie SIV między grupami zaszczepionymi MVA-BN nef a MVA-BN. Jednakże, istniała ogólnie 10-krotnie niższa ilość SIV w grupie zaszczepionej MVA-BN nef w porównaniu z grupą kontrolną (MVA-BN). Ponadto, po 35 tygodniach po infekcji (początkowy okres obserwacji) jedynie 1 z sześciu małp zaszczepionych MVA-BN nef musiano uśmiercić ze względu na ostry stan chorobowy, dla porównania, w grupie kontrolnej, 4 z 6 zwierząt (Fig. 5). Rozwój choroby jasno
PL 212 047 B1 skorelowany był z wyższą ilością wirusa i zwierzęta te obserwowano przez dodatkowe 29 tygodni po infekcji. Szczepionka MVA-BN nef okazała się opóźniać postęp choroby, w porównaniu z grupą kontrolną i nawet w 46 tygodniu po infekcji 5 z 6 MVA-BN nef zwierząt przeżyło (Fig. 5). Jednakże, do 59 tygodnia po infekcji uśmiercono dwa kolejne zwierzęta w grupie zaszczepionych nef, pozostawiając pięć żywych zwierząt (trzy z grupy MVA-BN i dwa zaszczepione MVA-BN). Badanie mian przeciwciał wytworzonych wobec MVA-BN u tych 12 małp jasno wykazało, że MVA-BN może wzmacniać odpowiedź immunologiczną, nawet przy istniejącej wcześniej odporności na MVA (Fig. 6). Po podstawowej immunizacji MVA-BN lub MVA-Bn nef wszystkie małpy wytworzyły odpowiedź przeciwciałową na MVA o średnim mianie 1000. Wspomniana odpowiedź przeciwciałową była znacznie wzmocniona przez drugą immunizację, jasno wskazując, że MVA może być zastosowany do wywołania podstawowejprzypominającej odpowiedzi immunologicznej u zdrowych małp. Opisywane miana przeciwciał stopniowo malały, mimo że do 9 tygodnia po immunizacji osiągnęły plateau, tak, że średnie miano dla MVA w 99 tygodniu wynosiło 2000.
Pięć małp, które przeżyły było zainfekowanych SIV i charakteryzowało się upośledzeniem odporności z ilością CD4 niższą niż 400/μ1 krwi. W celu zbadania wpływu użycia MVA-BN u małp z niedoborem odporności, pięć zwierząt zaszczepiono trzykrotnie MVA-BN tat w 100, 102 i 106 tygodniu po pierwszym szczepieniu. Pierwsza immunizacja MVA-BN znacznie wzmocniła odpowiedź przeciwciałową na MVA u wspomnianych małp o upośledzonej odporności, która uległa następnie dalszemu wzmocnieniu po trzecim szczepieniu przypominającym, 6 tygodni później (Fig. 6).
Wyniki te wskazują, że MVA-BN może wzmacniać odpowiedź immunologiczną w obecności znacznej, istniejącej wcześniej odporności na MVA, nawet u małp o upośledzonej odporności. Mimo że odpowiedź immunologiczna małp uległa wzmocnieniu po immunizacji MVA-BN tat, poziom SIV pozostał stały, wskazując na to, że immunizację MVA-BN są bezpieczne i nie wpływają na poziom SIV u małp o upośledzonej odporności (Fig. 7).
Badanie to wykazało, że MVA-BN może wywołać podstawową/przypominającą odpowiedź immunologiczną u małp rezus o upośledzonej odporności, i że szczepienia MVA-BN są bezpieczne i nie wpływają na poziom wiremii u zainfekowanych SIV zwierząt. Opóźnienie rozwoju chorób podobnych AIDS u zwierząt zaszczepionych szczepionką MVA-BN nef wskazuje, że odpowiedź immunologiczna przeciwko nef została skutecznie wytworzona.
2.2.4.: Terapeutyczne szczepienia małp zainfekowanych SIV Przebieg leczenia przeciwretrowirusowego
Szczepionka terapeutyczna HIV oparta na MVA-BN może być zastosowana u osobników poddanych terapii przeciwretrowirusowej. Zatem, opisane badanie określa bezpieczeństwo (wpływ na poziom SIV) i skuteczność rekombinowanych MVA kodujących różnorodne antygeny SIV (gag, pol, env, rev, tat i nef) u zainfekowanych SIV małp, traktowanych PMPA. PMPA jest analogiem nukleozydu i jest skuteczny przeciwko HIV i SIV (Rosenwirth, B. i wsp., 2000, J.Virol. 74, 1704-11).
Konstrukty
Wszystkie rekombinowane konstrukty MVA były namnażane w komórkach CEF, oczyszczane na cukrozie i przygotowywane w Tris o pH 7.4.
Protokół szczepień
Trzy grupy (n=6) małp rezus (Macaca mulatta) infekowano 50 MID50 patogennego, wyizolowanego podstawowego SIV (1XC), a następnie codziennie traktowano PMPA (60 mg/kg podając s.c.) przez 19 tygodni. W 10 tygodniu, zwierzęta zaszczepiano rekombinowanym MVA-BN (i.m.) lub roztworem soli fizjologicznej i podawano identyczne szczepienie 6 tygodni później. 1 grupa otrzymała mieszaninę MVA gag-pol i MVA-env, 2 grupa otrzymała MVA-tat, MVA-rev i MVA-nef, natomiast 3 grupa otrzymała roztwór soli fizjologicznej. Stan kliniczny zwierząt stale kontrolowano i pobierano regularnie próby krwi do pomiaru wiremii, parametrów immunologicznych i pełnego zakresu hematologii oraz klinicznych parametrów chemicznych krwi.
