BR112015002131B1 - Vírus vaccinia ankara modificado (mva) recombinante, composição farmacêutica e uso do referido mva recombinante - Google Patents

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Abstract

VACINA DE VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (RSV) DE VÍRUS VACCÍNIA ANCARA MODIFICADO RECOMBINANTE. São fornecidas aqui cepas de vírus de vaccínia modificadas Ancara recombinantes (MVA) como vacinas melhoradas contra infecção com vírus sincicial respiratório (vírus RSV) e para produtos relacionados, métodos e usos. Especificamente, são fornecidos aqui vetores de MVA recombinantes geneticamente modificados compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e pelo menos uma sequência de nucleotídeo que codifica um determinante antigênico de uma proteína de nucleocapsídeo de RSV. Também são fornecidos aqui produtos, métodos e usos dos mesmos, por exemplo, apropriados para afetar uma resposta imune em um sujeito, ou apropriados para diagnosticar uma infecção por RSV, bem como para determinar se um sujeito está em risco de infecção recorrente por RSV.

Description

CAMPO
[0001] A presente invenção refere-se a um vírus da vaccínia modificado recombinante Ancara (vírus MVA) como uma vacina melhorada contra uma infecção com o Vírus Sincicial Respiratório (vírus RSV) e produtos relacionados, métodos e utilizações. Especificamente, a presente invenção refere-se a um vetor MVA recombinante geneticamente modificado que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína da nucleocapsídeo de RSV. A invenção também se refere a produtos, métodos e utilizações dos mesmos, por exemplo, adequados para realizar uma resposta imune em um sujeito, ou adequados para o diagnóstico de uma infecção por RSV, bem como para determinar se um indivíduo está em risco de infecção por RSV recorrente.
FUNDAMENTOS
[0002] RSV é um patógeno respiratório significativo. A infecção aguda do trato respiratório inferior (LRT) causa significativa morbidade e mortalidade em bebês e crianças menores de cinco anos em todo o mundo [A.M. Aliyu et al. (2010), Bayero J. Pure Appl. Sci. 3(1):147-155]. O vírus respiratório sincicial (RSV) é a causa mais clinicamente importante de infecção LRT; infecção primária com RSV geralmente ocorre pela idade de 2 anos [W.P. Glezen (1987), Ped. Virol. 2:1-4; Y. Murata (2009), Clin. Lab. Med. 29(4):725-739]. Como a infecção de RSV primária não induz imunidade completa para RSV, reinfecções frequentes ocorrem ao longo da vida, com as infecções mais graves desenvolvendo em pessoas muito jovens, os muito velhos, e em pacientes imunocomprometidos de qualquer idade [Y. Murata (2009)].
[0003] Como muitos de 40% das pessoas infectadas com o RSV, eventualmente, desenvolver a doença LRT grave requer hospitalização, com a gravidade e intensidade da doença, dependendo da magnitude e intensidade da infecção e da resposta do hospedeiro [Aliyu et al. (2010)]. RSV também pode causar doença LRT grave em pacientes de qualquer idade tendo comprometidos os sistemas imunológico, respiratório, ou cardíaco, e também podem predispor crianças a posterior desenvolvimento de asma. Nos Estados Unidos apenas, RSV causa cerca de 126 mil internações e 300 mortes infantis por ano [Y. Murata (2009)]. Além disso, RSV responde por mais de 80 mil internações e mais de 13.000 mortes a cada inverno em pacientes idosos, e aqueles com condições subjacente cardiopulmonares ou imunossupressão [Y. Murata (2009)]. Apesar da importância de RSV como um agente patogênico respiratório, no entanto, não existe atualmente uma vacina contra RSV segura e eficaz no mercado.
[0004] O RSV é um vírus de RNA encapsulado da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae [Aliyu et al. (2010)]. Cada vírion contém um RSV de sentido negativo, molécula de RNA não segmentada, de cadeia simples de cerca de 15.191 nucleotídeos contendo dez genes que codificam onze proteínas separadas (M2 contém duas regiões de leitura aberta), incluindo oito proteínas estruturais (G, F, SH, M1, N, P, M2.1, e L) e três não estruturais (NS1, NS2, e M2.2) [Y. Murata (2009)]. O genoma é transcrito sequencialmente a partir de NS1 para G, na seguinte ordem: 3’-NS1-NS2-N-P-M1-SH-G-F-M2.1-M2.2-L-5’.
[0005] O envelope viral contém três glicoproteínas transmembranares (glicoproteína de ligação (G), glicoproteína de fusão (F), e uma pequena proteína hidrofóbica (SH)), bem como as proteínas da matriz (M1) [Y. Murata (2009)]. Durante a replicação de RSV, o vírus primeiro se liga à célula alvo em um processo mediado pela proteína G fortemente glicosilada. O vírus, em seguida, se funde com a célula hospedeira em um processo mediado pela proteína F, penetrando assim na membrana da célula e entrando na célula hospedeira; a proteína F também é necessária para a formação de sincícios característicos de células infectadas com RSV. Os processos de ligação e de fusão são aumentados por proteína SH. A proteína M1 regula o conjunto de RSV maduro através da interação com as proteínas do envelope F e G e com as proteínas da nucleocapsídeo N, P, e M2.1 (ver abaixo). Dentro do envelope, de RNA viral encapsulado por um complexo de transcriptase consistindo na proteína da nucleocapsídeo (N), fosfoproteína (P), fator de transcrição de alongamento (M2.1) e RNA polimerase (L) proteínas [Y. Murata (2009)]. N se associa com o RNA genômico, enquanto que P é um cofator para a L, a RNA polimerase viral. M2.1 é um fator de alongamento necessário para a transcrição viral e M2.2 regula a transcrição do genoma viral. Finalmente, NS1 e NS2 inibem atividade de interferon tipo I.
[0006] Isolados clínicos de RSV são classificados de acordo com o grupo antigênico (A ou B) e ainda subdivididos em vários genótipos (por exemplo, A2 ou ALong para o grupo A; e B1, CH-18537, ou 8/60 para o grupo B), baseado na variabilidade genética dentro do genoma viral de cada grupo antigênico [Y. Murata (2009)]. A classificação baseia-se na reatividade dos vírus com anticorpos monoclonais dirigidos contra a glicoproteína de ligação (proteína G) e por diversas análises genéticas. [M. Sato et al., J. Clin. Microbiol. 43(1):36-40 (2005)]. Entre isolados virais, algumas proteínas codificadas pelo RSV são altamente conservadas ao nível da sequência de aminoácidos (por exemplo, F), enquanto outros variam extensivamente (por exemplo, G) entre e dentro dos dois principais grupos antigênicos [Y. Murata (2009)]. As proteínas F dos grupos antigênicos A e B partilham homologia considerável. Em contraste, a proteína G é consideravelmente diferente entre os dois grupos antigênicos.
[0007] A proteína G é a proteína de RSV mais variável, com a sua região hipervariável em C-terminal contanto para a maior parte dos epítopos específicos de cepa. Padrões de epidemiologia moleculares e evolutivos de proteínas G forneceram informações importantes sobre as características clínicas e epidemiológicas de RSV. Normalmente vários genótipos diferentes circulam de uma só vez, e aquele que predomina em uma comunidade a cada ano pode mudar. No entanto, a importância da diversidade de cepas para as características clínicas e epidemiológicas de RSV é ainda pouco compreendida. Proteínas de RSV recombinantes são, portanto, acompanhadas por uma designação de cepa para indicar a cepa de RSV original do qual gene ou proteína foi clonado. Por exemplo, uma proteína G clonada de RSV cepa A Long é designada proteína G(ALong), RSV ALong G, or RSV ALong G.
[0008] RSV estimula uma grande variedade de respostas imunes em hospedeiros infectados, incluindo a secreção de quimiocinas e citocinas, a produção de anticorpos neutralizantes humorais e da mucosa, e a produção de células T CD4 + (por exemplo, TH1 e TH2) e células T CD8+ (por exemplo, CTL). Tais respostas imunes hospedeiras são em grande parte responsáveis pelas manifestações clínicas da infecção pelo RSV, já que o vírus causa citopatologia celular limitada in vivo [Y. Murata (2009)]. As manifestações fenotípicas e gravidade da doença induzida pelo RSV são aparentemente mediadas pelo equilíbrio e interações entre a gama de respostas imunológicas estimuladas pela infecção por RSV [Y. Murata (2009)].
[0009] Muitos estudos anteriores sugerem que as respostas imunes celulares e humorais desempenham diferentes papéis na indução de imunidade contra RSV e a resolução da infecção por RSV, bem como na progressão da doença [Y. Murata (2009) e referências neste]. Por exemplo, estudos com anticorpos anti-F humanizados mostraram que enquanto os anticorpos anti-RSV são suficientes para impedir ou limitar a gravidade da infecção, eles não são necessários para eliminar a infecção viral [Y. Murata (2009); A.F.G. Antonis et al. (2007), Vaccine 25:48184827]. Em contraste, as respostas de células T são necessárias para eliminar as infecções por RSV estabelecidas [Y. Murata (2009)]. A resposta de células T induzida por RSV também desempenha um papel fundamental na patologia pulmonar durante a infecção. Por exemplo, as células TH1 secretoras de interferon-Y (IFNY) - com ou sem um uma resposta CTL associada a CD8+ — elimina RSV com patologia pulmonar mínima, enquanto células TH2 secretoras de interleucina 4 (IL-4) também eliminam RSV, mas frequentemente acompanhada por alterações pulmonares significativas, incluindo infiltração eosinofílica, um marco da doença melhorada observada durante estudos de vacina anteriores (ver abaixo).
[0010] Apesar da abundância de informações disponíveis sobre a imunologia, virologia e fisiologia da infecção por RSV, no entanto, está longe de ser precisamente claro que tipo de resposta imune é provável que seja mais eficaz em induzir imunidade duradoura enquanto também não produzem doença agravada em exposição pós-vacinação contra RSV, como discutido em mais detalhe nas seções seguintes.
Desenvolvimento de Vacinas anteriores
[0011] As vacinas normalmente utilizam uma de várias estratégias para induzir imunidade protetora contra um agente infeccioso alvo ou patogênico (por exemplo, um vírus, bactéria, ou parasita), incluindo: (1) preparações de agentes patogênicos inativados; (2) preparações de patógenos vivos atenuados, incluindo isolados do patógenos geneticamente atenuados; (3) preparações de vacina de subunidade de proteína purificada; (4) vacinas baseadas em vetores virais que codificam os antígenos e/ou adjuvantes de agentes patogênicos; e (5) vacinas baseadas em DNA que codificam os antígenos de agentes patogênicos.
[0012] Esforços iniciais de desenvolvimento de vacinas RSV focaram em uma preparação de vírus inativado, até que uma eficácia dos ensaios clínicos de uma vacina de RSV inativada por formalina (FI-RSV) foram conduzidos nos Estados Unidos durante os anos 1960, com resultados desastrosos [M.R. Olson & S.M. Varga (2007), J. Immunol. 179:5415-5424]. Um número significativo de pacientes vacinados desenvolveu doença agravada pulmonar caracterizada por infiltrações de eosinófilos e neutrófilos e uma resposta inflamatória substancial após infecção natural subsequente com RSV [Olson & Varga (2007), [Blanco JC et al. (2010) Hum Vaccin. 6:482-92]. Muitos desses pacientes necessitaram de hospitalização e alguns pacientes criticamente doentes morreram. Por conseguinte, os investigadores começaram a procurar fatores virais e/ou do hospedeiro que contribuem para o desenvolvimento de doença agravada após o desafio subsequente em um esforço para desenvolver uma vacina contra RSV segura. Essa busca tem rendido muitas novas informações sobre a biologia de RSV e o amplo espectro de respostas imunes que podem induzir, mas uma vacina segura e eficaz para RSV permanece indefinida.
[0013] Os esforços de desenvolvimento de vacinas de pós-FI-RSV têm sido centrados em grande parte em vacinas de antígenos únicos usando G, F, e, em menor grau, N ou M2, com os antígenos virais ou liberados por vetores de DNA virais ou plasmídeos que expressam os genes virais ou como proteínas purificadas. [Ver, por exemplo, W. Olszewska et al. (2004), Vaccine 23:215-221; G. Taylor et al. (1997), J. Gen. Virol. 78:3195-3206; and L.S. Wyatt et al. (2000), Vaccine 18:392-397]. A vacinação com uma combinação de F + G também foi testada em bezerros, ratos do algodão e camundongos BALB/c com resultados variados [Antonis et al. (2007) (calves); B. Moss, Pedido de Patente US No. 06/849,299 (‘o pedido ’299’), depositado em 8 de abril de 1986 (ratos do algodão); e L.S. Wyatt et al. (2000) (camundongos BALB/c)]. Ambos F e G são imunogênicos em bezerros, camundongos, ratos do algodão, humanos, e, pelo menos, em algum grau em macacos infantis [A.F.G. Antonis et al. (2007) (bezerros); B. Moss, o pedido ’299 (ratos do algodão); L. de Waal et al. (2004), Vaccine 22:923-926 (infant macaques); L.S. Wyatt et al. (2000) (camundongos BALB/c); Y. Murata (2009) (humanos)].
[0014] Significativamente, contudo, a natureza e tipo de resposta imune induzida por vacinas candidatas de RSV varia - geralmente muito consideravelmente - dependendo do tipo de vacina utilizada, os antígenos selecionados, a via de administração, e até mesmo o organismo de modelo utilizado. Por exemplo, a imunização com RSV vivo ou com vetores de replicação que codificam proteínas F de RSV induz uma resposta de TH dominante acompanhada pela produção de anticorpos neutralizantes anti-F e CD8 + CTLs, ambos associados com patologia pulmonar mínima sobre desafio de vírus após a vacinação [Y. Murata (2009) e referências neste]. Em contraste, a imunização com uma preparação de RSV inativada com FI induz uma resposta de TH2 dominante completamente desprovida de uma resposta de CTL CD8 +, que produz um alterações patológicas aumentadas nos pulmões [Y. Murata (2009) e referências neste]. Curiosamente, a administração da proteína G de RSV como uma vacina de subunidade purificada ou em um vetor de replicação induz uma resposta TH2 dominante eventualmente produzindo infiltrados pulmonares eosinofílicos das vias respiratórias e hiperreatividade após o desafio com vírus pós-vacinação, uma resposta muito semelhante à doença reforçada observada com FI-RSV [Y. Murata (2009) e referências neste]. Além disso, enquanto que a vacinação com vírus vaccínia modificado Ancara (MVA) que codifica anticorpos anti-F induzidos por proteína F de RSV e células T CD8+ específicas para F em bezerros, a vacinação com anticorpos anti-M e anti-G induzidos por MVA-F+MVA-G, mas não células T CD8+ específicas para F ou G[A.F.G. Antonis et al. (2007)].
[0015] A vacinação de camundongos com vírus vaccínia (VV) expressando a proteína F (VV-F) induziu uma resposta de células T CD8 + forte que conduzem a eliminação da replicação de RSV a partir de pulmão acompanhada por uma perda de peso igual ou maior do que os camundongos imunizados com o FI-RSV [ W. Olszewska et al. (2004)]. No entanto, não foi relacionado com a doença reforçada induzida por FI-RSV ou proteína G expressando VV (VV-G) (resposta TH2 combinada de eosinofilia pulmonar e perda de peso) resultando de secreção melhorada de citocinas TH2 como IL-4 e IL-5. Alguns no campo sugeriram que uma vacina de RSV capaz de induzir uma resposta imune relativamente equilibrada, incluindo um componente celular e um humoral seria menos provável de apresentar imunopatologia reforçada no desafio após a vacinação [W. Olszewska et al. (2004)].
[0016] No entanto, enquanto a vacinação de camundongos BALB/c com vírus vaccínia modificado Ancara (MVA) que codifica F, G ou F + G induziu apenas uma resposta imune equilibrada, incluindo ambos uma resposta humoral (ou seja, uma resposta equilibrada de IgG1 e IgG2a) e uma resposta TH1 (ou seja, níveis aumentados de IFNy/interleucina-12 (IL-12) e níveis reduzidos de interleucina-4 (IL-4)/interleucina-5 (IL-5)) animais, vacinados, no entanto, ainda apresentaram alguma perda de peso [W. Olszewska et al. (2004)].
[0017] Apesar de despender um esforço considerável para caracterizar a natureza e extensão das respostas imunes induzidas por vários candidatos a vacinas em vários sistemas de modelo diferente, não se sabe exatamente qual tipo de resposta imune é necessária para transmitir imunidade duradoura e completa para RSV sem predisposição de receptores da vacina para o reforço doença. Devido ao acentuado desequilíbrio entre a carga clínica de RSV e as opções terapêuticas e profiláticas disponíveis, o desenvolvimento de uma vacina de RSV permanece uma necessidade médica não satisfeita.
DESCRIÇÃO
[0018] Embora tentativas infrutíferas anteriores para desenvolver uma vacina contra RSV focada principalmente na vacinação com glicoproteína de membrana RSV-F ou RSV-G ou ambas, os presentes inventores descobriram que a vacinação com um vírus vaccínia recombinante Ancara (MVA), que expressa pelo menos um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e pelo menos um determinante antigênico de uma proteína da nucleocapsídeo de RSV induz uma melhor proteção. Além disso, tais construções induzem imunidade estéril quase completa, quando aplicada por via intranasal em comparação com a administração subcutânea, ou mesmo quando comparado com a via de administração intramuscular utilizada por Wyatt e colegas [L.S. Wyatt et al. (2000)]. Maior proteção pode ser obtida por administração de vacinas de RSV candidatas por via intranasal, em comparação com a administração intramuscular.
[0019] Com MVAs recombinantes expressando ou glicoproteína de membrana RSV-F ou RSV-G (ou ambas) (por exemplo, MVA-mBN199B) ou com MVA recombinantes que expressa pelo menos um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e pelo menos um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV (por exemplo, MVA- mBN201B), os presentes inventores não observaram replicação de RSV nos pulmões 4 dias após desafio, embora genomas RSV ainda eram detectáveis por RT-qPCR. MVAs recombinantes que expressam pelo menos um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e pelo menos um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV (por exemplo, MVA-mBN201B) induziu uma melhor proteção e uma maior diminuição na carga viral de RSV detectável por RT-qPCR porque induziu uma resposta mais forte de células T CD8 + contra o determinante antigênico de uma proteína RSV de nucleocapsídeo. A administração de tais vírus recombinantes por via intranasal além disso induziu imunidade estéril quase completa (quase nenhuma carga viral detectável de RSV por RT-qPCR) porque induziu a resposta imune da mucosa e a secreção de anticorpos IgA, as respostas que estavam ausentes quando estas construções foram administrados por via subcutânea.
[0020] Em contraste a FI-RSV, tais construções induzem uma resposta imune de Th1 equilibrada gerando boas respostas de anticorpos, bem como as respostas celulares fortes e específicas do sistema imunológico para os antígenos de RSV. Com a administração intranasal da vacina produzindo níveis de anticorpos IgG ainda mais elevados do que os resultantes da administração subcutânea convencional em adição à indução de uma boa resposta de anticorpos IgA, a proteção é melhorada e perda de peso corporal reduzida. A magnitude da resposta imune celular foi independente da via de administração, no entanto. Curiosamente, os inventores observaram um padrão de resposta de células T induzida por MVAs recombinantes expressando pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV (por exemplo, MVA-mBN201B, expressando proteínas F, G, N, e M2 de RSV) que foi semelhante à resposta da célula T induzida por administrações RSV, ainda que muito maior.
[0021] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um vírus de vaccínia recombinante modificado Ancara (MVA), que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de vírus sincicial respiratório (RSV) e pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV.
