CN109266622A - 重组改良型安卡拉痘苗病毒(mva)呼吸道合胞病毒(rsv)疫苗 - Google Patents

重组改良型安卡拉痘苗病毒(mva)呼吸道合胞病毒(rsv)疫苗 Download PDF

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Abstract

本文提供作为针对呼吸道合胞病毒(RSV病毒)感染的改进的疫苗的重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)株，以及相关产物、方法及用途。具体地说，本文提供基因工程化的重组MVA载体，其包含至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。本文还提供其例如适合于影响受试者的免疫反应或适合于诊断RSV感染以及确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的产物、方法以及用途。

Description

重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗
本申请为申请号为201380040909.3，申请日为2013年3月15日，发明名称为“重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗”的分案申请。
领域
本发明涉及作为针对呼吸道合胞病毒(RSV病毒)感染的改进的疫苗的重组改良型安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus Ankara)(MVA病毒)，以及相关产物、方法及用途。具体地说，本发明涉及基因工程化的重组MVA载体，其包含至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。本发明还涉及其例如适合于影响受试者的免疫反应或适合于诊断RSV感染以及确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的产物、方法以及用途。
背景
RSV是一种重要的呼吸道病原体。在世界范围内，急性下呼吸道(LRT)感染在婴儿和五岁以下儿童中引发显著发病率和死亡率[A.M.Aliyu等(2010),Bayero J.PureAppl.Sci.3(1):147-155]。呼吸道合胞病毒(RSV)是临床上最重要的LRT感染原因；原发性RSV感染通常到2岁时出现[W.P.Glezen(1987),Ped.Virol.2:1-4；Y.Murata(2009),Clin.Lab.Med.29(4):725-739]。因为原发性RSV感染不诱发对RSV的完全免疫，所以在一生中出现频繁的再感染，其中最严重的感染发生于极年轻者、极年老者中以及任何年龄的免疫缺陷患者中[Y.Murata(2009)]。
那些感染RSV者中多达40％最终患有需要住院治疗的严重LRT疾病，其中疾病的严重性和强度取决于感染的量度和强度以及宿主反应[Aliyu等(2010)]。RSV在任何年龄的患有免疫、呼吸道或心脏系统缺陷的患者中还可以引起严重的LRT疾病，并且还可以使儿童预先倾向于较晚患有哮喘。仅在美国，RSV一年引起估计126,000例住院治疗和300例婴儿死亡[Y.Murata(2009)]。此外，RSV是每年冬天在年长患者和那些患有潜在心肺或免疫抑制疾患者之中超过80,000例住院治疗和超过13,000例死亡的原因[Y.Murata(2009)]。然而，尽管RSV作为呼吸道病原体具重要性，但当前市场上没有安全并且有效的RSV疫苗。
RSV是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒亚科(Pneumovirinae)的一种包膜RNA病毒[Aliyu等(2010)]。各RSV病毒体含有具有约15,191个核苷酸的非片段、负义、单链RNA分子，其含有十段编码十一种独立的蛋白质的基因(M2含有两个开放阅读框)，所述十一种独立的蛋白质包括八种结构蛋白(G、F、SH、M1、N、P、M2.1以及L)和三种非结构蛋白(NS1、NS2以及M2.2)[Y.Murata(2009)]。基因组按以下顺序从NS1到L依序转录∶3’-NS1-NS2-N-P-M1-SH-G-F-M2.1-M2.2-L-5’。
病毒包膜含有三种跨膜糖蛋白(粘附糖蛋白(G)、融合糖蛋白(F)以及小疏水性蛋白(SH))以及基质(M1)蛋白[Y.Murata(2009)]。在RSV复制期间，病毒首先在由高度糖基化G蛋白介导的过程中粘附于靶细胞。然后病毒在由F蛋白介导的过程中与宿主细胞融合，从而穿透细胞膜并且进入宿主细胞；F蛋白也是形成RSV感染的细胞的合胞体特征所需的。粘附和融合过程因SH蛋白而加强。M1蛋白通过与包膜蛋白F和G以及与核衣壳蛋白N、P以及M2.1相互作用调节成熟RSV的组装(参见下文)。在包膜内，病毒RNA由转录酶复合物壳体化，所述转录酶复合物由核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、转录延伸因子(M2.1)以及RNA聚合酶(L)蛋白组成[Y.Murata(2009)]。N与基因组RNA缔合，而P是病毒RNA聚合酶L的辅因子。M2.1是为病毒转录所必需的延伸因子，且M2.2调节病毒基因组的转录。最后，NS1和NS2抑制I型干扰素活性。
临床RSV分离株根据抗原组分类(A或B)并且基于各抗原组的病毒基因组内的遗传变异性进一步再分成多个基因型(例如对于A组，A2或A长；而对于B组，B1、CH-18537或8/60)[Y.Murata(2009)]。分类是基于病毒与针对粘附糖蛋白(G蛋白)的单克隆抗体的反应性并且通过各种遗传分析来进行。[M.Sato等,J.Clin.Microbiol.43(1):36-40(2005)]。在病毒分离株之中,一些RSV编码蛋白在氨基酸序列层面是高度保守的(例如F)，而其它蛋白质在两种主要抗原组之间以及其内部彻底改变(例如G)[Y.Murata(2009)]。A和B抗原组的F蛋白享有相当的同源性。与此相反，G蛋白在两种抗原组之间相当不同。
G蛋白是最可变的RSV蛋白，其中其超变C端区域是大部分的病毒株特异性表位的成因。G蛋白的分子流行病学和演化模式已提供关于RSV的临床和流行病学特征的重要信息。典型地，若干不同基因型立刻循环，并且在一个地区中占主导地位的基因型每年可变化。然而，病毒株多样性对RSV的临床和流行病学特征的重要性仍了解得不充分。因此，重组RSV蛋白伴有用于指示用于克隆基因或蛋白质的原始RSV株的病毒株标识。举例来说，从RSV株A长克隆的G蛋白命名为G(A长)、RSV A长G或RSV A长G蛋白。
RSV刺激受感染宿主中的多种免疫反应，包括趋化因子和细胞因子的分泌、中和体液和粘膜抗体的产生以及CD4+(例如TH1和TH2)和CD8+(例如CTL)T细胞的产生。此类宿主免疫反应是RSV感染的临床表现的原因，因为病毒引起有限的体内细胞病变[Y.Murata(2009)]。RSV诱发的疾病的表型表现和严重性显然由RSV感染刺激的一系列免疫反应间的平衡和相互作用介导[Y.Murata(2009)]。
许多先前研究表明细胞和体液免疫反应在对RSV的免疫性的诱导和RSV感染的消除中以及在疾病进展中发挥不同作用[Y.Murata(2009)和其中的参考文献]。举例来说，使用人源化抗F抗体的研究显示，虽然抗RSV抗体足以预防或限制感染的严重性，但其不是清除病毒感染所需要的[Y.Murata(2009)；A.F.G.Antonis等(2007),Vaccine 25:4818-4827]。与此相反，T细胞反应是清除已确定的RSV感染所必需的[Y.Murata(2009)]。RSV诱导的T细胞反应还在感染期间的肺病变中发挥关键作用。举例来说，干扰素-γ(IFNγ)-分泌TH1细胞(具有或不具有相关CD8+CTL反应)在具有最小肺病变的情况下清除RSV，而白介素4(IL-4)-分泌TH2细胞也清除RSV，但经常伴有显著的肺变化，包括嗜酸性粒细胞浸润，其为在先前疫苗试验期间观测到增强性疾病的标志(参见下文)。
尽管可获得的关于RSV感染的免疫学、病毒学以及生理学的信息是丰富的，然而，如以下段落中更详细论述，仍远未确切地清楚哪种免疫反应可能最有效诱导持续免疫性，同时在接种后暴露于RSV时还不产生增强性疾病。
现有疫苗开发
疫苗典型地使用若干策略中的一种来诱导针对目标感染剂或病原体(例如病毒、细菌或寄生虫)的保护性免疫，包括∶(1)灭活病原体制剂；(2)活减毒病原体制剂，包括基因减毒病原体菌株；(3)纯化蛋白质亚基疫苗制剂；(4)编码病原体抗原的基于病毒载体的疫苗和/或佐剂；以及(5)编码病原体抗原的基于DNA的疫苗。
初始RSV疫苗开发工作集中在灭活病毒制剂，直到二十世纪六十年代期间在美国进行了测试福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗的功效的临床试验并且结果极糟[M.R.Olson和S.M.Varga(2007),J.Immunol.179:5415-5424]。大量接种患者患有以嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润为特征的增强性肺病并且在后续自然感染RSV之后发生大量的炎性反应[Olson和Varga(2007),[Blanco JC等(2010)Hum Vaccin.6:482-92]。那些患者中有许多需要住院治疗并且少量垂危患者死亡。因此，研究者开始搜寻在后续激发之后有助于增强性疾病的发生的病毒和/或宿主因素，尝试开发更安全的RSV疫苗。所述搜寻已产生许多关于的RSV生物学和其可诱导的广谱免疫反应的新信息，但安全并且有效的RSV疫苗仍然难以获得。
FI后RSV疫苗开发工作已大部分集中于单一抗原疫苗，其使用G、F，在较低程度上N或M2(其中由病毒或质粒DNA载体递送的病毒抗原)表达病毒基因或作为纯化蛋白质。[参见例如W.Olszewska等(2004),Vaccine 23:215-221；G.Taylor等(1997),J.Gen.Virol.78:3195-3206；以及L.S.Wyatt等(2000),Vaccine 18:392-397]。还已在小牛、棉鼠以及BALB/c小鼠中测试了使用F+G组合的接种，并且结果不同[Antonis等(2007)(小牛)；B.Moss的于1986年4月8日提交的美国专利申请No.06/849,299(‘’299申请’)(棉鼠)；以及L.S.Wyatt等(2000)(BALB/c小鼠)]。F与G两者在小牛、小鼠、棉鼠、人类中以及在至少一些程度上在猕猴婴猴中均具免疫原性[A.F.G.Antonis等(2007)(小牛)；B.Moss,’299申请(棉鼠)；L.deWaal等(2004),Vaccine 22:923-926(猕猴婴猴)；L.S.Wyatt等(2000)(BALB/c小鼠)；Y.Murata(2009)(人类)]。
然而，取决于所用疫苗、所选抗原、施用途径以及甚至所用模型生物的类型，由RSV疫苗候选者诱导的免疫反应的性质和类型显著不同(常常相当不同)。举例来说，使用活RSV或用编码RSV F蛋白的复制载体的免疫诱导了伴随中和抗F抗体和CD8+CTL产生的主导TH1反应，两者均与在接种后病毒激发时的最小肺病变有关[Y.Murata(2009)和其中所引用的参考文献]。与此相反，使用FI灭活RSV制剂的免疫诱导完全缺乏CD8+CTL反应的主导TH2反应，其在肺中产生了增加的病变变化[Y.Murata(2009)和其中所引用的参考文献]。有趣的是，施用呈纯化亚单位疫苗形式或于复制载体中的RSV G蛋白诱导主导TH2反应，其在接种后病毒激发之后最终产生嗜酸性粒细胞肺部浸润和气道超反应性，这是一种类似于在FI-RSV情况下的增强性疾病的反应[Y.Murata(2009)和其中所引用的参考文献]。此外，虽然使用编码RSV F蛋白的改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)接种在小牛中诱导抗F抗体和F特异性CD8+T细胞，但是用MVA-F+MVA-G接种诱导抗F和抗G抗体，但不诱导F特异性或G特异性CD8+T细胞[A.F.G.Antonis等(2007)]。
用表达F蛋白的痘苗病毒(VV)(VV-F)接种小鼠诱导强CD8+T细胞反应，其引起复制RSV从肺部清除，伴随与用FI-RSV免疫的小鼠相比类似或更大的重量减轻[W.Olszewska等(2004)]。然而，其不涉及由诸如IL-4和IL-5等TH2细胞因子分泌增强引起的由FI-RSV或VV表达G蛋白(VV-G)诱导的增强性疾病(组合的TH2反应肺嗜酸性粒细胞增多和重量减轻)。本领域中的一些研究表明能够诱导包括细胞与体液组分的相对平衡的免疫反应的RSV疫苗在接种后激发时将更少会展示增强性免疫病变[W.Olszewska等(2004)].。
然而，虽然用编码F、G或F+G的改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)接种BALB/c小鼠正是诱导了此类平衡免疫反应，包括体液反应(即平衡的IgG1和IgG2a反应)和TH1反应(即IFNγ/白介素-12(IL-12)水平上升和白介素-4(IL-4)/白介素-5(IL-5)水平降低)，然而所接种的动物仍表现出某种程度的重量减轻[W.Olszewska等(2004)]。
尽管耗费大量努力来表征在若干不同模型系统中由各种疫苗候选者诱导的免疫反应的性质和程度，但是仍不确切地清楚哪种免疫反应是传送针对RSV的持续和完全免疫而不使疫苗接受者预先倾向于患有增强性疾病所需要的。因为RSV与可获得的治疗剂和预防性选择的临床负担之间明显不平衡，所以开发RSV疫苗仍然是未得到满足的医疗需要。
描述
虽然为开发RSV疫苗而作出的现有不成功努力主要集中于用RSV-F或RSV-G膜糖蛋白或者两者进行接种，但是本发明人已发现用表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白的至少一种抗原决定簇的重组安卡拉痘苗病毒(MVA)进行接种诱导了更佳保护。此外，此类构建体当与皮下施加相比或甚至当与由Wyatt和同事使用的肌内施用途径相比时通过鼻内途径施加时诱导几乎完全无菌免疫[L.S.Wyatt等(2000)]。与肌内施用相比，通过鼻内施用候选RSV疫苗可获得增强的保护。
使用表达RSV F或RSV G膜糖蛋白(或两者)的重组MVA(例如MVA-mBN199B)或使用表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白的至少一种抗原决定簇的重组MVA(例如MVA-mBN201B)，本发明人在激发后4天在肺中未观测到复制RSV，尽管通过RT-qPCR仍可检测RSV基因组。表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白的至少一种抗原决定簇的重组MVA(例如MVA-mBN201B)诱导更佳保护和通过RT-qPCR可检测的RSV病毒负荷的更大降低，因为它们诱导了针对RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的更强的CD8+T细胞反应。此外，通过鼻内途径施用此类重组病毒诱导了几乎完全的无菌免疫(通过RT-qPCR几乎不可检测RSV病毒负荷)，因为其诱导粘膜免疫反应和IgA抗体分泌，当皮下施用此类构建体时不存在此类反应。
与FI-RSV相反，此类构建体诱导平衡的Th1免疫反应，从而产生针对RSV抗原的良好抗体反应以及强的特异性细胞免疫反应。在除诱导良好IgA抗体反应之外，鼻内施用疫苗产生与由常规皮下施用引起的那些IgG抗体水平相比甚至更高的IgG抗体水平的的情况下，保护得以改善并且体重损失降低。然而，细胞免疫反应的大小与施用途径无关。有趣的是，本发明人观察到由表达至少一条编码RSV膜糖蛋白抗原决定簇的异源核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的异源核苷酸序列的重组MVA(例如表达RSV F、G、N以及M2蛋白的MVA-mBN201B)诱导的T细胞反应模式，其类似于由RSV施用诱导的T细胞反应，虽然要高得多。
因此，在第一方面中，本发明提供一种重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包含至少一条编码呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)
已通过在鸡胚胎成纤维细胞上对真皮痘苗株安卡拉进行超过570次连续传代产生了MVA[绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒病毒，CVA；综述可参见Mayr等(1975),Infection 3,6-14]，其保存在Vaccination Institute,Ankara,Turkey中多年并且用作人类接种的基础。然而，由于与痘苗病毒相关的时常的严重接种后并发症，为产生更减毒、更安全的天花疫苗而进行了若干尝试。
在1960年至1974年期间，Anton Mayr教授通过在CEF细胞中进行超过570次连续传代成功使CVA减毒[Mayr等(1975)]。已在多种动物模型中显示所得MVA是无毒力的[Mayr,A.和Danner,K.(1978),Dev.Biol.Stand.41:225-234]。作为早期开发MVA作为先前天花疫苗的一部分，在处于痘苗的有害反应的危险中的受试者中存在与Lister Elstree[Stickl(1974),Prev.Med.3:97-101；Stickl和Hochstein-Mintzel(1971),MunichMed.Wochenschr.113:1149-1153]组合使用MVA-517的临床试验。在1976年，在德国将来源于MVA-571种苗储备的MVA(对应于第571代)注册作为二阶段肠胃外天花接种计划中的初免疫苗。随后，MVA-572用于约120,000个高加索个体中，大多数是1岁至3岁的儿童，并且未报导严重副作用，尽管许多受试者是在患有与痘苗相关的并发症的高风险群体之中(Mayr等(1978),Zentralbl.Bacteriol.(B)167:375-390)。MVA-572以ECACC V94012707保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)。
作为用于减弱MVA毒性的传代的结果，存在取决于在CEF细胞中传代的次数的许多不同病毒株或分离株。举例来说，在德国在天花根除计划期间使用MVA-572，而MVA-575广泛用作兽用疫苗。MVA-575于2000年12月7日以保藏号V00120707保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)。减毒的CVA病毒MVA(改良型安卡拉痘苗病毒)是通过在原代鸡胚胎成纤维细胞上CVA的连续繁殖(超过570次传代)来获得的。
尽管Mayr等证实，在二十世纪七十年代期间MVA在人类和哺乳动物中是高度减毒的和无毒力的，但是某些研究者已报导MVA在哺乳动物和人类细胞系中未充分减毒，因为在这些细胞中可能发生残余复制[Blanchard等(1998),J Gen Virol 79:1159-1167；Carroll和Moss(1997),Virology 238:198-211；美国专利No.5,185,146；Ambrosini等(1999),JNeurosci Res 55:569]。假定这些出版物中所报导的结果已使用各种已知MVA株获得，因为所用病毒的性质、特别是其在各种细胞系中的生长习性基本上不同。出于各种原因此类残余复制是不需要的，包括与在人类中使用有关的安全性担忧。
Bavarian Nordic已开发出对于开发更安全的产物(诸如疫苗或药物)来说具有增强的安全性特征的MVA株∶MVA由Bavarian Nordic进一步传代并且命名为MVA-BN。MVA以及MVA-BN与祖先CVA病毒相比缺乏约15％(来自六个区域的31kb)的基因组。所述缺失影响许多毒性和寄主范围基因以及A型包涵体的基因。对应于第583代的MVA-BN的样品于2000年8月30日以编号V00083008保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。
MVA-BN可粘附于并且进入非常有效地表达病毒编码基因的人类细胞。然而，不出现子代病毒的组装和释放。MVA-BN非常适合于原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)细胞并且在人类细胞中不复制。在人类细胞中，病毒基因得以表达，并且未产生感染性病毒。MVA-BN根据美国疾病控制和预防中心被归类为1级生物安全有机体。已将MVA-BN和衍生物的制剂向许多类型的动物并且向包括免疫缺陷个体的2000个人类受试者施用。所有接种已证明通常是安全的并且良好耐受。尽管其高度减毒并且毒性降低，但是在临床前研究中MVA-BN已显示可引发针对痘苗和针对由克隆至MVA基因组中的基因编码的异源基因产物的体液与细胞免疫反应[E.Harrer等(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等(2003),Hum.Gene Ther.14(14):1347-1360；M.Di Nicola等(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390]。
MVA的“衍生物”或“变体”是指展现与如本文所描述的MVA基本上相同的复制特征但在它们基因组的一个或多个部分中展现差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或变体未能在人类和小鼠、甚至在严重免疫抑制小鼠中进行体内繁殖性复制。更具体地说，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体还优选地具有在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中繁殖性复制的能力，但在人角化细胞细胞系HaCat[Boukamp等(1988),J Cell Biol 106:761-771]、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC No.91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC No.85120602)以及人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC No.CCL-2)中没有繁殖性复制的能力。另外，MVA-BN的衍生物或变体在Hela细胞和HaCaT细胞系中具有比MVA-575小至少两倍、更优选地小三倍的病毒扩增率。对MVA变体的这些性质的测试和分析描述于WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中，两者以引用的方式并入本文中。
病毒的扩增或复制一般以称为“扩增率”的由受感染细胞产生的病毒(输出)与本来用于感染起初细胞的量(输入)的比率表示。扩增率“1”定义了一种扩增状态，其中由受感染细胞产生的病毒的量与最初用于感染细胞的量相同，这意味着受感染细胞容许病毒感染和繁殖。与之相反，扩增率小于1(即输出与输入水平相比有所降低)表明缺乏繁殖性复制并且因此病毒减毒。
基于MVA的疫苗的优势包括其安全性性质以及可用于大规模疫苗生产。临床前测试已显示MVA-BN与其它MVA株相比展示优越的减毒和功效(WO 02/42480)。MVA-BN株的另外的性质是在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导与DNA初免/痘苗病毒加强方案相比基本上相同水平的免疫性的能力。
重组MVA-BN病毒(本文中的最优选实施方案)因其在哺乳动物细胞中的不同复制缺陷和其已充分确定的无毒性而被认为是安全的。此外，除其功效之外，工业规模制造的可行性也可以是有益的。另外，基于MVA的疫苗可递送多个异源抗原并且允许同时诱导体液与细胞免疫。
在另一个方面中，适合用于产生重组病毒的MVA病毒株可以是MVA-572株、MVA-575株或任何类似减毒MVA株。也适合的可以是突变体MVA，诸如缺失型绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒(dCVA)。dCVA包含MVA基因组的del I、del II、del III、del IV、del V以及del VI缺失位点。所述位点特别适用于插入多个异源序列。dCVA可在人类细胞系(诸如人293、143B以及MRC-5细胞系)中繁殖性复制(其中扩增率大于10)，然后其通过用于基于病毒的接种策略的进一步突变实现优化(参见WO 2011/092029)。
定义
术语“抗原决定簇”是指刺激宿主的免疫系统产生抗原特异性免疫反应(细胞反应和/或体液抗体反应)的任何分子。抗原决定簇可包括在宿主中仍引发免疫反应的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位，并且形成抗原、蛋白质的同系物或变体、多肽以及抗原性蛋白质片段、抗原以及表位的一部分，包括例如糖基化蛋白、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位，以及编码此类分子的核苷酸序列。因此，蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位不限于特定天然核苷酸或氨基酸序列，但涵盖与天然序列同一的序列以及对天然序列的修饰，诸如缺失、添加、插入以及取代。
优选地，所述同系物或变体与参考蛋白、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位在核苷酸或氨基酸序列层面具有至少约50％、至少约60％或65％、至少约70％或75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％；更典型地至少约90％、91％、92％、93％或94％和甚至更典型地至少约95％、96％、97％、98％或99％；最典型地至少约99％的同一性。术语同系物或变体还涵盖截短、缺失或另外修饰的核苷酸或蛋白质序列，诸如，例如(1)编码缺乏信号肽的可溶性形式的相应RSV-F或RSV-G蛋白以及全长RSV-F或RSV-G蛋白的跨膜域和/或胞浆域的RSV-F或RSV-G核苷酸序列，(2)编码全长RSV-M2或RSV-N蛋白的缺失、截短或另外的突变形式的RSV-M2或RSV-N核苷酸序列，(3)缺乏信号肽的可溶性形式的RSV-F或RSV-G蛋白以及全长RSV-F或RSV-G蛋白的跨膜域和/或胞浆域，或(4)全长RSV-M2或RSV-N蛋白的缺失、截短或另外突变形式。
用于测定核酸和氨基酸之间的序列同一性的技术是本领域中已知的。可通过测定两条或更多条序列的“同一性百分比”来将其进行比较。两条序列(核酸或氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度并且乘以100。
相对于本文所描述的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考序列(即将其衍生出来的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原或表位)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
加以必要的变更，这也适用于“核苷酸序列同一性百分比(％)”。