Wszystkie zwierzęta uzyskały wysoki poziom SIV, który osiągnął maksimum po 2 tygodniach od dokonania infekcji (Fig. 8). W następstwie codziennego podawania PMPA, poziom SIV uległ obniżeniu i ustabilizował się na niskim poziomie do 9 tygodnia. Ze względu na to, że poprzednie badania ze szczepieniem MVA w 10 i 16 tygodniu nie wykazały żadnego wpływu na poziom SIV, stwierdzono, że MVA-BN jest bezpiecznym wektorem szczepionkowym dla zwierząt o upośledzonej odporności. Gdy zwierzęta przeszły leczenie PMPA (21 tydzień), poziom SIV wzrastał. Mimo że trzy zwierzęta w 1 grupie miały obniżony poziom SIV, w porównaniu z 3 grupą kontrolną, nie odnotowano żadnej istotnej różnicy w średniej ilości SIV pomiędzy jakąkolwiek grupą po zakończeniu leczenia PMPA (Fig. 8).
PL 212 047 B1
Zastosowanie ELISA do zainfekowanych SIV komórek T zwierzęcych lizatów dało odpowiedź przeciwciałową na SIV do 4 tygodnia po infekcji (Fig. 9). Miano przeciwciał SIV w grupie kontrolnej (roztwór soli fizjologicznej) malało podczas leczenia PMPA i gwałtownie wzrastało po zatrzymaniu podawania PMPA, co znalazło odzwierciedlenie w spadku, a następnie wzroście poziomu SIV podczas terapii przeciwretrowirusowej (Fig. 9). Podobny wzorzec zmian miana przeciwciała SIV obserwowano w 2 grupie, która otrzymała MVA-tat, MVA-rev i MVA-nef, możliwie, ukazując podekspresję tych białek regulatorowych w lizatach komórek T zainfekowanych SIV, poddanych testowi ELISA. Jednak, przeciwnie niż poprzednio, miana przeciwciał przeciwko SIV w 1 grupie wzrosły po zaszczepieniu MVA gag-pol i MVA-env w 10 tygodniu, wskazując, że rekombinowany MVA-BN może wzmacniać odpowiedź immunologiczną na SIV u zwierząt zainfekowanych (SIV) i poddanych przeciwwirusowej terapii. Istotnie, miana przeciwciał wobec SIV były wzmocnione po drugim szczepieniu w 16 tygodniu, wykazując, że MVA może wzmacniać odpowiedź immunologiczną u zwierząt o upośledzonej odporności, nawet w obecności istniejącej uprzednio oporności na MVA (Fig. 8). Miano przeciwciał wobec MVA w grupie 1 również odzwierciedlało ten wzorzec z utworzeniem odpowiedzi przeciwciałowej w następstwie podstawowej immunizacji i była ona znacznie wzmocniona po drugim szczepieniu (przypominającym) (Fig.10).
Literatura
Schneider, J., Gilbert, SC, Blanchard, TJ., Hanke, T., Robson, KJ., Hannan, CM., Becker, M., Sinden, R., Smith, GL. oraz Hill, AVS. 1998. Enhanced immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete efficacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified virus Ankara. Nat.Med.4; 397 -402. Thomson, SA., Sherritt, MA., Medveczky, J., Elliott, SL., Moss, DJ., Fernando, GJP., Brown, LE. oraz Suhrbier, A. 1998. Delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J.Immunol. 160: 1717.
T a b e l a 1
| CEF | HeLa | HaCat | 143B | BHK | Vero | CV-1 | |
| MVA-BN | 579.73 | 0.04 | 0.22 | 0.00 | 65.88 | 2.33 | 0.00 |
| MVA-575 | 796.53 | 0.15 | 1.17 | 0.02 | 131.22 | 10.66 | 0.06 |
| MYA-HLR | 86.68 | 124.97 | 59.09 | 0.83 | 87.86 | 34.97 | 29.70 |
| MYA-Vero | 251.89 | 27.41 | 1.28 | 2.91 | 702.77 | 1416.46 | 4.48 |
Amplifikacja wirusa ponad poziom ilości dostarczonej wirusa po 4 dniach infekcji Stosunek amplifikacji = ilość otrzymana TCID50 - ilość dostarczona TCID50.
Claims (38)
1. Zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN zdeponowanego w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ECACC), Salisbury (UK), pod numerem V00083008, znamienny tym, że:
(i) jest zdolny do reproduktywnej replikacji w fibroblastach embrionu kurcząt (CEF) oraz w linii komórek nerki młodego chomika BHK i jest niezdolny do reproduktywnej replikacji w liniach komórek ludzkich, (ii) jest niezdolny do replikacji in vivo w organizmie myszy o silnie upośledzonej odporności.
2. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1, znamienny tym, że linie komórek ludzkich stanowią: linia komórkowa ludzkiego kostniakomięsaka kości 143B, ludzka linia komórkowa keratynocytów HaCat oraz linia komórkowa ludzkiego gruczolakoraka szyjki macicy HeLa.
3. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mysz o silnie upośledzonej odporności jest niezdolna do produkcji dojrzałych komórek B i T.
4. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że mysz o silnie upośledzonej odporności jest transgeniczną myszą AGR129.
5. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że został on oczyszczony jako klon.
6. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jedną sekwencję heterologicznego kwasu nukleinowego.
PL 212 047 B1
7. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wspomniana sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego wybrana jest z sekwencji kodujących przynajmniej jeden antygen, epitop antygenowy i/lub składnik terapeutyczny.
8. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 7, znamienny tym, że epitopy antygenowe pochodzą z wirusa grypy, z wirusów wybranych z rodziny Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitis - wirusów opryszczki, ludzkiego wirusa braku odporności lub z wirusów powodujących gorączkę krwotoczną.
9. Wirus MVA-BN lub jego pochodna według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego jest genem nef.
10. Genom wirus MVA-BN lub jego pochodnej określonego w zastrz. od 1 do 9.
11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną określonego w zastrz. od 1 do 9 i/lub genom określony w zastrz. 10 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik i/lub substancję dodatkową.
12. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną określonego w zastrz. od 1 do 9 i/lub genom określony w zastrz. 10.
13. Kompozycja farmaceutyczna określona w zastrz. 11 lub szczepionka określona w zastrz. 12 2 zawierająca przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej.