Vírus vaccínia Ancara modificado (MVA)
[0022] MVA foi gerado por mais de 570 passagens seriadas em fibroblastos de embrião de galinha da cepa Ancara de vaccínia dérmica [vírus vaccínia Chorioallantois vírus Ancara, CVA; para revisão ver Mayr et al. (1975), Infection 3, 6-14], que foi mantida no Vaccination Institute, Ankara, Turquia durante muitos anos e usado como a base para a vacinação de seres humanos. No entanto, devido às complicações pós-vacinais muitas vezes graves associadas com vírus vaccínia, houve várias tentativas para gerar uma vacina contra a varíola mais atenuada, mais segura.
[0023] Durante o período de 1960-1974, Prof. Anton Mayr conseguiu atenuar CVA por mais de 570 passagens contínuas em células CEF [Mayr et al. (1975)]. Foi demonstrado em uma variedade de modelos animais que a MVA resultante era avirulenta [Mayr, A. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Stand. 41: 225-234]. Como parte do desenvolvimento inicial da MVA como uma vacina pré-varíola, houve ensaios clínicos utilizando MVA-517 em combinação com Lister Elstree [Stickl (1974), Prev. Med. 3: 97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel (1971), Munich Med. Wochenschr. 113: 1149-1153] em sujeitos em risco de reação adversa da vaccínia. Em 1976, o MVA derivado de estoque semente MVA- 571 (correspondente a 571 ° passagem) foi registrada na Alemanha como a vacina inicial em um programa de vacinação parenteral de dois estágios contra a varíola. Posteriormente, MVA-572 foi usado em cerca de 120 mil indivíduos caucasianos, maioria de crianças entre 1 e 3 anos de idade, sem relatos de efeitos colaterais graves, embora muitos dos sujeitos estavam entre a população com alto risco de complicações associadas à vaccínia (Mayr et al. (1978), Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390). MVA-572 foi depositado na Coleção Europeia de Culturas de Células Animais como ECACC V94012707.
[0024] Como um resultado da passagem usada para atenuar o MVA, há um número de diferentes cepas ou isolados, dependendo do número de passagens em células CEF. Por exemplo, MVA-572 foi usado na Alemanha, durante o programa de erradicação da varíola, e MVA-575 foi amplamente utilizado como uma vacina veterinária. MVA-575 foi depositado em 7 de dezembro de 2000, na Coleção Europeia de Culturas de Células Animais (ECACC) com o número de depósito V00120707. O MVA vírus CVA atenuado (Vírus Vaccínia Ancara modificado) foi obtido por propagação em série (mais de 570 passagens) do CVA em fibroblastos de embrião de galinha primário.
[0025] Embora Mayr et al. terem demonstrado durante a década de 1970 que o MVA é altamente atenuado e avirulento em humanos e mamíferos, certos investigadores relataram que o MVA não está completamente atenuado em linhagens de células de mamíferos e humanas uma vez que podem ocorrer replicação residual nestas células [Blanchard et al. (1998), J Gen Virol 79:1159-1167; Carroll & Moss (1997), Virology 238:198-211; Pat. U.S. No. 5.185.146;Ambrosini et al. (1999), J Neurosci Res 55: 569]. Assume-se que os resultados relatados nestas publicações foram obtidas com várias cepas conhecidas de MVA, uma vez que os vírus utilizados diferem essencialmente nas suas propriedades, particularmente no seu comportamento de crescimento em várias linhagens celulares. Essa replicação residual é indesejável por várias razões, incluindo questões de segurança em conexão com o uso em seres humanos.
[0026] As cepas de MVA tendo perfis de segurança reforçado para o desenvolvimento de produtos mais seguros, como vacinas ou produtos farmacêuticos, foram desenvolvidos pela Bavarian Nordic: MVA foi adicionalmente passado por Bavarian Nordic e é designada MVA-BN. MVA bem como o MVA-BN não tem aproximadamente 15% (31 kb de seis regiões) do genoma em comparação com o vírus da CVA ancestral. As eliminações afetam um número de genes de virulência e gama de hospedeiros, bem como o gene para o corpos de inclusão Tipo A. Uma amostra de MVA-BN correspondente a passagem 583 foi depositada em 30 de agosto de 2000 na Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC) sob o número V00083008.
[0027] MVA-BN pode se ligar a penetrar nas células humanas onde genes viralmente codificados são expressos de forma muito eficiente. No entanto, a montagem e liberação de vírus da progenia não ocorre. MVA-BN está altamente adaptada para células de fibroblastos de embrião de galinha primários (CEF) e não se replicam em células humanas. Em células humanas, os genes virais são expressos, e nenhum vírus infeccioso é produzido. MVA-BN é classificado como organismo de Nível de Biossegurança 1 de acordo com os Centros para Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos. Preparações de MVA-BN e seus derivados têm sido administradas a muitos tipos de animais, e em mais de 2.000 seres humanos, incluindo os indivíduos imunodeficientes. Todas as vacinas demonstraram ser geralmente seguras e bem toleradas. Apesar da sua elevada atenuação e virulência reduzida, em estudos pré-clínicos MVA-BN demonstrou provocar ambas as respostas imunes humoral e celular para vaccínia e para produtos de genes heterólogos codificados pelos genes clonados no genoma do MVA [E. Harrer et al.(2005), Antivir. Ther. 10(2):285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14):1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10(16):5381-5390].
[0028] “Derivados” ou “variantes” de MVA referem-se aos vírus que exibem essencialmente as mesmas características de replicação como o MVA, como aqui descrito, mas que exibem diferenças em uma ou mais partes do seu genoma. MVA-BN, bem como um derivado ou variante de MVA-BN não consegue replicar reprodutivamente in vivo em humanos e camundongos, mesmo em camundongos gravemente imunossuprimidos. Mais especificamente, o MVA-BN ou um seu derivado ou variante de MVA-BN tem, de preferência, também a capacidade de replicação reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF), mas sem capacidade de replicação reprodutiva na linhagem celular de queratinócitos humanos HaCat [Boukamp et al (1988 ), J Cell Biol 106: 761-771], a linhagem celular de osteossarcoma ósseo humano 143B (ECACC N° 12502 911), a linhagem celular de rim de embrião humano 293 (ECACC N° 85120602) e a linhagem celular de adenocarcinoma de cérvice humano HeLa (ATCC No. CCL-2). Além disso, um derivado ou variante de MVA-BN tem uma razão de amplificação do vírus de pelo menos duas vezes menos, mais preferencialmente de três vezes menos do que o MVA-575 em células HeLa e linhagens celulares HaCaT. Testes e ensaios para estas propriedades de variantes de MVA são descritos em WO 02/42480 (US 2003/0206926) e WO 03/048184 (US 2006/0159699), ambas incorporadas aqui por referência.
[0029] A amplificação ou a replicação de um vírus é normalmente expressa como a razão entre vírus produzido a partir de uma célula infectada (saída) para a quantidade originalmente utilizada para infectar as células em primeiro lugar (entrada) referida como a “razão de amplificação”. Uma razão de amplificação de “1” define um estado de amplificação em que a quantidade de vírus produzida a partir das células infectadas é igual à quantidade inicialmente utilizada para infectar as células, o que significa que as células infectadas são permissivas para a infecção pelo vírus e reprodução. Em contraste, uma razão de amplificação inferior a 1, ou seja, uma diminuição na saída em comparação com o nível de entrada, indica uma falta de replicação reprodutiva e, por conseguinte, a atenuação do vírus.
[0030] As vantagens da vacina baseada no MVA incluem o seu perfil de segurança, bem como a disponibilidade para a produção de vacinas em larga escala. Testes pré-clínicos revelaram que o MVA-BN demonstra atenuação e eficácia superiores em comparação com outras cepas de MVA (WO02/42480). Uma propriedade adicional de cepas de MVA-BN é a capacidade para induzir substancialmente o mesmo nível de imunidade em regimes de início de vírus vaccínia/reforço de vírus vaccínia, quando comparados com os regimes de início DNA/reforço vírus vaccínia.
[0031] Os vírus recombinantes MVA-BN, a modalidade mais preferencial aqui, são considerados seguros devido à sua deficiência de replicação distinta em células de mamíferos e a sua avirulência bem estabelecida. Além disso, além da sua eficácia, a viabilidade de produção em escala industrial pode ser benéfica. Além disso, as vacinas baseadas em MVA podem fornecer vários antígenos heterólogos e permitem a indução simultânea de imunidade humoral e celular.
[0032] Em outro aspecto, uma cepa viral de MVA adequada para gerar o vírus recombinante pode ser cepa de MVA-572, MVA-575 ou qualquer cepa do MVA atenuada da mesma forma. Também adequado pode ser um MVA mutante, como vírus vaccínia chorioallantois Ancara suprimido (dCVA). Um dCVA compreende sítios de deleção del I, del II, del III, del IV, del V, e del VI do genoma de MVA. Os sítios são particularmente úteis para a inserção de múltiplas sequências heterólogas. O dCVA pode replicar reprodutivamente (com uma razão de amplificação maior do que 10) em uma linhagem celular humana (por exemplo, linhagens celulares humanas 293, 143B, e MRC-5), que, em seguida, permite a otimização por outra mutação útil para uma estratégia de vacinação a base de vírus (ver WO 2011/092029).
Definições
[0033] O termo “determinante antigênico” refere-se a qualquer molécula que estimula o sistema imune de um hospedeiro para produzir uma resposta imune específica para o antígeno, se uma resposta celular e/ou uma resposta humoral de anticorpos. Determinantes antigênicos podem incluir proteínas, polipeptídeos, fragmentos proteicos antigênicos, antígenos, e epítopos que ainda induzem uma resposta imune em um hospedeiro e formam parte de um antígeno, homólogo ou variante de proteínas, polipeptídeos, fragmentos proteicos antigênicos e, antígenos e epítopos, incluindo, por exemplo, proteínas glicosiladas, polipeptídeos, fragmentos proteicos antigênicos, antígenos e epítopos e sequências de nucleotídeos que codificam tais moléculas. Assim, proteínas, polipeptídeos, fragmentos proteicos antigênicos, antígenos e epítopos não estão limitados a determinadas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos nativas mas englobam sequências idênticas à sequência nativa, bem como modificações na sequência nativa, tais como deleções, adições, inserções e substituições.
[0034] Preferencialmente, tais homólogos ou variantes têm pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% ou 65%, pelo menos cerca de 70% ou 75%, pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 , 86%, 87%, 88%, ou 89%, mais tipicamente, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94% e ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, mais tipicamente, pelo menos cerca de 99% de identidade com a referida proteína, polipeptídeo, fragmento antigênico da proteína, antígeno e epítopo ao nível da sequência de nucleotídeos ou aminoácidos.. O termo homólogo ou variante também engloba sequências nucleotídicas ou proteicas truncadas, suprimidas ou modificadas de outra forma como, por exemplo, (1) sequências de nucleotídeos de RSV-F ou de RSV-G que codificam formas solúveis das proteínas de RSV-F ou RSV-G correspondentes sem o peptídeo de sinal, bem como os domínios de transmembrana e/ou citoplasmático do RSV-F de comprimento total ou proteínas de RSV-G, (2) sequências de nucleotídeos de RSV-M2 ou RSV-N que codificam versões deletadas, truncadas ou de outro modo mutadas das proteínas RSV-M2 ou RSV-N de comprimento completo, (3) formas solúveis de proteínas RSV-F ou RSV-G sem o peptídeo de sinal, bem como domínios transmembrana e/ou citoplasmático de proteínas RSV-F ou RSV-G de comprimento completo, ou (4) (4) versões deletadas, truncadas ou de outra forma mutadas de proteínas RSV-M2 ou RSV-N de comprimento completo.
[0035] As técnicas para determinar a identidade de sequência entre os ácidos nucleicos e aminoácidos são conhecidas na técnica. Duas ou mais sequências podem ser comparadas por determinação da sua “percentagem de identidade”. A percentagem de identidade de duas sequências, quer sequências de ácido nucleico ou aminoácidos , é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100.
[0036] “Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação às proteínas, polipeptídeos, fragmentos proteicos antigênicos, antígenos e epítopos aqui descritos é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência (ou seja, a proteína, polipeptídeo, fragmento proteico antigênico, antígeno ou epítopo a partir do qual é derivado), após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para atingir a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público como o software BLAST, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências a serem comparadas.
[0037] O mesmo aplica-se a “percentagem (%) de identidade de sequência de nucleotídeos”, mutatis mutandis.
[0038] Por exemplo, um alinhamento adequado para sequências de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo local de homologia de Smith e Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482-489. Este algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos, usando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763. Uma implementação exemplificativadeste algoritmo para determinar a percentagem de identidade de uma sequência is é fornecida pelo Genetics Computer Group (Madison, Wis.) em aplicação de utilidade “BestFit”. Os parâmetros padrões para este método estão descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (disponível de Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Um método preferencial para estabelecer a percentagem de identidade no contexto da presente invenção é a utilização do pacote MPSRCH de programas com direitos autorais pela Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif). A partir deste conjunto de pacotes o algoritmo Smith-Waterman pode ser empregado onde os parâmetros padrão são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de gap aberto de 12, penalidade de gap extensão de uma, e um gap de seis). A partir dos dados gerado o valor “combinado” reflete “identidade de sequência”. Outros programas adequados para calcular a percentagem de identidade ou de similaridade entre sequências são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, utilizado com os parâmetros padrões. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser utilizados utilizando os seguintes parâmetros padrões: código genético = padrão; filtro=nenhum; fita=ambas; cutoff=60; expect=10; Matriz=BLOSUM62; Descrições=50 sequências; classificado por =HIGH SCORE; Banco de dados=não redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço na internet: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0039] Como aqui utilizado, um gene “heterólogo”, ácido nucleico, antígeno, ou proteína deve ser entendido como sendo uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido que não está presente no genoma de tipo selvagem poxvírus (por exemplo , MVA). O especialista entende que um “gene heterólogo”, quando presente em um poxvírus como o MVA, deve ser incorporado no genoma poxviral, de tal maneira que, após a administração do poxvírus recombinante a uma célula hospedeira, este é expresso como o correspondente produto do gene heterólogo, ou seja, como “antígeno heterólogo” e/ou “proteína heteróloga”. A expressão é normalmente conseguido ligando operativamente o gene heterólogo a elementos reguladores que permitem a expressão na célula infectada em poxvírus. Preferencialmente, os elementos reguladores incluem um promotor natural ou sintético poxviral.
[0040] “Imunidade estéril”, como aqui utilizado, significa uma imunidade protetora na ausência de genoma de RSV detectável quando os métodos de detecção sensíveis, como RT-qPCR, são aplicados.
[0041] Deve ser notado que, como aqui utilizado, as formas singulares “um”, “uma”, e “a/o”, incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um epítopo” inclui um ou mais dos epítopos e referência a “o método” inclui referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos dos especialistas na técnica que podem ser modificados ou substituídos para os métodos descritos aqui.
[0042] A menos que indicado de outra forma, o termo “pelo menos” precedendo uma série de elementos deve ser entendido para se referir a todos os elementos da série. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes destinam-se a ser englobadas na presente invenção.
[0043] Ao longo desta especificação e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreender”, e variações tais como “compreende” e “compreendendo”, será entendida como implicando a inclusão de um inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiro ou etapa. Quando aqui utilizado, o termo “compreendendo” pode ser substituído com o termo “contém” ou “incluindo” ou, por vezes, quando aqui utilizado com o termo “ter”. Qualquer dos termos acima mencionados (que compreende, contendo, nomeadamente, ter), embora menos preferencial, quando aqui utilizado no contexto de um aspecto ou modalidade da presente invenção pode ser substituído pelo termo “consistindo em”.
[0044] Quando usado aqui, “que consiste em” exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado no elemento reivindicado. Quando usado aqui, “que consiste essencialmente em” não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas do pedido.
[0045] Como aqui utilizado, o termo conjuntivo “e/ou” entre os vários elementos mencionados é entendido como englobando ambas as opções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são unidos por “e/ou”, uma primeira opção refere-se a aplicabilidade do primeiro elemento, sem o segundo. Uma segunda opção refere-se a aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção refere-se à aplicação dos primeiros e segundos elementos em conjunto. Qualquer uma destas opções é compreendida como estando dentro do significado e, portanto, satisfaz a exigência de o termo “e/ou” como aqui utilizado. Aplicabilidade simultânea de mais do que uma das opções é também entendida como estando dentro do significado e, portanto, satisfaz a exigência do termo “e/ou”.
Sequências de nucleotídeos e Proteínas de RSV
[0046] Os genes de RSV como aqui mencionados referem-se aos genes, ou para um homólogo ou variante de genes, que codificam a proteína correspondente em qualquer cepa de RSV ou isolado, mesmo que a sequência exata e/ou a localização genômica do gene pode variar entre cepas ou isolados.
[0047] Do mesmo modo, as proteínas de RSV aqui mencionadas referem-se às proteínas, ou a um homólogo ou variante das proteínas, codificadas e expressas pelo gene da proteína correspondente, como definido acima.
[0048] A título de exemplo, como aqui indiferentemente utilizado, os termos “gene de proteína F”, “gene da glicoproteína F”, “gene da proteína RSV-F”, “gene da glicoproteína RSV-F” ou “gene F” referem-se ao gene, ou a um homólogo ou variante do gene, que codifica a glicoproteína transmembrana de fusão de qualquer cepa de RSV ou isolado, mesmo que a sequência exata e/ou a localização genômica do gene da proteína F possa ser diferente entre cepas ou isolados. Por exemplo, na cepa A2 de RSV, o gene da proteína F(A2) compreende os nucleotídeos 5601-7499 (terminais incluídos) como numerados no GenBank número de acessão M11486. O gene da proteína F(A2) compreende ainda uma região de leitura aberta que codifica proteína (ORF) que abrange os nucleotídeos 5614-7338 (terminais incluídos) como numerado no GenBank No. de acessão M11486. A sequência de nucleotídeos do gene da proteína F de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 28.
[0049] Também aqui são usados indiferentemente os termos “proteína F”, “glicoproteína F”, “proteína RSV-F”, “glicoproteína RSV-F”, ou “F” que se referem à glicoproteína transmembranar de fusão pesadamente glicosilada, ou para um homólogo ou variante da proteína, codificada e expressa por um gene da proteína RSV-F, como definido acima. A sequência de aminoácidos da proteína F de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 29. A proteína F de RSV (A2) compreende um peptídeo de sinal, um domínio extracelular, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático (ver, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot No. de acessão P03420). O peptídeo de sinal da proteína F de RSV A2 consiste nos aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 29; o domínio extracelular da proteína F de RSV A2 consiste nos aminoácidos 1-529 de SEQ ID NO: 29 ou os aminoácidos 22-529 da SEQ ID NO: 29; o domínio transmembrana da proteína F de RSV A2 consiste nos aminoácidos 530-550 da SEQ ID NO: 29; e o domínio citoplasmático da proteína F de RSV A2 consiste nos aminoácidos 551-574 da SEQ ID NO: 29.
[0050] Da mesma forma, também os termos “gene de proteína G”, “gene da glicoproteína G”, “gene da proteína RSV-G”, “gene da glicoproteína RSV-G” ou “gene G” são aqui utilizados indiferentemente. Por exemplo, na cepa A2 de RSV, o gene da proteína G(A2) compreende os nucleotídeos 4626-5543 (terminais incluídos) como numerados no GenBank número de acessão M11486. O gene da proteína G (A2) compreende ainda uma região de leitura aberta que codifica proteína (ORF) que abrange os nucleotídeos 4641 -5537 (terminais incluídos) como numerado no GenBank No. de acessão M11486. A sequência de nucleotídeos do gene da proteína G de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 30.