举例来说，通过Smith和Waterman,(1981),Advances in Applied Mathematics2:482-489的局部同源算法提供核酸序列的适当比对。此算法可通过使用由Dayhoff,Atlasof Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编著,5增刊3:353-358,NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发并且通过Gribskov(1986),Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763标准化的打分矩阵应用于氨基酸序列。此算法用于测定序列的同一性百分比的示例性实现方式由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”功效应用中提供。此方法的缺省参数描述于威斯康辛州序列分析包程序手册(Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual),第8版(1995)(可购自Genetics Computer Group,Madison,Wis.)中。在本发明上下文中确定同一性百分比的优选方法是使用由爱丁堡大学(University of Edinburgh)拥有版权、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,Calif)分销的MPSRCH程序包。由此套程序包，可使用Smith-Waterman算法，其中在打分表中使用缺省参数(例如空位开口罚分是12、空位延伸罚分是一，并且空位是六)。从产生的数据来看，“匹配”值反映了“序列同一性”。其它适合用于计算序列之间的同一性百分比或相似性的程序通常是本领域中已知的，例如另一种比对程序是以缺省参数使用的BLAST。举例来说，可使用以下缺省参数来使用BLASTN和BLASTP∶遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序依据＝高得分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士蛋白质(Swiss protein)+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于以下网址：http://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/。
如本文所用，“异源”基因、核酸、抗原或蛋白质被认为是不存在于野生型痘病毒基因组(例如MVA)中的核酸或氨基酸序列。熟练人员了解“异源基因”当存在于诸如MVA的痘病毒中时是要以如下方式并入痘病毒基因组中，使得在向宿主细胞施用重组痘病毒之后，所述异源基因表达为相应异源基因产物，即“异源抗原”和/或“异源蛋白质”。表达一般是通过将异源基因可操作地连接至允许在痘病毒感染的细胞中表达的调控元件来实现。优选地，调控元件包括天然或合成痘病毒启动子。
如本文所用的“无菌免疫”意指在应用诸如RT-qPCR的灵敏检测方法时在不存在可检测的RSV基因组的情况下的保护性免疫。
必须指出的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述”包括复数参考物。因此，举例来说，提到“一种表位”包括一个或多个表位，并且提到“该/所述方法”包括提到本领域普通技术人员已知可改进或替换本文所描述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指出，否则位于一系列元素前面的术语“至少”应被理解为是指所述系列中的每一个元素。本领域的熟练技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验确定本文所描述的本发明特定实施方案的许多等效物。此类等效物意在由本发明涵盖。
在本说明书和随附权利要求书通篇中，除非上下文另外要求，否则词语“包含/包括(comprise)”和诸如“包含/包括(comprises,comprising)”的变型应被理解为暗示包括所陈述的整体或者步骤或者整体或步骤的群组，但不排除任何其它整体或者步骤或者整体或步骤的群组。当在本文中使用时，术语“包含/包括(comprising)”可用术语“含有”或“包括(including)”或有时当在本文中使用时用术语“具有”取代。以上所提到的术语(包含、含有、包括、具有)中的任一者尽管较不优选，但无论何时在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情况下均可用术语“由...组成”取代。
当在本文中使用时，“由...组成”排除权利要求组成部分中未规定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由...组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
如本文所用，多个所引用元素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖个别与组合选择两者。举例来说，在两个元素通过“和/或”连接的情况下，第一选择指第一元素在不存在第二元素情况下的适用性。第二选择指第二元素在不存在第一元素情况下的适用性。第三选择指第一和第二元素一起的适用性。这些选择中的任一种均被认为落入所述含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。所述选择中超过一种的共存适用性也被认为落入所述含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
RSV核苷酸序列和蛋白质
尽管在病毒株或分离株之间基因的确切序列和/或基因组位置可不同，如本文所提到的RSV基因是指编码任何RSV株或分离株中的相应蛋白质的基因；或所述基因的同系物或变体。
同样地，本文所提到的RSV蛋白是指由如上文所定义的相应蛋白质基因编码和表达的蛋白质或所述蛋白质的同系物或变体。
举例来说，如在本文中可互换使用，术语“F蛋白基因”、“F糖蛋白基因”、“RSV F蛋白基因”、“RSV F糖蛋白基因”或“F基因”是指编码任何RSV株或分离株中的跨膜融合糖蛋白的基因，尽管病毒株或分离株之间的确切序列和/或基因组位置可不同；或所述基因的同系物或变体。举例来说，在RSV的A2株中，F(A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号M11486中所编号的第5601-7499位(包括端点)核苷酸。F(A2)蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中所编号的第5614-7338位(包括端点)核苷酸的编码蛋白质的开放阅读框(ORF)。来自RSV A2的F蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:28中。
在本文中也可互换使用的是术语“F蛋白”、“F糖蛋白”、“RSV F蛋白”、“RSV F糖蛋白”或“F”，所述术语是指由如上文所定义的RSV F蛋白基因编码和表达的高度糖基化跨膜融合糖蛋白或所述蛋白质的同系物或变体。来自RSV A2的F蛋白的氨基酸序列显示于SEQID NO:29中。RSV(A2)F蛋白包含信号肽、胞外域、跨膜域以及胞浆域(参见例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P03420)。RSV A2F蛋白的信号肽由SEQ ID NO:29的第1-21位氨基酸组成；RSV A2F蛋白的胞外域由SEQ ID NO:29的第1-529位氨基酸或SEQ ID NO:29的第22-529位氨基酸组成；RSV A2F蛋白的跨膜域由SEQ ID NO:29的第530-550位氨基酸组成；并且RSVA2F蛋白的胞浆域由SEQ ID NO:29的第551-574位氨基酸组成。
同样地，术语“G蛋白基因”、“G糖蛋白基因”、“RSV G蛋白基因”、“RSV G糖蛋白基因”或“G基因”在本文中也可互换使用。举例来说，在RSV的A2株中，G(A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号M11486中所编号的第4626-5543位(包括端点)核苷酸。G(A2)蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中所编号的第4641-5537位(包括端点)核苷酸的编码蛋白质的开放阅读框(ORF)。来自RSV A2的G蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:30中。
术语“G蛋白”、“G糖蛋白”、“RSV G蛋白”、“RSV G糖蛋白”或“G”是指高度糖基化跨膜粘附糖蛋白或所述蛋白质的同系物或变体。来自RSV A2的G蛋白的氨基酸序列显示于SEQID NO:31中。RSV A2G蛋白包含胞外域、跨膜域以及胞浆域(参见例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P03423)。RSV A2G蛋白的胞外域由SEQ ID NO:31的第67-298位氨基酸组成；RSVA2G蛋白的跨膜域由SEQ ID NO:31的第38-66位氨基酸组成；并且RSV A2G蛋白的胞浆域由SEQ ID NO:31的第1-37位氨基酸组成。
在本文中也可互换地使用的是术语“M2蛋白基因”、“M2核衣壳蛋白基因”、“RSV M2蛋白基因”、“RSV M2基质蛋白基因”、“RSV M2核衣壳蛋白基因”或“M2基因”。举例来说，在RSV的A2株中，M2(A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号M11486中所编号的第7550-8506位(包括端点)核苷酸。M2(A2)蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中所编号的第7559-8143位(包括端点)核苷酸的蛋白质编码的开放阅读框(ORF)。来自RSV A2的M2蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:32中。
在本文中可互换使用的是术语“M2蛋白”、“M2核衣壳蛋白”、“RSV M2蛋白”、“RSVM2核衣壳蛋白”、“RSV M2基质蛋白”或“M2”。来自RSV A2的M2蛋白的氨基酸序列显示于SEQID NO:33中(参见例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04545)。
另外，术语“N蛋白基因”、“N核衣壳蛋白基因”、“RSV N蛋白基因”、“RSV N核衣壳蛋白基因”或“N基因”在本文中可互换使用。举例来说，在RSV的A2株中，N(A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号M11486中所编号的第1081-2277位(包括端点)核苷酸。N(A2)蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中所编号的第1096-2271位(包括端点)核苷酸的编码开放阅读框(ORF)的蛋白质。来自RSV A2的N蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:34中。
来自RSV A2的在本文中可互换地使用的术语“N蛋白”、“N核衣壳蛋白”、“RSV N蛋白”、“RSV N核衣壳蛋白”或“N”的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:35中(参见例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P03418)。
本发明的某些实施方案
在某些实施方案中，重组MVA表达至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV F抗原决定簇。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV G抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇来自于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV G抗原决定簇来自于RSV株A2。
在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇并且RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV G抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇与RSV G抗原决定簇两者均可来源于RSV株A2。
在某些实施方案中，重组MVA表达至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV F抗原决定簇并且至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV F抗原决定簇并且至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV G抗原决定簇并且至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV G抗原决定簇并且至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV N抗原决定簇。
在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇并且RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇。在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSVF抗原决定簇，RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇，并且RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇是RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇，RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇，并且RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇是RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇与RSV G抗原决定簇两者均可来源于RSV株A2。
在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列和各自编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇，RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇，RSV核衣壳蛋白的第一抗原决定簇是RSV M2抗原决定簇，并且RSV核衣壳蛋白的第二抗原决定簇是RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇与RSV G抗原决定簇两者均来源于RSV株A2。
在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的三条异源核苷酸序列和各自编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇并且RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇，RSV核衣壳蛋白的第一抗原决定簇是RSV M2抗原决定簇，并且RSV核衣壳蛋白的第二抗原决定簇是RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇与RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇两者均来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第三抗原决定簇是RSV F抗原决定簇。
在某些实施方案中，重组MVA包含各自编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的四条异源核苷酸序列和各自编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的两条异源核苷酸序列。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇是RSV F抗原决定簇并且RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇是RSV G抗原决定簇，RSV核衣壳蛋白的第一抗原决定簇是RSV M2抗原决定簇，并且RSV核衣壳蛋白的第二抗原决定簇是RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第一抗原决定簇与RSV膜糖蛋白的第二抗原决定簇两者均来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第三抗原决定簇是RSV F抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV膜糖蛋白的第四抗原决定簇是RSV G抗原决定簇。
在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV F抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV F抗原决定簇是变体RSV F抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV F抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，全长RSV(A2)F抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:29的核苷酸序列SEQ IDNO:28。在某些实施方案中，变体RSV(A2)F抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的核苷酸序列SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，截短的RSV(A2)F抗原决定簇缺乏全长RSV(A2)F抗原决定簇的胞浆域和跨膜域。在某些实施方案中，截短的RSV(A2)F抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:16的核苷酸序列SEQ ID NO:15。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV F抗原决定簇来源于RSV株A长。在某些实施方案中，变体RSV(A长)F抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:6的核苷酸序列SEQ ID NO:5。在某些实施方案中，截短的RSV(A长)F抗原决定簇缺乏全长RSV(A长)F抗原决定簇的胞浆域和跨膜域。
在某些实施方案中，至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV G抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV G抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV G抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV G抗原决定簇是变体RSV G抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV G抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，全长RSV(A2)G抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列SEQ IDNO:1。在某些实施方案中，截短的RSV(A2)G抗原决定簇缺乏全长RSV(A2)G抗原决定簇的胞浆域和跨膜域。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV G抗原决定簇来源于RSV株B。在某些实施方案中，截短的RSV(B)G抗原决定簇缺乏全长RSV(B)G抗原决定簇的胞浆域和跨膜域。在某些实施方案中，截短的RSV(B)G抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:8的核苷酸序列SEQ ID NO:7。
在某些实施方案中，至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是变体RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV M2抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV(A2)M2抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:33的核苷酸序列SEQID NO:32。
在某些实施方案中，至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列编码RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是变体RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV N抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV(A2)N抗原决定簇包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:35的核苷酸序列SEQ ID NO:34。
在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇与RSV M2抗原决定簇两者均由单个开放阅读框编码并且由自切割蛋白酶结构域隔开。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV M2抗原决定簇是变体RSV M2抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV M2抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是全长的。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是截短的。在某些实施方案中，RSV N抗原决定簇是变体RSV N抗原决定簇。在某些实施方案中，全长、截短或变体RSV N抗原决定簇来源于RSV株A2。在某些实施方案中，自切割蛋白酶结构域来源于口蹄疫病毒。在某些实施方案中，自切割蛋白酶结构域是来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A片段，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:12的核苷酸序列SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，至少一条编码RSV N抗原决定簇和RSV M2抗原决定簇的异源核苷酸序列包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:18的核苷酸序列SEQ ID NO:17。
整合至MVA中的位点
在某些实施方案中，将编码RSV膜糖蛋白的一种或多种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白的一种或多种抗原决定簇的异源核苷酸序列并入MVA基因组或MVA-BN基因组中的多个插入位点。如图1中所描绘，可将编码RSV蛋白的一种或多种抗原决定簇的异源核苷酸序列作为独立的转录单元或融合基因插入至重组MVA中。
在某些实施方案中，将异源RSV核苷酸序列插入到MVA的一个或多个基因间区(IGR)中。IGR可选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137以及IGR148/149，优选自IGR64/65、IGR88/89和/或IGR 148/149。另外地或可选地，可将异源RSV核苷酸序列插入到MVA的一个或多个天然存在的缺失位点I、II、II、IV、V或VI。在某些实施方案中，少于5个、4个、3个或2个的所述整合位点包含异源RSV核苷酸序列。
包含异源RSV核苷酸序列的MVA的插入位点的数目可以是1、2、3、4、5、6、7或更多。重组MVA可包含插入到4个、3个、2个或更少个插入位点的异源RSV核苷酸序列，但优选地使用两个插入位点。在某些实施方案中，使用三个插入位点。优选地，重组MVA包含插入到2个或3个插入位点的至少4个、5个、6个或7个核苷酸序列。
本文所提供的重组MVA病毒可通过本领域中已知的常规方法来产生。用于获得重组痘病毒或用于将异源核苷酸序列插入痘病毒基因组的方法是本领域技术人员熟知的。举例来说，用于诸如DNA的克隆、DNA与RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR以及PCR扩增技术等标准分子生物学技术的方法描述于Molecular Cloning,Alaboratory Manual(第2版)[J.Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]中，并且用于处理和操纵病毒的技术描述于VirologyMethods Manual[B.W.J.Mahy等(编著),Academic Press(1996)]中。类似地，用于MVA的处理、操纵以及基因工程化的技术和诀窍描述于MolecularVirology:A Practical Approach[A.J.Davison和R.M.Elliott(编著),The PracticalApproach Series,IRL Press at Oxford University Press,Oxford,UK(1993)(参见例如第9章:Expression of genes by Vaccinia virus vectors)]和Current Protocols inMolecularBiology[John Wiley&Son,Inc.(1998)(参见例如第16章,第IV部分:Expressionof proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)]中。
为产生本文所公开的各种重组MVA，不同的方法可适用。所要插入病毒的核苷酸序列可放入与MVA的一段DNA同源的DNA已插入其中的大肠杆菌(E.coli)质粒构建体中。单独地，所要插入的DNA序列可连接至启动子。启动子-基因键可置于质粒构建体中，使得启动子-基因键两侧与位于含非必需基因座的MVA DNA区域侧翼的DNA序列同源的DNA相接。所得质粒构建体可通过在大肠杆菌细菌内通过繁殖进行扩增并且分离。可将含有所要插入的DNA基因序列的经分离的质粒转染至例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的细胞培养物中，同时用MVA感染培养物。质粒和病毒基因组中的同源MVA DNA之间的重组分别可产生通过存在外来DNA序列而改良的MVA。