14. Wirus MVA-BN lub jego pochodna określone w zastrz. od 1 do 9, genom określony w zastrz. 10, kompozycja określona w zastrz. od 11 do 13 lub szczepionka określona w zastrz. od 12 do 13 do oddziaływania na, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej w organizmie żywego zwierzęcia lub człowieka.
15. Wirus MVA-BN lub jego pochodna określone w zastrz. od 1 do 9, genom określony w zastrz. 10, kompozycja określona w zastrz. od 11 do 13 lub szczepionka określona w zastrz. od 12 do 13 do szczepienia zwierzęcia lub człowieka przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy.
16. Wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według zastrz. 15, znamienny tym, że chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna.
17. Wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność.
18. Wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według zastrz. 14 albo 15, albo 16, albo 17, znamienny tym, że zwierzę lub człowiek posiada istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy.
19. Wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według zastrz. 14 albo 15 albo, 16 albo, 17 albo 18, znamienny tym, że zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej.
20. Wirus MVA-BN lub jego pochodna, genom, kompozycja lub szczepionka według zastrz. 19, znamienny tym, że terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową.
21. Wirus MVA-BN lub jego pochodna określone w zastrz. od 6 do 9, lub genom określony w zastrz. 10 do wprowadzania homologicznej lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórek docelowych.
22. Zastosowanie Wirus MVA-BN lub jego pochodnej określonego w zastrz. od 1 do 9, i/lub genom określonego w zastrz. 10 do wytwarzania leku lub szczepionki.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że lek lub szczepionka są przeznaczone do podawania w celu wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia lub człowieka.
24. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, znamienne tym, że lek lub szczepionka są przeciwko chorobie wywoływanej przez ludzkie wirusy z grupy ospy.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że chorobą wywoływaną przez ludzkie wirusy z grupy ospy jest ospa wietrzna.
26. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, znamienne tym, że lek lub 2 szczepionka zawiera przynajmniej 102 TCID50 (dawka infekcyjna hodowli komórkowej) wirusa MVA-BN lub jego pochodnej.
27. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, znamienne tym, że Wirus MVA-BN lub jego pochodna są przeznaczone do wytwarzania leku do podawania w terapeutycznie skutecznych ilościach w pierwszym szczepieniu („szczepienie podstawowe”) i w drugim szczepieniu („szczepienie przypominające”).
PL 212 047 B1
28. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, znamienne tym, że zwierzę lub człowiek posiada upośledzoną odporność.
29. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, znamienne tym, że zwierzę lub człowiek posiada istniejącą wcześniej odporność na wirusy ospy.
30. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, znamienne tym, że zwierzę lub człowiek jest poddawany terapii antywirusowej.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że terapia antywirusowa jest terapią antyretrowirusową.
32. Wirus MVA-BN lub jego pochodna określone w zastrz. od 1 do 9 jako adiuwant.
33. Zastosowanie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej określonych w zastrz. od 1 do 9 jako adiuwanta.
34. Sposób wprowadzenia sekwencji homologicznego i/lub heterologicznego kwasu nukleinowego do komórek docelowych in vitro, znamienny tym, że obejmuje infekcję komórek docelowych wirusem MVA-BN lub jego pochodną określonych w zastrz. od 6 do 9 albo transfekcję komórki docelowej genomem według zastrz. 10.
35. Sposób otrzymywania peptydu lub białka, znamienny tym, że obejmuj e
a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną określonych w zastrz. od
1 do 9,
b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz
c) izolację i/lub wzbogacenie peptydu i/lub białka wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza.
36. Sposób otrzymywania wirusa MVA-BN lub jego pochodnej, znamienny tym, że obejmuje
a) infekcję komórek gospodarza wirusem MVA-BN lub jego pochodną określonych w zastrz. od
1 do 9,
b) hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach oraz
c) izolację i/lub wzbogacenie wirusa MVA-BN lub jego pochodnej wyprodukowanych przez wspomnianą komórkę gospodarza.
37. Komórka, korzystnie komórka ludzka, znamienna tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną określone w zastrz. od 1 do 9 albo genom określony w zastrz. 10.
38. Zestaw do szczepienia podstawowego/przypominającego, znamienny tym, że zawiera wirusa MVA-BN lub jego pochodną określone w zastrz. od 1 do 9, kompozycję określoną w zastrz. 11 lub 13, szczepionkę określoną w zastrz. 12 lub 13 do pierwszego szczepienia („szczepienia podstawowego”) w pierwszej fiolce/pojemniku i do drugiego szczepienia („szczepienia przypominającego”) w drugiej fiolce/pojemniku.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200001764 | 2000-11-23 | ||
| PCT/EP2001/013628 WO2002042480A2 (en) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | Modified vaccinia ankara virus variant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL361459A1 PL361459A1 (pl) | 2004-10-04 |
| PL212047B1 true PL212047B1 (pl) | 2012-08-31 |
Family
ID=8159864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL361459A PL212047B1 (pl) | 2000-11-23 | 2001-11-22 | Zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara MVA-BN i jego pochodna, genom i zawierające je kompozycja farmaceutyczna, zwłaszcza szczepionka oraz ich zastosowania |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (11) | US6913752B2 (pl) |
| EP (4) | EP1335987B2 (pl) |
| JP (1) | JP4421188B2 (pl) |
| KR (3) | KR100830295B1 (pl) |
| CN (2) | CN100537773C (pl) |
| AT (1) | ATE314483T2 (pl) |
| AU (2) | AU3163902A (pl) |
| BE (1) | BE2013C065I2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0115533B8 (pl) |
| CA (1) | CA2421151C (pl) |
| CY (2) | CY1105594T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ295808B6 (pl) |
| DE (2) | DE60116371T3 (pl) |
| DK (1) | DK1335987T4 (pl) |
| EE (1) | EE05680B1 (pl) |
| ES (1) | ES2256323T5 (pl) |
| FR (1) | FR13C0070I2 (pl) |
| HK (1) | HK1059453A1 (pl) |