[0051] Os termos “proteína G”, “glicoproteína G”, “proteína RSV-G”, “glicoproteína RSV-G”, ou “G” refere-se a glicoproteína transmembrana de fixação pesadamente glicosilada, ou um homólogo ou variante da proteína. A sequência de aminoácidos da proteína G de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 31. Proteína G de RSV A2 compreende um domínio extracelular, um domínio transmembrana, e um domínio citoplasmático (ver, por exemplo, UniProtKB/Swiss- Prot No. de acessão P03423). O domínio extracelular da proteína G de RSV A2 consiste nos aminoácidos 67-298 da SEQ ID NO: 31; o domínio transmembrana de proteína G de RSV A2 consiste nos aminoácidos 38-66 de SEQ ID NO: 31; e o domínio citoplasmático da proteína G de RSV A2 consiste nos aminoácidos 1-37 de SEQ ID NO: 31.
[0052] De modo intercambiável são utilizados na presente também os termos “gene de proteína M2”, “gene da proteína do nucleocapsídeo M2”, “gene da proteína de RSV M2”, “gene da proteína de matriz de RSV M2”, “gene da proteína do nucleocapsídeo de RSV M2” ou “gene M2”. Por exemplo, na cepa A2 de RSV, o gene da proteína M2 (A2) compreende os nucleotídeos 7550-8506 (terminais incluídos) como numerados no GenBank número de acessão M11486. O gene da proteína M2 (A2) compreende ainda uma região de leitura aberta que codifica proteína (ORF) que abrange os nucleotídeos 7559-8143 (terminais incluídos) como numerado no GenBank No. de acessão M11486. A sequência de nucleotídeos do gene da proteína M2 de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 32.
[0053] São aqui utilizados indiferentemente os termos “proteína M2”, “proteína do nucleocapsídeo M2”, “proteína M2de RSV”, “proteína do nucleocapsídeo RSV M2”, “proteína da matriz de RSV M2”, ou “M2”. A sequência de aminoácidos da proteína M2 de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 33 (ver, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot No. de acessão P04545).
[0054] Além disso, os termos “gene da proteína N”, “gene da proteína do nucleocapsídeo N”, “gene da proteína N de RSV”, “gene da proteína do nucleocapsídeo N de RSV” ou “gene N” podem ser aqui utilizados indistintamente. Por exemplo, na cepa A2 de RSV, o gene da proteína N (A2) compreende os nucleotídeos 1081-2277 (terminais incluídos) como numerado no GenBank Número de acessão M11486. O gene da proteína N (A2) compreende ainda uma proteína de codificação de leitura aberta (ORF) que abrange os nucleotídeos 1096-2271 (terminais incluídos) como numerados em GenBank número de acessão M11486. A sequência de nucleotídeos do gene da proteína N do RSV A2 é definida apresentada em SEQ ID NO: 34.
[0055] A sequência de aminoácidos da “proteína N”, “proteína do nucleocapsídeo N”, “proteína de RSV N”, “proteína do nucleocapsídeo RSV N”, ou “N”, termos que são aqui utilizados indiferentemente, a partir de RSV A2 está descrita em SEQ ID NO: 35 (ver, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot No. de acessão P03418).
Certas modalidades da Invenção
[0056] Em certas modalidades, o MVA recombinante expressa pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-F. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-G. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F é derivado de RSV cepa A2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G é derivado de RSV cepa A2.
[0057] Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico de RSV-F e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F é derivado de RSV cepa A2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G é derivado de RSV cepa A2. Em certas modalidades, ambos o determinante antigênico RSV-F e o determinante antigênico RSV-G podem ser derivados de RSV cepa A2.
[0058] Em certas modalidades, o MVA recombinante expressa pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-F e a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV que codifica para um determinante antigênico de RSV M2. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-F e a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de RSV N. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-G e a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de RSV M2. Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-G e a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de RSV N.
[0059] Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico de RSV-F e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G. Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F, o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G, e o determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico RSV M2. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F, o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G, e o determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico RSV N. Em certas modalidades, ambos determinante antigênico RSV-F e o determinante antigênico RSV-G podem ser derivados de RSV cepa A2.
[0060] Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F, o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G, o primeiro determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico RSV M2, e o segundo determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico de RSV N. Em certas modalidades, ambos determinante antigênico RSV-F e o determinante antigênico RSV-G são derivados de RSV cepa A2.
[0061] Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende três sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G, o primeiro determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico RSV M2, e o segundo determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico de RSV N. Em certas modalidades, ambos o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV são derivados de RSV cepa A2. Em certas modalidades, o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F.
[0062] Em certas modalidades, o MVA recombinante compreende quatro sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e duas sequências de nucleotídeos heterólogas, cada uma codificando um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. Em certas modalidades, o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G, o primeiro determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico RSV M2, e o segundo determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV é um determinante antigênico de RSV N. Em certas modalidades, ambos o primeiro determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV são derivados de RSV cepa A2. Em certas modalidades, o segundo determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-F. Em certas modalidades, o quarto determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV é um determinante antigênico RSV-G.
[0063] Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-F. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F é de comprimento completo. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F é uma variante de determinante antigênico RSV-F. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa A2 de RSV. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) F de comprimento total compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 28 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Em certas modalidades, determinante antigênico RSV (A2) F variante compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) F truncado não possui os domínios citoplasmáticos e transmembrana de determinante antigênico RSV (A2) F de tamanho completo. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) F truncado compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-F de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa ALong de RSV. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (ALong) F variante compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (ALong) F truncado não possui os domínios citoplasmáticos e transmembrana de determinante antigênico RSV (ALong) F de tamanho completo.
[0064] Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-G. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G é de tamanho completo. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G é um determinante antigênico RSV-G variante. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G de comprimento total, variante ou truncada é derivado de RSV cepa A2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) G de comprimento total compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) G truncado não possui os domínios citoplasmáticos e transmembrana de RSV de determinante antigênico (A2) G comprimento completo. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV-G de comprimento total, variante ou truncado é derivado de RSV cepa B. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (B) G truncado não tem os domínios citoplasmáticos e transmembrana de determinante antigênico RSV (B) G de comprimento completo. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (B) G truncado compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0065] Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de RSV M2. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é de comprimento total. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é uma variante de determinante antigênico RSV M2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV M2 de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa A2 de RSV. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) M2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 32, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[0066] Em certas modalidades, pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de RSV N. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é de comprimento total. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é uma variante de determinante antigênico RSV N. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa A2 de RSV. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV (A2) N compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 34, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
[0067] Em certas modalidades, ambos o determinante antigênico RSV N e o determinante antigênico RSV M2 são codificados por uma única região de leitura aberta e separados por um domínio de protease de autoclivagem. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é de comprimento total. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico de RSV M2 é uma variante de determinante antigênico RSV M2. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV M2 de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa A2 de RSV. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é de comprimento total. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é truncado. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N é uma variante de determinante antigênico RSV N. Em certas modalidades, o determinante antigênico RSV N de comprimento total, truncado ou variante é derivado da cepa A2 de RSV. Em certas modalidades, o domínio de protease de autoclivagem é derivado de vírus de Febre Aftosa. Em certas modalidades, o domínio de protease de autoclivagem é o fragmento protease 2A de vírus da Febre Aftosa Vírus da Doença, compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em determinadas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica para um determinante antigênico RSV N e um determinante antigênico RSV M2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
Sítios de integração na MVA
[0068] Em certas modalidades, as sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam para um ou mais determinantes antigênicos de glicoproteínas de membrana de RSV e um ou mais determinantes antigênicos de proteínas do nucleocapsídeo de RSV são incorporadas em uma variedade de sítios de inserção no genoma do MVA, ou no genoma de MVA- BN. As sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam um ou mais determinantes antigênicos de proteínas de RSV podem ser inseridas no MVA recombinante, como unidades de transcrição separadas ou como genes de fusão, como representado na Figura 1.
[0069] Em certas modalidades, as sequências de nucleotídeos heterólogas de RSV são inseridas em uma ou mais regiões intergênicas (IGR) do MVA. O IGR pode ser selecionado a partir de IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, e IGR 148/149, preferencialmente a partir de IGR64/65, IGR88/89, e/ou IGR 148/149. As sequências de nucleotídeos heterólogas de RSV podem ser, adicionalmente ou alternativamente, inseridas em um ou mais dos sítios de ocorrência natural de deleção I, II, II, IV, V, VI ou do MVA. Em certas modalidades, menos do que 5, 4, 3, 2 ou dos sítios de integração compreendem sequências de nucleotídeos heterólogos RSV.
[0070] O número de sítios de inserção de MVA que compreendem sequências de nucleotídeos heterólogas de RSV pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais. O MVA recombinante pode compreender sequências de nucleotídeos de RSV heterólogas inseridas em 4, 3, 2, ou menos sítios de inserção, mas preferencialmente dois sítios de inserção são utilizados. Em certas modalidades, três sítios de inserção são utilizados. Preferencialmente, o MVA recombinante compreende, pelo menos, 4, 5, 6, ou 7 sequências de nucleotídeos inseridas em 2 ou 3 sítios de inserção.
[0071] Os vírus MVA recombinantes aqui proporcionados podem ser gerados por métodos de rotina conhecidos na técnica. Métodos para obter os poxvírus recombinantes ou para inserir sequências nucleotídicas heterólogas no genoma de um poxvirus são bem conhecidos para o especialista na técnica. Por exemplo, métodos de técnicas padrão de biologia molecular tais como clonagem de DNA, isolamento de DNA e de RNA, análise de Western blot, RT-PCR e técnicas de amplificação por PCR estão descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed.) [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], e técnicas para a manipulação e manuseio de vírus encontram-se descritas em Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]. Da mesma forma, as técnicas e know-how para o tratamento, manipulação e engenharia genética de MVA são descritos em Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(see, e.g., Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] e Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998)(ver, por exemplo, capítulo 16, seção IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].
[0072] Para a geração dos vários MVAs recombinantes aqui descritos, os métodos diferentes podem ser aplicáveis. As sequências de nucleotídeos a serem inseridas no vírus podem ser colocadas em um constructo plasmídeo de E. coli no qual DNA homólogo a uma secção de DNA do MVA foi inserido. Separadamente, a sequência de DNA a ser inserida pode ser ligada a um promotor. A ligação promotor-gene pode ser posicionada na construção de plasmídeo de forma a que a ligação promotor-gene seja flanqueada em ambas as extremidades por DNA homólogo a uma sequência de DNA que flanqueia uma região de DNA de MVA contendo um locus não essencial. O constructo de plasmídeo resultante pode ser amplificado por propagação dentro de bactérias E. coli e isolados. O plasmídeo isolado contendo a sequência gênica de DNA a ser inserida pode ser transfectado para uma cultura de células, por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha (CEF), ao mesmo tempo que a cultura foi infectada com MVA. A recombinação homóloga entre o DNA de MVA no plasmídeo e o genoma viral, respectivamente, pode gerar um MVA modificado pela presença de sequências de DNA estranhas.
[0073] De acordo com uma modalidade preferencial, uma célula de uma cultura de células apropriada como, por exemplo, células CEF, pode ser infectada com um poxvírus. A célula infectada pode ser, posteriormente, transfectada com um primeiro vetor de plasmídeo, compreendendo um gene ou genes estranhos, preferencialmente sob o controle de transcrição de um elemento de controle de expressão de poxvírus. Como explicado acima, o vetor plasmídeo compreende também sequências capazes de dirigir a inserção da sequência exógena em uma parte selecionada do genoma poxviral. Opcionalmente, o vetor plasmídeo também contém uma cassete que compreende um gene marcador e/ou de seleção ligado operacionalmente a um promotor de poxvirus. Os genes marcadores ou de seleção adequados são, por exemplo, os genes que codificam a proteína fluorescente verde, β- galactosidase, neomicina-fosforibosiltransferase ou outros marcadores. A utilização de marcadores de seleção ou cassetes simplifica a identificação e isolamento do poxvírus recombinante gerado. No entanto, um poxvírus recombinante também pode ser identificado por tecnologia de PCR. Subsequentemente, uma outra célula pode ser infectada com os poxvírus recombinantes obtidos como descrito acima e foram transfectadas com um segundo vetor que compreende um segundo gene ou genes estrangeiros. No caso, este gene pode ser introduzido em um sítio de inserção diferente do genoma poxviral, o segundo vetor também difere nas sequências de poxvírus homólogas que dirigem a integração do segundo gene ou genes estranhos dentro do genoma do poxvírus. Após a recombinação homóloga ter ocorrido, o vírus recombinante que compreende dois ou mais genes estranhos pode ser isolado. Para a introdução de genes estranhos adicionais no vírus recombinante, as etapas de infecção e transfecção podem ser repetidas utilizando o vírus recombinante isolado nas etapas anteriores para a infecção e utilizando ainda um vetor que compreende um gene estranho ou mais genes para a transfecção.
[0074] Alternativamente, as etapas de infecção e de transfecção como descrito acima são permutáveis, ou seja, uma célula adequada pode em primeiro lugar ser transfectada pelo vetor de plasmídeo que compreende o gene estranho e, em seguida, infectada com o poxvírus. Como uma alternativa adicional, é também possível introduzir cada gene estranho em vírus diferentes, coinfectar uma célula com todos os vírus recombinantes obtidos e uma triagem para um recombinante, incluindo todos os genes estranhos. Uma terceira alternativa é a ligação de genoma de DNA e sequências estranhas e a reconstituição in vitro do DNA do genoma do vírus vaccínia recombinado utilizando um vírus auxiliar. Uma quarta alternativa é a recombinação homóloga em E. coli ou outra espécie de bactérias entre um genoma do vírus vaccínia clonado como um cromossoma bacteriano artificial (BAC) e uma sequência estranha linear flanqueada com sequências de DNA homólogas a sequências que flanqueiam o sítio desejado para a integração no genoma do vírus vaccínia.
Expressão de genes de RSV
[0075] Em uma modalidade, a expressão de um, mais, ou todas as sequências de nucleotídeos heterólogas RSV está sob o controle de um ou mais promotores de poxvírus. Em certas modalidades, o promotor é um promotor de poxvírus Pr7.5, um promotor híbrido precoce/tardio, um promotor PrS, promotor precoce ou tardio sintético ou natural, ou um promotor ATI de vírus de varíola. Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é selecionado do grupo que consiste no promotor PrS (SEQ ID NO: 39), o promotor Pr7.5 (SEQ ID NO: 40), o promotor PrSynIIm (SEQ ID NO: 41), o promotor PrLE1 (SEQ ID NO: 42), e o promotor PrH5m (SEQ ID NO: 43 [L.S. Wyatt et al. (1996), Vaccine 14(15):1451-1458]). Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é o promotor PrS (SEQ ID NO: 39). Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é o promotor Pr7.5 (SEQ ID NO: 40). Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é o promotor PrSynllm (SEQ ID NO: 41). Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é o promotor PrLE1 (SEQ ID NO: 42). Em certas modalidades, o promotor de poxvírus é o promotor PrH5m (SEQ ID NO: 43).
[0076] Uma sequência ou sequências de nucleotídeos heterólogas de RSV pode ser expressa como uma única unidade de transcrição. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos heteróloga de RSV pode ser operativamente ligada a um promotor do vírus vaccínia e/ou ligada a um terminador da transcrição do vírus de vaccínia. Em certas modalidades, uma ou mais sequências de nucleotídeos heteróloga de RSV estão expressas como uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode compreender ainda um sítio de reconhecimento para uma peptidase ou uma sequência de peptídeo de auto- clivagem heteróloga. A sequência do peptídeo de auto- clivagem heteróloga pode ser a peptidase 2A de vírus da Febre Aftosa.
[0077] Em certas modalidades, a “unidade de transcrição” é inserida por si mesma dentro de um sítio de inserção no genoma do MVA, mas pode também ser inserido com outras unidades de transcrição em um sítio de inserção no genoma do MVA. A “unidade de transcrição” não é de ocorrência natural (ou seja, é heteróloga, exógena ou estranha) no genoma de MVA e é capaz de transcrição em células infectadas.
[0078] Preferencialmente, o MVA recombinante compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou mais unidades de transcrição inseridas no genoma MVA. Em certas modalidades, o MVA recombinante expressa estavelmente proteínas codificadas de RSV 1, 2, 3, 4, 5, ou mais unidades de transcrição. Em certos modalidades, o MVA recombinante compreende 2, 3, 4, 5 ou mais unidades de transcrição inseridas no genoma MVA em 1, 2, 3 ou mais sítios de inserção no genoma MVA.
As vacinas de RSV e Composições Farmacêuticas
[0079] Uma vez que os vírus recombinantes, incluindo MVA MVA-BN, aqui descritos são de replicação altamente restrita e, assim, altamente atenuados, são candidatos ideais para o tratamento de uma ampla variedade de mamíferos, incluindo seres humanos e mesmo seres humanos imunocomprometidos. Assim, são aqui proporcionados os MVAs recombinantes de acordo com a presente invenção para utilização como substâncias ativas farmacêuticas, assim como composições farmacêuticas e vacinas, destinando-se a indução de uma resposta imune em um corpo animal vivo, incluindo um humano.
[0080] Para isso, o MVA recombinante, a composição farmacêutica ou vacina podem ser formuladas em solução em uma concentração na gama de 104 a 109 TCID50/ml, 105 a 5 x 108 TCID50/ml, 106 a 108 TCID50/ml, ou 107 a 108 TCID50/ml. Uma dose preferencial para humanos está compreendida entre 106 a 109 TCID50, incluindo uma dose de 106 TCID50, 107 TCID50, 108 TCID50 ou 5 x 108 TCID50.
[0081] As composições farmacêuticas aqui fornecidas podem geralmente incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou veículos aprovados, aditivos, antibióticos, conservantes, adjuvantes, diluentes e/ou estabilizadores. Essas substâncias auxiliares podem ser água, solução salina, glicerol, etanol, agentes umectantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes de pH, ou semelhantes. Os veículos adequados são tipicamente grandes moléculas metabolizadas lentamente tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos ou semelhantes.
[0082] Para a preparação de vacinas, os vírus MVA recombinantes aqui proporcionados podem ser convertidos em uma forma fisiologicamente aceitável. Isto pode ser feito com base na experiência na preparação de vacinas de poxvírus utilizadas para vacinação contra a varíola, como descrito por H. Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99:23862392 (1974).
[0083] Por exemplo, os vírus purificados podem ser armazenadas a -80°C, com um título de 5x108 TCID50/ml formulado em cerca de 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,7. Para a preparação de injeções de vacina, por exemplo, 102-108 ou 102-109 partículas do vírus podem ser liofilizadas em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de 2% de peptona e 1% de albumina humana em uma ampola, preferencialmente uma ampola de vidro. Alternativamente, as injeções de vacina podem ser produzidas por liofilização em etapas do vírus em uma formulação. Esta formulação pode conter aditivos adicionais tais como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinilpirrolidona, ou outros auxiliares, como antioxidantes ou gás inerte, estabilizadores ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina do soro humano) adequados para administração in vivo. A ampola de vidro é então selada e pode ser armazenada entre 4°C e a temperatura ambiente durante vários meses. No entanto, desde que não exista necessidade, a ampola é armazenada preferencialmente em temperaturas inferiores a -20°C.
[0084] Para vacinação ou terapia, o liofilizado pode ser dissolvido em uma solução aquosa, preferencialmente solução salina fisiológica ou tampão Tris, e administrada sistemicamente ou localmente, isto é, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intranasal ou qualquer outra via de administração conhecida para o praticante especialista. O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser otimizados pelos especialistas na técnica de um modo conhecido. No entanto, mais habitualmente um paciente é vacinado com uma segunda dose cerca de um mês a seis semanas após a primeira dose de vacinação.
Kits compreendendo Vírus MVA recombinantes
[0085] Também são aqui proporcionados kits que compreendem qualquer um ou mais dos MVA recombinantes aqui descritos. O kit pode compreender um ou vários recipientes ou frascos de MVA recombinante, juntamente com instruções para a administração do MVA recombinante a um sujeito em risco de infecção por RSV. Em certas modalidades, o sujeito é um ser humano. As instruções podem indicar que o MVA recombinante é administrado ao sujeito em dose única ou em múltiplas (ou seja, 2, 3, 4, etc.) doses. Em certas modalidades, as instruções indicam que o vírus MVA recombinante é administrado em uma primeira (inicial) e segunda (reforço) administração a indivíduos naive ou não naive.