根据一个优选实施方案，可用痘病毒感染如例如CEF细胞的适合的细胞培养物的细胞。随后，受感染细胞可优选地在痘病毒表达控制元件的转录控制下用包含一种或多种外来基因的第一质粒载体转染。如上文所解释，质粒载体还包含能够引导外源序列插入痘病毒基因组的所选部分中的序列。任选地，质粒载体还含有包含可操作地连接至痘病毒启动子的标记和/或选择基因的盒子。适合的标记或选择基因是例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖基转移酶或其它标记的基因。选择或标记盒的使用简化了所产生的重组痘病毒的鉴别和分离。然而，重组痘病毒还可以通过PCR技术来鉴别。随后，可使另一个细胞感染如上文所描述获得的重组痘病毒并且用包含一种或多种第二外来基因的第二载体转染。假如可将此基因引入痘病毒基因组的不同插入位点，那么第二载体在引导一种或多种第二外来基因整合至痘病毒基因组中的痘病毒同源序列方面也不同。在已出现同源重组之后，可将包含两种或更多种外来基因的重组病毒分离。为将其它外来基因引入至重组病毒中，可通过使用用于感染的在先前步骤中分离的重组病毒用于感染并且通过使用用于转染的包含另外一种或多种外来基因的另一载体来重复感染步骤和转染步骤。
或者，如上文所描述的感染和转染步骤是可互换的，即适合的细胞可首先通过包含外来基因的质粒载体转染并且然后用痘病毒感染。作为另一种替代方式，也可能将各外来基因引入至不同病毒中，用所有所获得的重组病毒共感染细胞并且筛选包括所有外来基因的重组。第三种替代方式是在体外连接DNA基因组与外来序列并且使用辅助病毒重建重组痘苗病毒DNA基因组。第四种替代方式是在大肠杆菌或另一种细菌物种中使以细菌人工染色体(BAC)形式克隆的痘苗病毒基因组与侧翼是与痘苗病毒基因组中位于所需整合位点侧翼的序列同源的DNA序列的线性外来序列之间进行同源性重组。
RSV基因的表达
在一个实施方案中，一种、多种或所有异源RSV核苷酸序列的表达是受一种或多种痘病毒启动子的控制。在某些实施方案中，痘病毒启动子是Pr7.5启动子、杂合早期/晚期启动子、PrS启动子、合成或天然早期或晚期启动子或牛痘病毒ATI启动子。在某些实施方案中，痘病毒启动子选自PrS启动子(SEQ ID NO:39)、Pr7.5启动子(SEQ ID NO:40)、PrSynIIm启动子(SEQ ID NO:41)、PrLE1启动子(SEQ ID NO:42)以及PrH5m启动子(SEQ ID NO:43[L.S.Wyatt等(1996),Vaccine 14(15):1451-1458])。在某些实施方案中，痘病毒启动子是PrS启动子(SEQ ID NO:39)。在某些实施方案中，痘病毒启动子是Pr7.5启动子(SEQ ID NO:40)。在某些实施方案中，痘病毒启动子是PrSynIIm启动子(SEQ ID NO:41)。在某些实施方案中，痘病毒启动子是PrLE1启动子(SEQ ID NO:42)。在某些实施方案中，痘病毒启动子是PrH5m启动子(SEQ ID NO:43)。
一种或多种异源RSV核苷酸序列可作为单一转录单元表达。举例来说，可将异源RSV核苷酸序列可操作地连接至痘苗病毒启动子和/或连接至痘苗病毒转录终止子。在某些实施方案中，一种或多种异源RSV核苷酸序列以融合蛋白形式表达。融合蛋白还可包含肽酶或异源自切割肽序列的识别位点。异源自切割肽序列可以是来自口蹄疫病毒的2A肽酶。
在某些实施方案中，“转录单元”是自身插入MVA基因组中的插入位点中，但也可以与其它转录单元一起插入MVA基因组中的插入位点。“转录单元”不是MVA基因组中天然存在的(即它是异源的、外源的或外来的)并且能够在受感染细胞中转录。
优选地，重组MVA包含1、2、3、4、5或更多个插入MVA基因组的转录单元。在某些实施方案中，重组MVA稳定表达由1、2、3、4、5或更多个转录单元编码的RSV蛋白。在某些实施方案中，重组MVA包含在MVA基因组中的1、2、3或更多个插入位点处插入MVA基因组的2、3、4、5或更多个转录单元。
RSV疫苗和药物组合物
因为本文所描述的包括MVA-BN的重组MVA病毒是高度复制限制性的，并且因此高度减毒，所以它们是用于治疗包括人类和甚至免疫缺陷人类的广泛范围的哺乳动物的理想候选物。因此，本文提供了用作活性药物物质的根据本发明的重组MVA，以及药物组合物和疫苗，其全部旨在用于诱导包括人类的活动物体中的免疫反应。
为此，重组MVA、疫苗或药物组合物可以104至109TCID50/ml、105至5×108TCID50/ml、106至108TCID50/ml或107至108TCID50/ml的浓度范围配制成溶液形式。用于人类的优选剂量包含106至109TCID50之间，包括106TCID50、107TCID50、108TCID50或5×108TCID50的剂量。
本文所提供的药物组合物通常可包含一种或多种药学上可接受的和/或批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类助剂物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适合的载体典型地是大的缓慢代谢的分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
对于疫苗的制备，可使本文所提供的重组MVA病毒转化成生理学上可接受的形式。这可基于如由H.Stickl等,Dtsch.med.Wschr.99:2386-2392(1974)所描述的在制备用于针对天花接种的痘病毒疫苗方面的经验来进行。
举例来说，可将纯化病毒储存在-80℃下，其中滴度是5×108TCID50/ml，于约10mMTris、140mM NaCl pH 7.7中配制。对于疫苗注射物的制备，可将例如102-108或102-109个病毒粒子在安瓿、优选玻璃安瓿中在2％蛋白胨和1％人白蛋白的存在下在100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。或者，疫苗注射物可通过将制剂中的病毒逐渐冷冻干燥来制备。此制剂可含有适合用于体内施用的其它添加剂，诸如甘露糖醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮；或其它助剂(诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白))。然后，将玻璃安瓿密封并且可将其储存在4℃与室温之间数月。然而，只要不存在需要，就可将安瓿优选地储存在-20℃下的温度下。
对于接种或治疗，可将冻干剂溶解于水溶液、优选地生理盐水或Tris缓冲液中，并且全身或局部施用，即胃肠外、皮下、静脉内、肌内、鼻内或熟练从业者已知的任何其它施用途径。施用模式、剂量以及施用次数可由本领域技术人员以已知方式优化。然而，最常见的是，在第一次接种注射之后约一个月至六周用第二次注射物接种患者。
包含重组MVA病毒的试剂盒
本文还提供包含任何一种或多种的本文所描述的重组MVA的试剂盒。所述试剂盒可包括重组MVA的一个或多个容器或小瓶，以及向处于RSV感染风险中的受试者施用重组MVA的说明书。在某些实施方案中，受试者是人类。说明书可指示向受试者施用单剂量或多(即2、3、4等)剂量的重组MVA。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA病毒是以第一次(初免)和第二次(加强)施用向初次接受试验或非初次接受试验的受试者施用。
进一步提供包括于第一小瓶或容器中的用于第一次施用(初免)和于第二小瓶或容器中的用于第二次施用(加强)的重组MVA病毒的试剂盒。所述试剂盒还可以包括用于第三次、第四次或进一步施用(加强)的第三、第四或其它小瓶或容器中的重组MVA。
方法和重组MVA病毒的用途
本文还提供免疫受试动物的方法，以及用于免疫受试动物方法中的重组MVA，以及本文所提供的重组MVA在用于免疫受试动物的药剂或疫苗的制备中的用途。在某些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是大鼠、兔、猪、小鼠或人类，并且所述方法包括向受试者施用一定剂量的本文所提供的重组MVA的任何一种或多种。
受试者优选地是人类并且可为成人，其中所述成人可以是免疫缺陷的。在某些实施方案中，所述成人超过50、55、60、65、70、75、80或85岁。在其它实施方案中，受试者的年龄小于5岁、小于3岁、小于2岁、小于15个月、小于12个月、小于9个月、小于6个月或小于3个月。受试者的年龄还可以在0-3个月、3-6个月、6-9个月、9-12个月、1-2岁或2-5岁范围内。
在某些实施方案中，本文所提供的重组MVA中的任一者是以106至109TCID50的剂量、以106至5×108TCID50或107至108TCID50的剂量向受试者施用。本文所提供的重组MVA还可以106、107TCID50、108或5×108TCID50的剂量向受试者施用。在某些实施方案中，本文所提供的重组MVA中的任一者是以107TCID50、108或5×108TCID50的剂量向人类受试者施用。
本文所提供的重组MVA是以单剂量或以多(即2、3、4等)剂量向受试者施用。在某些实施方案中，重组MVA是以第一次(初免)和第二次(加强)施用来进行施用。在某些实施方案中，第一剂量包含107至108TCID50的重组MVA病毒并且第二剂量包含107至108TCID50的重组MVA病毒。
重组MVA可全身或局部、肠胃外、皮下、静脉内、肌内或鼻内施用，优选皮下或鼻内施用。重组MVA还可以通过熟练从业者已知的任何其它施用途径来施用。
在另一个方面中，本文提供诊断RSV感染的方法和确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的方法，所述复发性RSV感染特别是对于新生儿、介于1岁与6岁之间的儿童和/或老年人来说可能是一种严重威胁。
本发明人已发现当前诊断RSV感染的方法可能提供不正确的结果。举例来说，检测针对RSV的抗体的免疫测定或病毒斑测定可能未必准确识别处于复发性感染风险中的个体。的确，本发明人观测到尽管取自个体的样品可在病毒斑测定中反馈阴性结果[参见例如W.Olszewska等,2004]，此类结果有时可能是假阴性，因为更灵敏的方法有时证实感染性RSV粒子仍存在。事实上，需要诸如定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)的方法来证实受试者是否可能实际上感染了RSV、是否处于复发性感染的风险中，或已接种的受试者是否的确具有针对RSV的后天无菌免疫。此测定可能是关键的，因为接种之后的再感染有时引起增强性疾病，偶而引起死亡。
因此，在某些实施方案中，本文提供确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的方法，其包括定量地确定获自受试者的样品是否含有RSV基因组，其中RSV基因组的存在指示复发性感染RSV的可能性。在某些实施方案中，定量确定获自受试者的样品是否含有RSV基因组是通过qRT-PCR来进行的。
如本文所用，术语“样品”是指含有多核苷酸和多肽或其部分的获自个体、细胞系、组织培养物或其它来源的任何生物样品。生物样品包括体液(诸如，例如，血液、血清、血浆、尿、滑液、脊髓液、支气管肺泡灌洗液(BAL))和发现和/或怀疑含有RSV的身体组织，包括例如获自参与临床试验或其它实验性研究的受试者的临床样品。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域中熟知的。在某些实施方案中，生物样品包括RSV核酸。
如在本文中可互换使用，术语“RT-qPCR”、“qRT-PCR”是指一种称为“定量实时聚合酶链式反应”的方法。在一些情况下，此方法也可以称为动态聚合酶链式反应(KPCR)。
在某些实施方案中，本文提供确定受试者是否具有针对RSV的后天无菌免疫的方法，其包括定量地确定获自受试者的样品是否含有RSV基因组，其中RSV基因组的存在指示受试者不具有针对RSV的后天无菌免疫。本文还提供对不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的方法，其包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA中的任一者。另外地或可选地，提供了本文所描述的重组MVA中的任一者以用于对不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的方法中，所述方法包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA的任一者。本文还提供了本文所描述的重组MVA中的任一者在制备用于对不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的药剂和/或疫苗的制备中的用途，其中药剂或疫苗是鼻内施用的。
在某些实施方案中，本文提供在不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导针对RSV的无菌免疫的方法，其包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA的任一者。本文还提供本文所描述的重组MVA的任一者以用于在不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导针对RSV的无菌免疫的方法中，所述方法包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA的任一者。另外地或可选地，本文提供本文所描述的重组MVA的任一者在用于在不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导针对RSV的无菌免疫的药剂和/或疫苗的制备中的用途，其中所述药剂或疫苗是鼻内施用的。
本发明的某些实施方案还包括以下各项∶
1.包含编码至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列的一种重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，用于通过鼻内施用来治疗或预防RSV感染，其中排除肌内施用。
2.包含编码至少一种呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列的重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)在制备药物组合物和/或疫苗中的用途，其中鼻内施用药物组合物和/或疫苗并且其中排除肌内施用。
3.一种针对RSV感染对包括人类的受试者进行免疫的方法，其包括向包括人类的受试者鼻内施用包含编码呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇的核苷酸序列的重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，其中排除肌内施用。
4.如第1项所述的重组MVA、如第2项所述的用途和/或如第3项所述的方法，其仅仅包括鼻内施用。
5.如第1项所述的重组MVA、如第2项所述的用途和/或如第3项所述的方法，其包括皮下施用。
6.如第1项或第4至5项中任一项所述的重组MVA、如第2项、第4项或第5项中任一项所述的用途和/或如第3至5项中任一项所述的方法，其中所述重组MVA进一步包含编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
7.一种重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包含至少一条编码呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳抗原决定簇的核苷酸序列。
8.如第1至7项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码RSV F抗原决定簇。
9.如第1至8项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其进一步包含至少一条编码RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
10.如第1至9项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码全长RSV F膜糖蛋白。
11.如第8至10项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选来源于A2和/或A长。
12.如第8至11项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
13.如第8至12项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO:3。
14.如第1至13项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码截短的RSV F膜糖蛋白。
15.如第14项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述截短的RSV F膜糖蛋白的核苷酸序列来源于RSV株A，优选地来源于A长。
16.如第14或15项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的RSV F膜糖蛋白缺乏跨膜域。
17.如第14至16项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的RSVF膜糖蛋白缺乏胞浆域。
18.如第8至17项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
19.如第8至18项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID NO:5。
20.如前述项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇。
21.如第1至20项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其进一步包含至少一条编码RSV G膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
22.如第1至21项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码全长RSV G膜糖蛋白。
23.如第20至22项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选来源于株A2和/或B。
24.如第20至23项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
25.如第20至24项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID NO:1。
26.如第1至25项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码截短的RSV G膜糖蛋白。
27.如第26项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码截短的RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株B。
28.如第26或27项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短RSV G膜糖蛋白缺乏跨膜域。
29.如第26至28项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的RSVG膜糖蛋白缺乏胞浆域。
30.如第20至29项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
31.如第20至30项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID NO:7。
32.如第6至31项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇。
33.如第6至32项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
34.如第6至33项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码全长蛋白。
35.如第32至34项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选株A2。
36.如第32至35项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSV N核衣壳与RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
37.如第36项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述RSV N核衣壳和所述RSVM2基质蛋白的抗原决定簇由单一开放阅读框编码。
38.如第36或37项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述RSV N核衣壳和所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇是由自切割蛋白酶结构域隔开。
39.如第38项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结构域序列来源于口蹄疫病毒。
40.如第38或39项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结构域序列是蛋白酶2A片段序列。
41.如第38至40项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结构域序列包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
42.如第38至41项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结构域包括核苷酸序列SEQ ID NO:11。
43.如第37至42项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述单一开放阅读框包括编码氨基酸序列SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
44.如第37至43项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述单一开放阅读框包括核苷酸序列SEQ ID NO:17。
45.如前述项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包括一条编码RSV膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和一条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
46.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV F膜糖蛋白和所述RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇。
47.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV F膜糖蛋白和所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
48.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV G膜糖蛋白和所述RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇。
49.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV G膜糖蛋白和所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
50.如第1至44项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
51.如第50项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV F和/或所述G膜糖蛋白和所述RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇。
52.如第50项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSV F和/或所述G膜糖蛋白和所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
53.如第1至44项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两条编码RSV膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和两条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
54.如第53项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含编码RSV F和/或G膜糖蛋白的抗原决定簇和RSV N核衣壳和/或M2基质蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
55.如第1至44项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含三条编码RSV膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和两条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
56.如第55项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两种RSV F膜糖蛋白和/或一种RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇以及所述RSV N核衣壳蛋白和/或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
57.如第55项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两种RSV G膜糖蛋白和/或一种RSV F膜糖蛋白的抗原决定簇以及所述RSV N核衣壳蛋白和/或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
58.如第1至44项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含四条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
59.如第58项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两种RSV F膜糖蛋白和/或两种RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇以及所述RSV N核衣壳蛋白或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