| HU (2) | HU230198B1 (pl) |
| IL (2) | IL154712A0 (pl) |
| LU (1) | LU92311I2 (pl) |
| MX (1) | MXPA03002513A (pl) |
| NO (1) | NO337867B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ524661A (pl) |
| PL (1) | PL212047B1 (pl) |
| PT (1) | PT1335987E (pl) |
| RU (1) | RU2290438C2 (pl) |
| SI (1) | SI1335987T2 (pl) |
| UA (1) | UA76731C2 (pl) |
| WO (1) | WO2002042480A2 (pl) |
Families Citing this family (150)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7097842B2 (en) | 2000-11-23 | 2006-08-29 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| ES2256323T5 (es) * | 2000-11-23 | 2016-11-21 | Bavarian Nordic A/S | Variante del virus Vaccinia Ankara Modificado |
| US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| UA82466C2 (uk) * | 2001-07-18 | 2008-04-25 | Бавариан Нордика А/С | Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу |
| WO2003048184A2 (en) | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus ns1 subunit vaccine |
| IL163701A0 (en) † | 2002-04-19 | 2005-12-18 | Bavarian Nordic As | Modified vaccinia virus ankara for the vaccinationof neonates |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| EA020230B1 (ru) | 2002-05-16 | 2014-09-30 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение |
| EP1404852B1 (en) * | 2002-05-16 | 2005-12-21 | Bavarian Nordic A/S | Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter |
| SI1434858T2 (sl) | 2002-09-05 | 2019-05-31 | Bavarian Nordic A/S | Postopek za pomnoževanje poksvirusa v razmerah brez seruma |
| DK1845164T3 (da) * | 2003-11-24 | 2010-09-20 | Bavarian Nordic As | Promoterer til ekspression i modificeret vacciniavirus ankara |
| WO2005120579A1 (ja) * | 2004-06-14 | 2005-12-22 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | 膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物 |
| CN1295339C (zh) * | 2005-01-11 | 2007-01-17 | 武汉大学 | 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用 |
| PT1855720T (pt) * | 2005-02-23 | 2016-12-14 | Bavarian Nordic As | Uso de um poxvírus modificado para a rápida indução de imunidade contra um poxvírus ou outros agentes infeciosos |
| US20090269365A1 (en) * | 2005-04-20 | 2009-10-29 | University Of Washington | Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same |
| KR100717279B1 (ko) * | 2005-08-08 | 2007-05-15 | 삼성전자주식회사 | 마스크롬 소자 및 그 형성 방법 |
| US7913477B2 (en) * | 2006-01-27 | 2011-03-29 | William Anthony Harper | Insert registration in packets |
| EP1826264A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-08-29 | Deutsches Primatenzentrum GmbH | Primate model for orthopox virus infections |
| EP1835031A1 (en) | 2006-03-14 | 2007-09-19 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans |
| AU2007263281B2 (en) | 2006-06-20 | 2012-12-06 | Transgene S.A. | Recombinant viral vaccine |
| NZ573437A (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-24 | Transgene Sa | Process for producing poxviruses and poxvirus compositions |
| WO2008028665A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Bavarian Nordic A/S | Phenotypic and genotypic differences of mva strains |
| DK2073837T3 (da) * | 2006-10-06 | 2014-09-29 | Bavarian Nordic Inc | Rekombinant modificeret vaccinia-ankara-virus, der koder for et her-2-antigen, i kombination med en taxan til anvendelse til behandling af cancer |
| US8268327B2 (en) | 2007-04-27 | 2012-09-18 | Bavarian Nordic A/S | Immediate protection against pathogens via MVA |
| US8003364B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography |
| JP2010526546A (ja) | 2007-05-14 | 2010-08-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製 |
| DK2207564T3 (en) * | 2007-10-18 | 2017-01-16 | Bavarian Nordic As | USE OF VAT FOR TREATMENT OF PROSTATACANCES |
| KR100970449B1 (ko) * | 2007-12-21 | 2010-07-16 | (주)이지아이 | 안전성을 갖는 어린이 놀이터용 고무 바닥재 및 설치방법 |
| WO2009152969A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-23 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| PL2382474T3 (pl) | 2009-01-20 | 2015-08-31 | Transgene Sa | Rozpuszczalny ICAM-1 jako biomarker do prognozowania odpowiedzi terapeutycznej |
| US8394385B2 (en) * | 2009-03-13 | 2013-03-12 | Bavarian Nordic A/S | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines |
| US8613936B2 (en) | 2009-03-13 | 2013-12-24 | Bavarian Nordic A/S | Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements |
| RU2542435C2 (ru) | 2009-03-24 | 2015-02-20 | Трансжене Са | Биомаркер для мониторинга пациентов |
| CN102395883B (zh) | 2009-04-17 | 2015-12-02 | 特朗斯吉有限公司 | 用于监控患者的生物标志物 |
| RU2552292C2 (ru) | 2009-07-10 | 2015-06-10 | Трансжене Са | Биомаркер для отбора пациентов и связанные с ним способы |
| EP2486138A1 (en) | 2009-10-08 | 2012-08-15 | Bavarian Nordic A/S | Generation of a broad t-cell response in humans against hiv |
| US9011874B2 (en) * | 2009-11-20 | 2015-04-21 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs |
| AU2011209175B2 (en) | 2010-01-28 | 2016-02-04 | Bavarian Nordic A/S | Vaccinia virus mutants containing the major genomic deletions of MVA |
| CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| WO2012010280A1 (en) | 2010-07-20 | 2012-01-26 | Bavarian Nordic A/S | Method for harvesting expression products |
| WO2012018856A2 (en) * | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Virxsys Corporation | Hiv vaccine therapy with concomitant antiviral monotherapy |
| WO2012048817A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara influenza vaccine |
| RS57397B8 (sr) | 2011-06-10 | 2020-01-31 | Univ Oregon Health & Science | Cmv glikoproteini i rekombinantni vektori |
| DK2739293T3 (da) | 2011-08-05 | 2020-08-24 | Sillajen Biotherapeutics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til frembringelse af vaccinavirus |
| AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2586461A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-01 | Christopher L. Parks | Viral particles derived from an enveloped virus |
| EP2788021B1 (en) | 2011-12-09 | 2017-01-18 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| EP2864487B1 (en) | 2012-06-22 | 2018-12-05 | Bavarian Nordic A/S | Poxviral vectors for low antibody response after a first priming immunization |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| WO2014009438A2 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterial antigen vaccine |
| WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