[0086] Também é proporcionado um kit que compreende o vírus recombinante de MVA em um primeiro frasco ou recipiente para uma primeira administração (inicial) e em um segundo frasco ou recipiente para uma segunda administração (reforço). O kit também pode compreender o MVA recombinante em um terceiro, quarto ou mais frascos ou recipientes para uma terceira, ou quarta outra administração (reforço).
Métodos e Aplicações de vírus MVA recombinantes
[0087] Além disso proporcionam-se aqui métodos de imunização de um sujeito animal, bem como MVAs recombinantes para uso em métodos de imunização de um animal de estudo e utilização dos MVAs recombinantes aqui proporcionados na preparação de um medicamento ou vacina para a imunização de um sujeito animal. Em certas modalidades, o animal é um mamífero. Em certas modalidades, o mamífero é um rato, coelho, porco, camundongo, ou humano, e os métodos compreendem a administração de uma dose de qualquer um ou mais dos MVAs recombinantes aqui fornecidos para o sujeito.
[0088] O sujeito é preferencialmente um ser humano e pode ser um adulto, em que o adulto pode ser imunocomprometido. Em certas modalidades, o adulto tem idade superior a 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, ou 85 anos. Em outras modalidades, a idade do sujeito é inferior a 5 anos, menos de 3 anos, menos de 2 anos, menos de 15 meses, menos de 12 meses, menos de 9 meses, menos de 6, ou menos do que 3 meses. A idade do sujeito também pode variar de 0-3 meses, 3-6 meses, 6-9 meses, 9-12, meses 1-2 anos, ou 2-5 anos.
[0089] Em certas modalidades, quaisquer um dos MVAs recombinantes aqui fornecidas são administrados ao indivíduo a uma dose de 106 a 109 TCID50, em uma dose de 106 a 5x108 TCID50. ou 107a 108 TCID50. Os MVAs recombinantes aqui proporcionados também podem ser administrados ao indivíduo a uma dose de 106, 107 TCID50, 108, ou 5x108 TCID50. Em certas modalidades, qualquer MVA recombinante aqui proporcionado é administrado a um sujeito humano em uma dose de 107 TCID50, 108, or 5x108 TCID50.
[0090] Os MVAs recombinantes aqui fornecidos são administrados ao sujeito em uma dose única, ou em múltiplas (isto é, 2, 3, 4, etc.) doses. Em certas modalidades, os MVAs recombinantes são administrados em uma primeira (inicial) e segunda (reforço) administração. Em certas modalidades, a primeira dose compreende 107 to 108 TCID50 de vírus MVA recombinante e a segunda dose compreende 107 a 108 TCID50 de vírus MVA recombinante.
[0091] Os MVAs recombinantes podem ser administrados sistemicamente ou localmente, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, ou intranasal, preferencialmente por via subcutânea ou por via intranasal. Os MVAs recombinantes também podem ser administrados por qualquer outra via de administração conhecida para o especialista
[0092] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de diagnóstico de infecção pelo RSV e métodos para determinar se um sujeito está em risco de infecção por RSV recorrente, que pode ser uma ameaça grave, em especial para recém-nascidos, as crianças entre 1 e 6 anos de idade, e/ou os idosos.
[0093] Os presentes inventores verificaram que os métodos atuais de diagnóstico de uma infecção por RSV podem proporcionar resultados errados. Por exemplo, um imunoensaio de detecção com anticorpos contra RSV ou um ensaio de placas virais podem não necessariamente identificar com precisão os indivíduos em risco de uma infecção recorrente. De fato, os presentes inventores observaram que apesar de uma amostra retirada de um indivíduo pode retornar um resultado negativo em um teste de placa viral [ver, por exemplo, W. Olszewska et al., 2004.], estes resultados podem ser, por vezes, os falsos negativos, uma vez que métodos mais sensíveis, por vezes, demonstram que as partículas de RSV infecciosas ainda estão presentes. De fato, os métodos, tais como reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) são necessários para determinar se um sujeito pode efetivamente ser infectado com RSV, está em risco de infecção recorrente, ou, na verdade, se um sujeito vacinado adquiriu imunidade estéril para RSV. Esta determinação pode ser crítica, porque a reinfecção após a vacinação, por vezes, causa a doença potencializada, ocasionalmente, resultando em morte.
[0094] Assim, em certas modalidades, proporcionam- se aqui métodos para determinar se um indivíduo está em risco de infecção por RSV recorrente, compreendendo determinar quantitativamente se uma amostra obtida a partir do sujeito contém genomas de RSV, em que a presença de genomas de RSV indica a probabilidade de uma infecção recorrente com RSV. Em certas modalidades, a determinação quantitativa de se uma amostra obtida de um sujeito contém genomas RSV é realizada por qRT-PCR.
[0095] Como aqui utilizado, o termo “amostra” refere-se a qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecido ou outra fonte contendo polinucleotídeos e polipeptídeos ou suas porções. As amostras biológicas incluem fluidos do corpo (tais como, por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, fluido sinovial, fluido espinal, lavado broncoalveolar (BAL)) e tecidos do corpo encontrado e/ou que são suspeitos de conter o RSV, incluindo amostras clínicas obtidas, por exemplo, de sujeitos que participaram de um ensaio clínico ou outro estudo experimental. Os métodos para a obtenção de biópsias de tecidos e fluidos do corpo de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Em certas modalidades, a amostra biológica inclui ácidos nucleicos de RSV.
[0096] Como aqui utilizadas indiferentemente, os termos “RT-qPCR” ou “qRT-PCR” referem-se a um método conhecido como “reação em cadeia da polimerase quantitativa de tempo real”. Em alguns casos, este método também pode ser referido como reação em cadeia da polimerase cinética (KPCR ).
[0097] Em certas modalidades, proporcionam-se aqui métodos para determinar se um sujeito adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo quantitativamente determinar se uma amostra obtida a partir do sujeito contém genomas de RSV, em que a presença de genomas de RSV indica que o sujeito não tem imunidade adquirida estéril contra RSV. Também fornecidos aqui, métodos de imunização de um indivíduo que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo a administração intranasal de qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descritos para o sujeito. Adicionalmente ou em alternativa, qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descrito é fornecido para utilização em métodos de imunização de um sujeito que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo o método a administração intranasal de qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descritos para o sujeito. Aqui proporcionada é também a utilização de qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descritos na preparação de um medicamento e/ou de vacina para a imunização de um sujeito que não adquiriu imunidade contra RSV estéril, em que o medicamento ou vacina é administrado por via intranasal.
[0098] Em certas modalidades, são fornecidos aqui, métodos de induzir imunidade estéril contra RSV em um sujeito que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo a administração intranasal de qualquer dos MVAs recombinantes aqui descritas para o sujeito. É também aqui proporcionado qualquer um dos MVAs recombinantes descritos para uso em métodos para induzir imunidade estéril contra o RSV em um sujeito que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, os métodos compreendendo a administração intranasal de qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descritos para o sujeito. Adicionalmente ou em alternativa, é aqui proporcionada a utilização de qualquer um dos MVAs recombinantes aqui descritos na preparação de um medicamento e/ou de vacina para induzir imunidade estéril contra o RSV em um sujeito que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, em que o medicamento ou vacina é administrado por via intranasal.
[0099] Certas modalidades da presente invenção também incluem os seguintes itens: 1. Vírus da vaccínia modificado recombinante Ancara (MVA), caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de pelo menos uma glicoproteína de membrana de vírus sincicial respiratório (RSV) para o tratamento ou prevenção de uma infecção por RSV, por administração intranasal, em que a administração intramuscular é excluída. 2. Utilização de um vírus da vaccínia modificado recombinante Ancara (MVA), que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de pelo menos uma glicoproteína de membrana de vírus sincicial respiratório (RSV) para a preparação de uma composição farmacêutica e/ou vacina, em que a composição farmacêutica e/ou a vacina é administrada por via intranasal e, em que a administração intramuscular é excluída. 3. Um método para imunizar um sujeito, incluindo um ser humano, contra a infecção pelo RSV, compreendendo administrar por via intranasal uma forma recombinante do vírus vaccínia modificado Ancara (MVA), que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de vírus sincicial respiratório (RSV) ao sujeito, incluindo o ser humano, em que a administração intramuscular é excluída. 4. O MVA recombinante do item 1, o uso do item 2 e/ou o método do item 3, que compreende a administração intranasal exclusivamente. 5. O MVA recombinante do item 1, o uso do item 2 e/ou o método do item 3, que compreende a administração subcutânea. 6. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 1 ou 4 a 5, a utilização de qualquer um dos itens 2, 4 ou 5 e/ou o método de qualquer um dos itens 3 a 5, em que o MVA recombinante compreende ainda uma sequência de nucleotídeo que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 7. Vírus da vaccínia modificado recombinante Ancara (MVA), caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de glicoproteína de membrana de um vírus sincicial respiratório (RSV) e pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico do nucleocapsídeo de RSV. 8. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 7, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico RSV-F. 9. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 8, compreendendo ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana RSV-F. 10. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 9, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica uma glicoproteína de membrana de RSV-F de comprimento total. 11. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 8 a 10, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-F é derivado de RSV cepa A, preferencialmente a partir de A2 e/ou Along. 12. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 8 a 11, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-F compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 . 13. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 8 a 12, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana RSV-F compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3. 14. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 13, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica uma glicoproteína de membrana RSV-F truncada. 15. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 14, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para a glicoproteína de membrana RSV-F truncada é derivado de RSV cepa A, preferencialmente de A long. 16. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 14 ou 15, em que a glicoproteína de membrana RSV-F truncada não possui o domínio transmembrana. 17. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 14 a 16, em que a glicoproteína de membrana RSV-F truncada não possui o domínio citoplasmático. 18. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 8 a 17, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-F compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 . 19. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 8 a 18, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-F compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5. 20. O MVA recombinante, a utilização e/ou o método de qualquer dos itens precedentes, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-G. 21. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 20, compreendendo ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana RSV-G. 22. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 21, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica uma glicoproteína de membrana RSV-G de comprimento completo. 23. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 20 a 22, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-G é derivado de RSV cepa A, preferencialmente a partir da cepa A2, e/ou B. 24. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos pontos 20 a 23, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-G compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 25. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 20 a 24, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína RSV-G de membrana compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1. 26. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 25, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana de RSV codifica uma glicoproteína de membrana RSV-G truncada. 27. O MVA recombinante, a utilização e/ou método do item 26, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana RSV-G truncada é derivada de RSV cepa B. 28. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 26 ou 27, em que a glicoproteína de membrana RSV-G truncada não possui o domínio transmembrana. 29. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 26 a 28, em que a glicoproteína de membrana RSV-G truncada não possui o domínio citoplasmático. 30. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 20 a 29, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-G compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 . 31. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 20 a 30, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da glicoproteína de membrana RSV-G compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7. 32. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 6-31, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico da proteína do nucleocapsídeo de RSV N. 33. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens de 6-32, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica para um determinante antigênico de uma proteína de matriz de RSV M2. 34. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 6-33, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica uma proteína de comprimento completo. 35. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 32 a 34, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico da proteína do nucleocapsídeo de RSV N é derivado de RSV cepa A, preferencialmente cepa A2. 36. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 32 a 35, em que a sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV codifica determinantes antigênicos do nucleocapsídeo de RSV N e proteínas da matriz de RSV M2. 37. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 36, em que ambos os determinantes antigênicos do nucleocapsídeo de RSV N e das proteínas da matriz de RSV M2 são codificadas por uma única região de leitura aberta. 38. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 36 ou 37, em que os determinantes antigênicos do nucleocapsídeo de RSV N e das proteínas da matriz de RSV M2 são separados por um domínio de protease de auto-clivagem. 39. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 38, em que a sequência do domínio de protease de auto- clivagem é derivado de Vírus da Febre Aftosa. 40. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 38 ou 39, em que a sequência do domínio de protease de auto-clivagem é o fragmento de sequência de protease 2A. 41. O MVA recombinante, a utilização e/ou o método de qualquer uma itens 38 a 40, em que a sequência do domínio de protease de auto-clivagem compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. 42. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 38 a 41, em que o domínio de protease de auto-clivagem compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11. 43. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 37 a 42, em que a região única de leitura aberta compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. 44. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 37 a 43, em que a região de leitura aberta única compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17. 45. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens precedentes, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 46. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 45, incluindo determinantes antigênicos da glicoproteína RSV-F e da membrana da proteína do nucleocapsídeo de RSV N. 47. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 45, incluindo determinantes antigênicos da glicoproteína da membrana RSV-F e da proteína da matriz de RSV M2. 48. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 45, incluindo determinantes antigênicos da glicoproteína da membrana RSV-G e da proteína do nucleocapsídeo de RSV N. 49. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 45, incluindo determinantes antigênicos da glicoproteína da membrana RSV-G e da proteína da matriz de RSV M2. 50. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 44 que compreende duas sequências de nucleotídeos que codificam para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 51. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 50, incluindo determinantes antigênicos de RSV F e/ou das glicoproteínas de membrana G e da proteína do nucleocapsídeo de RSV N. 52. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 50, incluindo determinantes antigênicos de RSV F e/ou das glicoproteínas de membrana G e a proteína da matriz RSV-M2. 53. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 44 que compreende duas sequências de nucleotídeos que codificam para determinantes antigênicos de uma glicoproteína de membrana de RSV e duas sequências de nucleotídeos que codificam determinantes antigênicos de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 54. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 53, compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam para determinantes antigênicos de um RSV-F e/ou de uma glicoproteína de membrana G e os determinantes antigênicos de um nucleocapsídeo RSV N e/ou de uma proteína da matriz M2. 55. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 44 que compreende três sequências de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV e duas sequências de nucleotídeos que codificam determinantes antigênicos de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 56. O MVA recombinante, a utilização e/ou método do item 55, incluindo determinantes antigênicos de duas glicoproteínas de membrana RSV-F e/ou de uma membrana glicoproteína RSV-G e um determinante antigênico da proteína do nucleocapsídeo de RSV N e/ou da proteína de matriz RSV M2. 57. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 55, incluindo determinantes antigênicos de duas glicoproteínas de membrana RSV-G e/ou de uma membrana glicoproteína RSV-F e um determinante antigênico da proteína do nucleocapsídeo de RSV N e/ou da proteína de matriz RSV M2. 58. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 44 que compreende quatro sequências nucleotídicas que codificam para determinantes antigênicos de RSV e glicoproteínas de membrana, uma sequência de nucleotídeos que codificam para um determinante antigênico de uma proteína do nucleocapsídeo de RSV. 59. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 58, incluindo determinantes antigênicos de duas glicoproteínas de membrana RSV-F e/ou duas glicoproteínas de membrana RSV-G e um determinante antigênico da proteína do nucleocapsídeo de RSV N ou da proteína de matriz de RSV M2. 60. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos itens 1 a 44 que compreende quatro sequências nucleotídicas que codificam para determinantes antigênicos de glicoproteínas de membrana RSV e duas sequências de nucleotídeos que codificam para determinantes antigênicos de proteínas do nucleocapsídeo de RSV. 61. O MVA recombinante, a utilização e/ou processo do item 60, incluindo determinantes antigênicos de duas glicoproteínas de membrana RSV-F e/ou de duas glicoproteínas de membrana RSV-G e determinantes antigênicos da proteína do nucleocapsídeo de RSV N e/ou das proteínas de matriz RSV M2. 62. O MVA recombinante, a utilização e/ou método de qualquer um dos pontos 1 a 61, em que o MVA utilizado para gerar o recombinante MVA é MVA-BN ou um seu derivado. 63. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 1 ou 4 para 62, para utilização como substância farmacêutica ativa. 64. Uma composição farmacêutica e/ou vacina compreendendo o MVA recombinante de qualquer um dos itens 1 ou 4 para 63 e, opcionalmente, um transportador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. 65. Utilização do MVA recombinante de qualquer um dos itens 1 ou 4 a 63, na preparação de uma composição farmacêutica e/ou vacina. 66. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 6-63, a composição farmacêutica e/ou vacina do item 64 e/ou o uso de qualquer um dos números 2, 4 e 6, 8-62 ou 65 para o tratamento ou prevenção de uma infecção por RSV. 67. Um método para imunizar um sujeito, incluindo um ser humano, contra a infecção pelo RSV, compreendendo a administração de MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4 a 63 ou 66 e/ou a composição farmacêutica e/ou vacina de acordo com o item 64 ou 66 para o sujeito, incluindo um humano. 68. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4 a 63 ou 66, a composição farmacêutica e/ou vacina do item 64 ou 66, a utilização de qualquer um dos números 2, 4 e 6, 8-62, 65 ou 66 e/ou o método de qualquer um dos itens 3 a 6, 8-62 ou 67, em que o MVA recombinante é ou será administrado em uma dose de entre 107-109 TCID50. 69. O MVA recombinante, a composição farmacêutica e/ou vacina, a utilização e/ou o método de qualquer um dos itens 5-68, em que o MVA recombinante é ou deve ser administrado por via intranasal e/ou via subcutânea. 70. O MVA recombinante, a composição farmacêutica e/ou vacina, a utilização e/ou o método de qualquer um dos itens 1 até 69, em que o MVA recombinante é ou deve ser administrado em uma dose única ou múltiplas doses para um sujeito imunologicamente naive ou imunologicamente experiente, incluindo um ser humano. 71. O MVA recombinante, a composição farmacêutica e/ou vacina, a utilização e/ou o método de qualquer um dos itens 1 a 70 para administração a um sujeito, incluindo um humano, com mais de 2 anos de idade. 72. O MVA recombinante, a composição farmacêutica e/ou vacina, a utilização e/ou o método de qualquer um dos itens 1 a 70 para administração a um sujeito, incluindo um humano, com menos de 2 anos de idade. 73. Um kit que compreende um ou vários frascos de MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4 a 63, 66 ou 68 a 72 e instruções para a administração do vírus a um indivíduo em risco de infecção por RSV. 74. Um kit compreendendo o MVA recombinante de acordo com qualquer um dos itens 1, 4 a 63, 66 ou 68 a 72 e/ou o kit de acordo com o item 73, compreendendo o MVA recombinante em um primeiro frasco ou recipiente para uma primeira administração (inicial) e em um segundo frasco ou recipiente para uma segunda administração (reforço). 75. O kit de acordo com o item 73 ou 74, compreendendo o MVA recombinante em um terceiro, quarto ou mais frasco ou recipiente para uma terceira, quarta ou outra administração (reforço). 76. Uma célula compreendendo o MVA recombinante de acordo com qualquer um dos itens 1, 4 a 63 ou 66. 77. Método de produção de um MVA recombinante de acordo com qualquer um dos itens 1, 4 a 63, 66 ou 68 a 72, compreendendo as etapas de: (a) infectar uma célula hospedeira com um vírus MVA, (b) transfectar a célula infectada com um vetor recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para um determinante antigênico de RSV, a referida sequência de nucleotídeos que compreende ainda uma sequência genômica do vírus MVA capaz de dirigir a integração da sequência de nucleotídeos no genoma do vírus MVA, (c) identificar, isolar e, opcionalmente, purificar o vírus MVA recombinante gerado. 78. Um MVA recombinante gerado de acordo com o método do item 77. 79. Um método para a produção de um MVA recombinante de acordo com qualquer uma itens 1, 4 a 63, 66 ou 68 a 72 e/ou para a produção de um determinante antigênico expresso a partir do genoma de dito MVA recombinante compreendendo as etapas de: (a) infectar uma célula hospedeira com o MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4-63, 66 ou de itens 68 a 72, ou transfecção da célula com o DNA recombinante de MVA recombinante, (b) cultivar a célula infectada ou transfectada, (c) isolar o MVA e/ou determinante antigênico a partir da referida célula. 80. Um MVA recombinante e/ou determinante antigênico pode ser obtido pelo método do item 79. 81. Método para determinar se um indivíduo está em risco de infecção recorrente por RSV, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação por meio de RT-qPCR se em uma amostra obtida a partir do sujeito RSV está presente, pelo que a presença de RSV indica a presença de uma infecção recorrente por RSV. 82. Método para determinar se um sujeito adquiriu imunidade estéril contra RSV, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação por meio de RT-qPCR se em uma amostra obtida a partir do sujeito se RSV está presente, pelo que a presença de RSV indica que o indivíduo não adquiriu imunidade estéril contra RSV. 83. Um método de imunização de um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo a administração por via intranasal de MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4-63, 66, 68 a 72, 78 ou 80 ou a composição farmacêutica e/ou vacina de qualquer um dos itens 64, 66 ou 68 a 72 para o sujeito. 84. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 463, 66, 68 a 72, 78 ou 80 e/ou a composição farmacêutica e/ou vacina de qualquer um dos itens 64, 66 ou 68 a 72 para utilização em um método de imunização de um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo o referido método a administração intranasal de dito MVA recombinante para o sujeito. 85. Utilização do MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4-63, 66, 68 a 72, 78 ou 80 para a preparação de uma composição farmacêutica e/ou de vacina para a imunização de um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 a não adquiriu imunidade estéril contra RSV, em que a composição farmacêutica e/ou a vacina é para administração intranasal. 86. Um método de indução de imunidade estéril em um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo a administração por via intranasal de MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4 a 63, 66, 68 a 72, 78 ou 80 e/ou a composição farmacêutica e/ou vacina de qualquer um dos itens 64, 66 ou 68 a 72 ao sujeito. 87. O MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 463, 66, 68 a 72, 78 ou 80 e/ou a composição farmacêutica e/ou vacina de qualquer um dos itens 64, 66 ou 68 a 72 para utilização em um método de indução de imunidade estéril em um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, compreendendo o referido método a administração intranasal do referido MVA recombinante para o sujeito. 88. Utilização do MVA recombinante de qualquer um dos itens 1, 4-63, 66, 68 a 72, 78 ou 80 para a preparação de uma composição farmacêutica e/ou vacina para induzir imunidade estéril em um sujeito diagnosticado pelo método do item 82 que não adquiriu imunidade estéril contra RSV, em que a composição farmacêutica ou vacina é para administração intranasal.