60.如第1至44项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含四条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和两种编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
61.如第60项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含两种RSV F膜糖蛋白和/或两种RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇以及所述RSV N核衣壳蛋白和/或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇。
62.如第1至61项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中用于产生所述重组MVA的MVA是MVA-BN或其衍生物。
63.如第1项或第4至62项中任一项所述的重组MVA，其用作活性药物物质。
64.一种药物组合物和/或疫苗，其包含如第1项或第4至63项中任一项所述的重组MVA以及任选的药学上可接受的载体和/或稀释剂。
65.如第1项或第4至63项中任一项所述的重组MVA的用途，其用于制备药物组合物和/或疫苗。
66.如第6至63项中任一项所述的重组MVA、如第64项所述的药物组合物和/或疫苗和/或如第2项、第4至6项、第8至62项或第65项中任一项所述的用途，其用于治疗或预防RSV感染。
67.一种针对RSV感染对包括人类的受试者进行免疫的方法，其包括向包括人类的所述受试者施用如第1项、第4至63项或第66项中任一项所述的重组MVA和/或根据第64项或第66项所述的药物组合物和/或疫苗。
68.如第1项、第4至63项或第66项中任一项所述的重组MVA，如第64项或第66项所述的药物组合物和/或疫苗，如第2项、第4至6项、第8至62项、第65项或第66项中任一项所述的用途和/或如第3至6项、第8至62项或第67项中任一项所述的方法，其中重组MVA是或有待于以介于107-109TCID50之间的剂量施用。
69.如第5至68项中任一项所述的重组MVA、药物组合物和/或疫苗、用途和/或方法，其中所述重组MVA是或有待于鼻内和/或皮下施用。
70.如第1至69项中任一项所述的重组MVA、药物组合物和/或疫苗、用途和/或方法，其中所述重组MVA是或有待于以单剂量或多剂量向在免疫上初次接受试验或在免疫上有经验的包括人类的受试者施用。
71.如第1至70项中任一项所述的重组MVA、药物组合物和/或疫苗、用途和/或方法，其用于向包括大于2岁的人类的受试者施用。
72.如第1至70项中任一项所述的重组MVA、药物组合物和/或疫苗、用途和/或方法，其用于向包括小于2岁的人类的受试者施用。
73.一种试剂盒，其包括如第1项、第4至63项、第66项或第68至72项中任一项所述的重组MVA的一个或多个小瓶以及用于向处于RSV感染的风险中的受试者施用所述病毒的说明书。
74.一种包含根据第1项、第4至63项、第66项或第68至72项中任一项所述的重组MVA的试剂盒和/或根据第73项所述的试剂盒，其包含用于第一次施用(初免)的于第一小瓶或容器中和用于第二次施用(加强)的第二小瓶或容器中的所述重组MVA。
75.根据第73或74项所述的试剂盒，其包含用于第三次、第四次或进一步施用(加强)的于第三、第四或其它小瓶或容器中的所述重组MVA。
76.一种细胞，其包含根据第1项、第4至63项或第66项中任一项所述的重组MVA。
77.一种产生根据第1项、第4至63项、第66项或第68至72项中任一项所述的重组MVA的方法，其包括以下步骤∶
(a)用MVA病毒感染宿主细胞，
(b)用包含编码RSV抗原决定簇的核苷酸序列的重组载体转染受感染细胞，所述核苷酸序列进一步包括能够引导所述核苷酸序列整合至MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，
(c)识别、分离并且任选地纯化所产生的重组MVA病毒。
78.一种重组MVA，其是根据第77项所述的方法产生。
79.一种用于制备根据第1项、第4至63项、第66项或第68至72项所述的重组MVA和/或用于产生由所述重组MVA的所述基因组表达的抗原决定簇的方法，其包括以下步骤∶
(a)用第1项、第4至63项、第66项或第68至72项中任一项所述的重组MVA感染宿主细胞，或用所述重组MVA的重组DNA转染所述细胞，
(b)培养所感染或转染的细胞，
(c)从所述细胞分离MVA和/或抗原决定簇。
80.一种重组MVA和/或抗原决定簇，其可通过第79项所述的方法获得。
81.一种用于确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的方法，其包括借助于RT-qPCR确定在获自所述受试者的样品中是否存在RSV，借此RSV的存在指示复发性RSV感染的存在。
82.一种用于确定受试者是否具有针对RSV的后天无菌免疫的方法，其包括借助于RT-qPCR确定在获自所述受试者的样品中是否存在RSV，借此RSV的存在指示所述受试者不具有针对RSV的后天无菌免疫。
83.一种对通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的方法，其包括向所述受试者鼻内施用如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA和/或如第64项、第66项或第68至72项中任一项所述的药物组合物和/或疫苗。
84.如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA和/或如第64项、第66项或第68至72项中任一项所述的药物组合物和/或疫苗，其用于对通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的方法中，所述方法包括向所述受试者鼻内施用所述重组MVA。
85.如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA的用途，其用于制备用于对通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的药物组合物和/或疫苗，其中所述药物组合物和/或疫苗用于鼻内施用。
86.一种在通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导无菌免疫的方法，其包括向所述受试者鼻内施用如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA和/或如第64项、第66项或第68至72项中任一项所述的药物组合物和/或疫苗。
87.如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA和/或如第64项、第66项或第68至72项中任一项所述的药物组合物和/或疫苗，其用于在通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导无菌免疫的方法中，所述方法包括向所述受试者鼻内施用所述重组MVA。
88.如第1项、第4至63项、第66项、第68至72项、第78项或第80项中任一项所述的重组MVA的用途，其用于制备用于在通过如第82项所述的方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导无菌免疫的药物组合物和/或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗用于鼻内施用。
应了解，前述一般描述与详细描述两者均仅是示例性和说明性的并且不限定或限制如要求保护的发明。并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明本发明的各种实施方案并且与所述描述一起用以解释本发明的原理。
附图简述
图1示出了用于所测试的重组MVA-构建体、MVA-mBN199B、MVA-mBN201B、MVA-mBN201BΔM2、MVA-mBN294B、MVA-mBN295B以及MVA-mBN330B中的异源RSV基因。
图2示出了通过基于IBL Hamburg的ELISA测量的血清RSV特异性IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫(皮下或鼻内)两次或三次。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将血清稀释100倍并且使用涂有RSVF和G蛋白的板使用基于IBL Hamburg试剂盒的RSV特异性IgG ELISA进行分析。
图3示出了在连续稀释之后通过基于IBL Hamburg的ELISA测量的血清RSV特异性IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将血清稀释(100倍、200倍以及400倍)并且使用涂有RSV F和G蛋白的板使用基于IBL Hamburg试剂盒的RSV特异性IgG ELISA进行分析。
图4示出了使用仅涂有F蛋白的板通过基于IBL Hamburg的ELISA测量的血清RSV特异性IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2皮下免疫两次或三次。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将血清稀释100倍并且使用仅涂有RSV F蛋白的板使用基于IBL Hamburg试剂盒的RSV特异性IgG ELISA进行分析。
图5示出了通过基于Serion的ELISA测量的血清RSV特异性IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将血清稀释(100倍)并且使用涂有RSV裂解物的板使用基于Serion试剂盒的RSV特异性IgG ELISA进行分析。
图6示出了在支气管肺泡灌洗(BAL)流体和血清中的通过基于IBL Hamburg的ELISA测量的RSV特异性IgA对比IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将血清和BAL流体稀释(100倍)并且使用涂有RSV F和G蛋白的板使用基于IBLHamburg试剂盒的RSV特异性IgG或IgA ELISA进行分析。
图7示出了通过ELISPOT测量的RSV F特异性、RSV G特异性以及RSV M2特异性T细胞反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。在第48天将脾分离并且将脾细胞用三种不同RSV F特异性肽(RSV-1(SEQ ID NO:19)、RSV-2(SEQ ID NO:20)以及RSV-3(SEQ ID NO:21))、一种RSV G特异性肽(RSV-4(SEQ ID NO:22))、一种RSV M2特异性肽(RSV-9(SEQ ID NO:27))或MVA-BN再刺激。通过ELISPOT检测IFNγ分泌细胞。如实施例中所解释计算刺激指数。
图8示出了用RSV(A2)激发之后的相对体重损失。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV(A2)激发。从激发当天开始每天测量重量。将激发当天的重量用作基线来计算相对体重变化的百分比。
图9示出了通过空斑测定测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV(A2)激发。4天后将肺分离并且通过空斑测定确定RSV负荷(pfu/肺)。
图10示出了通过RT-qPCR测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫两次或三次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV A2激发。4天后将肺分离并且通过RT-qPCR测定RSV负荷(基于所观测到的L基因拷贝的数目来估计)。
图11示出了通过ELISA测量的RSV(A2)激发后4天的支气管肺泡灌洗(BAL)中的IL4水平。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B或MVA-mBN201B免疫两次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。然后将小鼠用106pfu RSV A2激发。4天后将肺用1ml PBS洗涤并且通过ELISA测定BAL中的IL4水平。(n.d.＝未检出)
图12示出了通过ELISA测量的RSV(A2)激发后4天的支气管肺泡灌洗(BAL)中的IL5水平。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B或MVA-mBN201B免疫两次(皮下或鼻内)。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。然后将小鼠用106pfu RSV A2激发。4天后将肺用1ml PBS洗涤并且通过ELISA测定BAL中的IL5水平。(n.d.＝未检出)
图13示出了通过基于Serion的ELISA测量的血清RSV特异性IgG反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将最后一次免疫之后2周所获得每组5只小鼠的血清稀释并且使用涂有RSV裂解物的板使用基于Serion试剂盒的RSV特异性IgG ELISA进行分析。
图14示出了通过PRNT测量的血清RSV特异性中和抗体反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。将最后一次免疫之后2周所获得的每组5只小鼠的血清通过PRNT进行分析。
图15示出了通过ELISPOT测量的RSV F特异性和RSV M2特异性T细胞反应。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内免疫两次。在第34天将脾分离并且将脾细胞用一种RSVF特异性肽(RSV-2(SEQ ID NO:20))、一种RSV M2特异性肽(RSV-9(SEQ ID NO:27))或MVA-BN进行再刺激。通过ELISPOT检测IFNγ分泌细胞。如实施例中所解释计算刺激指数。
图16示出了通过空斑测定测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内或用50μl FI-RSV肌内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV(A2)激发。4天后将肺分离并且通过空斑测定确定RSV负荷(pfu/肺)。
图17示出了通过RT-qPCR测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内或用50μl FI-RSV肌内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV A2激发。4天后将肺分离并且通过RT-qPCR测定RSV负荷(基于所观测到的L基因拷贝的数目来估计)。
图18示出了RSV(A2)激发后4天支气管肺泡灌洗(BAL)流体中的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润。将小鼠用TBS或1×108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A 3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfu RSV鼻内或用50μl FI-RSV肌内免疫两次。然后将小鼠用106pfu RSV A2激发。4天后将肺用1ml PBS洗涤并且测定BAL流体中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的百分比。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码来自人类RSV(hRSV)株A2(GenBank登录号M11486)的全长G蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:2是来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的全长G蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码来自hRSV株A2的全长F蛋白(BN变体)的DNA序列。
SEQ ID NO:4是来自hRSV株A2的全长F蛋白(BN变体)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是编码来自hRSV株A长的全长F蛋白(BN变体)的DNA序列。
SEQ ID NO:6是编码来自hRSV株A长的全长F蛋白(BN变体)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是编码来自hRSV株B(GenBank登录号P20896)的缺乏跨膜域和胞浆域的截短G蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:8是来自hRSV株B(GenBank登录号P20896)的缺乏跨膜域和胞浆域的截短G蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏终止密码子的N蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:10是来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏终止密码子的N蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是编码缺乏起始与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A的片段的DNA序列。
SEQ ID NO:12是缺乏起始与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A的片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏起始密码子的全长M2蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:14是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏起始密码子的全长M2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏跨膜域和胞浆域的截短F蛋白(BN变体)的DNA序列。
SEQ ID NO:16是来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏跨膜域和胞浆域的截短F蛋白(BN变体)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏终止密码子的N蛋白的DNA序列+编码缺乏起始密码子与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A片段的DNA序列+编码来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏起始密码子的全长M2蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:18是来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的N蛋白的氨基酸序列+缺乏起始密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A片段的氨基酸序列+来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的缺乏起始密码子的全长M2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是来源于RSV F蛋白的RSV-1肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是来源于RSV F蛋白的RSV-2肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是来源于RSV F蛋白的RSV-3肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是来源于RSV G蛋白的RSV-4肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是来源于RSV G蛋白的RSV-5肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是来源于RSV G蛋白的RSV-6肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是来源于RSV G蛋白的RSV-7肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是来源于RSV G蛋白的RSV-8肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是来源于RSV M2蛋白的RSV-9肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是编码来自hRSV株A2的全长F蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:29是来自hRSV株A2的全长F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是编码来自hRSV株A2的全长G蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:31是来自hRSV株A2的全长G蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是编码来自hRSV株A2的全长M2蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:33是来自hRSV株A2的全长M2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是编码来自hRSV株A2的全长N蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO:35是来自hRSV株A2的全长N蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是用于RT-qPCR中的引物1。
SEQ ID NO:37是用于RT-qPCR中的引物2。
SEQ ID NO:38是用于RT-qPCR中的探针6。
SEQ ID NO:39是PrS启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是Pr7.5启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是PrSynIIm启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是PrLE1启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是PrH5m启动子的核苷酸序列。
实施例
实施例1∶重组MVA的构建。
重组MVA的产生是如下进行：通过经由在CEF细胞中的使用用于选择重组MVA的选择标记的同源性重组将RSV编码序列与所指示的启动子(图1)一起插入MVA基因组。使用基因间区(IGR)作为插入位点描述于WO03/097845中。为缺失选择标记，使用同源性重组的第二步骤。
MVA-病毒用作用于产生含有IGR88/89中的RSV-A2-G和RSV-F-A2_BN的基因的重组MVA-mBN199B的原料。MVA-mBN199的PreMaster材料用作用于产生以下描述的MVA-mBN201B的原料。
插入到IGR88/89中(MVA-mBN199B)∶
RSV-A2-G的编码序列是基于RSV-A2株糖蛋白G的天然存在序列。融合蛋白RSV-F-A2BN的编码序列也是基于RSV-A2株，但由Bavarian Nordic改良。两种所插入的基因均是由Geneart使用人适应密码子使用合成并且用于克隆重组质粒。RSV-A2-G的蛋白质序列显示与GenBank序列P03423.1的100％同一性。RSV-F-A2BN的蛋白质序列由于在位置103处的一个单一的氨基酸交换(P换成A)仅显示与GenBank序列P03420.1的99％同一性。
插入至IGR148/149中(MVA-mBN201B)∶
RSV-N-A2和RSV-M2-A2的编码序列是基于相应RSV-A2株糖蛋白的天然存在序列。两个基因是通过2A自切割肽序列[M.D.Ryan等(1991),J.Gen.Virol.72(Pt 11):2727-2732]连接，这允许两种单独的天然蛋白质在单一启动子的控制下表达。RSV-G(B)和RSV-FA长BN的编码序列被截短以去除跨膜域，使得所表达的蛋白质可得以分泌。所有插入的基因均是由Geneart使用优化密码子使用合成并且用于克隆重组质粒。RSV-N-A2和RSV-M2-A2的蛋白质序列分别显示出与GenBank序列P03418.1和P04545.1有100％的同一性。截短的RSV-G(B)的蛋白质序列显示与GenBank序列P20896.1有100％的同一性。如R.P.Du等(1994)Biotechnology(N Y)12(8):813-818所描述，截短的RSV-F A长BN的编码序列被设计成含有RSV-F蛋白的起始526个氨基酸。
MVA-mBN210BΔM2的M2(A2)中的缺失突变体∶
MVA-mBN210BΔM2在M2(A2)基因的第12个密码子中包括缺失突变，从而不允许功能性M2表达。此缺失引起苏氨酸和丙氨酸两种氨基酸添加至M2(A2)的起始11个氨基酸中，继之转录停止(UGA终止密码子)。
实施例2∶表达RSV F蛋白、RSV G蛋白、RSV N蛋白以及RSV M2蛋白的重组MVA疫苗 的免疫原性和功效。
疫苗候选者MVA-mBN199B编码RSV的糖蛋白(G)和融合(F)蛋白，而MVA-mBN201BΔM2和MVA-mBN201B表达除全长F和G蛋白之外的截短型F和G、核衣壳蛋白(N)，并且在MVA-mBN201B的情况下还表达RSV的基质蛋白(M2)(参见图1)。这些实验的目标是分析与MVA-mBN199B相比MVA-mBN201BΔM2和MVA-mBN201B在经由皮下(s.c.)或鼻内(i.n.)施用途径进行两次和三次免疫之后的免疫原性和保护性功效。
这些构建体的功效是使用BALB/c小鼠的RSV(A2)激发模型来测试的。用MVA-mBN199B或MVA-mBN201B进行两次免疫当皮下施加时如根据实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)所判断提供部分保护，并且当通过鼻内途径施加时提供几乎完全保护。由MVA-mBN201B提供的保护比由MVA-mBN199B所提供的更佳。在由两种构建体诱导的体液免疫反应中不存在差异，不过在T细胞反应中观测到重大差异。MVA-mBN199B诱导良好RSV F特异性细胞反应，然而与MVA-mBN199B相比用MVA-mBN201B观测到强M2特异性T细胞反应以及更显著的G特异性反应。因为在皮下和鼻内免疫之后所诱导的IgG和T细胞反应类似，所以通过鼻内免疫获得的几乎完全无菌免疫可能与在粘膜感染位点处RSV特异性IgA的诱导和分泌有关。对于MVA-mBN201BΔM2，缺乏M2特异性T细胞反应与MVA-mBN201B相比与减少的保护有关并且产生了与MVA-mBN199B相比类似的保护。