| BR112015002131B1 (pt) | 2012-08-01 | 2022-11-01 | Bavarian Nordic A/S | Vírus vaccinia ankara modificado (mva) recombinante, composição farmacêutica e uso do referido mva recombinante |
| WO2014037124A1 (en) | 2012-09-04 | 2014-03-13 | Bavarian Nordic A/S | Methods and compositions for enhancing vaccine immune responses |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| CA2888367A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Bavarian Nordic, Inc. | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| EA032498B1 (ru) | 2012-10-28 | 2019-06-28 | Бавариан Нордик А/С | ПРОМОТОР Pr13.5 ДЛЯ УСТОЙЧИВЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ И ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ |
| KR102269491B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2021-06-25 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 단회 고용량의 mva가 신생아 및 영아에서 보호 면역 반응을 유도 |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| AU2014340201B2 (en) | 2013-10-23 | 2019-02-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HLA-A24 agonist epitopes of MUC1-C oncoprotein and compositions and methods of use |
| WO2015077717A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status |
| US20160376596A1 (en) | 2013-11-28 | 2016-12-29 | Bavarian Nordic A/S | Compositions and methods for inducing an enhanced immune response using poxvirus vectors |
| WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
| NZ721908A (en) | 2013-12-20 | 2022-12-23 | Massachusetts Gen Hospital | Combination therapy with neoantigen vaccine |
| WO2015175340A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Bavarian Nordic, Inc. | Combination therapy for treating cancer with a poxvirus expressing a tumor antigen and a monoclonal antibody against tim-3 |
| CN106103471B (zh) | 2014-01-09 | 2020-01-07 | 特兰斯吉恩股份有限公司 | 异源寡聚分枝杆菌抗原的融合 |
| EP3888676A1 (en) | 2014-06-13 | 2021-10-06 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic combinations |
| EP3188753B1 (en) | 2014-09-03 | 2019-12-18 | Bavarian Nordic A/S | Methods and compositions for inducing protective immunity against filovirus infection |
| KR20170072195A (ko) | 2014-09-03 | 2017-06-26 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 면역 반응을 증대시키기 위한 방법 및 조성물 |
| LT3197489T (lt) | 2014-09-26 | 2021-07-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti indukuoti apsauginį imunitetą prieš žmogaus imunodeficito viruso infekciją |
| KR101623498B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-05-24 | 대한민국 | 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３ |
| KR101645642B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-08-11 | 대한민국 | Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스 |
| EP3421046A1 (en) | 2014-11-04 | 2019-01-02 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
| WO2016100975A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Massachsetts Institute Ot Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
| US10993997B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t cell repertoire |
| EP4122492A1 (en) | 2015-02-25 | 2023-01-25 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva)as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| CN116173193A (zh) | 2015-04-17 | 2023-05-30 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用 |
| IL294183B2 (en) | 2015-05-20 | 2023-10-01 | Dana Farber Cancer Inst Inc | shared neoantigens |
| TW202241500A (zh) | 2015-06-09 | 2022-11-01 | 美商博德研究所有限公司 | 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法 |
| EP3307309A1 (en) * | 2015-06-15 | 2018-04-18 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) foot and mouth disease virus (fmdv) vaccine |
| US9925258B2 (en) | 2015-10-02 | 2018-03-27 | International Aids Vaccine Initiative | Replication-competent VSV-HIV Env vaccines |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| CN106591361A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 钱文斌 | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 |
| ME03545B (me) | 2015-12-15 | 2020-07-20 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Anтigeni, veктori i sastavi virusa humane imunodeficijencije, i postupci njihove primene |
| PL3407910T3 (pl) | 2016-01-29 | 2022-08-16 | Bavarian Nordic A/S | Rekombinowana zmodyfikowana szczepionka przeciwko wirusowi krowianki ankara (mva) przeciwko wirusowi zapalenia mózgu koni |
| CN109152815B (zh) | 2016-02-25 | 2022-10-18 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | 用于癌症免疫治疗的具有胸苷激酶缺失和具有或不具有人flt3l或gm-csf表达的复制型减毒痘苗病毒 |
| EP3419662A4 (en) | 2016-02-25 | 2019-09-18 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | RECOMBINANT MVA OR MVADELE3L EXPRESSING FLT3L HUMAN AND THEIR USE AS IMMUNOTHERAPEUTIC AGENTS AGAINST SOLID TUMORS |
| MX2018012376A (es) | 2016-04-13 | 2019-08-01 | Synthetic Genomics Inc | Sistemas de replicón de arterivirus recombinantes y usos de estos. |
| US20190346442A1 (en) | 2016-04-18 | 2019-11-14 | The Broad Institute, Inc. | Improved hla epitope prediction |
| AU2017259259B2 (en) | 2016-05-02 | 2020-11-19 | Bavarian Nordic A/S | Therapeutic HPV vaccine combinations |
| KR102389489B1 (ko) | 2016-06-16 | 2022-04-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Hiv 백신 제형 |
| US10925956B2 (en) | 2016-07-15 | 2021-02-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
| CA3035759A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| EP3747463A1 (en) | 2016-09-15 | 2020-12-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Trimer stabilizing hiv envelope protein mutations |
| CN110198733A (zh) | 2016-09-28 | 2019-09-03 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 用于增强痘病毒中转基因的稳定性的组合物和方法 |
| BR112019007433A2 (pt) | 2016-10-17 | 2019-07-02 | Synthetic Genomics Inc | sistemas de replicon de vírus recombinante e usos dos mesmos |
| ES2883720T3 (es) | 2016-11-07 | 2021-12-09 | Us Health | Desarrollo de epítopos agonistas del virus del papiloma humano |
| WO2018106615A2 (en) | 2016-12-05 | 2018-06-14 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing gene expression |
| US11549149B2 (en) | 2017-01-24 | 2023-01-10 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
| US11173204B2 (en) | 2017-04-06 | 2021-11-16 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | MVA-BN and Ad26.ZEBOV or Ad26.filo prime-boost regimen |