[0100] Deve ser entendido que a descrição geral e detalhada anterior são apenas exemplificativas e explicativas e não restringem ou limitam a invenção como reivindicada. Os desenhos que a acompanham estão incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram várias modalidades da invenção e juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0101] A Figura 1 mostra os genes heterólogos de RSV utilizados nos constructos de MVAs recombinantes testados, MVA-mBN199B, MVA-mBN201B, MVA-mBN201BΔM2, MVA- mBN294B, MVA-mBN295B e MVA-mBN330B.
[0102] A Figura 2 mostra as respostas de IgG específicas de RSV séricos medidos por ELISA baseado em Hamburgo IBL. Os camundongos foram imunizados (s.c. ou i.m.) duas ou três vezes com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA- mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BÁM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros foram diluídos a 1/100 e analisados utilizando um ELISA de IgG específico para o RSV com base no kit IBL Hamburgo, utilizando placas revestidas com proteínas RSV F e G.
[0103] A Figura 3 mostra as respostas de IgG específicas de RSV séricos medidos por ELISA baseado em Hamburgo IBL após a diluição serial. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com ou 1x108 TCID50 of MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros foram diluídos (1/100, 1/200 e 1/400) e analisados utilizando um ELISA de IgG específico para o RSV com base no kit IBL Hamburgo, utilizando placas revestidas com proteínas RSV-F e G.
[0104] A Figura 4 mostra as respostas de IgG específico de RSV de soro medidos por ELISA baseado em Hamburgo IBL utilizando placas revestidas apenas com a proteína F. Os camundongos foram imunizados s.c. duas ou três vezes com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA- mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros foram diluídos a 1/100 e analisados utilizando um ELISA de IgG específico para o RSV com base no kit IBL Hamburgo, utilizando placas revestidas com apenas proteína RSV-F.
[0105] A Figura 5 mostra as respostas de IgG específico de RSV de soro medidos por ELISA baseada em Serion. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com 1 x 10 ou 1x108 TCID50 de MVA- mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros foram diluídos (1/100) e analisados utilizando um ELISA de IgG específico para o RSV com base no kit Serion, utilizando placas recobertas com um lisado de RSV.
[0106] A Figura 6 mostra as respostas de IgA específica para RSV contra a IgG medidas por ELISA baseada em Hamburgo IBL no lavado broncoalveolar (LBA) e soros. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com ou 1x108 TCID50 of MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros e fluidos BAL foram diluídas (1/100) e analisados por meio de um anticorpo de IgG específico para o RSV ou ELISA IgA baseado no kit IBL Hamburgo, utilizando placas revestidas com proteínas RSV-F e G.
[0107] A Figura 7 mostra respostas de células T específicas para RSV F, RSV-G e RSV-M2 medidos por ELISPOT. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com 1 x 10 ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA- mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os baços foram isolados no dia 48 e os esplenócitos foram estimulados de novo com três peptídeos diferentes específicos para RSV-F (RSV-1 (SEQ ID NO:19), RSV-2 (SEQ ID NO:20) e RSV-3 (SEQ ID NO:21), um peptídeo específico para RSV-G (RSV-4 (SEQ ID NO:22)), um peptídeo específico para RSV M2 (RSV-9 (SEQ ID NO:27)) ou MVA-BN. Células secretoras de IFNy foram detectadas por ELISPOT. O índice de estimulação foi calculado como explicado nos exemplos.
[0108] A Figura 8 mostra a perda de peso corporal relativa depois de desafiados com o RSV (A2). Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com ou 1x108 TCID50 of MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV(A2) no Dia 49. O peso foi medido diariamente a partir do dia do desafio. O peso no dia de desafio foi usado como linha de base para calcular a percentagem relativa de mudança de peso corporal.
[0109] A Figura 9 mostra a carga do RSV nos pulmões medida por ensaio de placas. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com ou 1x108 TCID50 of MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV(A2) no Dia 49. Os pulmões foram isolados 4 dias mais tarde e a carga de RSV (pfu por pulmão) foi determinada por ensaio de placas.
[0110] A Figura 10 mostra a carga do RSV nos pulmões medido por RT-qPCR. Os camundongos foram imunizados duas ou três vezes (s.c. ou i.n.) em TBS com ou 1x108 TCID50 of MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BΔM2. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV A2 no Dia 49. Os pulmões foram isolados 4 dias mais tarde e a carga de RSV (estimado com base no número de cópias do gene L observadas) foi determinada por RT-qPCR.
[0111] A Figura 11 mostra o nível de IL4 no lavado broncoalveolar (LBA) 4 dias após desafio de RSV (A2) medido por ELISA. Os camundongos foram imunizados duas vezes (s.c. ou i.n.) com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B ou MVA- mBN201B. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV A2. Os pulmões foram lavados com 1 ml de PBS 4 dias mais tarde e o nível de IL4 no BAL foi determinada por ELISA. (n.d. = não detectável)
[0112] A Figura 12 mostra o nível de IL-5 no lavado broncoalveolar (LBA) 4 dias após desafio de RSV (A2) medido por ELISA. Os camundongos foram imunizados duas vezes (s.c. ou i.n.) com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B ou MVA- mBN201B. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV A2. Os pulmões foram lavados com 1 ml de PBS 4 dias mais tarde e o nível de IL-5 em BAL foi determinado por ELISA. (n.d. = não detectável)
[0113] A Figura 13 mostra as respostas de IgG específicas de RSV em soro medidas por ELISA baseada em Serion. Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA- mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros de cinco camundongos por grupo obtidos 2 semanas após a última imunização foram diluídos e analisados usando um ELISA de IgG específico para o RSV com base no kit Serion, utilizando placas recobertas com um lisado de RSV.
[0114] A Figura 14 mostra as respostas de anticorpos neutralizantes específicos de RSV de soro medido por PRNT. Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA- mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os soros de cinco camundongos por grupo obtido 2 semanas após a última imunização foram analisados por PRNT.
[0115] A Figura 15 mostra respostas de células T específicas de RSV F e RSV-M2 medidas por ELISPOT. Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA- mBN201B ou MVA-mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes, com 106 pfu RSV. Os baços foram isolados no dia 34 e os esplenócitos foram estimulados de novo com um peptídeo específico de RSV F (RSV-2 (SEQ ID NO:20), um peptídeo específico de RSV M2 (RSV-9 (SEQ ID NO:27)) ou MVA-BN. Células secretoras de IFNy foram detectadas por ELISPOT. O índice de estimulação foi calculado como explicado nos exemplos.
[0116] A Figura 16 mostra a carga de RSV nos pulmões medida por ensaio de placas. Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA- mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes i.n. com 106 pfu RSV ou i.m. com 50μl FI-RSV. Camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV(A2) no Dia 49. Os pulmões foram isolados 4 dias mais tarde e a carga de RSV (pfu por pulmão) foi determinada por ensaio de placas.
[0117] A Figura 17 mostra a carga do RSV nos pulmões medida por RT-qPCR. Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes i.n. com 106 pfu RSV ou i.m. com 50μl FI-RSV. Os camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV A2 no Dia 49. Os pulmões foram isolados 4 dias mais tarde e a carga de RSV (estimado com base no número de cópias do gene L observadas) foi determinada por RT-qPCR.
[0118] A Figura 18 mostra infiltrações de eosinófilos e neutrófilos nos fluidos de lavado broncoalveolar (LBA) 4 dias após desafio de RSV (A2). Os camundongos foram imunizados s.c. duas vezes três semanas de distância com TBS ou 1x108 TCID50 de MVA-mBN199B, MVA- mBN201B ou MVA-mBN294A. Os camundongos de controle foram imunizados duas vezes i.n. com 106 pfu RSV ou i.m. com 50μl FI-RSV. Os camundongos foram então desafiados com 106 pfu RSV A2. Os pulmões foram lavados com 1 ml de PBS 4 dias mais tarde e a percentagem de neutrófilos e de eosinófilos no fluido BAL foi determinada.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0119] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA que codifica a proteína G de comprimento completo RSV humano (HRSV) cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0120] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da proteína G de comprimento completo a partir de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0121] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de DNA que codifica para a proteína F de comprimento completo (variante BN) de hRSV cepa A2.
[0122] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos da proteína F de comprimento completo (variante BN) de hRSV cepa A2.
[0123] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de DNA que codifica para a proteína F de comprimento completo (variante BN) de hRSV de cepa ALong.
[0124] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos que codifica a proteína F de comprimento completo (variante BN) de hRSV de cepa ALong.
[0125] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de DNA que codifica a proteína G truncada sem os domínios transmembrana e citoplasmáticos de hRSV cepa B (GenBank número de acessão P20896).
[0126] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da proteína G truncada sem os domínios transmembrana e citoplasmáticos de hRSV cepa B (GenBank número de acessão P20896).
[0127] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de DNA que codifica a proteína N sem um códon de parada da hRSV cepa A2 (Genbank No. de acessão M11486).
[0128] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos da proteína N sem um códon de parada da hRSV cepa A2 (Genbank número de acessão M11486).
[0129] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de DNA que codifica um fragmento de protease 2A de Vírus da Febre Aftosa sem ambos códons de início e parada.
[0130] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de um fragmento de protease 2A do Vírus da Febre Aftosa sem ambos códon de início e parada.
[0131] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de DNA que codifica a proteína M2 de comprimento completo sem um códon de início de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0132] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos que codifica a proteína M2 de comprimento completo sem um códon de início de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0133] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de DNA que codifica a proteína F truncada sem os domínios transmembrana e citoplasmáticos (variante BN) de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0134] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos da proteína F truncada sem os domínios transmembrana e citoplasmáticos (variante BN) de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0135] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de DNA que codifica a proteína N sem um códon de parada de hRSV cepa A2 (Genbank No. de acessão M11486) + uma sequência de DNA que codifica fragmento protease 2A a partir de vírus de febre aftosa, sem um códon de início e um códon de parada + uma sequência de DNA que codifica a proteína M2 de comprimento completo sem um códon de início de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0136] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos da proteína N do hRSV cepa A2 (Genbank No. de acessão M11486) + a sequência de aminoácidos do fragmento de protease 2A a partir do vírus da febre aftosa, sem um códon de início + a sequência de aminoácidos da proteína M2 de comprimento completo sem um códon de início de hRSV cepa A2 (GenBank número de acessão M11486).
[0137] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo de RSV-derivado da proteína RSV-F.
[0138] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos de RSV-2 peptídeo derivado da proteína RSV-F.
[0139] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos de RSV-3 peptídeo derivado da proteína RSV-F.
[0140] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos de RSV -4 peptídeo derivado da proteína RSV-G.
[0141] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos de RSV-5 peptídeo derivado da proteína RSV-G.
[0142] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos de RSV-6 peptídeo derivado da proteína RSV-G.
[0143] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos de RSV-7 peptídeo derivado da proteína RSV-G.
[0144] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos de RSV-8 peptídeo derivado da proteína RSV-G.
[0145] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos de RSV-9 peptídeo derivado da proteína de RSV M2.
[0146] SEQ ID NO: 28 é uma sequência de DNA que codifica para a proteína F de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0147] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos da proteína F de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0148] SEQ ID NO: 30 é uma sequência de DNA de comprimento completo que codifica a proteína G de hRSV cepa A2.
[0149] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos da proteína G de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0150] SEQ ID NO: 32 é uma sequência de DNA que codifica para a proteína M2 de comprimento completo a partir de hRSV cepa A2.
[0151] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos da proteína M2 de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0152] SEQ ID NO: 34 é uma sequência de DNA que codifica para a proteína N de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0153] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos da proteína N de comprimento completo de hRSV cepa A2.
[0154] SEQ ID NO: 36 é Iniciador 1 utilizado em análise de RT-qPCR.
[0155] SEQ ID NO: 37 é Iniciador 2 utilizado em análise de RT-qPCR.
[0156] SEQ ID NO: 38 é Sonda 6 utilizada em análise de RT-qPCR.
[0157] SEQ ID NO: 39 é a sequência de nucleotídeos do promotor PrS.
[0158] SEQ ID NO: 40 é a sequência de nucleotídeos do promotor Pr7.5.
[0159] SEQ ID NO: 41 é a sequência de nucleotídeos do promotor PrSynIIm.
[0160] SEQ ID NO: 42 é a sequência de nucleotídeos do promotor PrLE1.
[0161] SEQ ID NO: 43 é a sequência de nucleotídeos do promotor PrH5m.
EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de MVAs Recombinantes.
[0162] Geração de MVA recombinante foi realizada através da inserção de sequências de codificação de RSV em conjunto com os promotores indicados (Figura 1) no genoma do MVA por via da recombinação homóloga em células CEF, usando um marcador de seleção para selecionar para MVA recombinante. A utilização de regiões intergênicas (IGRs) como sítios de inserção é descrita em WO 03/097845. A fim de eliminar o marcador de seleção, uma segunda etapa de recombinação homóloga foi empregue.
[0163] Vírus MVA-BN® foi utilizado como material de partida para a geração do MVA-mBN199B recombinante contendo os genes para RSV-A2-G e RSV-F-A2_BN em IGR88/89. O material pré-mestre de MVA-mBN199 foi utilizado como material de partida para a geração de MVA-mBN201 B descrito abaixo.
Inserções em IGR88/89 (MVA-mBN199B):
[0164] A sequência de codificação para o RSV-A2-G é baseada na sequência de ocorrência natural da glicoproteína G da cepa RSV-A2. A sequência de codificação da proteína de fusão de RSV-F-A2 BN também é baseada na cepa RSV-A2, mas foi modificada por Bavarian Nordic. Ambos os genes inseridos foram sintetizados por Geneart com utilização de códons adaptados humanos e utilizados para clonagem de um plasmídeo de recombinação. A sequência da proteína de RSV- A2-G mostra 100% de identidade à sequência no GenBank P03423.1. A sequência da proteína de RSV-F-A2 BN mostra apenas 99% de identidade de sequência no GenBank P03420.1 devido a uma única troca de aminoácido (P para A) na posição 103.
Inserções em IGR148/149 (MVA-mBN201 B):
[0165] As sequências de codificação para RSV-N-A2 e RSV-M2-A2 estão baseados nas sequências que ocorrem naturalmente das respectivas glicoproteínas da cepa RSV-A2. Ambos os genes são ligados por uma sequência peptídica 2A de auto-clivagem [M.D. Ryan et al. (1991), J. Gen. Virol. 72(Pt 11):2727-2732] que permite a expressão de duas proteínas nativas separados sob o controle de um único promotor. As sequências de codificação para RSV-G (B) e RSV-F ALong BN foram truncadas para remover os domínios transmembrana, de modo que as proteínas expressas possam ser secretadas. Todos os genes inseridos foram sintetizados por Geneart com utilização de códons otimizados e utilizados para clonagem do plasmídeo de recombinação. As sequências de proteínas de RSV-N-A2 e RSV-M2-A2 mostram 100% de identidade com a sequência no GenBank P03418.1 e P04545.1, respectivamente. A sequência da proteína de RSV-G (B) truncada mostra 100% de identidade com a sequência no GenBank P20896.1. A sequência de codificação de RSV-F ALong BN truncada foi concebida para conter os primeiros 526 aminoácidos da proteína de RSV-F, como descrito por R.P. Du et al. (1994) Biotechnology (N Y) 12(8):813-818.
Mutante de deleção em M2 (A2) de MVA-mBN210BΔM2:
[0166] MVA-mBN210BΔM2 inclui uma mutação de deleção no 12° códon do gene M2 (A2) não permitindo que uma M2 funcional seja expressa. Esta deleção provoca a adição dos dois aminoácidos treonina e alanina para os primeiros 11 aminoácidos de M2 (A2), seguido de uma parada de transcrição (códon de parada UGA).
Exemplo 2: Imunogenicidade e eficácia de vacinas de MVA recombinante Expressando proteína RSV F, proteína RSV- G, o proteína RSV N, e proteína RSV M2.
[0167] A vacina candidata MVA-mBN199B codifica a glicoproteína (G) e a proteína de fusão (F) de RSV, enquanto que MVA-mBN201BΔM2 e MVA-mBN201B expressam versões truncadas de F e G em adição às proteínas F e G de comprimentos completos, a proteína do nucleocapsídeo (N) e, no caso de MVA-mBN201 B, também a proteína de matriz (M2) do RSV (ver Figura 1). O objetivo destes experimentos foi analisar a imunogenicidade e eficácia protetora de MVA- mBN201BΔM2 e MVA-mBN201B em comparação com MVA-mBN199B depois de dois ou três imunizações através das vias de administração subcutânea (SC) ou intranasal (i.n.).
[0168] A eficácia destes constructos foi testada usando um modelo de desafio RSV (A2) em camundongos BALB/c. Duas imunizações com MVA-mBN199B ou MVA-mBN201 B ofereceu proteção parcial como julgado por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR), quando aplicadas por via subcutânea e uma proteção quase completa quando aplicada por via intranasal. A proteção oferecida pelo MVA-mBN201 B foi melhor do que a oferecida pelo MVA- mBN199B. Não houve diferença nas respostas imunes humorais induzidas pelos dois constructos, embora diferenças maiores fossem observadas nas respostas de células-T. MVA-mBN199B induziu uma boa resposta celular específica para RSV-F, enquanto que uma resposta forte de células T específica para M2 foi observada com MVA-mBN201B, assim como uma resposta específica para G mais pronunciada em comparação com o MVA-mBN199B. À medida que as respostas de células T e IgG induzidas após imunização subcutânea e intranasal foram semelhantes, a imunidade estéril quase completa obtida por imunizações intranasais provavelmente se correlaciona com a indução e secreção de IgA específica para RSV no local da infecção da mucosa. Para MVA-mBN201BΔM2, a falta de respostas de células T específicas para M2 se correlaciona com uma proteção reduzida em comparação com o MVA-mBN201B e proporcionou uma proteção semelhante à de MVA-mBN199B.