研究设计
将小鼠用1×108TCID50MVA-mBN199B(组3、4以及5)、1×108TCID50MVA-mBN201B(组6、7以及8)或1×108TCID50MVA-mBN201BΔM2(组9)皮下(s.c.)或鼻内(i.n.)处理。根据表1将小鼠处理两次(组3、4、6、7以及9)或三次(组5和8)。根据表7将两个对照组用TBS(组1)处理(皮下)或用RSV(组2)鼻内处理两次。在免疫或激发的前一天以及处死的当天收集血液。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定RSV特异性IgG滴度。在第48天，将一半小鼠处死。将它们的脾去除并且准备用于通过酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)分析RSV特异性T细胞反应。在第49天，将剩余小鼠用106pfu RSV A2激发(鼻内)。从激发当天开始每天监测外观和体重。激发后四天，通过注射高剂量的氯胺酮-赛拉嗪(Ketamine-Xylazine)和末端放血将小鼠处死。在肺灌洗之后，将肺去除并且通过空斑测定和通过RT-qPCR分析RSV负荷。
表1∶实验设计
％相对于第一次免疫。
#将小鼠用106pfu的RSV A2通过鼻内途径激发。激发之后四天，在麻醉下将小鼠放血并且处死。对BAL流体和肺进行取样。
&在第48天，将这些小鼠处死并且通过ELISPOT分析脾。
研究时间表。存活阶段的研究时间表概括于表2中。
表2∶存活阶段的研究时间表
**相对于第1次免疫当天。
材料和方法
实验动物。八十五只七周龄的雌性BALB/cJ Rj(H-2d)小鼠是获自Janvier(Routedes Chênes Secs,F-53940 Le Genest-Saint-Isle,France)。所有小鼠均是无特定病原体的。
窝。在位于Bavarian Nordic-Martinsreid的动物设施的117室进行研究。此装置具备在20-24℃的温度和介于40％与70％之间的相对湿度下的过滤的空气。对该室以14小时光照和10小时黑暗的循环进行人工照明。研究驯化期是15天。将动物放在透明SealSafeTM笼(H Temp[聚砜]II L型笼-欧洲标准)中，其占地面积是530cm2。将笼用H-Temp SealSafeTM盖遮盖。将笼放置于具有为每一个笼分别提供HEPA过滤的空气的SLIMLineTM循环单元的TECNIPLAST-IVC SealSafeTM系统中。动物草垫每周更换一次。
日粮和水。使小鼠可以自由获取经辐照的维持性日粮(SSNIFF R/M-H，经辐照的，V1534-727)和水(在121℃下高压灭菌20分钟)。
预处理程序∶对动物的识别。为单个标记各笼内的动物，根据标准程序进行耳打孔。
纳入/排除检查。根据标准程序进行纳入/排除检查。
对预取血进行血液取样。根据标准程序通过面静脉穿刺获得约150μl的血液样品。根据标准程序将血液样品转移至实验室用于进一步加工。
处理程序∶测试项1至3和参考项的制备和施用。测试项和参考项的制备和施用是在II类微生物安全柜(/II类H型,Kendro)中根据标准程序进行。简言之，对于皮下施用，将重组MVA在TBS中稀释，获得浓度是2×108TCID50/ml的工作溶液。根据标准程序皮下注射于500μl中的1×108TCID50。对于鼻内施用，将重组MVA在TBS中稀释，获得浓度是2×109TCID50/ml的工作溶液。根据标准程序在麻醉(赛拉嗪/氯胺酮)小鼠的一个鼻孔中施用50μl稀释的病毒。根据标准程序皮下施用500μl TBS。
测验项4/激发病毒的制备和施用。将RSV储备小瓶解冻并且因为病毒不稳定性(在冰上最多15分钟)尽快使用。使病毒一直保持在冰上并且立即用于根据标准程序使用100μl纯病毒溶液通过鼻内途径来激发麻醉(赛拉嗪/氯胺酮)的小鼠。
处理后程序∶
体重。根据标准程序从激发当天直到处死每天监测体重。
血液取样。根据标准程序通过球后或面静脉穿刺(细节参见表1和表2)获得血液样品(约150μl)。根据标准程序将血液样品转移至实验室用于进一步加工。
安乐死。在第48天通过颈椎脱位对一半小鼠执行安乐死。在第53天，剩余小鼠通过腹膜内注射接受加倍剂量的氯胺酮-赛拉嗪并且通过切割腹膜腔内的主动脉进行安乐死。
脾去除。无菌去除脾。根据标准程序将它们放入用培养基填充的管中。已将这些管引入到动物设施中并且然后根据标准程序导出。
肺灌洗和肺去除。通过用1ml PBS冲洗肺部4次来收集支气管肺泡灌洗(BAL)流体。然后将肺去除并且在液氮中以两半进行快速冷冻用于后续空斑测定和RNA提取。
分析:血液样品加工和血清储存。转移至实验室之后，根据标准程序将血液样品加工成血清。制备之后，将血清储存在-20℃(±5℃)下直到需要进行分析。
对血清样品的RSV特异性抗体滴度的分析。使用改良的ELISA试剂盒(经典SerionELISA，目录号ESR113G)测定所有血清样品的总RSV特异性IgG ELISA滴度∶替代为试剂盒供应的碱性磷酸酶缀合抗人IgG抗体，使用碱性磷酸酶缀合山羊抗小鼠IgG(Serotec cat:103004)作为第二抗体。
使用改良的ELISA试剂盒(IBL-Hamburg Ref.RE56881)测定所有血清样品和BAL流体的RSV-F/G特异性IgG ELISA滴度。替代为试剂盒供应的POD缀合抗人IgG抗体，使用HRP缀合的绵羊抗小鼠IgG(ref.BN-687-95/96，Serotec cat∶AAC10P)作为第二抗体。
除组4和7外，使用改良的ELISA试剂盒(IBL-Hamburg Ref.RE56881试剂和RSV(F蛋白)IgG微量滴定条Ref.RE56692)测定第48天的血清样品的RSV-F特异性IgG ELISA滴度。替代在试剂盒内供应的POD缀合抗人IgG抗体，使用HRP缀合的绵羊抗小鼠IgG(ref.BN-687-95/96，Serotec cat∶AAC10P)作为第二抗体。
使用改良的ELISA试剂盒(IBL-Hamburg Ref.RE56881)分别测定来自第48天和第53天样品的血清和BAL流体的RSV特异性IgA ELISA滴度∶替代试剂盒内供应的POD缀合抗人IgG抗体，使用HRP缀合的绵羊抗小鼠IgA(ref.BN-687-95/96Serotec cat∶STAR137P)作为第二抗体。
对脾细胞的RSV特异性细胞免疫反应的分析。在最后一次施用之后两周通过用如其它地方所描述(参见例如S.M.Varga等(2000)；S.Johnstone等(2004)；S.Jiang等,(2002)；以及A.B.Kulkarni等,J.Virol.67(7):4086-4092(1993))的特定肽再刺激脾细胞并且通过ELISPOT测定检测IFNγ从脾细胞的释放来测定RSV F特异性、RSV G特异性以及RSV M2特异性细胞反应。
ELISPOT测定法。使用小鼠IFN-γ试剂盒(BD Biosciences，目录号551083)进行ELISPOT测定。根据制造商的说明书进行测定。简言之，在脾细胞分离前一天将板用捕获抗体涂布。分离之后，将细胞转移到ELISPOT板并且在37℃下用不同肽(参见表3)刺激20小时。使用检测抗体检测IFNγ产生。使用BDTM ELISPOT AEC Substrate Set(BD Biosciences，目录号551951)根据制造商的说明书使板显影。
ELISPOT刺激计划。所有条件一式两份进行测试。以5μg/ml(1μg/孔)的最终浓度使用RSV-1、RSV-2、RSV-3、RSV-4以及RSV-5肽(参见表3)来刺激5×105和2.5×105个脾细胞/孔。使用MVA(免疫对照)以10的感染复数(MOI)刺激5×105和2.5×105个脾细胞/孔，并且使用伴刀豆球蛋白A(ConA[阳性对照])以0.5μg/ml的最终浓度刺激2.5×105个脾细胞。作为阴性对照，仅将5×105个脾细胞在培养基(补充有Glutamax、青霉素、链霉素、10％胎牛血清以及105Mβ-巯基乙醇的RPMI-1640)中培养。
表3∶RSV特异性刺激
肽名称 特异性 肽序列
RSV-1 F TYMLTNSELL(SEQ ID NO:19)
RSV-2 F KYKNAVTEL(SEQ ID NO:20)
RSV-3 F ELQLLMQSTPAANNR(SEQ ID NO:21)
RSV-4 G WAICKRIPNKKPG(SEQ ID NO:22)
RSV-5 M2 SYIGSINNI(SEQ ID NO:27)
对BAL流体流体和肺的分析。由于染色问题，BAL的细胞表征是不可能的。肺样品中的RSV负荷是通过RSV空斑测定和通过RT-qPCR测定。
RSV空斑测定。使用法式滤压壶(French Press)将快速冷冻的肺各自的一半在1ml冷培养基中均质化(补充有7％胎牛血清的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium))。简单离心之后，将两管各上清液以两倍连续稀释液滴定到在48孔平底板中生长的Vero细胞单层内。六天后，将单层洗涤并且用1％甲醛固定。24小时之后，将单层用0.04％中性红(Neutral Red)染色并且将空斑计数。
RSV RT-qPCR。立即去除100μl均质化肺组织并且使用来自Qiagen(目录号74104)的微型试剂盒分离RNA。使用来自Applied Biosystems(目录号4387406)的高容量RNA至cDNA试剂盒进行逆转录反应。使用以下参数在热循环器中进行对RSV L基因具特异性的PCR∶(1)50℃，2分钟；(2)95℃，10分钟；(3)45个(在95℃下15秒，在60℃下1分钟)循环，其使用来自Applied Biosystems(目录号4352042)的通用PCR Master Mix和以下三种引物的混合物∶(1)引物1(5’-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3’；SEQ ID NO:36)；(2)引物2(5’-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAAT-3’；SEQ ID NO:37)；以及(3)探针6(5’-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3’；(SEQ ID NO:38)。拷贝数根据含有RSV L基因的片段的pMISC202质粒载体的标准曲线来确定。使用鼠β肌动蛋白的类似反应作为内部对照，以使用来自Applied Biosystems(目录号4351315)的VIC/MGB标记探针来输入cDNA。
研究记录。制备存活阶段流程图以收集存活阶段的各个步骤期间的所有信息。此外，将小鼠特异性或笼特异性信息记录在相应笼牌上。不将笼牌视为研究原始数据，而是Upper Bavaria政府的要求。
制备分析阶段流程图以收集分析阶段的各个步骤期间的所有信息。将测定记录于测定特异性测试记录或实验室笔记本中；将交叉参照记录于分析阶段流程图中。根据标准程序检查包括原始数据的所有测定记录。此外，根据标准程序制备血清样品的样品跟踪表。
数据处理。将原始数据转移至相应Excel文件中，用于根据标准程序进行进一步分析。
ELISA.使用Excel计算OD的平均值和平均数标准误差。
ELISPOT.根据制造商的说明书用CTL读数器读取ELISPOT板。测定各孔的斑点形成细胞(SFC)的数目并且将其转移至Excel文件中用于进一步评估。从5×105和2.5×105个细胞/孔的孵育物计算各孔中每1×106个脾细胞的斑点数目。计算阴性对照的平均值并且从各单个值中扣除，然后计算每只小鼠的平均值，以获得每只小鼠的刺激指数(SI)值(IFN-γ释放脾细胞的肽特异性频率)。
对于肽刺激，从具有5×105和2.5×105个细胞的孔获得SI，除了当斑点太多而不能计数时或对于RSV免疫动物而言。在那些情况下，仅使用浓度2.5×105。对于MVA-BN刺激，从具有5×105的孔获得SI，除了当斑点太多而不能计数时。在那种情况下，使用浓度2.5×105。在测定各个动物的SI之后，计算每一组的SI(每1×106个脾细胞的SFC)的平均值和平均数标准误差(SEM)。
体重变化。将RSV激发之前的各个体重值(以克计)视为基线值。使用这些基线值，使用Microsoft Excel计算在激发后各监测时间点的各个动物的体重变化(％)以及各组的平均体重变化。
RSV空斑测定。计算具有三个最高可计数稀释度的病毒的孔中的空斑数目。然后，将由稀释因子调节的平均空斑数目乘以10以获得以pfu/ml计的溶液滴度，并且最后乘以2以获得滴度/肺。
RSV RT-qPCR.使用来自Applied Biosystems(目录号4351107)的ABI 7500实时测量PCR扩增并且使用由Applied Biosystems提供的系统软件进行分析。将所有值与L基因标准相比较并且针对各样品的鼠β肌动蛋白测定进行标准化。
结果
体液免疫反应的分析∶血清样品的RSV特异性IgG抗体反应的分析。首先使用仅涂有重组RSV F和G蛋白的板用基于IBL-Hamburg试剂盒的ELISA分析血清(图2和图3)。如图2中所示，在单次免疫之后在所有三种构建体(MVA-mBN199B、MVA-mBN201BΔM2以及MVA-mBN201B)情况下观测到类似RSV特异性IgG反应(OD介于0.870与1.347之间)，并且与用于免疫的途径(皮下或鼻内)无关。虽然第二次免疫使得抗体反应增加2.0至几乎3.5倍(OD介于2.627至3.407之间)，但是第三次皮下注射仅对B细胞反应产生较小的影响，从而产生与第二次免疫之后的OD相比增加约0.500OD单位。使用仅涂有重组RSV F蛋白的板以基于IBLHamburg试剂盒的ELISA获得类似结果(图4)。
在连续稀释血清(1/100、1/200以及1/400)之后，RSV F特异性和RSV G特异性ELISA结果显示MVA-mBN199B、MVA-mBN201BΔM2以及MVA-mBN201B诱导类似RSV F特异性和RSV G特异性IgG反应，尽管MVA-mBN201BΔM2和MVA-mBN201B额外表达截短RSV F蛋白和截短RSV G蛋白(图3)。用构建体进行两次皮下免疫之后，与单独用RSV免疫(阳性对照)相比B细胞反应仍较低。为达到由两次鼻内施加RSV所诱导的抗体反应水平，需要使用MVA-mBN构建体进行第三皮下免疫。相比之下，当使用基于IBL Hamburg试剂盒的ELISA分析时，使用MVA-mBN199B和MVA-mBN201B进行的2次鼻内免疫诱导了与单独使用RSV进行两次免疫或使用MVA-mBN199B、MVA-mBN201BΔM2以及MVA-mBN201B进行3次皮下免疫类似的B细胞反应(图3)。
当使用涂有RSV裂解物的板通过基于Serion试剂盒的ELISA再次分析血清时，在MVA-mBN199B、MVA-mBN201BΔM2以及MVA-mBN201B之间又未发现差异。在2次与3次免疫之间或在皮下与鼻内施用途径之间也未观测到差异。此外，所述反应全部低于通过2次鼻内施加RSV所诱导的抗体反应(图5)。
RSV特异性IgA抗体反应的分析。在激发后4天(第53天)在BAL流体中测量到RSV F特异性和RSV G特异性IgA(基于IBL Hamburg试剂盒)。此外，还通过ELISA分析了BAL和血清的RSV F特异性和RSV G特异性IgG。将结果与恰好在激发前(第48天)在血清中获得的结果相比较并且显示于图6中。
正如所料，仅在鼻内施加RSV、MVA-mBN199B以及MVA-mBN201B之后检测到IgA反应。虽然IgG也可以在BAL中检测到，但是在鼻内施加之后检测到更高水平的IgA。血清IgA水平比IgG水平低得多，这与施加途径无关。
RSV特异性细胞免疫反应的分析。在最后一次免疫之后两周通过ELISPOT在脾中分析T细胞反应(图7)。通过鼻内或皮下途径施用的MVA-mBN199B诱导强RSV-F特异性T细胞反应。该免疫反应主要是针对RSV-F特异性肽RSV-2，其在RSV-M2不存在的情况下是免疫优性肽。在第2次皮下免疫之后，所述反应是约2000个斑点/106个脾细胞，并且在第3次皮下注射或第2次鼻内施加之后是约4000。类似于对RSV鼻内施加的反应，在用MVA-mBN199B免疫之后检测到对肽RSV-4的低G特异性反应(约500个斑点/106个脾细胞)，并且正如所料，MVA-mBN199B不诱导M2特异性T细胞。M2肽是小鼠中RSV的免疫优性肽。因此，RSV鼻内免疫诱导超过1000个斑点/106个脾细胞的良好M2特异性T细胞反应并且几乎没有F特异性T细胞反应。
像MVA-mBN199B那样，MVA-mBN201B诱导强T细胞反应，但它由M2占优(超过4000个斑点/106个脾细胞，与所施用的剂量数和施用途径无关)。甚至由MVA-mBN201B诱导的G特异性反应比由MVA-mBN199B或RSV诱导的G特异性反应高至少3倍。与MVA-mBN199B相反，由MVA-mBN201B诱导的F特异性反应低得多，其中对于RSV-2肽来说小于600个斑点/106个脾细胞。
使用RSV A2株的RSV激发。在最后一次免疫之后两周用106pfu的RSV(A2)鼻内激发小鼠。每天监测体重。激发后四天，将小鼠处死。用1ml PBS进行肺灌洗之后，将肺去除并且通过如上文所描述进行的空斑测定和RT-qPCR测定肺中的RSV负荷。
体重变化。在激发后一天所有小鼠均重量减轻，最有可能是因为麻醉或鼻内激发本身(图8)。RSV激发后4天，TBS处理的小鼠开始明显减轻重量。与此相反，第三次鼻内接受RSV的小鼠不显示体重减轻。激发后4天，用MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2皮下免疫的所有小鼠均减轻约20％重量。此类重量减轻早期由Olszewska等(Vaccine 23:215(2004))描述。然而，我们的RT-qPCR结果(图10)显示它与更佳保护和经由疫苗引发的CTL反应使RSV与原发性RSV感染的正常清除相比更早从肺中消除有关。当鼻内施加时，MVA-mBN201B免疫的小鼠具有与激发后2天皮下免疫的小鼠类似的重量减轻，但由于与皮下途径相比肺中的低RSV负荷在激发后4天已恢复(图10)。像RSV免疫组那样，用MVA-mBN199B鼻内免疫的小鼠未显示重量减轻。
通过空斑测定测量的RSV负荷。激发后四天，对非免疫小鼠检测到57671pfu/肺的平均值(图9)。如在RSV免疫对照组中，在2次皮下或鼻内施加之后在用MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN201BΔM2免疫的动物的肺中未检测到RSV A2空斑。
通过定量实时PCR测量的RSV负荷。还通过RT-qPCR分析了肺中的RSV负荷(图10)。虽然在所接种的小鼠中的任一只中通过空斑测定未检测到RSV，但是在用MVA-mBN199B免疫三次的小鼠中仍可检测RSV基因组。在用MVA-mBN199B进行3次免疫之后，RSV负荷与TBS对照组相比低38倍。在用MVA-mBN201B进行三次免疫之后RSV基因组也可检测到，但与TBS对照组相比负荷低158倍。在免疫两次或三次的小鼠之间不存在重大差异。有趣的是，在用在M2不存在的情况下等效于MVA-mBN199B的MVA-mBN201BΔM2接种之后未观测到在MVA-mBN201B情况下观测到的RSV负荷降低。
在用MVA-mBN201B鼻内免疫之后观测到在用RSV处理的组中所获得的类似的几乎完全保护，尽管在五分之一小鼠中仍可检测L基因的少量拷贝。用MVA-mBN199B鼻内免疫还诱导RSV负荷显著降低，但在四分之三小鼠中仍检测到低水平的L基因。
讨论和结论
虽然MVA-mBN201B表达除全长RSV F和G蛋白之外的也包括于MVA-mBN199B构建体中的截短型RSV F和G蛋白，但是MVA-mBN201B诱导类似大小的体液免疫反应。如根据与RSVF和G ELISA相比在仅RSV F ELISA中所测量的类似良好反应所判断，两种构建体均诱导主要针对RSV F蛋白的抗体反应。两次鼻内施加之后的抗体水平比两次皮下施加之后高。需要第三次皮下施加以达到通过两次鼻内施加诱导的抗体反应水平。与此相反，在使用皮下对比鼻内途径或使用2次对比3次皮下施加诱导的T细胞反应中未观测到重大差异。然而，MVA-mBN199B诱导良好RSV F特异性细胞反应，而在MVA-mBN201B情况下观测到强M2特异性T细胞反应。与MVA-mBN199B相比，由MVA-mBN201B诱导的RSV G特异性反应也更显著。由MVA-mBN201B诱导的T细胞反应模式类似于通过RSV免疫诱导的T细胞反应，虽然要高得多。
与施加途径或次数无关，两种构建体均保护小鼠不被RSV(A2)激发，并且不可从肺中回收正在复制的病毒。然而，如先前所观测，用MVA-mBN199B或MVA-mBN201B皮下免疫不引起无菌免疫(即甚至在目标感染剂从体内清除之后仍持续的免疫性)。在通过皮下施加MVA-mBN199B或MVA-mBN201B免疫的小鼠的肺中的基因组RSV负荷(由病毒RNA聚合酶(L)基因的水平度量)显著降低，仍可通过定量RT-PCR检测，并且尽管RSV特异性IgG水平增加第三次皮下免疫对病毒负荷不产生有益影响。与MVA-mBN199B相比，在用MVA-mBN201B接种之后RSV L蛋白质表达的降低稍微更显著，这可能由于M2特异性CD8+T细胞反应增加，因为像MVA-mBN199B那样，在用MVA-mBN201BΔM2接种的动物中RSV基因组负荷高于用MVA-mBN201B接种的动物。
在两次鼻内施加MVA-mBN199B或MVA-mBN201B之后几乎获得无菌免疫。此观察结果与在粘膜感染位点处RSV特异性IgA的诱导和分泌有关。
实施例3∶与FI-RSV相比表达RSV F蛋白、RSV G蛋白、RSV N蛋白以及RSV M2蛋白的 重组MVA疫苗的安全性。
疫苗候选者MVA-mBN199B编码RSV的糖蛋白(G)和融合(F)蛋白，而MVA-mBN201B表达除RSV全长蛋白之外的截短型RSV的F和G、核衣壳蛋白(N)以及基质蛋白(M2)(参见图1)。这些实验的目标是分析与FI-RSV相比MVA-mBN199B和MVA-mBN201B在经由皮下(s.c.)或鼻内(i.n.)施用途径进行两次免疫之后的安全性。
这些构建体的安全性是使用BALB/c小鼠的RSV(A2)激发模型来测试。与FI-RSV相比，用MVA-mBN199B或MVA-mBN201B进行的两次免疫在RSV(A2)激发之后不诱导BAL中IL4和IL5分泌增加。
研究设计
根据表x，将小鼠用1×108TCID50MVA-mBN199B(组3和4)、1×108TCID50MVA-mBN201B(组5和6)皮下(s.c.)或鼻内(i.n.)三周分开处理两次。根据表x，将三个对照组用TBS(组1)处理(皮下)或用RSV(组2)鼻内处理或用30μg FI-RSV(组7)肌内处理两次。在第35天，用106pfu RSV A2激发(鼻内)小鼠。激发后四天，通过注射高剂量的氯胺酮-赛拉嗪和末端放血将小鼠处死。肺灌洗之后，通过ELISA分析BAL中的IL4和IL5水平。
表4∶实验设计
％相对于第一次免疫。
#将小鼠用106pfu的RSV A2通过鼻内途径激发。激发之后四天，在麻醉下将小鼠放血并且处死。对BAL流体取样。
研究时间表。存活阶段的时间表概括于表y中。
表5∶存活阶段的研究时间表
**相对于第1次免疫当天。
材料和方法
实验动物。七周龄的雌性BALB/cJ Rj(H-2d)小鼠是获自Janvier(Route des Chênes Secs,F-53940 Le Genest-Saint-Isle,France)。所有小鼠均是无特定病原体的。
窝。在位于Bavarian Nordic-Martinsreid的动物设施的117室进行研究。此装置具备在20-24℃的温度和介于40％与70％之间的相对湿度下的过滤的空气。对该室以14小时光照和10小时黑暗的循环进行人工照明。研究驯化期是15天。将动物放在透明SealSafeTM笼(H Temp[聚砜]II L型笼-欧洲标准)中，其占地面积是530cm2。将笼用H-Temp SealSafeTM盖遮盖。将笼放置于具有为每一个笼分别提供HEPA过滤的空气的SLIMLineTM循环单元的TECNIPLAST-IVC SealSafeTM系统中。动物草垫每周更换一次。
日粮和水。使小鼠可以自由获取经辐照的维持性日粮(SSNIFF R/M-H，经辐照的，V1534-727)和水(在121℃下高压灭菌20分钟)。
预处理程序∶对动物的识别。为了单个标记各笼内的动物，根据标准程序进行耳打孔。
纳入/排除检查。根据标准程序进行纳入/排除检查。
针对预取血进行血液取样。根据标准程序通过面静脉穿刺获得约150μl的血液样品。根据标准程序将血液样品转移至实验室用于进一步加工。
处理程序∶测试项和参考项的制备和施用.测试项和参考项的制备和施用是在II类微生物安全柜(/II类H型，Kendro)中根据标准程序进行。简言之，对于皮下施用，将重组MVA在TBS中稀释，获得浓度是2×108TCID50/ml的工作溶液。根据标准程序皮下注射含1×108TCID50的500μl。对于鼻内施用，将重组MVA在TBS中稀释，获得浓度是2×109TCID50/ml的工作溶液。根据标准程序在麻醉(赛拉嗪/氯胺酮)小鼠的一个鼻孔中施用50μl稀释的病毒。根据标准程序皮下施用500μl TBS。
RSV(A2)病毒的制备和施用。将RSV储备小瓶解冻并且由于病毒的不稳定性(在冰上最多15分钟)尽快使用。使病毒一直保持在冰上并且立即用于根据标准程序使用100μl纯病毒溶液通过鼻内途径激发麻醉(赛拉嗪/氯胺酮)小鼠。
FI-RSV的制备和施用。肌内注射含30μg FI-RSV的40μl。
安乐死。在第35天，剩余小鼠通过腹膜内注射接受加倍剂量的氯胺酮-赛拉嗪并且通过切割腹膜腔内的主动脉进行安乐死。
肺灌洗。通过用1ml PBS冲洗肺部4次来收集支气管肺泡灌洗(BAL)流体。
分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(来自eBIOSCIENCE Cat N°BMS613的mIL4PLATINUM ELISA和来自eBIOSCIENCE Cat N°88-7054-22的READY-SET-GO MIL-5ELISA)测量支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中的IL-4和IL-5水平。
研究记录。制备存活阶段流程图以收集存活阶段的各个步骤期间的所有信息。此外，将小鼠特异性或笼特异性信息记录在相应笼牌上。不将笼牌视为研究原始数据，而是Upper Bavaria政府的要求。
制备分析阶段流程图以收集分析阶段的各个步骤期间的所有信息。将测定记录于测定特异性测试记录或实验室笔记本中；将交叉参照记录于分析阶段流程图中。根据标准程序检查包括原始数据的所有测定记录。此外，根据标准程序制备血清样品的样品跟踪表。
数据处理。将原始数据转移至相应Excel文件中，用于根据标准程序进行进一步分析。
ELISA.从相应ELISA试剂盒的标准曲线确定细胞因子浓度。
结果
对于MVA-mBN199B或MVA-mBN201B未观测到像在FI-RSV情况下观测到的IL-4(图11)和IL-5(图12)产生增加。当用MVA-mBN199B或MVA-mBN201B鼻内免疫小鼠时两种细胞因子均低于检测水平。
讨论和结论
如通过TH2反应所评估，与FI-RSV相比MVA-mBN199B与MVA-mBN201B两者均不诱导增强性疾病。
实施例4∶表达RSV F蛋白、RSV G蛋白、RSV N蛋白以及RSV M2蛋白的不同重组MVA 疫苗的免疫原性功效和安全性的比较。
疫苗候选者MVA-mBN199B编码RSV的糖蛋白(G)和融合(F)蛋白，MVA-mBN201B表达除全长蛋白之外的RSV的截短型F和G、核衣壳蛋白(N)以及基质蛋白(M2)，并且MVA-mBN294B表达RSV的一种F和和两种G全长蛋白、核衣壳蛋白(N)以及基质蛋白(M2)(参见图1)。MVA-mBN294A是在克隆MVA-mBN294B中的中间产物中，所述中间产物中仍具有一个克隆盒(cloning cassette)。此克隆盒不影响转基因蛋白的转基因表达或免疫原性。此实验的目标是分析与MVA-mBN199B和MVA-mBN201B相比MVA-mBN294A在经由皮下(s.c.)施用途径进行两次免疫之后的免疫原性、功效以及安全性。