| EP3621646A4 (en) | 2017-05-12 | 2021-06-02 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | VACCINIA VIRUS MUTANTS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY |
| JP2020519666A (ja) | 2017-05-15 | 2020-07-02 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 安定性のウイルス含有組成物 |
| WO2018211419A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| KR20200015759A (ko) | 2017-06-15 | 2020-02-12 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Hiv 항원을 인코딩하는 폭스바이러스 벡터, 및 그 사용 방법 |
| BR112020000867A2 (pt) | 2017-07-19 | 2020-07-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero |
| WO2019018724A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHODS FOR SAFE INDUCTION OF MULTICLADED CROSS-IMMUNITY AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN HUMAN BEINGS |
| KR20200044000A (ko) | 2017-08-24 | 2020-04-28 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 재조합 mva 및 항체의 정맥내 투여에 의한 암 치료를 위한 병용 요법 |
| US20190083620A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| EA202091513A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-09-09 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение |
| US11389531B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-07-19 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines |
| US11020476B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV) |
| WO2019123250A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and compositions for inducing an immune response against hepatitis b virus (hbv) |
| US11773139B2 (en) | 2017-12-20 | 2023-10-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Epstein-barr virus antigen constructs |
| CN111902163B (zh) | 2018-01-19 | 2024-02-13 | 杨森制药公司 | 使用重组复制子系统诱导和增强免疫应答 |
| US20220001001A1 (en) * | 2018-07-13 | 2022-01-06 | University Of Georgia Research Foundation | Broadly reactive immunogens of dengue virus, compositions, and methods of use thereof |
| CA3111273C (en) | 2018-09-06 | 2024-03-26 | Bavarian Nordic A/S | Storage improved poxvirus compositions |
| WO2020072700A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Hla single allele lines |
| CA3113818A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Bavarian Nordic A/S | Combination therapy for treating cancer with an intravenous administration of a recombinant mva and an immune checkpoint antagonist or agonist |
| WO2020102404A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Tp5, a peptide inhibitor of aberrant and hyperactive cdk5/p25 as treatment for cancer |
| BR112021009856A8 (pt) | 2018-11-20 | 2021-09-08 | Bavarian Nordic As | Terapia para tratamento do câncer com uma administração intratumoral e / ou intravenosa de um mva recombinante que codifica 4-1bbl (cd137l) e / ou cd40l |
| WO2020131586A2 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying neoantigens |
| TW202043256A (zh) | 2019-01-10 | 2020-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| WO2020237052A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| CA3140820A1 (en) | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Mucosal vaccine formulations |
| US11666651B2 (en) | 2019-11-14 | 2023-06-06 | Aelix Therapeutics, S.L. | Prime/boost immunization regimen against HIV-1 utilizing a multiepitope T cell immunogen comprising Gag, Pol, Vif, and Nef epitopes |
| CA3159588A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant mva viruses for intratumoral and/or intravenous administration for treating cancer |
| WO2021099572A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Bavarian Nordic A/S | Medical uses of 4-1bbl adjuvanted recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) |
| US20230287067A1 (en) | 2020-01-21 | 2023-09-14 | The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services | Human immunogenic epitopes of hemo and hhla2 human endogenous retroviruses (hervs) |
| WO2021150713A2 (en) | 2020-01-21 | 2021-07-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human immunogenic epitopes of h, k, and e human endogenous retroviruses (hervs) |
| JP2023516201A (ja) | 2020-03-12 | 2023-04-18 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ポックスウイルスの安定性を改善する組成物 |
| US20230233670A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-07-27 | Bavarian Nordic A/S | A Recombinant Modified Vaccinia Virus (MVA) Vaccine Against Coronavirus Disease |
| EP3928789A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| WO2021260065A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| BR112022027038A2 (pt) | 2020-07-08 | 2023-01-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Co | Vacinas de replicon de rna contra hbv |
| US20220118081A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine regimens |
| WO2022269003A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN |
| EP4108257A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| CA3230406A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Jurgen Hausmann | Utilization of micro-rna for downregulation of cytotoxic transgene expression by modified vaccinia virus ankara (mva) |
| WO2023118563A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Bavarian Nordic A/S | Therapy for modulating immune response with recombinant mva encoding il-12 |
| WO2023118508A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant mva viruses for intraperitoneal administration for treating cancer |
| WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
| WO2024003239A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN |
| WO2024003238A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Epstein-barr-virus vaccine |
| WO2024003346A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Mammalian cell line for the production of modified vaccinia virus ankara (mva) |
| WO2024015892A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | The Broad Institute, Inc. | Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery |
| EP4316514A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-07 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2 |
Family Cites Families (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4072565A (en) * | 1974-11-04 | 1978-02-07 | The Dow Chemical Company | Production of viruses in tissue culture without use of serum |
| US3914408A (en) * | 1973-10-12 | 1975-10-21 | Univ Nebraska | Vaccine for neonatal calf diarrhea |
| DE2714665A1 (de) * | 1977-04-01 | 1978-10-05 | Mayr Anton | Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung |
| US5155020A (en) * | 1989-03-08 | 1992-10-13 | Health Research Inc. | Recombinant poxvirus host range selection system |
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| GB8322414D0 (en) * | 1983-08-19 | 1983-09-21 | Szelke M | Renin inhibitors |
| FR2603040B1 (fr) | 1986-08-22 | 1990-01-26 | Transgene Sa | Proteine, sequence d'adn, poxvirus, cellules et leur procede de culture, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant, utiles dans la prevention de la schistosomose |
| AU613583B2 (en) | 1986-08-22 | 1991-08-08 | Transgene S.A. | Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity |
| DE3743298A1 (de) | 1987-12-19 | 1989-06-29 | Wilkinson Sword Gmbh | Rasierapparat und verfahren zur herstellung einer flaeche geringen reibungswiderstands an einem rasierapparat |
| CA1341245C (en) | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US6248333B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-06-19 | Health Research Inc. | Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD) |
| AU662491B2 (en) | 1990-09-25 | 1995-09-07 | Smithkline Beecham Corporation | Medium for culture of mammalian cells |
| EP0575491B1 (en) * | 1991-03-07 | 2003-08-13 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| US5843456A (en) * | 1991-03-07 | 1998-12-01 | Virogenetics Corporation | Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses |
| US5403582A (en) | 1993-01-21 | 1995-04-04 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus |
| US5405772A (en) | 1993-06-18 | 1995-04-11 | Amgen Inc. | Medium for long-term proliferation and development of cells |
| US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US5490794A (en) * | 1993-11-05 | 1996-02-13 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | Branch joint box |
| US6190655B1 (en) | 1993-12-03 | 2001-02-20 | Immunex Corporation | Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer |
| DE4405841C1 (de) * | 1994-02-23 | 1995-01-05 | Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr | Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel |
| JP3911010B2 (ja) * | 1994-04-29 | 2007-05-09 | イムノ・アクテイエンゲゼルシヤフト | 必須領域に外来ポリヌクレオチドを有する組換えポックスウイルス |
| NZ290089A (en) * | 1994-07-27 | 1999-05-28 | Queensland Inst Med Res | Recombinant polyepitope cytotoxic t lymphocyte (ctl) vaccines |
| US5676950A (en) * | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| US5753489A (en) | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| US5756341A (en) | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| US5566011A (en) * | 1994-12-08 | 1996-10-15 | Luncent Technologies Inc. | Antiflector black matrix having successively a chromium oxide layer, a molybdenum layer and a second chromium oxide layer |
| UA68327C2 (en) † | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| WO1997031119A1 (en) | 1996-02-21 | 1997-08-28 | Res Inst For Genetic And Human | Methods and compositions for protective and therapeutic genetic immunization |
| AU3813597A (en) | 1996-07-26 | 1998-02-20 | University Of Manitoba | Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells |
| ID19548A (id) † | 1996-09-24 | 1998-07-23 | Bavarian Nordic Res Inst As | Virus mva rekombinan yang mengekspresikan antigen-antigen virus demam dan penggunaan daripadanya dalam vaksin-vaksin |
| AU5091898A (en) | 1996-10-25 | 1998-05-15 | Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The | Method of vaccinating infants against infections |
| US6204250B1 (en) * | 1996-11-22 | 2001-03-20 | The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York | Immunization of infants |
| US20030138454A1 (en) * | 1997-06-09 | 2003-07-24 | Oxxon Pharmaccines, Ltd. | Vaccination method |
| GB9711957D0 (en) * | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Isis Innovation | Methods and reagents for vaccination |
| GB0023203D0 (en) | 2000-09-21 | 2000-11-01 | Isis Innovation | Vaccination method |
| DE19729279A1 (de) † | 1997-07-09 | 1999-01-14 | Peter Hildebrandt | Urologisches Implantat, insbesondere Gefäßwandstütze für den Urinaltrakt |
| WO1999007869A1 (en) * | 1997-08-05 | 1999-02-18 | University Of Florida | Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating virus |
| US6667176B1 (en) * | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| ATE407206T1 (de) | 1998-11-10 | 2008-09-15 | Univ Rochester | Methoden zu herstellung von genbanken |
| GB2370571B (en) | 1998-11-18 | 2003-05-07 | Oxford Biomedica Ltd | A modified 5t4 antigen |
| EP1160323A1 (en) | 1998-11-18 | 2001-12-05 | Oxford Biomedica (UK) Limited | 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy |
| US6173813B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-01-16 | Otis Elevator Company | Electronic control for an elevator braking system |
| US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| CA2401974C (en) * | 2000-03-02 | 2013-07-02 | Emory University | Dna expression vectors and methods of use |
| IL150736A0 (en) | 2000-03-14 | 2003-02-12 | Mayr Anton | Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva) |
| KR100341030B1 (ko) | 2000-03-16 | 2002-06-20 | 유태욱 | 캡션 데이터와 음성 데이터의 재생방법 및 이를 이용한 디스플레이장치 |
| KR20030036194A (ko) | 2000-05-24 | 2003-05-09 | 메리알 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ) 재조합아비폭스바이러스 백신 |
| MXPA03000279A (es) * | 2000-07-11 | 2004-04-05 | Bayer Ag | Uso de cepas del parapoxvirus ovis para la fabricacion de medicamentos antivirales y medicamentos contra el cancer. |
| US6733993B2 (en) * | 2000-09-15 | 2004-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications |
| US7097842B2 (en) * | 2000-11-23 | 2006-08-29 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| ES2256323T5 (es) | 2000-11-23 | 2016-11-21 | Bavarian Nordic A/S | Variante del virus Vaccinia Ankara Modificado |
| US7628980B2 (en) * | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| UA82466C2 (uk) * | 2001-07-18 | 2008-04-25 | Бавариан Нордика А/С | Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу |
| WO2003048184A2 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus ns1 subunit vaccine |
| MXPA04006001A (es) | 2001-12-20 | 2005-08-19 | Bavarian Nordic As | Metodo para la recuperacion y purificacion de poxvirus de celulas infectadas. |
| US7025970B2 (en) | 2002-03-15 | 2006-04-11 | Baxter International Inc. | Modified poxviruses, including modified smallpox virus vaccine based on recombinant drug-sensitive vaccinia virus, and new selection methods |