Desenho do Estudo
[0169] Os camundongos foram tratados por via subcutânea (s.c.) ou por via intranasal (i.n.) com 1x108 TCID50 MVA-mBN199B (grupos 3, 4 e 5), 1x108 TCID50 MVA- mBN201B (Grupos 6, 7 e 8), or 1x108 TCID50 MVA-mBN201BΔM2 (Grupo 9). Camundongos foram tratados duas vezes (Grupos 3, 4, 6, 7 e 9) ou três vezes (grupos 5 e 8) de acordo com a Tabela 1. Os dois grupos de controle foram tratados (s.c.) duas vezes com TBS (Grupo 1) ou i.n. com RSV (grupo 2), de acordo com a Tabela 7. O sangue foi recolhido no dia antes da imunização ou desafio, bem como no dia do sacrifício. Os títulos de IgG específicos para RSV foram determinados pelos métodos de Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). No Dia 48, metade dos camundongos foi sacrificada. Os seus baços foram removidos e preparados para análise de respostas de células T específicas para RSV por spot imunoabsorvente ligado a enzima (ELISPOT). No dia 49, os camundongos restantes foram desafiados (i.n.) com 106 pfu RSV A2. Aparência e peso corporal foram monitorados diariamente comenaçando no dia do desafio. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados por injeção de uma dose elevada de cetamina-xilazina e sangrados. Após a lavagem pulmonar, os pulmões foram removidos e a carga de RSV foi analisada por ensaio de placa e por RT-qPCR.Tabela 1: Desenho Experimental
Figure img0001
Figure img0002
% Relativa a primeira imunização. # camundongos foram desafiados por via intranasal com 106 pfu de RSV A2. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sangrados e sacrificados sob anestesia. Fluido BLA e os pulmões foram amostrados. & No dia 48, estes camundongos foram sacrificados e os baços foram analisados por ELISPOT. Cronograma do estudo. O cronograma da fase em vida é resumido na Tabela 2. Tabela 2: Cronograma do estudo da Fase em vida
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Figure img0005
** Em relação ao dia da 1° imunização.
Material e Métodos
[0170] Animais experimentais. Oitenta e cinco camundongos do sexo feminino BALB/cJ Rj (H-2d) com a idade de sete semanas foram obtidos a partir de Janvier (Route des Chenes Sees, F-53940 Le Genest-Saint-lsle, França). Todos os camundongos foram livres de patógenos específicos.
[0171] Alojamento. O estudo foi realizado na sala 117 do biotério no Bavarian Nordic-Martinsreid. Esta unidade foi fornecida com ar filtrado a uma temperatura de 20-24°C e uma umidade relativa entre 40% e 70%. O ambiente estava iluminado artificialmente em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. O período de aclimatação do estudo foi de 15 dias. Os animais foram alojados em gaiolas transparentes ™ (H Temp [polysulfon] gaiola Tipo II L - padrão Euro), com uma área útil de 530 cm2. As gaiolas foram cobertas com um H-Temp SealSafe™ lid. As gaiolas foram colocadas em um sistema TECNIPLAST-IVC SealSafe™ com uma unidade de circulação SLIMLine™ proporcionando cada gaiola única separadamente com ar filtrado HEPA. Camas para animais foram alterada uma vez por semana.
[0172] Dieta e água. Camundongos foram fornecidos com acesso gratuito à dieta de manutenção irradiada (SSNIFF R/M-H, irradiada, V1534-727) e água (autoclavada a 121°C por 20 minutos).
[0173] Procedimentos de Pré-Tratamento: identificação de animais. Para marcar individualmente animais em cada gaiola, perfuração da orelha foi feita de acordo com procedimentos padrão.
[0174] Avaliação de Inclusão/Exclusão. Avaliação de inclusão/exclusão foi realizada de acordo com procedimentos padrão.
[0175] Coleta de sangue para Pré-sangramento. As amostras de sangue de aproximadamente de 150 μl foram obtidas por punção da veia facial de acordo com os procedimentos padrão. As amostras de sangue foram transferidas para o laboratório para posterior processamento de acordo com os procedimentos padrão.
[0176] Procedimentos de tratamento: preparação e administração de Itens de teste 1-3 e item de referência. Preparação e administração de itens de teste e de referência foi realizada em gabinete de segurança microbiológica de classe II (HERAsafe®/class II tipo H, Kendro) de acordo com os procedimentos padrão. Resumidamente, para administração subcutânea, MVAs recombinantes foram diluídos em TBS para se obter uma solução de trabalho com uma concentração de 2x108 TCID50/ml. 1x108 TCID50 em 500μl s.c. foi injetado de acordo com procedimentos padrão. Para administração i.n., os MVAs recombinantes foram diluídos em TBS para se obter uma solução de trabalho com uma concentração de 2x109 TCID50/ml. 50 μl dos vírus diluídos foram administrados em uma narina de camundongos anestesiados (xilazina/cetamina) de acordo com processos convencionais. 500μl de TBS foram administrados s.c. de acordo com procedimentos padrão.
[0177] Preparação e Administração de Item de Teste 4/Desafio de vírus. O frasco de estoque de RSV foi descongelado e utilizado o mais depressa possível devido à instabilidade do vírus (máximo de 15 minutos no gelo). O vírus foi mantido em gelo em todos os momentos e imediatamente utilizado para desafiar camundongos anestesiados (cetamina/xilazina) com 100 μl da solução vírus puro por via intranasal de acordo com os procedimentos padrão.
Procedimentos de Pós-tratamento:
[0178] Peso Corporal. Os pesos corporais foram monitorados em uma base diária a partir do dia do desafio até ao sacrifício de acordo com procedimentos padrão.
[0179] Amostragem de sangue. As amostras de sangue (aproximadamente 150 μl) foram obtidas por punção retrobulbar ou da veia facial (para detalhes ver Tabela 1 e Tabela 2), de acordo com procedimentos padrão. As amostras de sangue foram transferidas para o laboratório para posterior processamento de acordo com os procedimentos padrão.
[0180] Eutanásia. Eutanásia de metade dos camundongos foi realizada no dia 48, por deslocamento cervical. No Dia 53, os restantes camundongos receberam uma dose dupla de cetamina-xilazina por injeção intraperitoneal e a eutanásia foi realizada por corte da aorta no interior da cavidade peritoneal.
[0181] Remoção do baço. Os baços foram removidos assepticamente. Eles foram colocados em tubos cheios com meio de acordo com procedimentos padrão. Esses tubos foram importados para a instalação de animais e foram então exportados de acordo com os procedimentos padrão.
[0182] Lavagem pulmonar e Remoção do pulmão. A lavagem broncoalveolar (BAL) foi recolhida por lavagem dos pulmões quatro vezes com 1 ml de PBS. Os pulmões foram removidos e congelados em duas metades em nitrogênio líquido para ensaio de placa e posterior extração de RNA.
[0183] Análise: Processamento de amostra de sangue e armazenamento de Soros. Após transferência para o laboratório, as amostras de sangue foram processadas para o soro de acordo com procedimentos padrão. Após preparação, o soro foi armazenado a -20°C (± 5°C) até ser necessário para análise.
[0184] Análise de títulos de anticorpos específicos para RSV a partir de amostras de soro. Os títulos de ELISA de IgG específicos para RSV totais foram determinados a partir de todas as amostras de soro, utilizando um kit de ELISA modificado (Serion ELISA clássico, Catalog No. ESR113G): Em vez de o anticorpo IgG anti-humano conjugado a fosfatase alcalina fornecido com o kit, um anti-IgG de camundongo de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Serotec cat: 103004) foi usado como o anticorpo secundário.
[0185] Os títulos ELISA IgG específicos de RSV-F/G foram determinados a partir de todas as amostras de soro e LBA usando um kit ELISA modificado (IBL-Hamburgo Ref. RE56881). Em vez do anticorpo anti-IgG humana conjugado com POD fornecido com o kit, um anti-IgG de camundongo de ovelha conjugado com HRP (ref BN-687-95/96, Serotec cat: AAC10P) foi usado como o anticorpo secundário.
[0186] Exceto para os grupos 4 e 7, os títulos de ELISA IgG específicos para RSV-F foram determinados a partir de amostras de soro de dia 48, utilizando um kit ELISA modificado (IBL-Hamburgo Ref. reagentes RE56881 e microplaca IgG para RSV (proteína F) Ref. RE56692). Em vez do anticorpo anti-IgG humana conjugado com POD fornecido dentro do kit, um anti-IgG de de ovelha conjugado com HRP (ref BN-687-95/96 Serotec cat: AAC10P) foi usado como o anticorpo secundário.
[0187] Os títulos de IgA ELISA específicos para RSV no soro e no fluido BAL foram determinados a partir de amostras de Dia 48 e Dia 53, respectivamente, utilizando um kit de ELISA modificado (IBL-Hamburg RE56881 Ref. RE56881): Em vez de o anticorpo anti-IgG humano conjugado a POD fornecido dentro do kit, um anti-IgA de camundongo de ovelha conjugado com HRP (ref. BN-687-95/96 Serotec cat: STAR137P) foi usado como o anticorpo secundário.
[0188] Análise de respostas imunes celulares específicas para RSV a partir de esplenócitos. As respostas celulares específicas para RSV F, RSV-G e RSV-M2-foram determinadas duas semanas após a última administração por re-estimulação de esplenócitos com peptídeos específicos, como descrito em outro local (ver, por exemplo, S.M. Varga et al. (2000); S. Johnstone et al. (2004); S. Jiang et al., (2002); e A.B. Kulkarni et al., J. Virol. 67(7):4086-4092 (1993)) e detecção da liberação de IFNy de esplenócitos por teste ELISPOT.
[0189] Método de Ensaio ELISPOT. O Kit IFN-gama de camundongo (BD Biosciences, Catálogo No. 551083) foi usado para o ensaio ELISPOT. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as placas foram revestidas com o anticorpo de captura no dia antes de isolamento de esplenócitos. Após o isolamento, as células foram transferidas para as placas de ELISPOT e estimuladas com peptídeos diferentes (ver Tabela 3) durante 20 horas a 37°C. Produção de IFNy foi detectada utilizando o anticorpo de detecção. As placas foram desenvolvidas utilizando o BD™ ELISPOT AEC Substrate Set (BD Biosciences, Catálogo No. 551951) de acordo com as instruções do fabricante.
[0190] Plano de Estímulo ELISPOT. Todas as condições foram testadas em duplicada. Foram utilizados peptídeos RSV-1, RSV-2, RSV-3, RSV-4, e RSV-5 (ver Tabela 3) em uma concentração final de 5 μg/ml (1 μg/poço) para estimular 5x105 e 2,5x105 esplenócitos por poço. MVA (imunização controle) foi utilizado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 para estimular 5x105 e 2,5x105 esplenócitos por poço e Concanavalina A A (ConA [controle positivo]) foi utilizada a uma concentração final de 0,5 g/ml para estimular a 2,5x105esplenócitos. Como controle negativo, 5x105 esplenócitos foram cultivadas em meio apenas (RPMI-1640 suplementado com Glutamax, penicilina, estreptomicina, 10% de Soro Fetal de bezerro e 105 M β- mercaptoetanol.Tabela 3: Estimulação específica para o RSV
Figure img0006
[0191] Análise do BAL e os pulmões. Caracterização celular do BAL não foi possível, devido a problemas de coloração. A carga de RSV nas amostras de pulmão foi determinada pelo ensaio de placas de RSV e por RT-qPCR.
[0192] Ensaio de placas de RSV. Uma metade de cada um dos pulmões de congelado foi homogeneizado em 1 ml de meio frio usando uma Prensa Francesa (meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 7% de soro fetal de bezerro). Depois de uma breve centrifugação, dois tubos de cada sobrenadante foram titulados em diluições em série de duas vezes em células Vero de monocamadas cultivadas em placas de 48 poços de fundo plano. Seis dias mais tarde, as monocamadas foram lavadas e fixadas com 1% de formaldeído. Após 24 horas, as monocamadas foram coradas com 0,04% de vermelho neutro, e as placas foram contadas.
[0193] RSV RT-qPCR. 100 μl do tecido pulmonar homogeneizado foi removida imediatamente e o RNA foi isolado utilizando o Kit RNeasy® Mini da Qiagen (Catálogo No. 74104). A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando Kit High Capacity RNA-to-cDNA da Applied Biosystems (catálogo No. 4387406). PCR específica para o gene RSV L foi realizado com os seguintes parâmetros em um termociclador: (1) 50°C durante 2 minutos; (2) 95°C durante 10 minutos; (3) 45 ciclos de (15 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C) utilizando o Universal PCR Master Mix da Applied Biosystems (Catálogo No. 4352042) e uma mistura de três iniciadores: (1) o iniciador 1 1 (5’-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3’; SEQ ID NO:36); (2) iniciador 2 (5’-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3’; SEQ ID NO:37); e (3) sonda 6 (5’-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3’; (SEQ ID NO:38). Número de cópias foi determinado a partir de uma curva padrão de vetor de plasmídeo pMISC202 contendo um fragmento do gene RSV-L. Reações semelhantes para beta- actina de murino foram utilizados como controles internos para a entrada de cDNA, utilizando uma sonda marcada para VIC/MGB a partir de Applied Biosystems (Catálogo No. 4351315).
[0194] Documentação do Estudo. Um fluxograma da fase de vida foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase na vida. Além disso, a informação específica de camundongo ou gaiola foi gravada no cartão correspondente da gaiola. Cartões de gaiola não são considerados como dados brutos do estudo, mas uma exigência do Governo de Alta Bavaria.
[0195] Um fluxograma de análise de fase foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase de análise. Os ensaios foram documentados em registros de teste específicos de ensaio ou os Livros de anotação do Laboratório; referências cruzadas foram documentadas na análise de fluxograma de fase. Toda a documentação do ensaio, incluindo dados em bruto foram revisados de acordo com os procedimentos padrão. Além disso, as folhas de rastreio de amostra para as amostras de soro foram preparadas de acordo com procedimentos padrão.
[0196] Processamento de Dados. Os dados brutos foram transferidos para os arquivos correspondentes de Excel para análise posterior de acordo com os procedimentos padrão.
[0197] ELISA. Os valores médios do OD e erros padrão da média foram calculados usando o Excel.
[0198] ELISPOT. Placas ELISPOT foram lidas com um leitor de CTL de acordo com as instruções do fabricante. O número de células formadoras de manchas (SFC) foi determinado para cada poço e transferido para um arquivo de Excel para posterior avaliação. A partir da incubação com 5x105 e 2,5x105 células por poço, o número de manchas por 1x106 esplenócitos foi calculado para cada poço.. A média de controle negativo foi calculada e foi subtraída de cada valor individual antes do cálculo do valor médio por camundongo para se obter o valor de índice de Estimulação (SI) (frequência específica do peptídeo de esplenócitos liberando IFN-y) por camundongo.
[0199] Para os estímulos peptídicos, SI foi obtido a partir dos poços com 5x105 e 2,5x105 células, exceto quando as manchas eram demasiado numerosas para contar ou para os animais imunizados para RSV. Nesses casos, apenas a concentração de 2,5x105 foi utilizada. Para a estimulação MVA-BN, SI foi obtido a partir dos poços com 5x105, exceto quando as manchas eram demasiado numerosas para contar. Nesse caso, a concentração de 2.5x105 foi utilizada. Após a determinação do SI para os animais individuais, a média de SI (SFC por 1x106 esplenócitos) e erro padrão da média (EPM) por grupo foi calculada.
[0200] Alterações do peso corporal. Os valores de peso corporal individuais (em gramas) antes do desafio com RSV foram tomados como valores de linha de base. Com estes valores de base, alterações de peso corporal de animais individuais (em%), bem como alterações de peso corporal médias dos grupos foram calculados para cada desafio após ponto de tempo monitorado usando o Microsoft Excel.
[0201] Ensaio de placas de RSV. Os números de placas foram contados no poço com os três maiores diluições de vírus contáveis. O número médio de placas ajustado pelo fator de diluição foi então multiplicado por 10 para obter o título da solução em pfu/ml e finalmente multiplicado por 2 para se obter o título por pulmão.
[0202] RSV RT-qPCR. Amplificações por PCR foram medidos em tempo real usando a ABI 7500 da Applied Biosystems (Catálogo No. 4.351.107) e analisadas utilizando o software do sistema fornecido pela Applied Biosystems. Todos os valores foram comparados com o padrão do gene L e foram normalizados para a determinação da beta-actina murina para cada amostra.
Resultados
[0203] Análise da resposta imune humoral: Análise de resposta de anticorpos IgG específicos para RSV a partir de amostras de soro. Os soros foram analisados em primeiro lugar com um ELISA baseado no kit IBL-Hamburg, utilizando placas recobertas apenas com RSV-F recombinante e proteínas G (Figura 2 e Figura 3). Como mostrado na Figura 2, as respostas de IgG específicas para RSV semelhantes (ODs que variam entre 0,870 e 1,347) foram observados com todos os três constructos (MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 e MVA- mBN201B) após uma única imunização e independente da via utilizado para a imunização (s.c. ou i.n.). Enquanto a segunda imunização resultou em um aumento de cerca de 2,0 a 3,5 vezes na resposta dos anticorpos (ODs variando entre 2,627-3,407), a terceira injeção s.c. teve apenas um efeito menor sobre a resposta de células B, produzindo um aumento de cerca de 0,500 unidades OD em comparação aos OD após a segunda imunização. Resultados semelhantes foram obtidos com um teste ELISA baseado no kit IBL Hamburgo, utilizando placas recobertas apenas com proteína RSV-F recombinante (Figura 4).
[0204] Após diluição em série de soros (1/100, 1/200 e 1/400) resultados de ELISA específicos para RSV Fe RSV G mostrou que MVA-mBN199B, MVA-mBN201 BΔM2 e MVA-B mBN201 induziram respostas de IgG específicas para RSV F e G semelhantes, apesar da expressão adicional de um RSV-F truncado e uma proteína truncada da proteína RSV-G por MVA- mBN201 BΔM2 e MVA-mBN201B (Figura 3). Após duas imunizações s.c. com os constructos, a resposta das células B foi ainda mais baixa em comparação com a imunização com RSV sozinho (controle positivo). Para atingir o nível de resposta de anticorpos induzida por duas aplicações i.n. de RSV foi necessária uma terceira imunização s.c. com os constructos MVA-mBN. Em contraste, 2 imunizações i.n. com MVA-mBN199B e MVA-mBN201B induziram respostas das células B semelhantes às duas imunizações com RSV sozinho ou 3 imunizações s.c. com MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 e MVA-mBN201B, quando analisados com ELISA com base no kit IBL Hamburgo (Figura 3).
[0205] Quando os soros foram analisados novamente por ELISA baseado no kit Serion usando placas revestidas com um lisado de RSV, mais uma vez, não foram encontradas diferenças entre MVA-mBN199B, MVA-mBN201BΔM2 e MVA-mBN201B. Não houve diferenças entre as 2 e 3 imunizações, ou entre a vias de administração s.c. e i.n. foram observados também. Além disso, as respostas foram menores do que a resposta de anticorpos induzida por 2 aplicações i.n. de RSV (Figura 5).