这些构建体的免疫原性功效和安全性是使用BALB/c小鼠的RSV(A2)激发模型来测试。我们证实尽管与MVA-mBN201B相比MVA-mBN294A(等效于MVA-mBN294B)有变化，但它诱导类似的B细胞和T细胞反应并且提供类似的保护。此实验显示，与仅表达RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的构建体(MVA-mBN199B)相比，表达RSV膜糖蛋白(F或G)的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白(N或M2)的至少一种抗原决定簇的任何构建体(MVA-mBN201B或MVA-mBN294A)诱导更佳保护
研究设计
根据表6按初免-加强时间表(第0天和第21天)将小鼠用1×108TCID50MVA-mBN294A、MVA-mBN199B或MVA-mBN201B接种(皮下)。根据表6将对照组用TBS或用RSV-A2皮下处理两次。根据表6肌内(i.m.)注射福尔马林灭活(FI)-RSV一次或两次。
在各免疫之前和激发之前一天以及在处死的当天收集血液。对于第34天的组1至5的5只动物，分别通过ELISA和PRNT测定RSV特异性IgG滴度和RSV特异性中和抗体滴度。
在第34天，通过注射致死剂量的氯胺酮-赛拉嗪和最后放血将一些小鼠(表6)处死。将脾去除并且准备用于通过ELISPOT分析RSV特异性T细胞反应。
在第35天，将剩余小鼠(表6)用106pfu RSV-A2激发。激发后四天，通过注射致死剂量的氯胺酮-赛拉嗪和最后放血将小鼠处死。在肺灌洗之后，将肺去除并且通过空斑测定和RT-qPCR分析RSV负荷。分析支气管肺泡灌洗(BAL)流体中的细胞浸润和细胞因子水平。
表6∶实验设计
1：相对于第一次免疫
2：将用106pfu的RSV-A2通过鼻内途径激发小鼠。激发之后四天，小鼠将被放血，在麻醉下处死并且对BAL和肺取样
&：在第34天，这些小鼠将被处死并且脾将通过ELISPOT进行分析
研究时间表。存活阶段的时间表概括于表7中。
表7∶存活阶段的第1部分的研究时间表
1：相对于第1次免疫当天
材料和方法
实验动物。七周龄的雌性BALB/cJ Rj(H-2d)小鼠是获自Janvier(Route des Chênes Secs,F-53940 Le Genest-Saint-Isle,France)。所有小鼠均是无特定病原体的。
窝。在位于Bavarian Nordic-Martinsreid的动物设施的117室进行研究。此装置具备在20-24℃的温度和介于40％与70％之间的相对湿度下的过滤的空气。对该室以14小时光照和10小时黑暗的循环进行人工照明。研究驯化期是15天。将动物放在透明SealSafeTM笼(H Temp[聚砜]II L型笼-欧洲标准)中，其占地面积是530cm2。将笼用H-Temp SealSafeTM盖遮盖。将笼放置于具有为每一个笼分别提供HEPA过滤的空气的SLIMLineTM循环单元的TECNIPLAST-IVC SealSafeTM系统中。动物草垫每周更换一次。
日粮和水。使小鼠可以自由获取经辐照的维持性日粮(SSNIFF R/M-H，经辐照的，V1534-727)和水(在121℃下高压灭菌20分钟)。
预处理程序∶
动物的识别。为单个标记各笼内的动物，根据标准程序进行耳打孔。
纳入/排除检查。根据标准程序进行纳入/排除检查。
针对预取血进行血液取样。根据标准程序通过面静脉穿刺获得约150μl的血液样品。根据标准程序将血液样品转移至实验室用于进一步加工。
处理程序∶测试项和参考项的制备和施用.测试项和参考项的制备和施用是在II类微生物安全柜(/II类H型，Kendro)中根据标准程序进行的。简言之，对于皮下施用，将重组MVA在TBS中稀释，获得浓度是2×108TCID50/ml的工作溶液。根据标准程序皮下注射含1×108TCID50的500μl。根据标准程序皮下施用500μl TBS。
RSV(A2)病毒的制备和施用。将RSV储备小瓶解冻并且因为病毒的不稳定性(在冰上最多15分钟)尽快使用。使病毒一直保持在冰上并且立即用于根据标准程序使用100μl纯病毒溶液通过鼻内途径激发麻醉(赛拉嗪/氯胺酮)小鼠。
FI-RSV的制备和施用∶肌内施加50μl FI-RSV。
处理后程序∶
血液取样。根据标准程序通过球后或面静脉穿刺(细节参见表7)获得血液样品(约150μl)。根据标准程序将血液样品转移至实验室用于进一步加工。
安乐死。小鼠通过腹膜内注射接受加倍剂量的氯胺酮-赛拉嗪并且通过切割腹膜腔内的主动脉进行安乐死。
脾去除。无菌去除脾。根据标准程序将它们放入用培养基填充的管中。已将这些管引入到动物设施中并且然后根据标准程序导出。
肺灌洗和肺去除。通过用1ml PBS冲洗肺部4次来收集支气管肺泡灌洗液(BAL)流体。然后将肺去除并且以液氮中以两半进行快速冷冻用于后续空斑测定和RNA提取。
分析∶
血液样品加工和血清的储存。转移至实验室之后，根据标准程序将血液样品加工成血清。制备之后，将血清储存在-20℃(±5℃)下直到需要进行分析。
对血清样品的RSV特异性抗体滴度的分析。使用改良的ELISA试剂盒(经典SerionELISA，目录号ESR113G)测定所有血清样品的总RSV特异性IgG ELISA滴度∶替代为试剂盒供应的碱性磷酸酶缀合抗人IgG抗体，使用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Serotec cat:103004)作为第二抗体。
对血清样品的RSV特异性中和抗体滴度的分析。简言之，制备测试血清的2倍连续稀释液并且将规定数目的RSV空斑形成单位(pfu)添加至血清稀释液中。在36℃(±2℃)和5％CO2(±1％)下孵育185min之后，将其添加至含有Vero细胞的预接种盘中。两天后将板固定，用RSV特异性抗体的混合物进行免疫染色并且将空斑计数。
对脾细胞的RSV特异性细胞免疫反应的分析。在最后一次施用之后两周通过用如其它地方所描述的特异性肽再刺激脾细胞并且通过ELISPOT测定检测IFNγ从脾细胞的释放来测定RSV F特异性和RSV M2特异性细胞反应。
ELISPOT测定法。使用小鼠IFN-γ试剂盒(BD Biosciences，目录号551083)进行ELISPOT测定。根据制造商的说明书进行分析。简言之，在脾细胞分离前一天将板用捕获抗体涂布。分离之后，将细胞转移到ELISPOT板并且在37℃下用不同肽(参见表3)刺激20小时。使用检测抗体检测IFNγ产生。使用BDTM ELISPOT AEC Substrate Set(BD Biosciences，目录号551951)根据制造商的说明书使板显影。
ELISPOT刺激计划。一式两份对所有条件进行测试。使用RSV-2和RSV-5肽(参见表8)以5μg/ml(1μg/孔)的最终浓度刺激5×105和2.5×105个脾细胞/孔。使用MVA(免疫对照)以10的感染复数(MOI)刺激5×105和2.5×105个脾细胞/孔，并且使用伴刀豆球蛋白A(ConA[阳性对照])以0.5μg/ml的最终浓度刺激2.5×105个脾细胞。作为阴性对照，仅将5×105个脾细胞在培养基(补充有Glutamax、青霉素、链霉素、10％胎牛血清以及105Mβ-巯基乙醇的RPMI-1640)中培养。
表8∶RSV特异性刺激
肽名称 特异性 肽序列
RSV-2 F KYKNAVTEL(SEQ ID NO:20)
RSV-5 M2 SYIGSINNI(SEQ ID NO:27)
对BAL流体的分析∶
通过将100μl BAL流体细胞离心涂片器离心(800rpm，5分钟)制备两个载玻片。将载玻片干燥过夜并且然后染色。将载玻片通过显微术分析以测定嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的百分比。然后将其余部分的BAL离心(12,000rpm，5分钟)。制备之后，将BAL上清液储存在-20℃(±5℃)下直到进行分析。使用可商购获得的ELISA试剂盒(来自eBIOSCIENCECat N°BMS613的mIL4PLATINUM ELISA和来自eBIOSCIENCE Cat N°88-7054-22的READY-SET-GO MIL-5ELISA)测量支气管肺泡灌洗(BAL)上清液中的IL-4和IL-5水平。
对肺中的RSV负荷的分析
肺样品中的RSV负荷是通过RSV空斑测定和通过RT-qPCR测定的。
RSV空斑测定。使用法式滤压壶将快速冷冻的肺各自的一半在1ml冷培养基中均质化(补充有7％胎牛血清的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基)。简单离心之后，将两管两倍连续稀释的各上清液滴定到在48孔平底板中生长的Vero细胞单层上。六天后，将单层洗涤并且用1％甲醛固定。24小时之后，将单层用0.04％中性红染色并且对空斑计数。
RSV RT-qPCR.立即去除100μl均质化肺组织并且使用来自Qiagen(目录号74104)的微型试剂盒分离RNA。使用来自Applied Biosystems(目录号4387406)的高容量RNA至cDNA试剂盒进行逆转录反应。使用以下参数在热循环器中进行对RSV L基因具特异性的PCR∶(1)50℃，2分钟；(2)95℃，10分钟；(3)45个(在95℃下15秒，在60℃下1分钟)循环，其使用来自Applied Biosystems(目录号4352042)的通用PCR Master Mix和以下三种引物的混合物∶(1)引物1(5’-GAA CTC AGT GTA GGT AGA ATG TTT GCA-3’；SEQ ID NO:36)；(2)引物2(5’-TTC AGC TAT CAT TTT CTC TGC CAA T-3’；SEQ ID NO:37)；以及(3)探针6(5’-TTT GAA CCT GTC TGA ACA TTC CCG GTT-3’；(SEQ ID NO:38)。拷贝数是根据含有RSV L基因的片段的pMISC202质粒载体的标准曲线来确定。使用鼠β肌动蛋白的类似反应作为内部对照，以使用来自Applied Biosystems(目录号4351315)的VIC/MGB标记探针来输入cDNA。
研究记录。
制备存活阶段流程图以收集存活阶段的各个步骤期间的所有信息。此外，将小鼠特异性或笼特异性信息记录在相应笼牌上。不将笼牌视为研究原始数据，而是UpperBavaria政府的要求。
制备分析阶段流程图以收集分析阶段的各个步骤期间的所有信息。将测定记录于测定特异性测试记录或实验室笔记本中；将交叉参照记录于分析阶段流程图中。根据标准程序审查包括原始数据的所有测定记录。此外，根据标准程序制备血清样品的样品跟踪表。
数据处理。将原始数据转移至相应Excel文件中，用于根据标准程序进行进一步分析。
ELISA.使用Excel计算OD的平均值和平均数标准误差。
PRNT.将空斑转移至宏以根据标准程序计算PRNT滴度。
ELISPOT.根据制造商的说明书用CTL读数器读取ELISPOT板。测定各孔的斑点形成细胞(SFC)的数目并且将其转移至Excel文件中用于进一步评估。根据5×105和2.5×105个细胞/孔的孵育，计算各孔中每1×106个脾细胞的斑点数目。计算阴性对照的平均值并且将其从各单个值中扣除，然后计算每一小鼠的平均值，以获得每一小鼠的刺激指数(SI)值(IFN-γ释放脾细胞的肽特异性频率)。
对于肽刺激，从具有5×105和2.5×105个细胞的孔获得SI，除了当斑点太多而不能计数时或对于RSV免疫动物而言。在那些情况下，仅使用浓度2.5×105。对于MVA-BN刺激，从具有5×105的孔获得SI，除了当斑点太多而不能计数时。在所述情况下，使用浓度2.5×105。在测定各个动物的SI之后，计算每一组的SI(每1×106个脾细胞的SFC)的平均值和平均数标准误差(SEM)。
RSV空斑测定。在具有病毒的三个最高可计数稀释度的孔中对空斑数进行计数。然后，将由稀释因子调节的平均空斑数目乘以10以获得以pfu/ml计的溶液滴度，并且最后乘以2以获得滴度/肺。
RSV RT-qPCR。使用来自Applied Biosystems(目录号4351107)的ABI7500实时测量PCR扩增并且使用由Applied Biosystems提供的系统软件进行分析。将所有值与L基因标准相比较并且针对各样品的鼠β肌动蛋白测定进行标准化。
细胞因子ELISA。根据相应ELISA试剂盒的标准曲线确定细胞因子浓度。
结果
对体液免疫反应的分析∶
对于RSV特异性IgG(ELISA，图13)与RSV特异性中和抗体反应(PRNT，图14)两者，我 们在三种构建体(MVA-mBN199B、MVA-mBN201B以及MVA-mBN294A)之间未观测到任何差异
对细胞免疫反应的分析∶
正如所料，MVA-mBN294A具有与MVA-mBN201B类似的T细胞反应模式(图15)，其诱导 由M2 T细胞反应支配的F与M2特异性反应。与此相反，MVA-mBN199B仅诱导F特异性反应，但 水平比MVA-mBN201B和MVA-mBN294A高。
对肺中的RSV负荷的分析∶
使用RSV A2株的RSV激发。在最后一次免疫之后两周用106pfu的RSV(A2)鼻内激发小鼠。激发后四天，将小鼠处死。用1ml PBS进行肺灌洗之后，将肺去除并且通过如上文所描述进行的空斑测定和RT-qPCR测定肺中的RSV负荷。
通过空斑测定测量的RSV负荷。激发后四天，检测用于非免疫小鼠的29842pfu/肺的平均值(图16)。如在RSV-免疫的对照组中，在2次皮下施加之后用MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A免疫的动物的肺中未检测到RSV A2空斑。
通过定量实时PCR测量的RSV负荷。还通过RT-qPCR分析了肺中的RSV负荷(图17)。虽然通过空斑测定在所接种小鼠中的任一只中均未检测到RSV，但在用MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A皮下免疫两次的小鼠中仍可检测到RSV基因组。对于MVA-mBN199B，RSV负荷与TBS对照组相比低45倍。RSV基因组对于MVA-mBN201B和MVA-mBN294A也可检测到，但与MVA-mBN199B相比负荷大大降低，与TBS对照组相比分别降低416和281倍。
对增强性疾病迹象的分析
与在实施例3中所描述的实验中使用的FI-RSV批次相反，用于此研究中的新批次不显示出IL-4或IL-5产生的任何增加。然而，我们能够使用此批次检测BAL流体中的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润，这是FI-RSV的增强性疾病的主要标志。对于MVA-mBN199B、MVA-mBN201B以及MVA-mBN294A来说，未检测到增强性疾病的迹象。
讨论和结论
尽管MVA-mBN294A(等效于MVA-mBN294B)与MVA-mBN201B之间有差异，但两者均诱导类似B细胞和T细胞反应并且在不诱导增强性疾病的情况下提供类似的保护。与仅表达膜糖蛋白(F和G)的抗原决定簇的MVA-mBN199B相比，两种构建体均诱导更佳保护。
通过考虑本说明书和实践本文所公开的发明，本发明的其它实施方案对本领域技术人员来说将显而易见。意在仅将本说明书和实施例视为示例性的，并且本发明的真正范围和精神由以下权利要求书表明。
序列表
<110> 巴法里安诺迪克有限公司（Bavarian Nordic A/S）
<120> 重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗
<130> BNI14747PCT
<141> 2013-03-15
<150> US 61/678,367
<151> 2012-08-01
<150> EP 12005594.2
<151> 2012-08-01
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 897
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒(hRSV, A2株Human Respiratory Syncytial Virus hRSV,strain A2)
<400> 1
atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60
aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120
atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180
tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240
tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300
cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360
ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420
acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480
aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540
acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600
aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660
aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720
accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780
cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840
accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897
<210> 2
<211> 298
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 2
Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr
100 105 110
Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu
210 215 220
Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro
245 250 255
Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly
260 265 270
Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln
290 295
<210> 3
<211> 1725
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 3
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacaa tcctgaccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
agcaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca cctccgtgat caccatcgag 180
ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgaactcc agctcctcat gcagtccacc 300
cctgccacca acaaccgggc cagaagagaa ctgccccggt ttatgaacta cacactgaac 360
aacgccaaaa agaccaatgt cactctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttt 420
ctgctgggcg tgggcagcgc cattgccagc ggcgtggccg tgtccaaggt gctgcacctg 480
gaaggcgaag tgaacaagat caagagtgcc ctgctctcca caaacaaggc cgtggtgtcc 540
ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtcctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctcc tgcccatcgt gaacaagcag agctgcagca tcagcaacat cgagactgtc 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgggagtt cagcgtgaac 720
gcaggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaatgaca tgcccatcac caacgatcag aagaaactca tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgcggcagc agagttacag tatcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacacaaa agagggcagt aacatctgcc tgacccggac cgacagaggc 1020
tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgtca ttctttccac aggccgagac atgcaaggtg 1080
cagagcaacc gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgccctc cgaagtcaac 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac ttccaagacc 1200
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aagtgcaccg ccagcaacaa gaatagagga atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgtcca ataagggcat ggacaccgtg tccgtgggca acacactgta ctacgtgaat 1380
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ctggtgttcc ccagcgacga gttcgacgcc agtatcagcc aggtcaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagagcgac gaactgctgc acaatgtgaa cgctggcaag 1560
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ctgatcgccg tgggcctgct gctgtactgc aaggcccgca gcacccctgt gaccctgtcc 1680
aaggatcagc tgtccggcat caacaatatc gccttctcca actga 1725
<210> 4
<211> 574
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 4
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
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Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
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Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
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Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
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Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
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Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
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Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
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Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
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Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
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Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
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Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
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Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
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Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
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Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
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Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 5
<211> 1725
<212> DNA
<213> hRSV 株A-长(hRSV strain A-Long)
<400> 5
atggaactgc ccatcctgaa ggccaacgcc atcaccacaa tcctggccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcagccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
agcaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca cctccgtgat caccatcgag 180
ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgaactcc agctcctcat gcagtccacc 300
cctgccgcca acaaccgggc cagaagagaa ctgccccggt ttatgaacta cacactgaac 360
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ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtgctgg atctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctcc tgcccatcgt gaacaagcag agctgccgga tcagcaacat cgagacagtg 660
atcgagttcc agcagaagaa caaccggctg ctggaaatca cccgggagtt cagcgtgaac 720
gtgggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780
atcaatgaca tgcccatcac caacgaccag aagaaactga tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgcggcagc agagctacag catcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacacaaa agagggcagt aacatctgcc tgacccggac cgacagaggc 1020
tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgtca ttctttccac aggccgagac atgcaaggtg 1080
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ctgtgcaacg tggacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac ttccaagacc 1200
gacgtgtcca gcagcgtgat tacctccctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260
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aaggatcagc tgtccggcat caacaatatc gccttctcca actga 1725
<210> 6
<211> 574
<212> PRT
<213> hRSV 株A-长(hRSV strain A-Long)
<400> 6
Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
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100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
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Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Val Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
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Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
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Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
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Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
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Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
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450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
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Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
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Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
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530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
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<210> 7
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<212> DNA
<213> hRSV B株(hRSV strain B)
<400> 7
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cacactactg ctcagacaaa gggccgaatc accacctcta ctcagaccaa taagccatca 300
acaaaatccc gctccaaaaa cccacctaaa aaacctaaag atgactatca tttcgaagtc 360
tttaatttcg tcccatgttc catttgcgga aacaaccagc tctgtaaatc tatctgtaaa 420
accatcccct ctaacaagcc aaaaaagaaa cctactatta aaccaactaa taagcccacc 480
actaagacta ctaacaaacg cgatccaaaa acacccgcca aaatgcctaa aaaagagatc 540
attacaaacc cagccaagaa accaactctc aaaactaccg aacgggacac ctccatttct 600
cagtctaccg tgctcgatac catcactccc aaatacacta tccagcagca gtcactccac 660
tcaacaacct ccgagaacac cccctcctca acccagattc ctactgcttc cgaaccatcc 720
accctcaacc ccaattga 738
<210> 8
<211> 245
<212> PRT
<213> hRSV B株(hRSV strain B)
<400> 8
Met Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile
1 5 10 15
Ser Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile
20 25 30
Lys Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Ser Thr Tyr Leu Thr Gln Val Pro
35 40 45
Pro Glu Arg Val Asn Ser Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Ser Pro Ile
50 55 60
His Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His
65 70 75 80
His Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr
85 90 95
Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro
100 105 110
Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile
115 120 125
Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser
130 135 140
Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr
145 150 155 160
Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro
165 170 175
Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn Pro Ala Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr
180 185 190
Thr Glu Arg Asp Thr Ser Ile Ser Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Ile
195 200 205
Thr Pro Lys Tyr Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His Ser Thr Thr Ser
210 215 220
Glu Asn Thr Pro Ser Ser Thr Gln Ile Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser
225 230 235 240
Thr Leu Asn Pro Asn
245
<210> 9
<211> 1176
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 9
atggccctga gcaaagtgaa gctgaacgac accctgaaca aggaccagct gctgtccagc 60
tccaagtaca ccatccagag aagcaccggc gacagcatcg acacccccaa ctacgacgtg 120
cagaagcaca tcaataagct gtgcggcatg ctgctgatca ccgaggacgc caaccacaag 180
ttcaccggcc tgatcgggat gctgtacgcc atgagccggc tgggccggga ggacaccatc 240
aagatcctgc gggacgccgg ctaccacgtg aaggccaacg gcgtggacgt gaccacccac 300
cggcaggaca tcaacggcaa agaaatgaag ttcgaggtgc tgaccctggc cagcctgacc 360
accgagatcc agatcaacat cgagatcgag agccggaagt cctacaagaa aatgctgaaa 420
gaaatgggcg aggtggcccc cgagtacaga cacgacagcc ccgactgcgg catgatcatc 480
ctgtgtatcg ccgccctggt catcacaaag ctggccgctg gcgacagatc tggcctgacc 540
gccgtgatca gacgggccaa caacgtgctg aagaacgaga tgaagcggta caagggcctg 600
ctgcccaagg atatcgccaa cagcttctac gaggtgttcg aaaagcaccc ccacttcatc 660
gacgtgttcg tgcacttcgg cattgcccag agcagcacca gaggcggcag cagagtggag 720
ggcatcttcg ccggcctgtt catgaacgcc tacggcgctg gccaggtcat gctgagatgg 780
ggcgtgctgg ccaagagcgt gaagaacatc atgctgggcc acgccagcgt gcaggccgag 840
atggaacagg tggtggaggt gtacgagtac gcccagaagc tgggcggcga ggccggcttc 900
taccacatcc tgaacaaccc caaggcctcc ctgctgtccc tgacccagtt cccccacttt 960
agcagcgtgg tgctcggaaa tgcagccgga ctgggcatca tgggcgagta ccgcggcacc 1020
cccagaaacc aggacctgta cgacgccgcc aaggcctacg ccgagcagct gaaagaaaac 1080
ggcgtgatca actacagcgt gctggacctg acagccgagg aactggaagc cattaagcac 1140
cagctgaacc ctaaggacaa cgacgtggag ctgtga 1176
<210> 10
<211> 391
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 10
Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser
195 200 205
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu
385 390
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)
<400> 11
ctgaacttcg atctgctgaa actggccggc gacgtggaaa gcaaccctgg cccc 54
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)
<400> 12
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 13
<211> 585
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 13
atgagcagac ggaacccctg caagttcgag atccggggcc actgcctgaa cggcaagcgg 60
tgccacttca gccacaacta cttcgagtgg ccccctcatg ctctgctggt ccggcagaac 120
tttatgctga accggatcct gaagtccatg gacaagagca tcgataccct gagcgagatc 180
agcggagccg ccgaactgga tagaaccgag gaatacgccc tgggcgtggt cggagtgctg 240
gaaagctaca tcggcagcat caacaacatc accaagcaga gcgcctgcgt ggccatgagc 300
aagctgctga ccgagctgaa cagcgacgat atcaagaagc tgcgcgacaa cgaagaactg 360
aactccccca agatccgggt gtacaacaca gtgatcagct acattgagag caaccggaag 420
aacaacaagc agaccatcca tctgctgaag cggctgcccg ccgacgtgct gaaaaagacc 480
atcaagaaca ccctggacat ccacaagtcc atcaccatca ataaccccaa agaaagcacc 540
gtgtccgaca ccaacgacca cgccaagaac aacgacacca cctga 585
<210> 14
<211> 194
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 14
Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro
20 25 30
His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys
35 40 45
Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys
85 90 95
Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr
115 120 125
Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln
130 135 140
Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro
165 170 175
Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp
180 185 190
Thr Thr
<210> 15
<211> 1575
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 15
atggaactcc ctattctcaa agccaatgct attactacca ttctcgccgc tgtcaccttt 60
tgtttcgcct cttcccagaa tattaccgaa gagttttacc agtctacctg ttccgccgtc 120
agtaaaggat acctgtccgc cctccgcact ggttggtata ctagtgtcat tacaatcgaa 180
ctctcaaata taaaagaaaa taagtgtaat gggaccgatg ctaaagtcaa actcattaaa 240
caagaactcg ataagtataa gaatgctgtc actgagctgc aactgctgat gcagtctaca 300
cccgcagcca ataatcgagc cagacgcgag ctgcctcgct ttatgaatta tactctcaat 360
aatactaaaa agacaaacgt caccctcagt aaaaagcgaa aaagacggtt tctcggattc 420
ctcctcggcg tgggctctgc tatcgctagc ggaattgctg tctccaaagt cctccatctg 480
gaaggggagg tcaacaaaat taagtctgct ctcctctcta caaacaaagc cgtcgtgtct 540
ctctccaatg gcgtgtctgt gctcacctct aaagtgctcg acctcaaaaa ttacattgat 600
aaacagctgc tccctattgt gaacaaacag tcttgccgca ttagcaatat cgaaaccgtc 660
attgaatttc aacaaaagaa taataggctc ctcgaaatta cccgcgaatt ctccgtgaat 720
gtgggagtca caacacctgt ctctacctat atgctcacta actccgaact cctctccctc 780
attaacgata tgcccattac aaatgatcag aaaaaactca tgtctaataa cgtccagatt 840
gtccgccagc agtcttatag cattatgtcc attatcaaag aggaagtcct cgcttacgtc 900
gtccagctcc ctctgtatgg ggtcatcgat acaccttgtt ggaaactcca tacctcccca 960
ctgtgtacaa ccaataccaa agaagggtcc aatatttgcc tgacaagaac cgaccgcggg 1020
tggtactgtg ataatgccgg ctctgtctcc tttttccccc aggccgaaac ctgtaaagtc 1080
cagtctaatc gagtcttttg cgatactatg aattccctca ccctcccttc agaagtgaat 1140
ctctgtaacg tcgatatttt caaccctaaa tatgattgca aaattatgac cagtaaaact 1200
gacgtgtcct cttccgtcat cacctccctc ggtgctattg tgtcttgtta cggaaaaact 1260
aaatgcacgg ctagtaataa gaaccgaggc attattaaga ccttttccaa cggctgtgat 1320
tatgtgtcta acaaaggcgt ggatactgtc agtgtcggaa atacactcta ctatgtcaac 1380
aaacaggaag ggaaaagtct ctacgtcaaa ggggagccga taatcaattt ttacgatccc 1440
ctcgtctttc cctccgatga atttgatgcc agtatttccc aggtgaacga aaaaatcaat 1500
cagtctctcg cttttattag aaaatctgat gaactcctgc ataacgtcaa tgcaggcaaa 1560
agcactacta attga 1575
<210> 16
<211> 524
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 16
Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Val Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn
515 520
<210> 17
<211> 1809
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 编码融合蛋白的cDNA，所述融合蛋白包含来自hRSV A2株的全长N蛋白， 其与FMDV的蛋白酶2A片段融合， 所述蛋白酶2A片段与hRSV A2株的全长M2蛋白融合
<400> 17
atggccctga gcaaagtgaa gctgaacgac accctgaaca aggaccagct gctgtccagc 60
tccaagtaca ccatccagag aagcaccggc gacagcatcg acacccccaa ctacgacgtg 120
cagaagcaca tcaataagct gtgcggcatg ctgctgatca ccgaggacgc caaccacaag 180
ttcaccggcc tgatcgggat gctgtacgcc atgagccggc tgggccggga ggacaccatc 240
aagatcctgc gggacgccgg ctaccacgtg aaggccaacg gcgtggacgt gaccacccac 300
cggcaggaca tcaacggcaa agaaatgaag ttcgaggtgc tgaccctggc cagcctgacc 360
accgagatcc agatcaacat cgagatcgag agccggaagt cctacaagaa aatgctgaaa 420
gaaatgggcg aggtggcccc cgagtacaga cacgacagcc ccgactgcgg catgatcatc 480
ctgtgtatcg ccgccctggt catcacaaag ctggccgctg gcgacagatc tggcctgacc 540
gccgtgatca gacgggccaa caacgtgctg aagaacgaga tgaagcggta caagggcctg 600
ctgcccaagg atatcgccaa cagcttctac gaggtgttcg aaaagcaccc ccacttcatc 660
gacgtgttcg tgcacttcgg cattgcccag agcagcacca gaggcggcag cagagtggag 720
ggcatcttcg ccggcctgtt catgaacgcc tacggcgctg gccaggtcat gctgagatgg 780
ggcgtgctgg ccaagagcgt gaagaacatc atgctgggcc acgccagcgt gcaggccgag 840
atggaacagg tggtggaggt gtacgagtac gcccagaagc tgggcggcga ggccggcttc 900
taccacatcc tgaacaaccc caaggcctcc ctgctgtccc tgacccagtt cccccacttt 960
agcagcgtgg tgctcggaaa tgcagccgga ctgggcatca tgggcgagta ccgcggcacc 1020
cccagaaacc aggacctgta cgacgccgcc aaggcctacg ccgagcagct gaaagaaaac 1080
ggcgtgatca actacagcgt gctggacctg acagccgagg aactggaagc cattaagcac 1140
cagctgaacc ctaaggacaa cgacgtggag ctgctgaact tcgatctgct gaaactggcc 1200
ggcgacgtgg aaagcaaccc tggccccagc agacggaacc cctgcaagtt cgagatccgg 1260
ggccactgcc tgaacggcaa gcggtgccac ttcagccaca actacttcga gtggccccct 1320
catgctctgc tggtccggca gaactttatg ctgaaccgga tcctgaagtc catggacaag 1380
agcatcgata ccctgagcga gatcagcgga gccgccgaac tggatagaac cgaggaatac 1440
gccctgggcg tggtcggagt gctggaaagc tacatcggca gcatcaacaa catcaccaag 1500
cagagcgcct gcgtggccat gagcaagctg ctgaccgagc tgaacagcga cgatatcaag 1560
aagctgcgcg acaacgaaga actgaactcc cccaagatcc gggtgtacaa cacagtgatc 1620
agctacattg agagcaaccg gaagaacaac aagcagacca tccatctgct gaagcggctg 1680