| IL163701A0 (en) * | 2002-04-19 | 2005-12-18 | Bavarian Nordic As | Modified vaccinia virus ankara for the vaccinationof neonates |
| EA020230B1 (ru) * | 2002-05-16 | 2014-09-30 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение |
| EP1404852B1 (en) * | 2002-05-16 | 2005-12-21 | Bavarian Nordic A/S | Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter |
| SI1434858T2 (sl) * | 2002-09-05 | 2019-05-31 | Bavarian Nordic A/S | Postopek za pomnoževanje poksvirusa v razmerah brez seruma |
| DE60314541T2 (de) * | 2002-11-25 | 2008-02-28 | Bavarian Nordic A/S | Mindestens zwei ati promotoren enthaltendes rekombinantes pockenvirus |
| US6976752B2 (en) * | 2003-10-28 | 2005-12-20 | Lexmark International, Inc. | Ink jet printer with resistance compensation circuit |
| DK1845164T3 (da) * | 2003-11-24 | 2010-09-20 | Bavarian Nordic As | Promoterer til ekspression i modificeret vacciniavirus ankara |
| EP1586330A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-10-19 | Georg-August-Universität Göttingen | Vaccination against malignant melanoma |
| WO2006044716A2 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Washington University In St.Louis | CELL PERMEABLE NANOCONJUGATES OF SHELL-CROSSLINKED KNEDEL (SCK) AND PEPTIDE NUCLEIC ACIDS ('PNAs') WITH UNIQUELY EXPRESSED OR OVER-EXPRESSED mRNA TARGETING SEQUENCES FOR EARLY DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCER |
| EP1835031A1 (en) | 2006-03-14 | 2007-09-19 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans |
| DK2073837T3 (da) * | 2006-10-06 | 2014-09-29 | Bavarian Nordic Inc | Rekombinant modificeret vaccinia-ankara-virus, der koder for et her-2-antigen, i kombination med en taxan til anvendelse til behandling af cancer |
| EP1925318A1 (en) | 2006-11-20 | 2008-05-28 | Paul-Ehrlich-Institut | Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu |
| US8268327B2 (en) * | 2007-04-27 | 2012-09-18 | Bavarian Nordic A/S | Immediate protection against pathogens via MVA |
| DK2207564T3 (en) * | 2007-10-18 | 2017-01-16 | Bavarian Nordic As | USE OF VAT FOR TREATMENT OF PROSTATACANCES |
-
2001
- 2001-11-22 ES ES01991753.3T patent/ES2256323T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 AU AU3163902A patent/AU3163902A/xx active Pending
- 2001-11-22 HU HU0400685A patent/HU230198B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-11-22 IL IL15471201A patent/IL154712A0/xx unknown
- 2001-11-22 UA UA2003054618A patent/UA76731C2/uk unknown
- 2001-11-22 BR BRPI0115533A patent/BRPI0115533B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-11-22 EE EEP200300173A patent/EE05680B1/xx unknown
- 2001-11-22 PL PL361459A patent/PL212047B1/pl unknown
- 2001-11-22 MX MXPA03002513A patent/MXPA03002513A/es active IP Right Grant
- 2001-11-22 AU AU2002231639A patent/AU2002231639B2/en not_active Expired
- 2001-11-22 DE DE60116371.0T patent/DE60116371T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 DK DK01991753.3T patent/DK1335987T4/en active
- 2001-11-22 EP EP01991753.3A patent/EP1335987B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 KR KR1020037006970A patent/KR100830295B1/ko active IP Right Grant
- 2001-11-22 CN CNB018194109A patent/CN100537773C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 SI SI200130512T patent/SI1335987T2/sl unknown
- 2001-11-22 KR KR1020087007423A patent/KR100910297B1/ko active IP Right Grant
- 2001-11-22 PT PT01991753T patent/PT1335987E/pt unknown
- 2001-11-22 EP EP05017694A patent/EP1598425A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 DE DE20122302U patent/DE20122302U1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 AT AT01991753T patent/ATE314483T2/de active
- 2001-11-22 CN CN200910151102A patent/CN101676389A/zh active Pending
- 2001-11-22 KR KR1020097010451A patent/KR20090057335A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-11-22 CZ CZ20031366A patent/CZ295808B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-11-22 CA CA2421151A patent/CA2421151C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 NZ NZ524661A patent/NZ524661A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-22 EP EP10158053A patent/EP2204452A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 WO PCT/EP2001/013628 patent/WO2002042480A2/en active Application Filing
- 2001-11-22 EP EP10158051A patent/EP2202315A1/en not_active Withdrawn
- 2001-11-22 JP JP2002545184A patent/JP4421188B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-22 RU RU2003118436/13A patent/RU2290438C2/ru active
-
2003
- 2003-03-03 IL IL154712A patent/IL154712A/en active IP Right Grant
- 2003-05-16 US US10/439,439 patent/US6913752B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-16 US US10/440,073 patent/US7189536B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-16 US US10/439,953 patent/US6761893B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-21 NO NO20032309A patent/NO337867B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-03-31 HK HK04102348.1A patent/HK1059453A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-08-05 US US11/198,557 patent/US7384644B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-03-27 CY CY20061100421T patent/CY1105594T1/el unknown
- 2006-08-23 US US11/508,797 patent/US7335364B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-10-26 US US11/977,808 patent/US7923017B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-12-04 US US11/999,127 patent/US7459270B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-05-22 US US12/471,144 patent/US7939086B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-03-22 US US13/053,361 patent/US8268325B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2011-03-22 US US13/053,450 patent/US8268329B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-08-17 US US13/588,217 patent/US20120328650A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-11-20 LU LU92311C patent/LU92311I2/fr unknown
- 2013-11-21 BE BE2013C065C patent/BE2013C065I2/fr unknown
- 2013-12-13 FR FR13C0070C patent/FR13C0070I2/fr active Active
- 2013-12-23 CY CY2013048C patent/CY2013048I1/el unknown
-
2016
- 2016-02-29 HU HUS1600010C patent/HUS1600010I1/hu unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4421188B2 (ja) | 変性ワクシニアアンカラウイルス変異体 | |
| AU2002231639A1 (en) | Modified vaccinia ankara virus variant |