[0206] Análise de Respostas de anticorpos IgA específica para RSV . IgA específicos de RSV F e RSV G (com base no kit IBL Hamburgo) foi medida em fluido BAL 4 dias pós-desafio (Dia 53). Além disso, foram também analisadas BAL e soros para IgG específicos para RSV-F e RSV G por ELISA. Os resultados foram comparados com os resultados obtidos em soros imediatamente antes do desafio (dia 48) e são mostrados na Figura 6.
[0207] Como esperado, as respostas de IgA foram detectadas apenas depois de aplicação i.n. com RSV, MVA- mBN199B e MVA-mBN201B. Embora IgG também possa ser detectado em BAL, IgA foi detectado em um nível superior após a aplicação. Os níveis séricos de IgA foram muito menores do que os níveis de IgG independentes da via de aplicação.
[0208] Análise de respostas imunes celulares específicas com RSV. Respostas de células T foram analisadas no baço por ELISPOT duas semanas após a última imunização (Figura 7). MVA-mBN199B administrado por via s.c. ou i.n. induziu uma resposta forte de células T específica de RSV-F. Esta resposta imune foi dirigida principalmente contra o peptídeo específico para RSV F de RSV-2, que é imunodominante na ausência de RSV-M2. A resposta foi de cerca de 2.000 pontos por cada 106 esplenócitos após a 2° imunização s.c., e cerca de 4000, após a3° injeção s.c. ou 2° aplicação intranasal. Semelhante à resposta de aplicações intranasal de RSV, uma resposta específica para G baixa para o peptídeo RSV-4 foi detectada após imunização com MVA-mBN199B (cerca de 500 pontos por 106 esplenócitos) e como esperado, o MVA-mBN199B não induziu células T específicas para M2. O peptídeo M2 é o peptídeo imunodominante de RSV em camundongos. Consequentemente, imunizações intranasais de RSV induziram uma boa resposta das células T específicas para M2 superiores a 1000 manchas por106 esplenócitos e quase nenhuma resposta de células T específica para F.
[0209] Como MVA-mBN199B, o MVA-mBN201B induziu uma resposta forte de células T, mas foi dominado por M2 (acima de 4.000 manchas por 106 esplenócitos, independente do número de doses administradas ou a via de administração). Mesmo a resposta específica para G induzida pelo MVA- mBN201B foi, pelo menos, 3 vezes maior do que a resposta específica para G induzida pelo MVA-mBN199B ou RSV. Em contraste ao MVA-mBN199B, a resposta específica para F induzida pelo MVA-mBN201B foi muito mais baixa, com menos de 600 manchas por 106 esplenócitos para o peptídeo de RSV- 2.
[0210] Desafio RSV com cepa RSV A2 . Os camundongos foram desafiados por via intranasal com 106 pfu de RSV(A2) duas semanas após a última imunização. O peso corporal foi monitorado diariamente. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados. Após a lavagem do pulmão com 1 ml de PBS, os pulmões foram removidos e a carga de RSV nos pulmões foi determinada por ensaio de placa e RT- qPCR conduzido como descrito acima.
[0211] Alterações do peso corporal. Todos os camundongos perderam peso um dia após o desafio, muito provavelmente devido à anestesia ou o desafio i.n por si só (Figura 8). Camundongos tratados com TBS começaram a perder peso de forma significativa quatro dias desafio pós-RSV. Em contraste, os camundongos que receberam RSV por via intranasal pela terceira vez não mostraram perda de peso corporal. Todos os camundongos imunizados s.c. com MVA- mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN201BÁM2 perderam cerca de 20% do peso quatro dias após o desafio. Essa perda de peso foi descrita anteriormente por Olszewska et al. (Vaccine 23:215 (2004)). Contudo, os nossos resultados de RT-qPCR (Figura 10) mostram que se correlacionam com uma melhor proteção e eliminação anterior para RSV a partir de pulmão através da resposta de CTL iniciados com vacina em comparação com a eliminação normal de infecção por RSV primário. Quando aplicado i.n., camundongos imunizados com MVA-B mBN201 tiveram uma perda de peso semelhante à de camundongos imunizados s.c. dois dias após o desafio, mas se recuperaram quatro dias após o desafio, devido à baixa carga de RSV nos pulmões em comparação com a via s.c. (Figura 10). Como o grupo imunizado com RSV, camundongos imunizados i.n. com MVA-mBN199B não mostraram nenhuma perda de peso.
[0212] Carga de RSV Medida pelo Ensaio de Placa. Quatro dias após o desafio uma média de 57671 pfu por pulmão para os camundongos não imunizados foi detectada (Figura 9). Como no grupo controle imunizados com RSV, nenhuma placa de RSV A2 foi detectada nos pulmões de animais imunizados com MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA- mBN201BΔM2 após 2 aplicações s.c. ou i.n.
[0213] Carga de RSV Medida por PCR Quantitativa em tempo real. A carga de RSV nos pulmões foi também analisada por RT-qPCR (figura 10). Enquanto RSV não foi detectado por teste de placas em qualquer um dos camundongos vacinados, os genomas de RSV ainda eram detectáveis em camundongos imunizados três vezes com MVA-mBN199B. Após três imunizações com MVA-mBN199B, a carga de RSV foi 38 vezes mais baixo comparada com o grupo de controle TBS. Genomas de RSV também eram detectáveis após três imunizações com MVA-mBN201B, mas a carga foi 158 vezes mais baixa em comparação com o grupo de controle TBS. Não havia grande diferença entre os camundongos imunizados duas ou três vezes. Curiosamente, a diminuição da carga de RSV observada com MVA-mBN201B não foi observada após vacinação com MVA- mBN201 BΔM2 que estava na ausência de M2 equivalente a MVA- mBN199B.
[0214] Proteção quase completa comparável à obtida no grupo tratado com RSV foi observada após a imunização i.n. com MVA-mBN201B, apesar de algumas cópias do gene G ainda eram detectáveis em um camundongo de cinco. Imunização intranasal com MVA-mBN199B também induziu uma forte diminuição da carga de RSV, mas o gene L foi ainda detectado a um nível baixo em três camundongos em cada quatro.
Discussão e Conclusões
[0215] Embora o MVA-mBN201B expresse versões das proteínas RSV-F e G truncadas além das proteínas RSV-F e G de comprimento completo também incluíram o constructo MVA- mBN199B, MVA-mBN201B induziu uma resposta imune humoral de magnitude semelhante. Ambos os constructos induziram uma resposta de anticorpos dirigida principalmente contra a proteína RSV-F, como avaliado por respostas boas semelhantes medidas em ELISA apenas de RSV F em comparação com ELISA de RSV-F e G. O nível de anticorpos após duas aplicações i.n. foi maior do que após duas aplicações sc. Uma terceira aplicação s.c. foi necessária para alcançar o nível de resposta de anticorpos induzida por duas aplicações i.n. Por outro lado, nenhuma diferença significativa foi observada nas respostas de células T induzidas utilizando as vias s.c. contra i.n. usando 2 versus 3 aplicações sc. No entanto, o MVA-mBN199B induziu uma resposta boa celular específica para RSV-F, enquanto que foi observada uma resposta forte de células T específica para M2 com MVA-mBN201B. A resposta específica para RSV-G induzida pelo MVA-mBN201B também foi mais pronunciada em comparação com o MVA-mBN199B. O padrão de resposta de células T induzida pelo MVA-mBN201B foi semelhante à resposta da célula T induzida por imunização de RSV, ainda que muito maior.
[0216] Independente das vias ou o número de aplicações, ambos os constructos protegeram camundongos do desafio com RSV (A2), e nenhum vírus replicante pode ser recuperado a partir dos pulmões. No entanto, como observado anteriormente, as imunizações s.c. com MVA- mBN199B ou MVA-mBN201B não resultou em imunidade estéril (ou seja, a imunidade que persiste mesmo após o agente infeccioso alvo ser eliminado do organismo). A carga de RSV genômico (medida pelos níveis de gene de RNA polimerase viral (L)) nos pulmões de camundongos imunizados por aplicação s.c. de MVA-mBN199B ou MVA-mBN201B foi significativamente reduzida, mas ainda detectável por RT- PCR quantitativo, e um terceira imunização s.c. não teve impacto benéfico sobre a carga viral apesar de seu aumento nos níveis de IgG específicos para RSV. A redução na expressão de proteína RSV G foi um pouco mais pronunciada após a vacinação com MVA-mBN201B em comparação com o MVA- mBN199B, o que pode ser devido ao aumento da resposta de células T CD8 + específicas para M2, dado que a carga genômica de RSV foi mais elevada em animais vacinados com MVA-mBN201 BΔM2 do que nos animais vacinados com MVA- mBN201B, como MVA-mBN199B.
[0217] Imunidade quase estéril foi obtida após duas aplicações i.n. MVA-mBN199B ou MVA-mBN201B. Esta observação é correlacionada com a indução e secreção de IgA específico para RSV no sítio da infecção da mucosa.
Exemplo 3: A segurança de vacinas recombinantes de MVA expressando proteína RSV-F, Proteína RSV-G, proteína RSV N, e proteína RSV M2, em comparação com o FI-RSV.
[0218] Candidato a vacina MVA-mBN199B codifica a glicoproteína (G) e a proteína de fusão (F) de RSV, enquanto que o MVA-mBN201B expressa versões truncadas de F e G em adição às proteínas de comprimento completo, a proteína do nucleocapsídeo (N) e a matriz proteína (M2) do RSV (ver Figura 1). O objetivo destes experimentos foi analisar a segurança de MVA-mBN199B e MVA-B mBN201 em comparação com FI-RSV após duas imunizações nas vias de administração subcutânea (s.c.) ou intranasal (i.n.).
[0219] A segurança destes constructos foi testada usando um modelo de desafio RSV (A2) em camundongos BALB/c. Duas imunizações com MVA-mBN199B ou MVA-B mBN201 não induziram aumento da secreção de IL4 e IL5 em BAL após desafio RSV (A2), em comparação com FI-RSV.
Desenho do Estudo
[0220] Camundongos foram tratados duas vezes com três semanas de diferença por via subcutânea (s.c.) ou intranasal (i.n.) com 1x108 TCID5O MVA-mBN199B (Grupos 3 e 4), 1x108 TCID50 MVA-mBN201B (Grupos 5 e 6) de acordo coma tabela x. Os três grupos de controle foram tratados (s.c.), duas vezes com TBS (Grupo 1) ou i.n. com RSV (grupo 2) ou i.m. com 30μg FI-RSV (Grupo 7), de acordo com a Tabela x. No dia 35, os camundongos foram desafiados (i.n.) com 106 pfu RSV A2. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados por injeção de uma dose elevada de cetamina-xilazina e sangrados. Após a lavagem pulmonar, os níveis de IL4 e IL5 foram analisados por ELISA em BAL.Tabela 4: Desenho Experimental
Figure img0007
% Relativa para a primeira imunização. # camundongos foram desafiados por via intranasal com 106 pfu de RSV A2. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sangrados e sacrificados sob anestesia. Fluido BAL foi amostrado. Cronograma do estudo. O cronograma da fase de vida é resumido na Tabela y. Tabela 5: Cronograma do estudo da Fase em vida
Figure img0008
** Em relação ao dia da 1° imunização.
Material e métodos
[0221] Animais Experimentais. Camundongos fêmea BALB/cJ Rj (H-2d) com a idade de sete semanas foram obtidos a partir de Janvier (Route des Chenes Sees, F-53940 Le Genest-Saint-lsle, França). Todos os camundongos foram livres de patógenos específicos.
[0222] Alojamento. O estudo foi realizado na sala 117 do biotério no Bavarian Nordic-Martinsreid. Esta unidade foi fornecida com ar filtrado a uma temperatura de 20-24°C e uma umidade relativa entre 40% e 70%. O ambiente estava iluminado artificialmente em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. O período de aclimatação do estudo foi de 15 dias. Os animais foram alojados em gaiolas transparentes ™ (H Temp [polysulfon] gaiola Tipo II L - padrão Euro), com uma área útil de 530 cm2. As gaiolas foram cobertas com um H-Temp SealSafe™ lid. As gaiolas foram colocadas em um sistema TECNIPLAST-IVC SealSafe™ com uma unidade de circulação SLIMLine™ proporcionando cada gaiola única separadamente com ar filtrado HEPA. Camas para animais foram alterada uma vez por semana.
[0223] Dieta e água. Camundongos foram fornecidos com acesso gratuito à dieta de manutenção irradiada (SSNIFF R/M-H, irradiada, V1534-727) e água (autoclavada a 121°C por 20 minutos).
[0224] Procedimentos de Pré-Tratamento: identificação de animais. Para marcar individualmente animais em cada gaiola, perfuração da orelha foi feita de acordo com procedimentos padrão.
[0225] Avaliação de Inclusão/Exclusão . Avaliação de inclusão/exclusão foi realizada de acordo com procedimentos padrão.
[0226] Coleta de sangue para Pré-sangramento.. As amostras de sangue de aproximadamente de 150 μl foram obtidas por punção da veia facial de acordo com os procedimentos padrão. As amostras de sangue foram transferidas para o laboratório para posterior processamento de acordo com os procedimentos padrão.
[0227] Procedimentos de tratamento: Preparação e administração de itens de teste e itens de referência. Preparação e administração de itens de teste e de referência foi realizada em gabinete de segurança microbiológica de classe II (HERAsafe®/class II tipo H, Kendro) de acordo com os procedimentos padrão. Resumidamente, para administração subcutânea, MVAs recombinantes foram diluídos em TBS para se obter uma solução de trabalho com uma concentração de 2x108 TCID50/ml. 1x108 TCID50 em 500μl s.c. foi injetado de acordo com procedimentos padrão. Para administração i.n., os MVAs recombinantes foram diluídos em TBS para se obter uma solução de trabalho com uma concentração de 2x109 TCID50/ml. 50 μl dos vírus diluídos foram administrados em uma narina de camundongos anestesiados (xilazina/cetamina) de acordo com processos convencionais. 500μl de TBS foram administrados s.c. de acordo com procedimentos padrão.
[0228] Preparação e Administração de vírus RSV (A2). O frasco de estoque de RSV foi descongelado e utilizado o mais depressa possível devido à instabilidade do vírus (máximo de 15 minutos no gelo). O vírus foi mantido em gelo em todos os momentos e imediatamente utilizado para desafiar camundongos anestesiados (cetamina/xilazina) com 100 μl da solução vírus puro por via intranasal de acordo com os procedimentos padrão.
[0229] Preparação e Administração do FI-RSV. 30μg de FI-RSV em 40μl foi injetado por via intramuscular.
[0230] Eutanásia. No Dia 35, os restantes camundongos receberam uma dose dupla de cetamina-xilazina por injeção intra-peritoneal e a eutanásia foi realizada por corte da aorta no interior da cavidade peritoneal.
[0231] Lavagem pulmonar. A lavagem broncoalveolar (BAL) foi recolhida por lavagem dos pulmões quatro vezes com 1 ml de PBS.
Análise
[0232] Níveis de IL-4 e IL-5 foram medidos em sobrenadante de lavado broncoalveolar (BAL) utilizando kits ELISA comercialmente disponíveis (mIL4 PLATINUM ELISA de eBIOSCIENCE Cat N° BMS613 e READY-SET-GO MIL-5 ELISA de eBIOSCIENCE Cat N° 88-7054-22).
[0233] Documentação do Estudo. Um fluxograma da fase de vida foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase na vida. Além disso, a informação específica de camundongo ou gaiola foi gravada no cartão correspondente da gaiola. Cartões de gaiola não são considerados como dados brutos do estudo, mas uma exigência do Governo de Alta Bavaria.
[0234] Um fluxograma de análise de fase foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase de análise. Os ensaios foram documentados em registros de teste específicos de ensaio ou os Livros de anotação do Laboratório; referências cruzadas foram documentadas na análise de fluxograma de fase. Toda a documentação do ensaio, incluindo dados em bruto foram revisados de acordo com os procedimentos padrão. Além disso, as folhas de rastreio de amostra para as amostras de soro foram preparadas de acordo com procedimentos padrão.
[0235] Processamento de Dados. Os dados brutos foram transferidos para os arquivos correspondentes de Excel para análise posterior de acordo com os procedimentos padrão.
[0236] ELISA. As concentrações de citocinas foram determinadas a partir da curva padrão dos respectivos kits de ELISA.
Resultados
[0237] Um aumento de produção de IL-4 (Figura 11) e IL-5 (Figura 12) como a observado com o FI-RSV não foi observado para o MVA-mBN199B ou MVA-mBN201B. Ambas as citocinas estavam abaixo do nível de detecção quando os camundongos foram imunizados com MVA-mBN199B ou MVA- mBN201B.
Discussão e Conclusões
[0238] Ambos MVA-mBN199B e MVA-B mBN201 não induziram doença agravada em relação ao FI-RSV como avaliada pela resposta de TH2.
Exemplo 4: Comparação de eficácia de imunogenicidade e segurança de diferentes vacinas de MVA recombinante Expressando proteína RSV F, proteína RSV G, proteína RSV N, e proteína RSV M2.
[0239] Candidato a vacina MVA-mBN199B codifica a glicoproteína (G) e a proteína de fusão (F) de RSV, o MVA- mBN201B expressa versões de F e G truncados em adição às proteínas de comprimento completo, a proteína do nucleocapsídeo (N) e a proteína da matriz (M2) de RSV e MVA-mBN294B expressa uma proteína F e 2 G de comprimento completo, a proteína do nucleocapsídeo (N) e a proteína de matriz (M2) do RSV (ver Figura 1). MVA-mBN294A é um produto intermédio na clonagem de MVA-mBN294B que ainda tem um cassete de clonagem nele. Este cassete de clonagem não impacta a expressão do transgene ou as propriedades imunogênicas das proteínas transgênicas. O objetivo deste experimento foi analisar a imunogenicidade, eficácia e segurança da MVA-mBN294A em comparação com MVA-mBN199B e MVA-mBN201B após duas imunizações pela via de administração subcutânea (s.c.).
[0240] A eficácia e segurança da imunogenicidade destes constructos foram testadas usando um modelo de desafio RSV (A2) em camundongos BALB/c. Nós confirmamos que, apesar das mudanças em MVA-mBN294A (equivalente a MVA- mBN294B) em comparação com MVA-mBN201B, este induziu respostas de células B e T semelhantes e ofereceu proteção similar. Este experimento mostrou que todos os constructos (MVA-mBN201B ou MVA-mBN294A) que expressam pelo menos um determinante antigênico de uma glicoproteína de membrana de RSV (F ou G) e pelo menos um determinante antigênico de uma proteína de RSV nucleocapsídeo (N ou M2) induz melhor proteção do que um constructo que expressa apenas determinantes antigênicos de glicoproteínas de membrana RSV (MVA-mBN199B)
Desenho do Estudo
[0241] Camundongos foram vacinadas (s.c.) com 1x108 TCID50 MVA-mBN294A, MVA-mBN199B ou MVA-mBN201B em um esquema de inicial-reforço (Dia 0 e 21) de acordo com a Tabela 6. Os grupos de controle foram tratados duas vezes por via subcutânea com TBS ou com RSV-A2 de acordo com a Tabela 6. (FI) -RSV inativado com formalina foi injetado por via intramuscular (i.m.) uma vez ou duas vezes de acordo com a Tabela 6.
[0242] O sangue foi recolhido no dia anterior a cada imunização e antes da infecção, bem como no dia do sacrifício. Para 5 animais dos grupos 1-5 no dia 34, os títulos de IgG específicos para RSV e títulos de anticorpos neutralizantes específicos para RSV foram determinados por ELISA e PRNT respectivamente.
[0243] No Dia 34, alguns camundongos (Tabela 6) foram sacrificados por injeção de uma dose letal de cetamina-xilazina e sangria final. Os baços foram removidos e preparados para análise de respostas de células T específicas para RSV por ELISPOT.