cccgccgacg tgctgaaaaa gaccatcaag aacaccctgg acatccacaa gtccatcacc 1740
atcaataacc ccaaagaaag caccgtgtcc gacaccaacg accacgccaa gaacaacgac 1800
accacctga 1809
<210> 18
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 融合蛋白，所述融合蛋白包含来自hRSV A2株的全长N蛋白， 其与FMDV的蛋白酶2A片段融合， 所述蛋白酶2A片段与hRSV A2株的全长M2蛋白融合
<400> 18
Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser
195 200 205
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
385 390 395 400
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys
405 410 415
Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser
420 425 430
His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn
435 440 445
Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr
450 455 460
Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr
465 470 475 480
Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn
485 490 495
Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr
500 505 510
Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu
515 520 525
Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu
530 535 540
Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu
545 550 555 560
Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His
565 570 575
Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr
580 585 590
Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp Thr Thr
595 600
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽.
<400> 21
Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg
1 5 10 15
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro Asn Phe
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Ile Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser Phe
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile
1 5
<210> 28
<211> 1725
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 28
atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60
tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120
agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180
ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240
caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300
ccaccaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360
aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420
ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480
gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540
ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600
aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agaaactgtg 660
atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720
gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta 780
atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840
gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta 900
gtacaattac cactatatgg tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct 960
ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020
tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080
caatcaaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaaataaat 1140
ctctgcaatg ttgacatatt caaccccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200
gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260
aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320
tatgtatcaa ataaagggat ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat 1380
aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440
ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500
cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560
tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga ttatagtaat attgttatca 1620
ttaattgctg ttggactgct cttatactgt aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680
aaagatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actaa 1725
<210> 29
<211> 574
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 29
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
565 570
<210> 30
<211> 897
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 30
atgagcaaga acaaggacca gcggaccgcc aagaccctgg aacggacctg ggacaccctg 60
aaccatctgc tgttcatcag tagctgcctg tacaagctga acctgaagtc cgtggcccag 120
atcaccctga gcatcctggc catgatcatc agcaccagcc tgatcattgc cgccatcatc 180
tttatcgcca gcgccaacca caaagtgacc cccaccacag ccatcatcca ggacgccacc 240
tcccagatca agaacaccac ccccacctac ctgacccaga accctcagct gggcatcagc 300
cccagcaacc ccagcgagat caccagccag atcacaacca tcctggcctc caccacccct 360
ggcgtgaagt ccaccctgca gagcaccacc gtgaaaacca agaataccac caccacacag 420
acccagccca gcaagcccac caccaagcag agacagaaca agcccccctc caagcccaac 480
aacgacttcc acttcgaggt gttcaacttc gtgccctgca gcatctgcag caacaacccc 540
acctgttggg ccatctgcaa gcggatcccc aacaagaagc ccggcaagaa aaccacaacc 600
aagcctacca agaagcctac cctgaaaacc accaagaagg accccaagcc ccagaccacc 660
aagagcaaag aggtgccaac caccaagccc accgaggaac ccaccatcaa caccaccaag 720
accaacatca tcaccaccct gctgacctcc aacaccaccg gcaaccccga gctgacaagc 780
cagatggaaa ccttccacag caccagcagc gagggcaacc ctagccctag ccaggtgtcc 840
accacctccg agtaccccag ccagcctagc agccccccca acacccccag acagtga 897
<210> 31
<211> 298
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 31
Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr
100 105 110
Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu
210 215 220
Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro
245 250 255
Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly
260 265 270
Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu Tyr Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg Gln
290 295
<210> 32
<211> 585
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 32
atgtcacgaa ggaatccttg caaatttgaa attcgaggtc attgcttaaa tggtaagagg 60
tgtcatttta gtcataatta ttttgaatgg ccaccccatg cactgcttgt aagacaaaac 120
tttatgttaa acagaatact taagtctatg gataaaagta tagatacctt atcagaaata 180
agtggagctg cagagttgga cagaacagaa gagtatgctc ttggtgtagt tggagtgcta 240
gagagttata taggatcaat aaacaatata actaaacaat cagcatgtgt tgccatgagc 300
aaactcctca ctgaactcaa tagtgatgat atcaaaaagc tgagggacaa tgaagagcta 360
aattcaccca agataagagt gtacaatact gtcatatcat atattgaaag caacaggaaa 420
aacaataaac aaactatcca tctgttaaaa agattgccag cagacgtatt gaagaaaacc 480
atcaaaaaca cattggatat ccataagagc ataaccatca acaacccaaa agaatcaact 540
gttagtgata caaatgacca tgccaaaaat aatgatacta cctga 585
<210> 33
<211> 194
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 33
Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro
20 25 30
His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys
35 40 45
Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys
85 90 95
Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr
115 120 125
Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln
130 135 140
Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr
145 150 155 160
Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro
165 170 175
Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp
180 185 190
Thr Thr
<210> 34
<211> 1176
<212> DNA
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 34
atggctctta gcaaagtcaa gttgaatgat acactcaaca aagatcaact tctgtcatcc 60
agcaaataca ccatccaacg gagcacagga gatagtattg atactcctaa ttatgatgtg 120
cagaaacaca tcaataagtt atgtggcatg ttattaatca cagaagatgc taatcataaa 180
ttcactgggt taataggtat gttatatgcg atgtctaggt taggaagaga agacaccata 240
aaaatactca gagatgcggg atatcatgta aaagcaaatg gagtagatgt aacaacacat 300
cgtcaagaca ttaatggaaa agaaatgaaa tttgaagtgt taacattggc aagcttaaca 360
actgaaattc aaatcaacat tgagatagaa tctagaaaat cctacaaaaa aatgctaaaa 420
gaaatgggag aggtagctcc agaatacagg catgactctc ctgattgtgg gatgataata 480
ttatgtatag cagcattagt aataactaaa ttagcagcag gggacagatc tggtcttaca 540
gccgtgatta ggagagctaa taatgtccta aaaaatgaaa tgaaacgtta caaaggctta 600
ctacccaagg acatagccaa cagcttctat gaagtgtttg aaaaacatcc ccactttata 660
gatgtttttg ttcattttgg tatagcacaa tcttctacca gaggtggcag tagagttgaa 720
gggatttttg caggattgtt tatgaatgcc tatggtgcag ggcaagtgat gttacggtgg 780
ggagtcttag caaaatcagt taaaaatatt atgttaggac atgctagtgt gcaagcagaa 840
atggaacaag ttgttgaggt ttatgaatat gcccaaaaat tgggtggtga agcaggattc 900
taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt tgactcaatt tcctcacttc 960
tccagtgtag tattaggcaa tgctgctggc ctaggcataa tgggagagta cagaggtaca 1020
ccgaggaatc aagatctata tgatgcagca aaggcatatg ctgaacaact caaagaaaat 1080
ggtgtgatta actacagtgt actagacttg acagcagaag aactagaggc tatcaaacat 1140
cagcttaatc caaaagataa tgatgtagag ctttga 1176
<210> 35
<211> 391
<212> PRT
<213> hRSV A2株(hRSV strain A2)
<400> 35
Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser
20 25 30
Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys
35 40 45
Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile
65 70 75 80
Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp
85 90 95
Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu
100 105 110
Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu
130 135 140
Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile
145 150 155 160
Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn
180 185 190
Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser
195 200 205
Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val
210 215 220
His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val
245 250 255
Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu
260 265 270
Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr
275 280 285
Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe
305 310 315 320
Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu
325 330 335
Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala
340 345 350
Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro
370 375 380
Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu
385 390
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> RT-PCR引物
<400> 36
gaactcagtg taggtagaat gtttgca 27
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> RT-PCR引物.
<400> 37
ttcagctatc attttctctg ccaat 25
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> RT-PCR探针
<400> 38
tttgaacctg tctgaacatt cccggtt 27
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 39
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40
<210> 40
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 40
tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60
aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104
<210> 41
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 41
taaaaattga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctattct 60
ataaataata aat 73
<210> 42
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 42
gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120
gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180
tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227
<210> 43
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 43
tacttaaaaa ttgaaaataa atacaaaggt tcttgagggt tgtgttaaat tgaaagcgag 60
aaataatcat aaataatttc attatcgcga tatccgttaa gtttgtatcg ta 112

Claims (17)

1.一种重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包含a)编码呼吸道合胞病毒(RSV)膜糖蛋白F的抗原决定簇的至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码SEQ ID NO:6或4或与SEQ ID NO:6或4的氨基酸序列具有至少95％同一性的其变体，b)编码第一和第二RSV G膜糖蛋白的第一和第二核苷酸序列，和c)编码RSV N核衣壳蛋白和RSV M2基质蛋白的抗原决定簇的至少一个核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的重组MVA，其中所述RSV N核衣壳蛋白和RSV M2基质蛋白的抗原决定簇由被自切割蛋白酶结构域隔开的单一开放阅读框编码。
3.如权利要求1或2所述的重组MVA，其中所述自切割蛋白酶结构域是衍生自口蹄疫病毒的蛋白酶2A片段序列。
4.如权利要求1至3任一项所述的重组MVA，其中所述单一开放阅读框包含编码氨基酸序列SEQ ID:18的核苷酸序列。
5.如权利要求1至4任一项所述的重组MVA，其中所述单一开放阅读框包含核苷酸序列SEQ ID NO:17。
6.如权利要求1至5任一项所述的重组MVA，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的核苷酸序列是衍生自RSV株A，优选株A2和/或B。
7.如权利要求1至6任一项所述的重组MVA，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的核苷酸序列包含编码选自氨基酸序列SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
8.如权利要求1至7任一项所述的重组MVA，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
9.如权利要求1至8任一项所述的重组MVA，其中所有所述RSV核苷酸序列均在早期痘病毒启动子的控制下。
10.一种药物组合物和/或疫苗，其包含如权利要求1至9任一项所述的重组MVA和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。
11.权利要求1至9任一项所述的重组MVA在制备用于治疗或预防RSV感染的药物中的用途。
12.权利要求1至9任一项所述的重组MVA在制备用于通过鼻内施用而治疗或预防RSV感染的药物中的用途，其中所述施用不包括肌内施用。
13.如权利要求11或12所述的用途，其中所述重组MVA是或有待于以单剂量或多剂量向在免疫上初次接受试验或在免疫上有经验的人类受试者施用。
14.如权利要求12或13所述的用途，其仅仅包括鼻内施用。
15.如权利要求12所述的用途，其中编码RSV F膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO:5或其与核苷酸序列SEQ ID NO:5具有至少约75％同一性的变体。
16.如权利要求10至15任一项所述的用途、药物组合物和/或疫苗，其用于向超过2岁的人类受试者施用。
17.如权利要求10至15任一项所述的用途、药物组合物和/或疫苗，其用于向小于2岁的人类受试者施用。
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