[0244] No Dia 35, os restantes camundongos (Tabela 6) foram desafiados com 106 pfu RSV-A2. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados por injeção de uma dose letal de cetamina-xilazina e sangria final. Após a lavagem pulmonar, os pulmões foram removidos e carga de RSV foi analisada por ensaio de placa e RT-qPCR. Infiltração celular e nível de citocinas em lavagem broncoalveolar foram analisados (BAL).Tabela 6: Desenho Experimental
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Figure img0010
1: em relação à primeira imunização 2: camundongos serão desafiados por via intranasal com 106 pfu of RSV-A2. Quatro dias após o desafio, os camundongos serão sangrados, sacrificados sob anestesia e BAL e pulmões serão amostrados &: No dia 34, estes camundongos serão sacrificados e os baços serão analisados por ELISPOT
[0245] Cronograma do estudo. O cronograma da fase em vida é resumido na Tabela 7. Tabela 7: Cronograma do estudo da Parte 1 da Fase em vida
Figure img0011
1: em relação ao dia da 1°imunização
Material e métodos
[0246] Animais Experimentais. Camundongos fêmea BALB/cJ Rj (H-2d) com a idade de sete semanas foram obtidos a partir de Janvier (Route des Chenes Sees, F-53940 Le Genest-Saint-lsle, França). Todos os camundongos foram livres de patógenos específicos.
[0247] Alojamento. O estudo foi realizado na sala 117 do biotério no Bavarian Nordic-Martinsreid. Esta unidade foi fornecida com ar filtrado a uma temperatura de 20-24°C e uma umidade relativa entre 40% e 70%. O ambiente estava iluminado artificialmente em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. O período de aclimatação do estudo foi de 15 dias. Os animais foram alojados em gaiolas transparentes ™ (H Temp [polysulfon] gaiola Tipo II L - padrão Euro), com uma área útil de 530 cm2. As gaiolas foram cobertas com um H-Temp SealSafe™ lid. As gaiolas foram colocadas em um sistema TECNIPLAST-IVC SealSafe™ com uma unidade de circulação SLIMLine™ proporcionando cada gaiola única separadamente com ar filtrado HEPA. Camas para animais foram alterada uma vez por semana.
[0248] Dieta e água. Camundongos foram fornecidos com acesso gratuito à dieta de manutenção irradiada (SSNIFF R/M-H, irradiada, V1534-727) e água (autoclavada a 121°C por 20 minutos).
Procedimentos de pré-tratamento:
[0249] Identificação de animais. Para marcar individualmente animais em cada gaiola, perfuração da orelha foi feita de acordo com procedimentos padrão.
[0250] Avaliação de Inclusão/Exclusão. Avaliação de inclusão/exclusão foi realizada de acordo com procedimentos padrão.
[0251] Coleta de sangue para Pré-sangramento. As amostras de sangue de aproximadamente de 150 μl foram obtidas por punção da veia facial de acordo com os procedimentos padrão. As amostras de sangue foram transferidas para o laboratório para posterior processamento de acordo com os procedimentos padrão.
[0252] Procedimentos de tratamento: Preparação e administração de itens de teste e itens de referência. Preparação e administração de itens de teste e de referência foi realizada em gabinete de segurança microbiológica de classe II (HERAsafe®/class II tipo H, Kendro) de acordo com os procedimentos padrão. Resumidamente, para administração subcutânea, MVAs recombinantes foram diluídos em TBS para se obter uma solução de trabalho com uma concentração de 2x108 TCID50/ml. 1x108 TCID50 em 500μl s.c. foi injetado de acordo com procedimentos padrão. 500μl de TBS foram administrados s.c. de acordo com procedimentos padrão.
[0253] Preparação e Administração de vírus RSV (A2). O frasco de estoque de RSV foi descongelado e utilizado o mais depressa possível devido à instabilidade do vírus (máximo de 15 minutos no gelo). O vírus foi mantido em gelo em todos os momentos e imediatamente utilizado para desafiar camundongos anestesiados (cetamina/xilazina) com 100 μl da solução vírus puro por via intranasal de acordo com os procedimentos padrão.
[0254] Preparação e Administração do FI-RSV: 50μl de FI-RSV foi aplicado i.m..
Procedimentos de Pós-tratamento:
[0255] Amostragem de sangue. As amostras de sangue (aproximadamente 150 μl) foram obtidas por punção retro- bulbar ou venosa facial (para detalhes ver Tabela 7) de acordo com procedimentos padrão. As amostras de sangue foram transferidas para o laboratório para posterior processamento de acordo com os procedimentos padrão.
[0256] Eutanásia. Os camundongos receberam uma dose dupla de cetamina-xilazina por injeção intraperitoneal e a eutanásia foi realizada por corte da aorta no interior da cavidade peritoneal.
[0257] Remoção do baço. Os baços foram removidos assepticamente. Eles foram colocados em tubos cheios com meio de acordo com procedimentos padrão. Esses tubos foram importados para a instalação de animais e foram então exportados de acordo com os procedimentos padrão.
[0258] Lavagem pulmonar e Remoção do pulmão. A lavagem broncoalveolar (BAL) foi recolhida por lavagem dos pulmões quatro vezes com 1 ml de PBS. Os pulmões foram removidos e congelados em duas metades em nitrogênio líquido para ensaio de placa e posterior extração de RNA.
Análise:
[0259] Processamento de amostra de sangue e armazenamento de soros. Após transferência para o laboratório, as amostras de sangue foram processadas para o soro de acordo com procedimentos padrão. Após preparação, o soro foi armazenado a -20°C (± 5°C) até ser necessário para análise.
[0260] Análise de títulos de anticorpos específicos para RSV a partir de amostras de soro.. Os títulos de ELISA de IgG específicos para RSV totais foram determinados a partir de todas as amostras de soro, utilizando um kit de ELISA modificado (Serion ELISA clássico, Catalog No. ESR113G): Em vez de o anticorpo IgG anti-humano conjugado a fosfatase alcalina fornecido com o kit, um anti-IgG de camundongo de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Serotec cat: 103004) foi usado como o anticorpo secundário.
[0261] Análise de títulos de anticorpos neutralizantes específicos para RSV a partir de amostras de soro. Resumidamente, diluições em série de 2 vezes dos soros de teste foram preparadas e um número definido de unidades formadoras de placas de RSV (pfu) foram adicionados à diluição do soro. Após 185 minutos de incubação a 36°C (±2°C) e 5% CO2 (±1%) este foi adicionado às placas contendo as células Vero semeadas previamente. Dois dias mais tarde, as placas foram fixadas, foram contadas com uma mistura de anticorpos específicos e placas com RSV imunocoradas.
[0262] Análise de respostas imunes celulares específicas para RSV a partir de esplenócitos. As respostas celulares específicas para RSV-F e RSV M2 foram determinadas duas semanas após a última administração por nova estimulação de esplenócitos com peptídeos específicos, como descrito em outro lugar e detecção da liberação de IFNy dos esplenócitos por teste ELISPOT.
[0263] Método de Ensaio ELISPOT. O Kit IFN-gama de camundongo (BD Biosciences, Catálogo No. 551083) foi usado para o ensaio ELISPOT. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as placas foram revestidas com o anticorpo de captura no dia antes de isolamento de esplenócitos. Após o isolamento, as células foram transferidas para as placas de ELISPOT e estimuladas com peptídeos diferentes (ver Tabela 3) durante 20 horas a 37°C. Produção de IFNy foi detectada utilizando o anticorpo de detecção. As placas foram desenvolvidas utilizando o BD™ ELISPOT AEC Substrate Set (BD Biosciences, Catálogo No. 551951) de acordo com as instruções do fabricante.
[0264] Plano de Estímulo ELISPOT. Todas as condições foram testadas em duplicada. Foram utilizados peptídeos RSV-2 e RSV-5 (ver Tabela 8) em uma concentração final de 5 μg/ml (1 μg/poço) para estimular 5x105 e 2,5x105 esplenócitos por poço. MVA (imunização controle) foi utilizado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 para estimular 5x105 e 2,5x105 esplenócitos por poço e Concanavalina A A (ConA [controle positivo]) foi utilizada a uma concentração final de 0,5 g/ml para estimular a 2,5x105esplenócitos. Como controle negativo, 5x105 esplenócitos foram cultivadas em meio apenas (RPMI-1640 suplementado com Glutamax, penicilina, estreptomicina, 10% de Soro Fetal de bezerro e 105M β-mercaptoetanol.Tabela 8: Estimulação específica para RSV
Figure img0012
Análise do BAL:
[0265] Duas lâminas foram preparadas por centrifugação cytospin (800 rpm, 5 minutos) de 100 μl de fluido BAL. As lâminas foram secas durante a noite e depois coradas. As lâminas foram analisadas por microscopia para determinar a percentagem de eosinófilos e neutrófilos. O resto do BAL foi, então, centrifugado (12.000 rpm 5 minutos). Após a preparação, os sobrenadantes de BAL foram armazenados a -20°C (± 5°C) até à análise. Níveis de IL-4 e IL-5 foram medidos em sobrenadante de lavado broncoalveolar (BAL) utilizando kits ELISA comercialmente disponíveis (mIL4 PLATINUM ELISA de eBIOSCIENCE Cat N° BMS613 e READYSET-GO MIL-5 ELISA de eBIOSCIENCE Cat N° 88-7054-22).
Análise de carga de RSV nos pulmões
[0266] A carga de RSV nas amostras de pulmão foi determinada pelo ensaio de placas de RSV e por RT-qPCR.
[0267] Ensaio de placas de RSV. Uma metade de cada um dos pulmões de congelado foi homogeneizado em 1 ml de meio frio usando uma Prensa Francesa (meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 7% de soro fetal de bezerro). Depois de uma breve centrifugação, dois tubos de cada sobrenadante foram titulados em diluições em série de duas vezes em células Vero de monocamadas cultivadas em placas de 48 poços de fundo plano. Seis dias mais tarde, as monocamadas foram lavadas e fixadas com 1% de formaldeído. Após 24 horas, as monocamadas foram coradas com 0,04% de vermelho neutro, e as placas foram contadas.
[0268] RSV RT-qPCR. 100 μl do tecido pulmonar homogeneizado foi removida imediatamente e o RNA foi isolado utilizando o Kit RNeasy® Mini da Qiagen (Catálogo No. 74104). A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando Kit High Capacity RNA-to-cDNA da Applied Biosystems (catálogo No. 4387406). PCR específica para o gene RSV L foi realizado com os seguintes parâmetros em um termociclador: (1) 50°C durante 2 minutos; (2) 95°C durante 10 minutos; (3) 45 ciclos de (15 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C) utilizando o Universal PCR Master Mix da Applied Biosystems (Catálogo No. 4352042) e uma mistura de três iniciadores: (1) o iniciador 1 (5’-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3’; SEQ ID NO:36); (2) iniciador 2 (5’-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3’; SEQ ID NO:37); e (3) sonda 6 (5’-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3’; (SEQ ID NO:38).Número de cópias foi determinado a partir de uma curva padrão de vetor de plasmídeo pMISC202 contendo um fragmento do gene RSV-L. Reações semelhantes para beta-actina de murino foram utilizados como controles internos para a entrada de cDNA, utilizando uma sonda marcada para VIC/MGB a partir de Applied Biosystems (Catálogo No. 4351315).
Documentação do Estudo.
[0269] Um fluxograma da fase de vida foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase na vida. Além disso, a informação específica de camundongo ou gaiola foi gravada no cartão correspondente da gaiola. Cartões de gaiola não são considerados como dados brutos do estudo, mas uma exigência do Governo de Alta Bavaria.
[0270] Um fluxograma de análise de fase foi preparado para coletar todas as informações durante as etapas individuais da fase de análise. Os ensaios foram documentados em registros de teste específicos de ensaio ou os Livros de anotação do Laboratório; referências cruzadas foram documentadas na análise de fluxograma de fase. Toda a documentação do ensaio, incluindo dados em bruto foram revisados de acordo com os procedimentos padrão. Além disso, as folhas de rastreio de amostra para as amostras de soro foram preparadas de acordo com procedimentos padrão.
[0271] Processamento de Dados. Os dados brutos foram transferidos para os arquivos correspondentes de Excel para análise posterior de acordo com os procedimentos padrão.
[0272] ELISA. Os valores médios do OD e erros padrão da média foram calculados usando o Excel.
[0273] PRNT. As placas foram transferidos para uma macro para calcular um título de PRNT de acordo com procedimentos padrão.
[0274] ELISPOT. Placas ELISPOT foram lidas com um leitor de CTL de acordo com as instruções do fabricante. O número de células formadoras de manchas (SFC) foi determinado para cada poço e transferido para um arquivo de Excel para posterior avaliação. A partir da incubação com 5x105 e 2,5x105 células por poço, o número de manchas por 1x106 esplenócitos foi calculado para cada poço.. A média de controle negativo foi calculada e foi subtraída de cada valor individual antes do cálculo do valor médio por camundongo para se obter o valor de índice de Estimulação (SI) (frequência específica do peptídeo de esplenócitos liberando IFN-y) por camundongo.
[0275] Para os estímulos peptídicos, SI foi obtido a partir dos poços com 5x105 e 2,5x105 células, exceto quando as manchas eram demasiado numerosas para contar ou para os animais imunizados para RSV. Nesses casos, apenas a concentração de 2,5x105 foi utilizada. Para a estimulação MVA-BN, SI foi obtido a partir dos poços com 5x105, exceto quando as manchas eram demasiado numerosas para contar. Nesse caso, a concentração de 2.5x105 foi utilizada. Após a determinação do SI para os animais individuais, a média de SI (SFC por 1x106 esplenócitos) e erro padrão da média (EPM) por grupo foi calculada.
[0276] Ensaio de placas de RSV. Os números de placas foram contados no poço com os três maiores diluições de vírus contáveis. O número médio de placas ajustadas pelo fator de diluição foi então multiplicado por 10 para obter o título da solução em pfu/ml e finalmente multiplicado por 2 para se obter o título por pulmão.
[0277] RSV RT-qPCR. Amplificações por PCR foram medidos em tempo real usando a ABI 7500 da Applied Biosystems (Catálogo No. 4.351.107) e analisadas utilizando o software do sistema fornecido pela Applied Biosystems. Todos os valores foram comparados com o padrão do gene L e foram normalizados para a determinação da beta-actina murina para cada amostra.
[0278] ELISA de citocinas. As concentrações de citocinas foram determinadas a partir da curva padrão dos respectivos kits de ELISA.
Resultados Análise da resposta imune humoral:
[0279] Para ambas as respostas de anticorpos IgG específicos para RSV (ELISA, Figura 13) e neutralizantes específicos para RSV (PRNT, Figura 14), não foi observada nenhuma diferença entre os três constructos (MVA-mBN199B, MVA-mBN201B e MVA-mBN294A)
Análise da resposta imune celular:
[0280] Como esperado, MVA-mBN294A teve um padrão de resposta de células T semelhante a MVA-mBN201B (Figura 15), induzindo ambas respostas específicas de F e M2 dominadas pela resposta das células T M2. Em contraste, apenas o MVA- mBN199B induziu uma resposta específica para F, mas a um nível mais elevado do que o MVA-mBN201B e MVA-mBN294A.
Análise da carga de RSV nos pulmões:
[0281] Desafio RSV com cepa RSV A2. Os camundongos foram desafiados por via intranasal com 106 pfu de RSV(A2) duas semanas após a última imunização. Quatro dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados. Após a lavagem do pulmão com 1 ml de PBS, os pulmões foram removidos e a carga de RSV nos pulmões foi determinada por ensaio de placa e RT-qPCR conduzido como descrito acima.
[0282] Carga de RSV Medida pelo Ensaio de placa. Quatro dias após o desafio uma média de 29842 pfu por pulmão para os camundongos não imunizados foi detectada (Figura 16). Como no grupo de controle imunizados com RSV, não foram detectados placas de RSV A2 nos pulmões de animais imunizados com MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA- mBN294A após 2 aplicações s.c.
[0283] Carga de RSV Medida por PCR Quantitativa em tempo real. A carga de RSV nos pulmões foi também analisada por RT-qPCR (figura 17). Enquanto RSV não foi detectada por teste de placas em qualquer dos camundongos vacinados, os genomas de RSV ainda eram detectáveis em camundongos imunizados s.c. duas vezes com MVA-mBN199B, MVA-mBN201B ou MVA-mBN294A. Para MVA-mBN199B, a carga de RSV foi 45 vezes mais baixa comparada com o grupo de controle TBS. Genomas RSV também eram detectáveis por MVA-mBN201B e MVA-mBN294A mas a carga foi fortemente reduzida em comparação com MVA- mBN199B, 416 vezes e 281 vezes menor em comparação com o grupo controle TBS, respectivamente.
Análise dos sinais de doença agravada
[0284] Em contraste com o lote de FI-RSV utilizado nos experimentos descritos no Exemplo 3, o novo lote utilizado neste estudo não mostrou qualquer aumento de produção de IL-4 ou IL-5. No entanto, fomos capazes com este lote de detectar infiltrações de eosinófilos e neutrófilos no BAL, que é a principal característica de doenças avançadas para FI-RSV. Nenhum sinal de doença avançada foi detectável por MVA-mBN199B, MVA-mBN201B, e MVA-mBN294A
Discussão e Conclusões
[0285] Apesar das diferenças entre o MVA-mBN294A (equivalente a MVA-mBN294B) e MVA-mBN201B, ambas respostas de células B e T induzidas semelhantes oferecem proteção semelhante sem induzir doença agravada. Ambos os constructos induziram uma proteção melhor do que o MVA- mBN199B que expressa apenas determinantes antigênicas das glicoproteínas de membrana (F e G).
[0286] Outras modalidades da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da consideração da especificação e prática da invenção aqui revelada. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados como apenas exemplificativos, com o verdadeiro escopo e espírito da invenção indicados pelas reivindicações que se seguem.

Claims (9)

1. Vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinante caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pelo menos uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:3 ou seus degenerados que codificam uma glicoproteína de membrana RSV F de comprimento total de SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:4, respectivamente; (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO:9 ou seus degenerados que codificam uma proteína de nucleocapsídeo do RSV N de comprimento total de SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:10, respectivamente; (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO:13 ou seus degenerados que codificam uma proteína de matriz de RSV M2 de comprimento completo de SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 14, respectivamente; em que tanto o determinante antigênico do nucleocapsídeo RSV N quanto a proteína de matriz RSV M2 são codificados por uma sequência de nucleotídeo que codifica um determinante antigênico de uma proteína de nucleocapsídeo RSV e são codificados por uma única estrutura de leitura aberta, e que compreende ainda: (d) pelo menos (i) uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou seus degenerados que codificam uma glicoproteína de membrana do RSV G de comprimento completo de SEQ ID NO: 2; ou pelo menos (ii) uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 ou seus degenerados que codificam uma glicoproteína de membrana do RSV G truncada de SEQ ID NO:8.
2. Vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo em (a) é derivada da cepa A de RSV, preferencialmente da cepa A2, e/ou Along.
3. MVA recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo em (b) é derivada da cepa A, preferencialmente, da cepa A2.
4. MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o determinante antigênico de nucleocapsídeo RSV N e a proteína da matriz de RSV M2 são separados por um domínio de protease de autoclivagem, em que preferencialmente a sequência do domínio de protease de autoclivagem é derivada do Vírus da Doença do Pé e Boca, em que mais preferencialmente a sequência do domínio de protease de autoclivagem é a sequência de fragmento 2A da protease.
5. MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo em (d) é derivada da cepa A de RSV, preferencialmente da cepa A2 e/ou B.
6. MVA recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o MVA utilizado para obter o MVA recombinante é o MVA-BN depositado na European Collection of Cell Cultures (ECACC) sob o número V00083008.
7. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o MVA recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e, opcionalmente, um transportador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser para a administração por via intranasal e/ou subcutânea, preferencialmente por via intranasal.
9. Uso do MVA recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de infecção por RSV.
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